流感復合多表位dna疫苗及其應用的制作方法

專利名稱：：流感復合多表位dna疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及流感疫苗，特別是涉及以流感病毒基因抗原表位為基礎的DNA疫苗。
背景技術：
：流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是由流感病毒(Influenzavirus,IV)引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒在呼吸道上皮細胞內復制并引起表面炎癥，表現為急性上呼吸道炎和全身中毒癥狀。20世紀30年代人類就開始了對流感病毒的認知及疫苗的開發，然而時至今曰流感病毒依然是威脅人類和動物健康的重要病原。數年來，流感病毒的流行造成了巨大的人力資源和物力資源的損失。依據其內部蛋白抗原性的不同，流感病毒可分為A、B、C三個型。A型在廣譜的溫血動物中存在(禽類和哺乳動物)中存在，而B和C型主要是人類的病原，C型也可在豬上分離到。依據其表面抗原血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)不同，又可分為若干不同的亞型。其中，A型流感病毒是對人和禽危害最為嚴重的流感類型。其某些亞型變異迅速，致病力強，曾造成過多次世界性大流行，在造成巨大經濟損失的同時，還會造成人和禽的大量死亡。數年來，人流感的流行一直以A型H3、Hl亞型，以及B型流感為主。據世衛組織(WHO)發布的公告，全球每年流感病例為6億~12億例，死亡50萬100萬人，其中重癥流感病例300萬~500萬例，重癥流感的病死率為8%~10%。在美國每年因流感造成的經濟損失就達30~50億美元。20世紀中流感造成了四次全球性大流行，包括1918-1919年的西班牙流感(H1N1),1957年的亞洲流感(H2N2),1968年的中國香港流感(H3N2)和1977年的俄國流感(H1N1)，給人類帶來了災難性的損失。僅1919年西班牙大流感就奪去了2100萬條生命，超過第一次世界大戰死亡人數，而全球感染人數達到6億，而其它幾次大流行造成的人類死亡數量也數以百萬計。禽流感(Avianinfluenza,AI)病原為A型流感病毒，血清型以H5、H7、H9亞型為主。目前，禽流感廣泛分布于世界范圍內的許多家禽和野禽中，自遷徙水禽分離到的病毒較多，而對雞和火雞的危害則最為嚴重。其中，高致病力禽流感(HPAI)對禽類危害最為嚴重，其主要血清型為H5和H7亞型。HPAI常以突然死亡和高死亡率為主要特征，常常導致感染雞群的全群覆沒，已經給養禽業帶來巨大的經濟損失，被國際獸疫局列為A類烈性傳染病，同時被列入國際生物武器公約動物類傳染病名單。一直以來，人們普遍認為高致病性禽流感的發生比較罕見，因為在1959-1998年的40年間，世界范圍內一共只報道了17次HPAI。但自1999年開始，HPAI的爆發變的非常頻繁，1997-2004的七年中就發生了8次HPAI，而且涉及的范圍更加廣泛，尤其是2004年禽流感的爆發最為嚴重。距不完全統計，亞洲各國死亡或淘汰的禽只總數近1億只，超過歷史數次HPAI感染/淘汰禽數的總量。在其數次流行的過程中，更發生了數起HPAI感染人類并造成死亡的病例，引起了民眾的極大恐慌。禽流感尤其是HPAI展示向人流感進化的趨勢，這令環境中流感的流行情況變得更為復雜，并可能再次引發流感大流行。由于尚缺乏可有效治療流感的藥物，疫苗的使用依然是阻止流感感染和傳播的有效手段。當前，人流感和禽流感的預防主要依賴于滅活疫苗以及減毒活疫苗，長期的使用經歷證明它們是安全有效的，并發揮了巨大的作用。但是，滅活疫苗和弱毒疫苗，都存在著一些自身無法避免的缺陷。滅活疫苗存在著激發的細胞免疫水平低下，僅能對抗原相配病毒株產生免疫保護，佐劑添加引起的應激反應，生產成本偏高，感染免疫監測等不足。而減毒活疫苗則有突變為高致病性流感的可能。且這兩種疫苗均無法有效應對現在流感病毒變異迅速、多亞型流感并存流行、種屬界限曰益模糊的趨勢。開發高效、安全的流感疫苗一直是各國研究的焦點。隨著生物
技術領域：
的飛速發展，以疫苗等生物制品為中心的生物技術研究已成為全球進步最快的領域之一。基因工程技術的不斷應用，新型佐劑的涌現，更是加速了疫苗研發的腳步。不斷研究更為安全有效的禽流感疫苗，克服傳統疫苗的諸多缺陷，更好的防控禽流感，成為科研人員關注的焦點。目前流感疫苗主要分為以下幾種。滅活全病毒疫苗傳統的禽流感的預防主要采用滅活全病毒疫苗。其一般是用甲醛滅活雞胚尿囊液增殖的禽流感病毒，并輔以佐劑，實驗證明其具有良好的免疫保護作用。滅活全病毒疫苗制備工藝簡單，免疫效果確實，免疫持續期長，安全性好，不會出現毒力返強和變異現象。目前，禽流感滅活疫苗主要針對亞型包括H5N1亞型、H7N1亞型和H9N2亞型3種，我國主要以H5N1和H9N2亞型為主。在我國，應用于疫苗生產的毒株包括H9亞型的SS株、F株、LG1株、Re-2株、SD696株，H5亞型的N28、Re-1株。2006年，H5、H9亞型二價滅活苗研制成功，并開始在生產實踐中進行應用。最近，禽流感(H9)四聯滅活疫苗取得中華人民共和國新獸藥注冊證書，并獲得農業部批準上巿。該疫苗主要針對禽流感(H9)、雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征等4種禽類傳染病。亞單位疫苗亞單位疫苗是指釆用理化學或基因工程手段制備的病原體的亞單位成分。它只含有病原體的一部分，不會引起病原體所致的動物發病，因此在安全性和純度方面大大提高。但由于其生產工藝復雜，導致了使用其成本昂貴。而且一些亞單位疫苗雖然有一定的免疫保護力，但受限于難以維持或恢復天然免疫原的三維結構，因此其總體免疫效果不佳，可能需要輔以佐劑配伍使用。釆用基因工程手段，可以將保護性抗原基因連接到載體質粒，然后導入表達系統中進行擴增和表達，通過這樣的方法可以獲得大量的保護性抗原蛋白。以這種方式生產的蛋白，不僅產量高，而且成本低，具有良好的開發和發展前景。重組活載體疫苗基因工程重組活疫苗是用基因工程技術將保護性抗原基因(目的基因)轉移到載體中使其表達的活疫苗。因此，在接種攜帶這種保護性抗原基因的重組疫苗后，除獲得對載體的免疫外，還可通過外源基因的表達獲得對插入基因相關疾病的保護力。而且可以用較大的載體同時插入多種病毒的抗原基因構建多價疫苗，從而大大減少疫苗接種的次數和勞動量。重組痘病毒載體疫苗痘病毒具有許多優點，目前是應用最廣泛的載體病毒。但是痘苗病毒有著廣泛的宿主范圍，使其易在自然界中傳播，而且個別人接種痘苗病毒后產生副反應，因此出于生態學和安全學的考慮，目前的研究傾向于使用構建的痘苗病毒宿主限制性突變株和其他限制性痘病毒成員為載體。這樣的載體主要包括雞痘病毒載體、金絲雀痘病毒載體和鴿痘病毒載體等。釆用對禽類致病性較弱的禽痘病毒或痘苗病毒為載體，構建成表達HA的重組病毒，用其作為疫苗，能在禽體內復制，并不斷表達HA蛋白、誘導免疫保護力。重組新城疫載體疫苗重組新城疫病毒rL-H5株，是釆用新城疫病毒LaSota株為載體，表達H5亞型禽流感病毒HA基因的重組病毒。疫苗可以同時預防禽流感和新城疫這兩種OIE規定的A類烈性禽類傳染病，它的使用大大降低了疫苗制造和使用成本，為提高我國禽流感免疫質量、加大免疫密度提供技術保證。其可同時誘導粘膜免疫、體液免疫和細胞免疫反應，對新生雛雞無不良反應。但是該疫苗受新城疫母源抗體影響較大，臨床應用中應把握好免疫時機。此外該疫苗在鵝群中使用時，免疫保護試驗結果并不理想。DNA疫苗DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質粒DNA(有時也可是RNA)，一般認為核酸疫苗被導入宿主細胞后，被周圍的組織細胞、抗原遞呈細胞(APCs)或其他炎性細胞攝取，并在細胞內表達病原體的蛋白質抗原，經加工后形成的多肽抗原可與宿主細胞主要組織相容性復合物MHCI和MHCII分子結合，并被遞呈給宿主的免疫識別系統，從而引起特異性體液和細胞免疫應答，從而起到免疫保護作用。抗獨特型抗體疫苗抗獨特型抗體疫苗是根據Jeme的免疫網絡學說研制的。一些抗獨特型抗體能夠和抗體的補位結合并且在空間結構上模擬抗原表位，這類抗體可以替代抗原作為診斷抗原檢測機體抗體的水平，還可以作為疫苗免疫動物，使動物產生免疫應答，抵抗相應病原體的侵襲。
發明內容本發明的目的是提供以流感抗原表位為基礎的DNA疫苗及其應用。本發明的目的及解決其技術問題是釆用以下的技術方案來實現的。依據本發明提供的流感復合多表位DNA疫苗，所述DNA疫苗編碼蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亞型流感病毒HA蛋白為載體骨架分子，并以ER信號肽作為引導序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒HA基因和NP、NA、NS1、M基因中高度保守的免疫優勢表位，其中包括來源于上述亞型的流感CTL表位17個，來源于上述亞型的流感Th和B細胞表位12個；共29個表位的流感復合多表位DNA疫苗。本發明的目的及解決其技術問題還可以釆用以下的技術措施來進一步實現。前述的DNA疫苗，其中所述的Th和B細胞表位為下表所列表位18-29(請參閱序列表SEQIDNo.22至SEQIDNo.33所示)；所述CTL表位為流感HA基因組中17個高度保守的CTL免疫優勢表位，如下表1-17所示(請參閱序列表SEQIDNo.5至SEQIDNo.21所示)序號<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表位之間采用柔性小分子linker連接。前述的DNA疫苗，其中所述柔性小分子linker為KAA、KAAA、AAA、NAAA或AAY。前述的DNA疫苗具有抗原性。前述的DNA疫苗具有免疫原性。前述的DNA疫苗在預防流感中的應用。前述的DNA疫苗的應用，其中所述疫苗同時預防多種亞型流感病毒，所述疫苗為注射劑。本發明的目的及解決其技術問題還釆用以下的技術方案來實現。依據本發明提供的一種H3/H1主導型流感復合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴增H3和HI亞型流感病毒HA基因并添加相應的表位基因，獲得重組體質粒。本發明的目的及解決其技術問題還采用以下的技術方案來實現。依據本發明提供的一種H3/H5主導型流感復合多表位DNA疫苗，其釆用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴增H3和H5亞型流感病毒HA基因并添加相應的表位基因，獲得重組體質粒。本發明的目的及解決其技術問題還釆用以下的技術方案來實現。依據本發明提供的一種H5/H7主導型流感復合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴增H5和H7亞型流感病毒HA基因并添加相應的表位基因，獲得重組體質粒。前述的DNA疫苗編碼蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亞型流感病毒HA蛋白為載體骨架分子，以內質網膜引導信號肽(ER)作為引導序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒HA基因和NP、M、NA、NS1基因中高度保守的免疫優勢表位，其中包括來源于多種亞型的流感CTL表位17條，來源于多個亞型的流感Th和B細胞表位12條，共29個表位的流感復合多表位DNA疫苗。同時，對基因啟始密碼子ATG的前后堿基序列作了設計和調整，使其符合Kozak規則；考慮到宿主細胞表達外源蛋白時對密碼子的偏愛性，還對密碼子進行了相應的調整，以期獲得最佳的免疫效果。本發明的流感復合多表位DNA疫苗，其中所述DNA疫苗CTL表位的選擇釆用SYFPEITHI、Bimas、Multipre對參考毒株序列進行分析，對其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位進行預測，篩選得分較高，排名靠前的CTL表位，綜合評價各軟件預測結果分析得到所需表位。Th表位預測釆用網絡服務器SYFPEITHI和Multipre。主要對HLA-DRB1*04、HLA-DRB1*07、HLA-DRB1*08、HLA-DRBl"l、HLA-DRB1*13、HLA-DRB1*15限制性Th細胞表位進行預測，并綜合參考其他HLA-DR親和力評分。B細胞表位預測釆用網絡服務器Bcepred對線性B細胞表位進行預測。篩選時依據親水性好(hydrophilicity)，可及性高(accessibility),可塑性好(flexibility),抗原性強(antigenicity),分子極性強(polarity),表面暴露(exposedsurface)和轉角(turns)可能性大的為候選B細胞表位。所有預測優先篩選位于HA主要抗原區HA1上的表位。隨后，匯總各項表位預測結果，以Th表位預測為基礎，使預測表位區盡量覆蓋與B細胞表位預測交集區，以獲得兼有Th與B細胞表位功能的預測表位。通過PDB(http:〃www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載、流感HA及NA蛋白分子構象，應用InsightII軟件進行分子建模，分析候選表位空間構象。排除位于oc-螺旋和(3-片層不易形成表位的序列，將位于轉角、無規則卷曲處且表面暴露好的序列確定為候選細胞表位。將候選表位序列與已發表的HA蛋白序列比較，分析其特異性(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。最后，綜合各項結果確定細胞表位。CTL表位盒設計，在預測和搜集CTL表位的基礎上，添加合適的Linker連接各CTL表位，并通過蛋白酶體裂解預測軟件PAProC優化CTL表位盒的構成和Linker的選擇。Th及B細胞表位盒設計，在預測和搜集Th與B細胞表位的基礎上，添加柔性及可裂解Linker連接各表位。而后，在此基礎上在表位盒中均加入內質網信號引導序列和通用Th表位，以輔助表位更好突破MHC限制性而發揮功能。根據設計的表位盒，復原其核苷酸序列，并參照真核優勢密碼子規則進行優化。在搜集已發表的表位基礎上，結合預測所得表位，對CTL表位盒和ThB表位盒進行分子設計，并釆用理論結合軟件模擬的方式進行表位盒組成的優化。最終，設計獲得了理論上具有良好功能的CTL表位盒和ThB表位盒，隨后進行人工合成。前述的DNA疫苗，通過細胞轉染試驗，證明目的基因有效表達且具有抗原性。前述的DNA疫苗，通過小鼠免疫試驗，表明該疫苗可誘導BALB/c小鼠產生針對所選表位的特異性體液免疫和細胞免疫反應，證明其具有免疫原性。前述的DNA疫苗，通過轉染人外周血來源DC細胞并與自體人T淋巴細胞共培養，可誘導產生針對所選表位的特異性體液免疫和細胞免疫反應，表明該疫苗在人體中應用的可行性。前述的技術方案具有如下優點在兩個表位盒的設計中均添加了內質網膜引導信號(ER)以促進表位多肽更高效的合成與折疊。設計中，本發明還在表位盒摻入了多個通用輔助性T細胞表位(HTL)。通用輔助性T細胞表位，具有與大多數人的HLA-DR分子、小鼠MHCII類分子高親和力結合的能力，可以有效地激活CD4+T淋巴細胞，使其分泌IL-2、IL-12等細胞因子，這些細胞因子以旁路分泌方式作用于流感抗原特異性T細胞，從而可大大提高疫苗的免疫效力。已證實其摻入可以有效改善表位遞呈過程中受MHC限制性的影響，并已廣泛應用于表位疫苗的設計與構建中。我們以此來輔助組建的表位盒更好克服種屬和個體MHC限制性的問題而發揮功能。在搜集已發表的流感表位的基礎上，釆用生物信息學方法，對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感的HA和NA的T和B細胞表位進行預測和篩選。隨后，通過體外實驗，分析了預測的Th和B細胞表位的抗原性。在此基礎上，進行了復合多表位DNA疫苗的設計與構建，該DNA疫苗重組體轉染BHK21細胞，RT-PCR及間接免疫熒光檢測表明，目的蛋白成功表達，表達產物可以分別被標準各亞型HA陽性血清及M，NS，NA陽性血清所識別。該疫苗免疫BALB/c小鼠、雞、豬的免疫實驗后進行免疫學指標的檢測，結果顯示這該疫苗可刺激小鼠、雞、豬、產生特異性體液免疫和細胞免疫反應。最后，我們通過小鼠、雞、豬的免疫實驗，對復合多表位DNA疫苗的免疫原性進行了研究。本發明可同時預防多種亞型流感病毒，可對多種動物免疫保護，該疫苗可以與任何藥物(抗病毒藥物、治療性抗體等)核酸疫苗質粒PVAX1-H3-EHA-H1-M2構建流程示意圖2為本發明較佳實施例核酸疫苗質粒pVAXl-H5-EHB-H3-M2構建流程示意圖3為本發明較佳實施例核酸疫苗質粒pVAXl-H5-EHC-H7-M2構建流程示意圖。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本發明綜合利用分子生物學、分子病毒學、分子免疫學、細胞生物學、生物信息學等不同學科知識、技術結合生物信息學模擬、分子設計、表位選擇以及基因重組技術，綜合考慮流感的特性、基因組結構和特點以及與感染和免疫緊密相關的問題，在分子水平上構建了三個主導型的針對不同亞型、不同流行株均有預防作用的新型流感復合多表位基因工程預防疫苗pVAXl-AHI、pVAXl-BHI、pVAXl-CHI、pVAXl-ACI、pVAXl-BCI、pVAXl-CCI。該疫苗通過接種機體，能夠誘導機體產生特異的細胞免疫和體液免疫反應，達到預防病毒感染目的，既可以作為預防性疫苗用于雞群和豬群的免疫接種，同時對人群的流感預防也有積極作用。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化、質粒的提取及限制性內切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質粒的篩選與鑒定、PCR擴增反應等參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實驗指南》第二版相關章節進行。實施例l流感多表位DNA疫苗的建立搜集已發表的流感表位，參考本發明之前已有研究的基礎上，從NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上分別下載獲得H1、H3、H5、H7、H9亞型流感HA基因和NA基因的氨基酸序列。生物信息學MHCI類分子預測釆用網絡服務器SYPEITHI(http:〃syfpeithi.bmi-heidelberg.com)、Bimas(http:〃www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla—bind)、Multipre(http:〃antigen.i2r.a-star.Edu.sg);生物信息學MHCII類分子預測釆用網絡服務器SYFPEITHI和Multipre;生物信息學B細胞表位預測釆用網絡服務器Bcepred(http:〃www.intech.res.in/raghava/bcepred)和生物分子模擬軟件InsightII(Accelrys，2005);蛋白酶體切割預測采用網絡服務器PAProC(http:〃www.paproc.de)。應用生物信息學方法，對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感HA和NA相關的CTL功能表位進行分析，綜合各項結果篩選獲得CTL相關表位17條(請參閱序列表SEQIDNo.5至SEQIDNo.21所示)；對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感HA的Th和B細胞表位進行了共預測分析，綜合各項結果篩選獲得ThB相關表位12條(請參閱序列表SEQIDNo.22至SEQIDNo.33所示)。根據針對物種和目的不同，設計了三種主導型的復合多表位核酸疫苗，包括H3和H1亞型一對人類主要感染流感亞型預防的同時，通過多表位基因盒的加入對H5、H7、H9亞型實現共預防保護，目標主要集中于人群；H3和H5亞型一對可能造成潛在大流行禽流感H5亞型和人流感H3亞型實現共預防的同時，通過多表位基因盒的加入對H1、H7、H9亞型實現共保護，目標主要集中豬和人群；H5和H7亞型一對禽流感主要兩個高致病性亞型進行共預防的同時，輔以多表位基因盒對H1、H3、H9亞型實現共保護，目標主要集中于禽和人群。由于單獨的多表位基因盒，片段較小，形成空間構型相對簡單，免疫原性較低。因此，本發明釆用復合多表位疫苗的形式以結構基因嵌合多表位基因盒，來提高表位盒的免疫原性。依據表位盒功能的不同將其連接入不同結構基因下游，如介導CTL功能為主的表位盒連接于NP基因下游；介導體液免疫的ThB表位盒和M2表位盒則連接入HA基因骨架內。依據不同主導型的需要，釆用PCR方式從人工合成總表位盒中分別擴增含有所需的不同功能表位盒。為了使融合基因能夠有效表達，在兩基因間添加柔性linker(G4S)3，以促進表達蛋白進行正確的空間構象折疊，減少由于空間構象間相互影響而可能產生的對抗原性的影響，此外還加入了具有自裂解功能口蹄疫2A蛋白linker。在翻譯起始的"ATG"處均添加Kozak序列，以促進融合蛋白的更高效的表達。1、流感CTL表位盒和ThB表位盒的合成將所設計的表位盒序列交由上海旭冠生物工程有限公司進行合成，CTL-1表位盒(如SEQIDNo.l所示)、M2表位盒(如SEQIDNo.4所示)按原有序列合成，CTL-2BOX(如SEQIDNo.2所示)和ThBBOX(如SEQIDNo.3所示)合成時主要合成表位的核心區域，以滿足后期DNA疫苗組建的需要。2、質粒pVAXl畫H3-EHA-Hl-M2、pVAXl-H5畫EHB-H3畫M2、pVAXl畫H5隱EHC-H7畫M2、pVAXl-NP-ETA、pVAXl-NP-ETB、pVAXl-NP-ETC的構建(1)H5HA、H1HA1、NP基因的獲得①模板制備將所得的A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)、A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的尿囊液，應用TRIZOLLSReagent按說明書方法提取總RNA,用于病毒基因組反轉錄和PCR擴增。.流程如下取400pl病毒尿囊液于1.5ml離心管，加800fillTRIZOLLSReagent,混勻，室溫孵育10min;加入200nl氯仿，混勻，室溫孵育15min;12000g離心15min。吸取上層水相并加入500jil異丙醇，室溫孵育10min;417°C12000g離心10min;沉淀用1ml75%乙醇漂洗，干燥，溶于20^1DEPC處理雙蒸水，-70°(3凍存備用。②引物設計應用Prime引物設計軟件，參考Genbank登錄的相關序列，設計3對引物，分別由A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)擴增H5HA基因，從A/NewCaledonia/20/99(H1N1)擴增H1HA1和NP基因，引物由TaKaRa公司合成。③反轉錄采用TaKaRa公司的RNALAPCRTMKit(AMV)對病毒RNA進行反轉錄。按試劑盒說明依次加入RNaseFreedH205.5(il、dNTPMixture2|il、RNaseInhibiter0.5(il、AMVReverseTranscriptaselfji、特異上游引物l(il、病毒RNA4(al，混勻后42。C孵育90min，-20"保存備用。④PCR反應用TaKaRa公司ExTaqTMKit擴增HA和NP基因，按試劑盒說明加入10xExTaqBuffer(Mg2+plus)5[il、dNTPMixture(2.5mM)4|il、上游引物lpl、下游引物lfil、反轉錄產物3pl、TaKaRaExTaq酶0.25(il、滅菌蒸餾水35.75nl。PCR循環參數設定為94。C預變性5min,94°Clmin，55°C1min，72°C2min,35個循環，最后72°C延伸10min。取PCR產物進行凝膠電泳，觀察擴增結果。PCR產物連接與陽性克隆質粒的鑒定將上述H5N1亞型AIVHA基因，H1N1亞型IVHA和NP基因的PCR產物與pMD18-Tsimple載體連接，構建pMD18-Tsimple-H5HA、pMD18-Tsimple-HlHA、pMD18-Tsimple-NP。按照載體試劑盒說明進行操作。T載體1^1，T4連接酶l(il，回收DNA片段適量并加ddH20補至10|il，于16。C反應14~16h。轉化后挑菌，提取質粒進行酶切鑒定。挑選酶切結果與預計相同者進一步鑒定，所有酶切結果均與預計完全相同者，即為陽性重組質粒。質粒純化后由大連寶生物公司進行序列測定。..(2)H3HA和H7HA基因的人工合成以A/AfricanStarling/983/79(H7N1)病毒株的HA基因為模板，人工合成完整HAORF核苷酸序列，克隆于pMD18-T上，構建DNA重組體pMD18-H7HA。以A/Wisconsin/67/2005(H3N2)病毒株的HA基因為模板，人工合成完整HAORF核苷酸序列，并以簡并堿基突變掉序列內部部分酶切位點，克隆于pMD18-T載體上，構建DNA重組體pMD18-H3HA。(3)不同主導型多表位基因盒的獲得由于各主導型的DNA疫苗含有相關流感亞型完整HA或HA1組分，因此在表位盒中可以省略相關亞型的HA來源表位。根據不同主導型的需要，對人工合成的CTLBOX-2和ThBBOX進行PCR改造，通過引物在片段兩端引入合適的酶切位點和linker或內質網膜引導引號(ER),通用Th(HTL)表位一TT、PAN-DR、Gag,用于進一步DNA疫苗構建的需要。與pMD18-Tsimple載體連接，并獲得陽性克隆，純化質粒送至大連寶生物公司進行序列測定。將改造好的CTLBOX-2通過SpeI和SalI雙酶切，與以經過相同雙酶切的含各流感通用Ml、NA1、NA2、NS1CTL表位的CTLBOX-1偶聯，構建成各主導型所需CTL功能表位盒。改造好的H3/H1主導型CTL表位盒陽性質粒命名為pMD18S-ETA,其ThB表位盒陽性質粒命名為pMD18S-EHA。H5/H3主導型CTL表位盒陽性質粒命名為pMD18S-ETB,其ThB表位盒陽性質粒命名為pMD18S-EHB。H5/H7主導型CTL表位盒陽性質粒命名為pMD18S-ETC，其ThB表位盒陽性質粒命名為pMD18S-EHC。0)HA及NP基因的改造根據不同主導型的需要，對獲得的HA和NP基因進行PCR改造，19通過引物在片段兩端引入合適的酶切位點及linker部分，用于進一步DNA疫苗構建的需要。與pMD18-Tsimple載體連接，獲得陽性克隆，純化質粒送至大連寶生物公司進行序列測定。獲得的含H5HA基因陽性質粒命名為pMD18S-H5HA，含H7HA1基因陽性質粒命名為pMD18S-H7HAl，含H3HA基因陽性質粒命名為pMD18S-H3HA,含H3HA1基因陽性質粒命名為pMD18S-H3HAl，含H1HA1基因陽性質粒命名為pMD18S-HlHAl,含NP基因陽性質粒命名為pMD18S-NP。再分別設計引物，PCR分別擴增可直接用于在pVAXl表達的H1HA1、H3HA1、H7HA1基因。與pMD18-Tsimple載體連接，并獲得陽性克隆，純化質粒送至大連寶生物公司進行序列測定。將含有H1HA1基因的陽性質粒命名為pMD18S-EHlHAl，將含有H3HA1基因的陽性質粒命名為pMD18S-EH3HAl，將含有H7HA1基因的陽性質粒命名為pMD18S-EH7HAl。(5)流感病毒復合多表位DNA重組體的構建■H3/H1主導型相關DNA重組體的構建(請參閱圖l所示)①DNA重組體pVAXl-H3的構建用限制性內切酶Nhel和Xhol消化質粒pMD18S-H3HA,獲得基因片段H3HA,與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-H3HA(pVAXl-H3)重組體質粒。②DNA重組體pVAXl-EHl的構建用限制性內切酶Nhel和HindIII消化質粒pMD18S-EHlHAl,獲得基因片段H1HA1，與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-HlHAl(pVAXl-EHl)重組體質粒。③DNA重組體pVAXl-NP的構建用限制性內切酶Kpnl和Sail消化質粒pMD18S-NP,獲得基因片段NP，與以KpnI和XhoI消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-NP重組體質粒。④DNA重組體pVAXl-H3-Hl的構建用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H3和pMD18S-HlHAl，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H3中，獲得重組質粒pVAXl-H3-HlHAl(pVAXl-H3-Hl)。DNA重組體pVAX1-ETA的構建用限制性內切酶EcoRI和Sail消化質粒pMD18S-ETA,獲得基因片段ETA,與以EcoRI和Xhol消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-ETA重組體質粒。DNA重組體pVAX1-EHA的構建用限制性內切酶HindIII和Xhol消化質粒pMD18S-EHA，獲得基因片段EHA，與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-EHA重組體質粒。⑦復合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETA的構建用限制性內切酶EcoRI和Sail消化質粒pMD18S-NP和pMD18S-ETA,回收ETA基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質粒pMD18S-NP-ETA。再用限制性內切酶Kpnl和Sail消化重組質粒pMD18S-NP-ETA，與Kpnl和Xhol消化真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETA重組體質粒。⑧復合多表位DNA重組體pVAX1-H3-EHA-H1-M2的構建用限制性內切酶HindIII和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H3和pMD18S-EHA,回收EHA基因片段，定向克隆到pVAXl-H3中，獲得重組質粒pVAXl-H3-EHA。用限制性內切酶Sphl和Xhol消化質粒pMD18S-HlHAl和pMD18-M2,回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-HlHAl中，獲得重組質粒pMD18S-HlHAl-M2。用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H3-EHA和pMD18S-HlHAl-M2，回收H1HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H3-EHA中，獲得重組質粒pVAXl-H3-EHA-H1HA1-M2(pVAXl-H3-EHA-Hl-M2)。■H5/H3主導型相關DNA重組體的構建(請參閱圖2所示)①DNA重組體pVAXl-H5的構建用限制性內切酶Nhel和Xhol消化質粒pMD18S-H5HA，獲得基因片段H5HA，與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-H5HA(pVAXl-H5)重組體質粒。②DNA重組體pVAX1-EH3的構建用限制性內切酶Nhel和HindIII消化質粒pMD18S-EH3HA1，獲得基因片段H3HA1,與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-H3HAl(pVAXl-EH3)重組體質粒。③DNA重組體pVAXl-H5-H3的構建用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5和pMD18S-H3HAl，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質粒pVAXl-H5-H3HAl(pVAXl-H5-H3)。④復合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETB的構建用限制性內切酶EcoRI和Sail消化質粒pMD18S-NP和pMD18S-ETB,回收ETB基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質粒pMD18S-NP-ETB。再用限制性內切酶Kpnl和Sail消化重組質粒pMD18S-NP-ETB，與Kpnl和Xhol消化真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETB重組體質粒。復合多表位DNA重組體pVAXl-H5-EHB-H3-M2的構建用限制性內切酶HindIII和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5和pMD18S-EHB,回收EHB基因片段，定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質粒pVAXl-H5-EHB。用限制性內切酶Sphl和Xhol消化質粒pMD18S-H3HAl和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H3HAl中，獲得重組質粒pMD18S-H3HAl-M2。用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5-EHB和pMD18S-H3HAl-M2,回收H3HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H5-EHB中，獲得重組質粒pVAXl-H5隱EHB-H3HA1-M2(pVAXl-H5-EHB畫H3-M2)。■H5/H7主導型相關DNA重組體的構建(請參閱圖3所示)①DNA重組體pVAXl-EH7的構建用限制性內切酶Nhel和HindIII消化質粒pMD18S-EH7HAl，獲得基因片段H7HA1,與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-H7HAl(pVAXl-EH7)重組體質粒。②DNA重組體pVAXl-H5-H7的構建用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5和pMD18S-H7HAl，回收H7HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質粒pVAXl-H5-H7HAl(pVAXl-H5-H7)。③DNA重組體pVAXl-ETC的構建用限制性內切酶EcoRI和Sail消化質粒pMD18S-ETC,獲得基因片段ETC,與以EcoRI和XhoI消化的真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-ETC重組體質粒。DNA重組體pVAX1-EHC的構建用限制性內切酶HindIII和Xhol消化質粒pMD18S-EHC,獲得基因片段EHC，與以相同內切酶消化的真核表達載體pVAXl連接，23經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-EHC重組體質粒。復合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETC的構建用限制性內切酶EcoRI和Sail消化質粒pMD18S-NP和pMD18S-ETC,回收ETC基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質粒pMD18SNP-ETC。再用限制性內切酶Kpnl和Sail消化重組質粒pMD18SNP-ETC，與Kpnl和Xhol消化真核表達載體pVAXl連接，經轉化，挑菌和提取質粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETC質粒。復合多表位DNA重組體pVAX1-H5-EHC-H7-M2的構建用限制性內切酶HindIII和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5和pMD18S-EHC，回收EHC基因片段，定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質粒pVAXl-H5-EHC。用限制性內切酶Sphl和Xhol消化質粒pMD18S-H7HA1和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H7HAl中，獲得重組質粒pMD18S-H7HAl-M2。用限制性內切酶Clal和Xhol消化上述試驗構建的重組質粒pVAXl-H5-EHC和pMD18S-H7HAl-M2，回收H7HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H5-EHC中，獲得重組質粒pVAXl陽H5陽EHC-H7HA1隱M2(pVAXl-H5-EHC-H7-M2)。3、流感病毒復合多表位DNA重組體的鑒定(1)流感復合多DNA重組體的酶切鑒定將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，取200(id涂于LB瓊脂平板，37'C培養過夜。挑取單個菌落接種于2ml含相應抗生素的LB培養液中，小量制備質粒DNA。選擇12種合適的限制性內切酶單獨或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結果與預計相同者進一步鑒定，所有酶切結果均與預計完全相同者，為陽性重組質粒。(2)流感復合多DNA重組體轉染細胞細胞計數取細胞懸液0.5ml，加入臺盼蘭溶液0.5ml,充分振蕩后，置室溫5-10min，用移液器滴入細胞計數板內，按白細胞計數24法計數四角大方格內的細胞總數(N)。將四角大方格內的細胞總數按公式換算成每亳升細胞懸液中的細胞數n(n-N/4xl0000K,式中K為稀釋倍數)。細胞培養根據細胞計數結果，稀釋細胞為5xl05/ml個裝瓶培養。每25ml容量小瓶裝4ml，置37'C孵箱內培養。細胞在l-2h貼壁，幾小時至十幾個小時后開始生長，24-48h長成單層。脂質體轉染于6x30mm的培養板中接種傳代的BHK細胞lxl()S3xl0S個/m1,當細胞長至60~80%單層時，將培養液棄掉，用PBS洗滌細胞兩遍，備用。與在室溫下作用15-30min的轉染試劑LipofectatimeTM2000和重組質粒的混合物共轉染。即在500^1MEM中，加入10jilLipofectatimeTM200，輕輕混勻，將重組質粒DNA10pg加入到另取的500^1MEM中，混句；然后將后者滴加于前一液體中，吹氣混勻，溫室作用15-30min。轉染后4.5h,更換新鮮配制的含2%FCS的MEM培養液，繼續培養72h，收獲細胞。此步設pVAXl空白質粒和細胞對照。(3)流感病毒復合多表位DNA重組體RT-PCR檢測釆用RT-PCR法，分別根據復合多表位重組質粒pVAX1-NP-ETA，pVAXl-H3-EHA隱Hl隱M2、pVAXl隱NP隱ETB、pVAXl-H5畫EHB-H3-M2、pVAXl-NP-ETC、pVAXl-H5-EHC-H7-M2序列，對重組質粒全序列進行擴增。收集轉染72h后表達質粒及空載體細胞，2000r/min離心10min,提取細胞總RNA。按常規方法進行反轉錄，PCR擴增反應條件為94°C5min;94。Clmin，58。Clmin,72。C3min,30個循環；72°C10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。分別轉染了pVAXl-NP-ETA、pVAXl-NP-ETB、pVAXl-NP-ETC的BHK細胞，經RT-RCR擴增，可見2400bp左右的條帶，與預計大小相符。分別轉染了pVAXl-H3-EHA-Hl-M2、pVAXl-H5-EHB-H3-M2、pVAXl-H5-EHC-H7-M2的BHK細胞，經RT-RCR擴增，可見4600bp左右的條帶，與預計大小相符。上述結果從轉錄水平證實，所構建的復合多表位重組質粒可以在真核細胞中有效轉錄。(4)流感病毒復合多表位DNA重組體間接免疫熒光法(IFA)PBS漂洗一次細胞板上細胞，冷丙酮固定10-15min。PBS洗滌3次，與兔抗不同亞型流感HA1陽性血清(1:300稀釋)反應1.5小時，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG反應1.5h。PBS洗滌3次，在板中滴一滴甘油緩沖液(50%甘油PBS)，置于熒光顯微鏡下，波長495nm處觀察和拍照(加入二抗后操作步驟均應避光進行，一般情況下，盡量在較短時間內完成拍照，以免熒光淬滅)。復合多表位DNA疫苗轉染BHK細胞后，通過不同陽性血清進行間接免疫熒光結果檢測結果顯示，轉染了各重組質粒的BHK細胞均出現特異性綠色的熒光，特異性熒光分布在細胞膜和細胞漿均有分布，正常BHK細胞和空載體對照未出現特異性熒光，呈陰性反應。說明重組質粒各抗原組分可以獲得有效表達，抗原性良好。實施例2H3/H1主導型復合多表位核酸疫苗小鼠實驗免疫研究1、實驗分組、小鼠免疫及采樣將BALB/c雌性小鼠20只隨機分2組，每組10只，分別為pVAXl空質粒對照組、pVAX-MEGNp24質粒免疫組。免疫分三次進行，間隔14d。每次向小鼠的雙側脛前肌注射lOOpgrDNA(溶于100pL無菌生理鹽水中)。于二免后2周取血，置4。C過夜，5000rpm離心10min，收集血清，-20匸保存備檢測用。第3次免疫后第10d摘眼球取血，頸推脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測細胞因子；同時無菌取其脾臟制備脾細胞懸液，分別用于特異性CTL活性測定、淋巴細胞轉化實驗和Thl/Th2類細胞因子檢測。26將6-8周齡雌性BALB/c小鼠100只隨機分10組，每組10只，包括8個免疫組，以及2個對照組空質粒和PBS對照組。分別于0d、21d、35d,免疫三次。首次免疫小鼠的雙側脛前肌注射200(igrDNA(溶于100)Lil無菌ddH20中)。以后每次免疫IOO嗎rDNA。三免后10天眼動脈釆血，置4。C過夜，5000r/min離心10min,收集血清，2(TC保存備抗體檢測用。取血結東后頸椎脫臼處死，同時無菌取其脾臟制備脾細胞懸液，用于檢測細胞免疫指標檢測——淋巴細胞轉化試驗、IFNY-ELISPOT檢測和T淋巴細胞亞類數量分析。2、免疫小鼠血清ELISA抗體檢測將AIVH5、H7、H9標準抗原及H1、H3亞型滅活病毒，4。C過夜包被ELISA板并編號。甩掉包被物，洗滌5次，每孔加封閉液IOO37°C孵育lh。洗滌液充分洗滌5次，每孔加入lOOjul免疫鼠血清(l:IOO倍稀釋)，輕輕震蕩混勻，37'C溫育1.5h。甩干孔內液體，用洗滌5遍，扣干。每空加入l:2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗體100ul，37°C孵育lh。甩干孔內液體，洗滌5遍，扣干。加入新配制的顯色溶液OPD,輕輕震蕩混勻，37'C避光顯色15min。最后，加入終止液50pl，輕輕震蕩混勻，終止反應，于492nm測定各孔吸光值。所得數據以AX士SD表示，并進行統計學分析(t檢驗)。從抗H3亞型流感病毒特異性ELISA抗體檢測結果分析，各免疫組ELISA抗體自免疫一周后開始出現，并逐步上升，二免之后穩步提高，三免后迅速提高并達到頂峰，45d時所有免疫組抗體水平均顯著高于對照組(p<0.01)。3、免疫小鼠細胞免疫應答檢測①脾臟單淋巴細胞懸液制備脫頸處死小鼠，消毒液浸泡5min，無菌條件下取出脾臟，置于盛有4mlHank's液的六孔板中，取出脾臟用雙層玻片研磨，lml大槍柔和吹勻混液。紗網輕柔過濾至含有4ml分離液(TDB)的10ml離心管，2000r/min離心15min。小心吸取中間層(淋巴細胞層)2-4ml至新10ml離心管中。加入5ml5%血清1640，輕柔反復洗滌二次，2000r/min離心10min。加入lml5%1640重懸細胞，計數，調細胞數至lxl。7個/ml，備用。②脾臟T淋巴細胞轉化試驗(WST法)操作步驟于96孔板中每孔分別加入用10%1640稀釋好的ConA(4ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50(il,同時設細胞中不加刺激物孔，而以加入與剌激劑等體積的10%1640作為組內對照，每樣本各種刺激均設3個復孔。然后向每孔中加混勻后脾淋巴細胞懸液50^d,使每孔中培養液總體積為lO(Hil,細胞濃度為2xl04/100W,隨后置于5。/。37。C培養72h。每孔加入10|ilwst，繼續培養4h。用酶標儀測定450nm吸光值，取3個孔平均值，計算刺激指數(SI)。所得數據進行統計學分析(數據的描述釆用5C土SD，組間比較采用非配對t檢驗)。復合多表位聯合免疫組SI指數顯著高于對照組(p<0.05)和其它幾個免疫組，說明該組小鼠整體細胞免疫水平最高。證實表位盒的添加可以發揮相應功能，引起全面的免疫應答，有效提高機體細胞免疫功能。③脾T淋巴細胞亞類數量的檢測取制備好的脾臟T淋巴細胞懸液取2xl(^個淋巴細胞于EP管中，加入lml的熒光洗液，1500r/min離心10min，洗滌2次。每管加入FITC標記Anti-MouseCD4單克隆抗體(0.5mg/ml)、PE標記Anti-MouseCD8a單克隆抗體(0.2mg/ml)、CY5/PE標記Anti-MouseCD3e(0.2mg/ml)的熒光洗液200|il重新懸浮細胞，各抗體濃度均按1嗎/106個淋巴細胞。混勻后4。C避光孵育30min。熒光洗液1500r/min離心10min,洗滌2次。最后以用500jLil熒光保存液重懸，上樣檢測。相同方法，同時分別制備各染色抗體單染對照管和空白管。FACS檢測lxl()4個細胞，分別得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴細胞的28數量，所得數據進行統計學分析。復合多表位聯合免疫組無論CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞數量均最高，且復合多表位聯合免疫組CD3+CD4+T淋巴細胞數量顯著高于對照組(pO.Ol),說明該組小鼠機體細胞免疫水平最優，可以推斷表位盒的加入顯著增進了CD3+CD4+T淋巴細胞數量，有助于調節機體整體免疫水平，證實復合多表位的策略是具有顯著優勢4、IFN-yELISPOT檢測每只鼠設3個刺激孔和3個對照孔，刺激孔每孔用50jal流感病毒液(1M0I)刺激，每孔總體積為200nl，細胞數為lxl0V孔，37°C，5。/。C02培養72h。去除培養液，加預冷的去離子水200nl/孔，培養板置冰上10min。lxWashingbuffer洗板5-7次，每次30s,最后一次，在吸水紙上扣干。加入生物素標記的檢測抗體，37。C孵育lh。lxWashingbuffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水紙上扣干。加入稀釋好的酶標抗親和素，37。C孵育lh。1xWashingbuffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水紙上扣干。加入顯色劑AEC液，避光顯色，室溫避光靜置20min;去離子水清洗培養板2次，扣干。放于通風處，室溫靜置10-30min,讓膜自然晾干。ELISPOT板斑點計數，并統計分析。復合多表位聯合免疫組ELISPOT斑點數均顯著多于對照組(p<0.01),復合多表位聯合免疫組斑點數最多，說明該組小鼠脾臟T淋巴細胞分泌IFN-y的能力最強。實施例3H5/H3主導型復合多表位核酸疫苗豬實驗免疫研究1、實驗分組、豬免疫及釆樣將50日齡長白豬30只隨機分6組，每組5只。分為5個免疫組，l個空質粒對照組，組間以不同耳號進行標記。分別于0d、21d、35d，免疫三次。首次免疫每只豬頸部肌肉注射2mgrDNA-殼聚糖納米粒懸29液。以后每次免疫lmgrDNA。分別于0d、14d、21d、35d、45d腹下靜脈釆血，5000r/min離心10min,收集血清，用于ELISA抗體的測定。三免后10天腹下靜脈無菌收集抗凝血用于外周血淋巴細胞分離，檢測細胞免疫指標檢測一淋巴細胞轉化試驗和T淋巴細胞亞類數量分析。收集的正常血液進行血清分離后，用于血清細胞因子含量的測定和HI抗體的測定。2、免疫豬血清ELISA抗體水平檢測將AIVH5、H7、H9標準抗原及H1、H3亞型滅活病毒，4。C過夜包被ELISA板并編號。甩掉包被物，洗滌5次，每孔加封閉液IOOMl，37°C孵育lh。洗滌液充分洗滌5次，每孔加入100^1免疫豬血清(l:IOO倍稀釋)，輕輕震蕩混勻，37'C溫育1.5h。甩干孔內液體，用洗滌5遍，扣干。每空加入l:2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗體100jul，37°C孵育lh。甩干孔內液體，洗滌5遍，扣干。加入新配制的顯色溶液OPD，輕輕震蕩混勻，37。C避光顯色15min。最后，加入終止液50pl，輕輕震蕩混勻，終止反應，于492nm測定各孔吸光值。所得數據以AX士SD表示，并進行統計學分析(t檢驗)免疫組ELISA抗體自免疫一周后開始出現，并逐步上升，二免之后穩步提高，三免后迅速提高并達到頂峰，45d時所有免疫組抗體水平均顯著高于對照組(p<0.01)。結果證實，復合多表位聯合免疫組(pVAXl-H5-EHB-H3-M2+pVAXl-NP-ETB)誘生了與單獨表達H5HA的pVAXl-H5組相當的H5亞型ELISA抗體水平。3、豬血清細胞因子檢測取出預包被ELISA板，依照順序對應加入100^1的標準樣品于空白微孔中。分別標記不同組別豬血清樣品，力口lOOpl于空白微孔中，每樣本均設2個復孔。隨后，在標準品和樣品孔中加入50pl的酶標記溶液。37匸下孵育60min。棄去孔內液體，加入200^1洗滌液洗板5次，每次靜置l-2min。棄去孔內液體，每孔加入底物A、B液各50pL,37。C下孵育15min。最后，每孔加入50(il終止液，終止反應。于450nm的酶標儀上讀取各孔OD值。根據試劑盒說明分別繪制標準曲線，并計算各樣品的細胞因子含量。所得數據以AX土SD表示，并進行統計學分析。三免后10d，釆集免疫豬外周血，釆用細胞因子ELISA試劑盒檢測血清中IFN-y和IL-4含量。各免疫組IFN-y水平均顯著高于對照組(p<0.01)。其中雙亞型聯合免疫組IFN-y水平最高，顯著高于H3免疫組、H5免疫組和雙亞型免疫組(pO.05或0.01)，說明與NP聯合免疫，有效刺激了T淋巴細胞IFN-y分泌。而與復合多表位聯合免疫組相比，差異不顯著。復合多表位聯合免疫組血清IL-4水平顯著高于雙亞型聯合免疫組(p<0.05)和其它免疫組(p<0.01),說明該組豬Th2細胞功能顯著增強。4、細胞介導的免疫應答檢測外周血淋巴細胞懸液制備無菌條件下取10ml豬抗凝血，在其中加入10ml無血清1640,混句。將混合好的豬血緩慢移入已有20ml豬淋巴細胞分離液的離心管中，2000r/min離心15min。小心吸取中間層(淋巴細胞層)5-8ml至滅菌的10ml離心管中，加入5ml含5%血清1640培養液混勻，1500rpm離心10min,洗滌2次。棄上清，加入2ml5。/。1640重懸細胞。計數，調細胞數至lxl(^個/ml，備用。②外周血T淋巴細胞轉化試驗(WST法)于96孔板中每孔分別加入用10%1640稀釋好的ConA(2.5ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50ul，同時設細胞中不加刺激物孔,而以加入與刺激劑等體積的10%1640作為組內對照,每樣本各種刺激均設3個復孔。然后向每孔中加混勻后豬外周血源淋巴細胞懸液50ul，使每孔中培養液總體積為lOOul,細胞濃度為2xl0Vl00ul，隨后置于5。/。37。C培養72h。每孔加入10ulwst，繼續培養4h。用酶標儀測定450nm吸光值，取3個孔平均值，計算刺激指數(SI)。所得數據進行統計學分析。復合多表位聯合免疫組SI指數最高，說明該組豬整體細胞免疫水平最高。其SI指數顯著高于雙亞型免疫組、H5免疫組、免疫組H3(p<0.05),但與雙亞型聯合免疫組差異不顯著，證明與NP聯合免疫策略，可以引起更為全面的免疫應答，有效提高了機體整體細胞免疫水平。③外周血T淋巴細胞亞類數量的檢測制備好的豬外周血T淋巴細胞懸液取2"06個淋巴細胞于EP管中，加入lml的熒光洗液，1500r/min離心10min，洗滌2次。每個樣品分為兩份，一份加入PEConjugatedMouseAnti-PigCD8a和FITCConjugatedMouseAnti-PigCD3e，一份加入PEConjugatedMouseAnti-PigCD4a和FITCConjugatedMouseAnti-PigCD3e。均以熒光洗液200ul重新懸浮細胞，各抗體濃度均按lug/106個淋巴細胞。混勻后，4"C避光孵育30min。熒光洗液1500r/min離心10min,洗滌2次。最后以用500)al熒光保存液重懸，上樣檢測。相同方法，同時分別制備各染色抗體單染對照管和空白管。FACS檢測lxl(^個細胞，分別得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴細胞的數量。所得數據進行統計學分析。復合多表位聯合免疫組CD3+CD4+T淋巴細胞數量顯著高于雙亞型聯合免疫組(P<0.05),說明該組豬機體細胞免疫水平最優。而其CD3+CD4+與CD3+CD8+比值低于雙亞型聯合免疫組，可以推斷表位盒的加入顯著增進了CD3+CD4+T淋巴細胞數量，在提高了機體整體免疫水平的同時，展示了Th2細胞免疫傾向的上調作用。上述實驗表明，本發明設計的流感復合多表位DNA疫苗具有良好的抗原性和免疫原性，能夠誘導BALB/c小鼠產生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細胞免疫反應。同時，該疫苗轉染人外周血來源DC細胞后，與自體人T淋巴細胞共培養后，可刺激細胞產生特異性體液免疫和細胞免疫應答，表明疫苗在人體中應用的可行性。本發明所制備的復合多表位疫苗無論在誘導體液免疫和細胞免疫方面都具有顯著的優勢的，而表位組分的加入在增進表位亞型特異性的細胞免疫反應上顯示了優勢。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所<120〉流感復合多表位DNA疫苗及其應用<130〉KHP09112908.0<160〉33<170>Paterrtlnversion3.5<210>1<211>426<212>DNA<213〉人工序列<400〉1gccgccaccatggg肌tgcaggtgc卿tccagagcctgtttctgctcctcctgtgggtg60cccggctccatctgggatttgtgttcacactcgccgcatacattctggga120tttgtgttcacactcaccgtgaaagctgctgccaagttcgtcgctgcctggaccctgaag180gctgccgctaaagcagcctgtgtg肌tggctcttgcttcactgtgaaagcsgccgcacaa240attgccatcttgataactactgtgacagctgcatacattacaggatttgcacctttttct300aaggctgccgcctctctctgtcctatccgctaggcgcagcagcctctatc360atcccttcaggccccctc犯agccgctgcaatC3tgga/taagaacatcat3ctg犯ggca420gccgcc426<210〉2〈211〉561〈212>腿<213〉人工序列<400〉2tacatttggggagttcaccaccctgttgcagcagcc肌attggc獄郷gatgcgg肌t60gtg犯ggcagccgccaacgtgacta/tgccaaa犯ggctgccgcatgtctg120"tagCCCCELCtgaatgccgccgctgaactgagggagcaattgagttcagtg180aaagccgccgctgtgacagcagcatgctcccatgccgg犯aagctgccgccacactgaca240tccctgtgaatgctgctgcatacatcgtcgcgccgttaaa300gccgctgcaaatgtgtcttacagtgg肌caagcaaagccgcagccacactgactgaaaga360ggagtgg肌gttaaggccgctgccaaactgt3Cggg3gtggaagcaagctg犯agccgca420gctac兆tggagcggacaaacattcctagagcagcagctacaatcatggaaaagaacgtt480actgttgccgcatacaccatcgggg犯tgccccaaa/tatgtg犯tgctgctgccacactg540tggtgccaaa561〈210>3<211〉1356<212〉DNA<213〉人工序列<400>3gccaccatgggcagatccagagcctgtttctgctcctcctgtgggtgccc60gggtcc卿ggaaaaagatggataatcctgggatt犯a/taaatgtatgga120cccgggcctggcaatgtacc郞agaaac犯3Ct3g鄧gC6Ltatttggcgc組cgcgggt180gacccgggcctg'gcagca犯gcctacagcaactgttacccttatgatgtg240ccggattatgcctcccttggacccgggcctggctgtcccagc犯犯cact300ctgaaattggggccggacccgggcctggcagggccctcta360aatgcttatgtctctgtagtgtcttcacattatggacccgggcctggcaaggaatcatgg420tcctacattg"tagaaacaccaMggacccgggcc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2日發明者南文龍,張金雙,昌李,霄李,田明堯,磊譚,趙翠青,金寧一,金擴世,魯會軍申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所