人源抗人干擾素α抗體及其應用的制作方法

專利名稱：人源抗人干擾素α抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療用人源基因工程抗體的制備及應用，尤其是特異性針對系統性紅斑狼 雍(Systemic lupus erythematosus , SLE)的治療靶蛋白人干擾素a(huIFN-a)，具有中和狼 雍病人血液中和huIFN-a升高引起的全身性疾病的治療用基因工程抗體。
背景技術：
利用抗體分子的阻斷作用研發的抗體藥物是近年來生物醫藥領域中發展起來的新生 力量。據統計，自1984年第一個基因工程抗體人-鼠嵌合抗體OKT3誕生以來，目前經FDA 批準上巿的有約20種基因工程改造的抗體藥物，另有150種正在進行臨床研究階段，預 計到2008年，抗體藥物收入將占到整個生物技術類產品收入的30%,所以它們在針對腫 瘤、心血管、自身免疫性疾病等的治療上有著極其廣泛的應用前景。
回顧治療性抗體的研究歷程，早期的鼠源性抗體由于其相對于人類的異物性已經不適 用于臨床，所以制備人源性抗體(全人抗體)是目前治療性抗體研發的主要策略。在人源 性抗體研究領域，人源抗體制備技術主要有人源抗體庫技術(天然、半合成和全合成)， 轉基因小鼠、人-人雜交瘤技術、人B細胞永生化技術等。利用噬菌體抗體展示庫技術制 備人源抗體庫是其中主要的方法之一。采用噬菌體抗體庫技術篩選抗體不必進行動物免 疫，易于制備稀有抗原的抗體及篩選全人源性的高親和力抗體。人源抗體庫可進一步分為 免疫庫和非免疫庫。在一些急性感染性疾病痊愈患者外周中如果存在高滴度的中和抗體， 那么可以通過獲得有效免疫的人抗體庫，篩選獲得所需要的抗體，這當然是最理想的。但 對于癌癥、自身免疫疾病和心血管疾病等的關鍵靶分子往往是由自身抗原組成，或者很難 在體內誘導有效的免疫應答，或者其作用機理是和免疫阻斷有關，所以非免疫抗體庫在餘 選針對與這些疾病相關的靶分子的治療性抗體中具有更廣泛的應用性。非免疫抗體庫包括 天然大容量抗體庫和合成抗體庫，它是一種不經過免疫就能獲得針對某種抗原的基因工程 抗體的技術。2000年AchimKnappik詳細報道了構建人源全合成抗體庫的方法，并構建了 庫容量為2x 109的全合成抗體庫。非免疫抗體庫特別是合成抗體庫技術在篩選治療性抗體 藥物方面顯示了良好的前景。
系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種以產生核抗體為特征，并形成免疫復合物沉積于組織， 激活補體，造成組織損傷的一種多系統受累的疾病。SLE病人的發病特點是復發與緩解交 替出現。其發病機制目前仍不是很清楚。很久以來人們就發現SLE患者的血清中，I型干 擾素的水平明顯升高，而且升高的程度與病情的進程具有很強的關聯性；而穩定期的SLE病人或SLE易感者，在病毒感染后可能會復發或發生SLE,這一現象提示可能與病毒誘導 大量IFN-a的產生有關。在動物實驗中，當未發病的NZB/W子一代小鼠中被注射IFN-a 后，則可以迅速導致這些小鼠產生嚴重的類似于SLE的病理特征，由此直接證實了 IFN-a在實驗性SLE發病中的作用。由于IFN-cc本身具有多種免疫調節作用，所以SLE患者 (特別是活動期患者)外周中高水平的IFN-a可能通過作用于多種免疫細胞，如T細胞、 B細胞參與SLE發病中的多種臨床表現。雖然目前對于SLE患者外周中高水平IFN-ot產 生的確切機制尚不明確，但是IFN-a和SLE臨床的密切關系使其成為SLE臨床治療中重 要的耙點分子，通過設計分子阻斷IFN-a和受體結合，有望起到緩解和治療SLE的目的。 利用抗體庫技術研究開發抗huIFN-a的基因工程治療性抗體是獲得治療系統性紅斑 狼洛的有效的抗體藥物有效途徑。目前，國際上有一例通過對鼠源抗huIFN-a抗體進行人 源化改造，目的是得到治療胰島素依賴的糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus , IDDM) 和 SLE 的抗體藥物的報道(Anan Chuntharapai, Jadine Lai, Xiaojian Huang et al. Characterization and humanization of a monoclonal antibody that neutralizes human leukocyte interferon: a candidate therapeutic for IDDM and SLE. CYTOKINE. 2001. 15: 250-260 )。但鼠 源抗體的人源化改造尚不能完全消除宿主產生抗抗體引起的過敏反應。美國的Medarex公 司釆用轉基因鼠技術，將人的抗體基因轉入小鼠中，這種技術與單克隆抗體技術結合，得 到了大量全人源的單克隆抗體，其中也包括針對huIFN-a的全人源的單克隆抗體(歐洲專 利號EP1781705，美國專利號20070014724),得到可以治療自身免疫疾病(如SLE)和免 疫排斥反應的藥物。目前Medarex公司開發的其中一株全人源的單克隆已經進入了二期臨 床試驗。以轉基因鼠技術為平臺篩選人源單克隆抗體，可以有效得到治療用的人源單抗， 繞過了對鼠源抗體進行人源化的技術瓶頸，加快了治療用單抗的研發效率。但是獲得整合 了人抗體基因的轉基因鼠從技術上講難度較大，相比較而言，從全合成抗體庫中得到的人 源抗huIFN-alb抗體，技術難度相對較低，獲得抗體的時間短，而且獲得的人源抗huIFN-alb 的單抗，也能顯著減少過敏反應，增加抗體穩定性和生物學活性，也將成為有效治療系統 性紅斑狼港的抗體藥物。

發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種人源抗人干擾素a抗體及其活性片段。
本發明的第二個目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的基因。
本發明的第三個目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備治療干擾素過量引起的
疾病的藥物中的應用。
本發明運用噬菌體表面呈現技術，從已構建的全合成人源單鏈抗體庫中，通過多輪的
生物淘洗(bio-panning),篩選獲得特異性抗人干擾素a (huIFN-a)的單鏈基因工程抗體(single chain variable fragment, scFv)。餘選獲得的scFv抗體包括9株scFv抗體，分別命名 為AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3、 AIFNalscFv4、 AIFNalscFv5、 AIFNalscFv6、 AIFNalscFv7、 AIFNalscFv8、 AIFNalscFv9。
這9株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區中的高變區(CDRs)的特異性 基因序列決定的，并在原核細胞中獲得有效表達的特異性結合人干擾素(x(huIFN-a)的功能 性抗體。它們特異性識別人干擾素alb(huIFN-(xlb)抗原，其中有3株針對人干擾素 huIFN-alb,與huIFN-alb具有明顯的免疫雜交反應(Western Blot, WB )和酶聯免疫(ELISA ) 反應，具有阻斷huIFN-alb與受體結合的中和活性功能。
AIFNalscFvl 、 AIFNalscFv2 、 AIFNalscFv3 、 AIFNalscFv4 、 AIFNalscFv5 、 AIFNalscFv6、 AIFNalscFv7、 AIFNalscFv8、 AIFNalscFv9特異性的輕鏈和重鏈可變區基 因來源于人源全合成抗體基因庫的特異性富集篩選。其輕鏈和重鏈可變區相應的三個CDR 區序列組合及其CDR區之間框架區序列組成了每個抗體可變區序列特征，AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3、 AIFNalscFv4、 AIFNalscFv5、 AIFNalscFv6、 AIFNalscFv7 隸屬于抗體重鏈家族VH3,抗體輕鏈家族VL1， AIFNalscFv8、 AIFNalscFv9隸屬于抗體 重鏈家族VH3，抗體輕鏈家族VL3 。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區 的決定族互補區域CDR1、 CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補所決定，6個相應 的CDR區氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區域，決定本發明中每個抗體的抗原 結合特征和抗huIFN-alb功能特征。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區氨基 酸詳細序列及其比較結果如圖2所示，圖中"-"符號表示與第一行抗體序列相同的氨基酸， 陰影部分為CDR區。
在本發明中，抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區氨基酸序列分別如以下各組所示SEQ ID No.l和2所示的氨基酸序列、SEQ ID No.3和4所示的氨基酸序列、SEQ ID No.5和6 所示的氨基酸序列、SEQIDNo.7和8所示的氨基酸序列、SEQ ID No.9和10所示的氨基 酸序列、SEQIDNo.ll和12所示的氨基酸序列、SEQIDNo.13和14所示的氨基酸序列、 SEQ ID No. 15和16所示的氨基酸序列以及SEQ ID No. 17和18所示的氨基酸序列。
應當理解，在不影響抗體活性的前提下，本領域技術人員可根據序列表SEQ ID No.l 18所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等 功能的氨基酸序列，例如在非高變區將具有類似性質的氨基酸進行替換。本發明包括所述 的抗體經過改造得到的各種衍生抗體。氨基酸的替換按如下各組進行
組1: leucine (亮氨酸)，isoleucine (異亮氨酸)，norleucine (正亮氨酸)，valine (纈 氨酸),norvaline (正纈氨酸)，alanine (丙氨酸),2-aminobutanoic acid (2-氨基丁酸)， methionine (蛋氨酸),O-methyl serine (2-甲基絲氨酸),t-butyl glycine (叔丁基甘氨酸),
6t-butylalanine (叔丁基丙氨酸)，cyclohexylalanine (環己基丙氨酸)；組2: aspartic acid (天 門冬氨酸)，glutamic acid (谷氨酸)，isoaspartic acid (異天門冬氨酸),isoglutatnic acid (異 谷氨酸),2- aminoadipic acid ( 2-氨基己二酸),2-aminosuberic acid ( 2-氨基辛二酸)； 組3:asparagine (天門冬酰胺)，glutamine (谷氨酰胺)；
組4: lysine (賴氨酸),arginine (精氨酸),ornithine (烏氨酸),2,4-diaminobutanoic acid (2,4-二氨基丁酸),2,3-diaminopropionic acid (2,3-二氨基丙酸);
組5: praline (脯氨酸)，3-hydroxyproline ( 3-羥基脯氨酸)，4-hydroxyproiine ( 4-羥基
脯氨酸)；
組6: serine (絲氨酸)，threonine (蘇氨酸)，homoserine (高絲氨酸)； 組7 : phenylalanine (苯丙氨酸)，tyrosine (酪氨酸)
組內各氨基酸之間的替換并不改變抗體蛋白的活性，由這些改變得到衍生抗體。 此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下， 對編碼上述抗體的基因序列進行修改，獲得編碼相同抗體的基因。例如本領域技術人員可 以根據表達抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達效率。
可將上述編碼單鏈抗體的基因克隆到表達載體中，進而轉化宿主，通過誘導表達-獲得 單鏈抗體。
此外，可將上述抗體的輕鏈編碼基因和重鏈編碼基因分別克隆到全抗表達載體中，并 導入宿主細胞中，獲得表達抗干擾素a的全抗免疫球蛋白。
在本發明實施例中，將上述3株scFv抗體(AIFNalscFvl 、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3 ) 的輕鏈和重鏈基因，分別克隆入全抗體表達載體pAC-K-CH3并轉染昆蟲Sf9細胞，利用 桿狀病毒八l蟲細胞系統實現了全抗體的分泌型表達，得到全抗體AIFNal IgGl、 AIFNal IgG2和AIFNal IgG3。
用ELISA和Western Blot對所獲人源單抗的免疫學特性進行鑒定。結果表明三株人源 單克隆抗體均特異性針對huIFN-alb，而對其他結構相近的干擾素家族抗原如huIFN-a2b 和huIFN-Y則沒有反應性。Western Blotting實驗結果也表明，3株抗體只特異性識別變性 的huIFN-alb蛋白。
采用體外細胞學實驗測定了所獲得的三株全抗體的免疫中和活性，結果顯示其中一株 具有拮抗基因工程來源的huIFN-alb和系統性紅斑狼瘡患者外周血清介導的干擾素刺激基 因的表達上調。
本發明在國際上首次獲得9株抗huIFN-alb的scFv噬菌體抗體，并在原核與真核系 統中表達了 3株scFv段抗體及其全抗體，完成了全抗體體外免疫調節功能的檢測，這一結 果的獲得為系統性紅斑狼瘡的治療帶來了希望。利用上述獲得的人源中和性抗huIFN-alb基因工程抗體可變區基因以及上述每個抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細胞、 酵母細胞、真核細胞及任何重組系統中表達和生產此抗體或以此為基礎的改建后的含有此 抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和huIFN-alb免疫學活性的抗體產物，制成臨床上 用于治療由系統性紅斑狼瘡病人體內外周huIFN-alb過量引起的全身性疾病的特異性抗體 藥物，從而為治療系統性紅斑狼瘡提供新的手段。基于上述抗體基因及其直接或間接的基 因產物，可制成注射型抗體制劑用于人體內由干擾素過量引起的多種自身免疫疾病的治 療。


圖1顯示的是phage-ELISA驗證9株噬菌體單鏈抗體對huIFN-alb的結合特異性； 圖2顯示的是本發明抗人IFN-alb抗體可變區氨基酸序列的比較圖； 圖3顯示的是ELISA檢測5株單鏈抗體的結合特性； 圖4顯示的是用Western Blot檢測原核表達的3株單鏈抗體的結合特性； 圖5顯示的是用Pull Down檢測表達的株人的特異性結合情況圖； 圖6顯示的是純化后IgG的SDS-PAGE電泳圖； 圖7顯示的是ELISA檢測5株IgG全抗體的結合特性； 圖8顯示的是用Western Blot檢測表達的3株人的特異性結合情況圖； 圖9顯示的是IFN-cx及抗huIFN-alb抗體處理正常人PBMCs后IFN-cc誘導基因 ISG15的變化情況；
圖10 IFN- oc及抗huIFN-alb抗體處理正常人PBMCs后IFN- a誘導基因ITIF-1的變
化情況；
圖11顯示的是加入SLE病人(IFN-a升高)及正常人血清并用抗huIFN-alb抗體中 和后正常人PBMCs中IFN-ct誘導基因ISG15的變化情況。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發 明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的 范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。 實施例l
本例運用噬菌體表面呈現技術，構建了人源全合成基因工程抗體文庫。用純化的 huIFN-alb對全合成噬菌體抗體庫進行富集篩選，并在￡. co/Z中進行分狄表達。通過 ELISA 、 Western Blot及Pju 11 Down鑒定scFv抗體對huIFN-alb特異性結合的功能活性，
8并進行序列測定。然后將陽性克隆的輕鏈和重鏈可變區基因，分別克隆入全抗體表達載體 pAC-K-CH3轉染昆蟲Sf9細胞，利用桿狀病毒八S蟲細胞系統實現全抗體的分泌型表達。 用ELISA和WestemBlot對所獲人源單抗的免疫學特性和免疫調節功能進行鑒定。
材料與方法
1. 細胞、載體和抗原制備
人源全合成抗體庫由軍事醫學科學院構建(杜威世，王雙，孫志偉等.全合成人源性噬 菌體抗體庫的構建.軍事醫學科學院院刊，2006, 30:319-322),篩選抗體庫的抗原為原核 構建表達純化的huIFN-alb (濃度為lmg/ml),菌株為XLI-Blue (美國Stratagene);所 用噬菌體為M13K07 (美國Invitrogene公司)。桿狀病毒表達載體為pAC-K-CH3 (德國 PROGEN PR3003 ) (Liang, M. F., Stefan, D., Li, D. X.， Queitsch, I" Li, W., and Bautz， E. F. Bac(xlovirasexpression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage displayselected antibody fragments. Journal of Immunological Methods.247: 119-130.), 昆蟲 細胞Sf9及293T細胞來自美國細胞培養中心(ATCC) 。 huIFN-alb的構建與表達參考了 文獻(李武平,呂宏亮,侯云德等.干擾素-pib的高效表達、純化及抗病毒活性研究.病毒學 報,2002年第03期)，并作了修改，具體方法如下PCR擴增人干擾素alb (huIFN-otlb) 基因序列，測序鑒定后，將其克隆入原核表達載體pET30a(美國invitrogen)，通過將重組質 粒轉化大腸桿菌RossetaTM(DE3)進行蛋白表達。表達的huIFN-a 1 b經Ni金屬螯合親和層析純 化。
2. 噬菌體抗體庫的富集篩選
篩選抗原為huIFN-alb,使用時用lxPBS (NaCI 8g , KC1 0.2g ， Na2HP04 1.44g , KH2PO4 0.24g溶于800mlddH2O中，用HCl調pH至7.4,定容到1L)稀釋至工作濃度，包被免 疫管。富集篩選方法基本按文獻進行(杜威世，王雙，孫志偉等.全合成人源性噬菌體抗體 庫的構建.軍事醫學科學院院刊，2006, 30:319-322),具體如下
用lxPBS稀釋的純化huIFN-alb抗原(10嗎/ml)溶液包被免疫管，每孔lml, 4'C過夜； 次日用lxPBST ( lxPBS， 0.05%Tween20, pH7.2)洗去未吸附的抗原，用含4。/。BSA蛋白的 lxPBS溶液37'C封閉1小時，棄封閉液；每孔加入90^il噬菌體抗體庫(MOI為1012，各子庫 按庫容量以l: l混合投入篩選)，37'C孵育2小時，棄去孔中未結合的噬菌體，并用1.5ml 的lxPBST水平震蕩洗滌(450rpm)，共10遍，以充分去除未吸附的噬菌體；最后用"PBS 洗三遍，吸凈孔中的液體；后每孔加入lmlGlycine-HCl(100mM, pH2.2)的洗脫液，室溫震 蕩洗滌(600rpm) 10分鐘。加入適量的2MTris-HCl(100mM， pH=2.2)，以中和含唾菌體的 洗脫液；將洗脫的噬菌體立即加入5 ml新鮮制備的XLI-Blue菌液中(OD6W) = 0.7 ),室溫孵育15-20分鐘；然后150rpm, 37匸震蕩培養1小時，立即取IO lal涂布含CTG(100嗎/ml氯霉 素，40嗎/ml安芐青霉素，40mM葡萄糖)的LB培養平皿用以滴定噬菌體；其余細菌根據噔 菌體的產出量涂CTG培養平板，37。C細菌培養箱培養過夜。次日用涂布棒將平板上長出的 細菌全部刮下，取部分刮下的細菌加入到100ml的CTG液體培養基中至OD60(^0.3，繼續培 養細菌至濃度達到OD600K).5,加入輔助噬菌體M13K07(滴度為1012/1111)20(^1, 37。C靜置 15-20min后，37。Cl50rpm振蕩培養l小時，加入卡那霉素(終濃度50嗎/ml), 37。C培養過夜。 將培養過夜的細菌懸液6500rpm離心15min,收集細菌培養上清，將上清轉入干凈的三角燒 瓶中，加入4。/。的PEG8000,3。/。的NaCl，充分溶解后冰洛30min以上。9000rpm離心20min, 棄上清。沉淀用PBS溶解，冰洛15min, 12000rpm離心5min,得到的上清即為第一輪富積 得到的抗體庫，將上清轉入Eppendorf管中，力口3。/。的BSA凍存備用。滴定噬菌體滴度后， 進行下一輪篩選。如此反復篩選3次。挑取第三輪富集篩選得到的克隆，采用phage-ELISA 對噬菌體抗體的結合活性進行鑒定，對鑒定得到的陽性克隆，測序獲得抗體基因序列。
3. scFv段抗體的誘導表達與純化
人源中和性抗huIFN-alb基因工程scFv抗體可溶性表達產物的制備基本按文獻進行 (Timothy J. LaRocca, Laura I. Katona， David G. Thanassi et al. Bactericidal Action of a Complement-Independent Antibody against Relapsing Fever Borrelia Resides in Its Variable Region. The Journal of Immunology, 2008, 180: 6222 -6228 ),具體為將帶有陽性抗體輕、 重鏈基因插入的陽性克隆擴增后按常規方法提取質粒DNA,并用5'端分別帶有NcoI和Xho1 的PCR引物擴增scFv抗體基因(上游引物scFv-pET22-L : CATGCCATGGCCGATATCGTTCTGAC, 下游 引 物scFv-pET22國R : CCGCTCGAGGCTCGACACGGTCACCAGAG) , PCR片段回收后經NcoI和XhoI酶切，與 相同雙酶切的pET22b載體片段連接，獲得重組單鏈抗體表達質粒，轉化BL-21 (DE3)感 受態細胞，過夜培養后，挑取氨節抗性的陽性單個菌落，接種2xYT細菌培養液擴大培養， PCR鑒定片段插入完整后，以l/100比例將陽性工程菌在新的2xYT細菌培養液中培養至 006()。 = 0.7時，加入20pM IPTG， 2(TC誘導表達過夜。收獲細菌，離心后棄上清，在沉淀 中加入原培養液1/10體積的PBS (0.02MpH7.4)重懸，反復凍融三次，4'C 12000 rpm離心 30分鐘，上清中含有誘導表達的scFv抗體，可用于進一步的免疫學特性鑒定。陰性對照為 載體pET22b轉化菌按同樣方法制備的細菌裂解液。單鏈抗體的純化采用Ni金屬螯合親和層 析法，按試劑盒中的常規步驟進行。
4. 人源抗huIFN-alb單鏈抗體的免疫學特性檢測
4.1 phage-ELIS A檢測scFv噬菌體抗體的表達
用0.1M NaHC03 ( pH9.6 )的包被液稀釋huIFN-alb2嗎/mL,取10(Htl加入聚氯乙烯96
10孔平底板中，4'C包被過夜；4%脫脂奶封閉，37'C孵育lh后，棄上清，加入表達的scFv噬 菌體抗體，37。C孵育lh后，PBST洗滌三次，加入酶標抗M13二抗(美國Sigma， l:4000稀 釋使用)，37。C孵育lh; PBST洗滌五次后，加入IOO L顯色液(A+B )顯色，最后加入2M H2S04終止反應，酶標儀檢測吸光度A (450)值。
4.2 Western Blot檢測scFv單鏈抗體的分泌表達
單鏈抗體分泌表達上清經超濾濃縮后進行10%的SDS-PAGE電泳，對應的陰性對照為 載體pET22b轉化菌按同樣方法制備的細菌超濾濃縮的細菌表達上清。采用半干法將聚丙烯 酰胺凝膠電泳后的蛋白質轉移到NC膜。轉膜后對凝膠進行考馬斯亮蘭染色以檢查蛋白質是 否轉移完全。將含標準分子量蛋白的泳道剪下，標注標準分子量參照蛋白位置。將NC膜在 含5。/。脫脂奶粉的lxPBS中室溫封閉2小時，lxPBST洗滌3次后與HPR標記的鼠抗His抗體 (Sigma公司，l:500使用)室溫反應l小時。lxPBST洗滌3次后放入DAB底物顯液色中顯色， 至棕色陽性條帶出現，將NC膜置于雙蒸水中終止反應，干燥后避光保存。
4.3 Western Blot檢測scFv單鏈抗體的結合特異性
采用純化的huIFN-alb、 huIFN-a2b和huIFN-y為抗原用以Western Blotting的方法鑒定單 鏈抗體的結合特異性。具體如下將上述純化的三種抗原(5嗎)經SDS-PAGE電泳后，采 用半干法轉移到NC膜。轉膜后對凝膠進行考馬斯亮蘭染色以檢査蛋白質是否轉移完全。將 標準分子量蛋白泳道剪下，標出分子量標準的參照蛋白位置。對NC膜采用含5。/。脫脂奶室 的lxPBS溫溫封閉2小時。將含有AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3表達產物原液 的 一抗工作液與封閉的NC膜在室溫孵育2小時。1 xPBST洗滌3次后與HPR標記的抗His抗體 (Sigma公司，1:1000使用)室溫反應l小時，lxTBST洗滌3次后，放入DAB底物顯液色中， 至棕色陽性條帶出現，將NC膜置于雙蒸水中適時終止反應，干燥后避光保存。
4.4 P[ill Down檢測scFv單鏈抗體的結合特異性
將50嗎/ml單鏈抗體與100昭/ml huIFN-alb于4。C孵育l小時，后加入4叱的Ni-resin (結 合蛋白的能力為8pg/ial)繼續孵育l小時，3000rpm離心5min，棄上清，沉淀以"PBS洗滌， 3000rpm離心5min收集沉淀，如此洗滌3-5遍后，用20nl lxPBS重懸沉淀，并加入蛋白上樣 緩沖液煮沸處理5分鐘，并進行15。/。SDS-PAGE電泳，然后常規的考馬氏藍染色和脫色后檢
5. 人源scFv單鏈抗體可變區基因的核酸序列分析
用Qiagen Miniprep Kit (德國QIAGEN)制備質粒DNA進行核酸序列分析。測序引物為 5'-AGCCCACCTCAACGCAATT-3'。測序結果和Internet V-Base基因庫中抗體基因序列進
行序列比對。
6. 全抗體重組表達質粒的構建將獲得的scFv抗體的重鏈(SEQ ID NO.20、 SEQ ID N0.22、 SEQ ID N0.24、 SEQ ID N0.34、 SEQIDN0.36)以引物(VH3L:gtaactcgagAGCGGTGGCGGTCTGGTG, VHR: gaagctagcGCTCGACACGGTCACCAGAGTG) PCR擴增后用Xhol/Nhel雙酶切，連接入 pAC-K-CH3載體(德國PROGENPR3003 ),再將輕鏈(SEQ IDN0.19、 SEQIDN0.21、 SEQIDN0.23、 SEQIDN0.33、 SEQIDN0.35)以引物 (vy31:gtaagagctcACCCAGCCGCCGAGCGTG, VY1L: gtaagagctcACTCAACCT CCGTCTGTTTCTGG, VY3R: CTTGAAGCTTGGTGCCACCGCCAAAC ) PCR擴增后 經Sacl/Hindlll位點連接進去，構建成全抗體表達載體。
7. 轉染和擴毒
采用美國Pharmogen公司的Ba印loGold共轉染試劑盒進行轉染。搡作方法略述如 下將5嗎的重組質粒DNA與0.5ng的Ba印loGold線性DNA混合后，并加入轉染試劑轉 染生長密度為50。/。的Sf9細胞，27'C培養4天后，收集含有重組病毒的毒種細胞培養上清進 行病毒滴定和擴增。具體操作見Bacnlovirus expression vector system手冊。
8. 全抗體IgG分泌表達和純化
將重組病毒感染生長密度70%左右的Sf9細胞，27。C吸附lh.改用SF-900II無血清培 養液，27。C培養3 5天后收集上清。并采用Protein-A親和層析法(Amersham，美國)直接 純化誘導表達上清(Harlow E , Lane D."Antibodies : A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor ,NY,1988.)。
9 .抗huIFN-alb人源IgG抗體的免疫學特性檢測
9.1 昆蟲細胞表達IgG抗體的免疫熒光(IFA)檢測
利用已獲得的抗人huIFN-alb的IgG全抗體基因的重組質粒，轉染Sf9細胞，經過3次擴 增獲得重組桿狀病毒，感染Sf9細胞，27。C培養約4-5天，收獲細胞，lxPBS洗滌一次，滴 加至載玻片上，吹干，在丙酮中固定15min并干燥，制成病毒抗原片。滴加FITC標記的抗 人IgG-Fc抗體溶液(美國Sigma， 1:80), 37。C溫育30min后，lxPBS沖洗，晾干，顯微鏡 下觀察Sf9細胞的熒光表達率和表達強度，陰性對照細胞為轉染空載體的sf9細胞。
9.2 IgG全抗體特異性結合huIFN-a 1 b的ELIS A檢測
用0.1MNaHCO3 (pH9.6)的包被液稀釋huIFN-otlb、 IFN-a2b、 IFN個BSA至2嗎/ml， 取100nl加入聚氯乙烯96孔平底板中，4"包被過夜；4%脫脂奶封閉，37。C孵育lh后，棄上 清，加入sf9細胞表達的全抗體IgG上清，37。C孵育lh后，PBST洗滌三次，加入HRP標記 的抗IgG-Fc二抗(美國Sigma， 1 : 1000稀釋使用)，37。C孵育lh; PBST洗滌五次后，加
12入IOO L底物顯色液(A+B)顯色，最后加入2MH2S04終止反應，酶標儀檢測吸光度(A-450)值。
9.3 IgG全抗體特異性結合huIFN-oclb的Western Blotting檢測
將純化的huIFN-alb抗原經SDS-PAGE電泳后，半干法轉移到NC膜。對NC膜在含5 % 脫脂奶粉的lxPBS室溫封閉2小時后，分別置于含AIFNalIgGl、 AIFNalIgG2和AIFNalIgG3 表達產物的一抗工作液中室溫孵育2小時，lxPBST洗滌3次，并于HPR標記的抗IgG-Fc二抗 (Sigma公司，1:1000使用)室溫反應l小時。lxPBST洗滌3次后，置于DAB底物顯液色中， 至棕色陽性條帶出現適時終止反應，避光保存。
10 .抗huIFN-alb人源IgG抗體免疫中和活性的檢測
10.1 抗huIFN-alb人源IgG抗體中和活性檢測
收集正常人新鮮外周血標本，密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞(PBMCs)， 將獲得的PBMCs以1><105/孔的細胞量種入96孔培養板，分別加入合成的人IFN-a U00ng/mL)和不同濃度的抗huIFN-alb抗體(Ojng/mL、 3jug/mL、 12pg/mL) ， 37。C和 5%(:02條件下孵育4小時，后收集細胞，檢測上述不同培養條件下IFN-cc誘導基因(ISG15 和IFIT-1 )的表達差異來評估抗huIFN-alb抗體的免疫中和活性。收集的細胞采用TRIzol 試劑 (Invi加gen公司)抽提RNA,以隨機引物進行逆轉錄(ReverAid M-JV^1V逆轉 錄酶，Fermentas公司)獲得cDNA,并采用實時定量PCR ( SYBR premix Ex Taq , Takara 公司)技術檢測樣本中ISG15和ITIF-1基因的表達。ISG15和IFIT-1的引物序列分別為 ISG15 forward: 5，-GAG AGG CAG CGA ACT CAT CT-3，； Reverse: 5，-AGC TCT GAC ACC GACATGG-3，； IFIT-1 forward: 5，-GCAGAACGG CTG CCT AATTT-3,; Reverse: 5，-TCA GGCATTTCATCGTCATC-3'。 PCR反應的內參基因的引物序列如下GAPDH ( 200nM forward ) 5，-CTGGAACGGTGAAGGTGACA -3， ， ( 200nM reverse ) 5'-
AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA -3，。經7500 Real-time PCR系統(Applied Biosystem) 進行40個循環后計算得到Ct值，以2"a值代表目的基因的相對表達量(-ACt=-(Ct目絲因-Ct 內參基b))。對樣品獲得的數據進行平均值和SD值的統計分析。 10.2抗huIFN-alb人源IgG抗體中和SLE病人血清IFN-a的效應檢測
為了評估抗huIFN-alb抗體是否具有臨床應用的價值，在上述中和活性試驗的基礎上， 本實驗組又利用含升高的IFN-a的SLE病人血清及正常人對照血清(以1/10體積比加入 培養基)處理正常人PBMCs,并加入抗huIFN-alb抗體(24(xg/mL)對血清中IFN-a的作 用進行中和，37"和5%(302條件下孵育4小時后，收集細胞檢測IFN-a誘導基因(ISG15) 的表達差異來評估抗huIFN-alb抗體對血清中IFN-a的免疫中和活性。方法同上，即收集 的細胞采用TRIzol 試劑 (Invitrogen公司)抽提RNA,以隨機引物進行逆轉錄(ReverAid M-MplV逆轉錄酶，Fermentas公司)獲得cDNA,并采用實時定量PCR( SYBR premix Ex TaqTM , Takara公司)技術檢測樣本中ISG15基因的表達。所用ISG15及內參基 因引物序列同上。經7500 R6al-time PCR系統(Applied BiosystSm)進行40個循環后得到Ct 值，以2^值代表目的基因的相對表達量(^^=-((:"的基因-Ct內參基因))。對樣品獲得的數據 進行平均值的統計分析。
1.非高變區突變后的抗體對huIFN-alb抗性的研究
基于AIFNalIgGl輕鏈可變區氨基酸序列，將SEQ ID No.l所示氨基酸序列的第(44) 位的(丙氨酸，A)替換為(纈氨酸，V)，將其重鏈可變區的第(40)位的(丙氨酸，A) 替換為(纈氨酸，V)。分別合成AIFNalIgGl的輕鏈編碼核酸序列(在相應位置將密碼子 GCA替換為GUU或GUG或GUA或GUC )以及重鏈編碼核酸序列(在相應位置將密碼子GCA 替換為GUU或GUG或GUA或GUC)。按照上述6 10的方法，將輕鏈基因和重鏈基因克隆 到pAC-K-CH3中，并轉染昆蟲Sf9細胞，利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統實現全抗體的分泌 型表達，并對該突變體進行免疫學檢測。
結果
1. 人源抗人huIFN-alb抗體庫的篩選
以純化的huIFN-alb (10嗎/ml)為抗原對全合成抗體庫進行條選，經3輪餘選后隨機挑 取1500個克隆擴增培養收集上清。以純化的huIFN-alb抗原(2pg/ml)包被96孔板，加入待 測樣品上清，通過HRP標記的抗人M13二抗(sigma公司，l:4000稀釋使用)檢測待測樣品 中抗體表達陽性率。結果顯示，經三輪篩選后，共獲得300株人源scFv表達陽性克隆。300 株人源scFv表達陽性克隆中，通過phage-ELISA，釆用純化的huIFN-alb、 huIFN-a2b和 huIFN-Y抗原對抗體的結合特異性進行復篩檢測，獲得100個與huIFN-alb特異性結合的克 隆。
2. 人源抗人IFN抗體scFv抗體的序列分析
用DNASTAR、 Mega3.O序列分析軟件進行分析處理，比較Internet V-Base基因庫中的 IgG序列，上述100株人源抗huIFN-alb基因工程抗體中，對86株抗體的序列進行了測序， 86個克隆分別屬于9個不同的抗體序列，共發現9株帶有不同的抗體輕重鏈可變區序列及其 組合的抗體，其重鏈可變區主要分類在IgG VH3家族，其輕鏈可變區主要分類在IgG VL1 和VL3家族。圖2為9株人源抗huIFN-alb基因工程抗體的可變區基因的氨基酸序列及其相 互比較，圖中以第一行抗體序列為比較的標準序列，"-"符號表示與第一行抗體序列相同的 氨基酸，陰影部分為CDR區。具體的，人源單鏈抗體AIFNalscFvl的蛋白序列如SEQ ID NO. 1 和2,單鏈抗體AIFNalscFv2的蛋白序列如SEQIDN0.3和4，單鏈抗體AIFNalscFv3的蛋白 序列如SEQ ID N0.5和6，單鏈抗體AIFNalscFv4的蛋白序列如SEQ ID N0.7和8，單鏈抗體
14AIFNal scFv5的蛋白序列如SEQ ID N0.9和10,單鏈抗體AIFNal scFv6的蛋白序列如SEQ ID N0.11和12,單鏈抗體AIFNalscFv7的蛋白序列如SEQ ID N0.13和14,單鏈抗體 AIFNalscFv8的蛋白序列如SEQ ID N0.15和16,單鏈抗體AIFNalscFv9的蛋白序列如SEQ IDN0.17和18。
3. 人源抗huIFN-odb鬼菌體單鏈抗體的結合特性
為了鑒定這9株不同的噬菌體抗體能否穩定結合huIFN-alb,我們釆用phage-ELISA對9 株抗體的結合特異性和穩定性進行多次驗證，phage-EUSA實驗中采用了3種抗原，分別為 huIFN-alb、 huIFN-a2b和huIFN-y， ELISA測定結果顯示，其中有5株抗體與huIFN-alb結 合的ELISA值明顯高于huIFN-a2b和huIFN-Y,有兩倍以上差異，結果表明，最后獲得5株抗 體(AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3、 AIFNalscFv8、 AIFNalscFv9)能夠穩定 而且特異性結合huIFN-alb，而與無關抗原huIFN-a2b和huIFN-Y無交叉反應，結果見圖l。
4. 人源抗huIFN-alb單鏈抗體的結合特異性
為了進一步證實所獲得的5株重組scFv抗體是特異性的針對huIFN-alb,本發明進一步 通過ELISA、 WesternBlot和PullDown鑒定原核分泌表達的scFv抗體的功能活性。ELISA結 果表明細菌中分泌表達的單鏈抗體AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3與huIFN-alb 反應，但與重組蛋白huIFN-a2b、 huIFN-y不反應，如圖3所示。Western Blotting結果表明 AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3可分別與變性的huIFN-alb反應，但與重組蛋白 huIFN-a2b、 huIFN-Y不反應，如圖4所示。這提示AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3 所針對的huIFN-alb的抗原決定簇為線性抗原決定簇。Pull Down結果表明表明 AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3可與huIFN-alb反應形成復合物，如圖5所示。
5. 全抗體IgG表達和純化
將3株經過結合特異性驗證的scFv抗體(AIFNalscFvl、 AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3) 的輕鏈和重鏈基因，分別克隆入全抗體表達載體pAC-K-CH3轉染昆蟲Sf9細胞，利用 桿狀病毒/昆蟲細胞系統實現全抗體的分泌型表達。采用Amersham公司的Protein-A親和 層析柱直接純化表達上清，通過SDS-PAGE檢驗全抗體IgG的表達及純化情況，結果證實 得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈，分別位于約28KD、 55KD處，通過 非變性的SDS-PAGE分析，得到未解鏈的抗體蛋白，位于150KD處左右，如圖6所示。
6. 人源抗huIFN-alb全抗體的結合特異性
為了證實所獲得的重組IgG抗體(AIFNalIgGl、 AIFNalIgG2、 AIFNalIgG3 )是特異 性的針對huIFN-alb，本發明進一步通過ELISA和Western Blot鑒定全抗體IgG的功能活 性。ELISA結果與驗證scFv抗體功能活性相 一致，純化的全抗體AIFNalIgGl 、 AIFNalIgG2、AIFNalIgG3與huIFN-alb反應，但與重組蛋白huIFN-a2b、 huIFN-丫和BSA不反應，如圖 7所示。Western Blotting結果表明AIFNalIgGl、 AIFNalIgG2、 AIFNalIgG3可分別與變 性的IFN-alb反應。這提示AIFNalIgGl、 AIFNalIgG2、 AIFNalIgG3所針對的IFN-alb 的抗原決定簇為線性抗原決定簇。如圖8所示。
7.人源抗huIFN-alb全抗體的免疫中和活性
為了證實合成的人源抗huIFN-alb抗體是否具有免疫中和活性及對其中和活性進行初 步的評估，本發明將獲得的的抗體(AIFNalIgGl、 AIFNalIgG2、 AIFNalIgG3 )作用于IFN-a 處理過的正常人PBMCs,發現正常人PBMCs在IFN-a的作用下，IFN-a誘導基因(ISG15 和IFIT-1)的表達明顯升高，但是加入抗huIFN-alb抗體后這兩個基因的表達都被明顯的 抑制，并且呈現比較好的劑量依賴性，即隨著加入的抗huIFN-alb抗體的增加，抑制IFN-a 誘導基因表達的作用就越明顯。由此說明本次制備的人源抗huIFN-a 1 b抗體具有良好的中 和活性。其對ISG15和IFIT-1的作用分別如圖9和圖10所示。抗huIFN-alb抗體對血清 中IFN-a的中和作用也很明顯。在病人血清IFN-a的作用下，IFN-a誘導基因ISG15的表 達明顯升高，在抗huIFN-alb抗體的作用下則可降低到正常血清處理或無刺激培養條件下 的基因表達水平，如圖11所示。提示本發明具有良好的治療性應用前景。
8、非高變區突變后的抗體對huIFN-alb抗性影響
按照上述6 10的方法，將基于AIFNalIgGl修改后的輕鏈基因和重鏈基因克隆到 pAC-K-CH3中，并轉染昆蟲Sf9細胞，利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統實現全抗體的分泌型 表達，得到突變體AIFNalIgGl'。對該突變體進行免疫學檢測，ELISA結果表明純化的全 抗體AIFNalIgGl，與huIFN-alb反應，但與重組蛋白huIFN-a2b和huIFN-Y不反應，且親和力 和特異性與AIFNalIgGl'基本相同。Western Blotting結果表明AIFNalIgGl'可與變性的 IFN-alb反應。序列表
<110>中國疾病預防控制中心病毒病所 <120〉人源抗人干擾素a抗體及其應用 <130> KHP09112369. i <歸 50
<170> Patentln version 3. 5
SEQ ID NO. 1
Asplie ValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal ThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal SerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr AspAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu AspGluAlaAspTyrTyrCysGinValArgAspAsnAsnGlu
AsnGlu TrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 2
GluVal GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu ArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet SerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyCeuGluTrpVal
SerAla lieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly ArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr
LeuGin MetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg TyrlieAspPheGlyAspHisMetAspPheTrpGlyGinGly
ThrLeu ValThrValSerSer
SEQID NO. 3
Asplie ValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal ThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal SerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr AspAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer LysSerGlyThrSerAlaSerCeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu AspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerArgAspAspSerAsp
SerLeu LeuValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 4
GluVal GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu ArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet SerTrpValArgGinAlaProGly匕ysGlyLeuGluTrpVal
SerAla lieSerGlySerGlyGlySerThr丁yrTyrAlaAspSerVal
LysGly ArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysThrProCysThr
CysArg GinProAlaCysGlyAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArg
GlySer AspPheGlyAspSerPheAlaPheTrpGlyGinGlyThrLeu
ValThr ValSerSer
SEQID NO. 5
Asplie ValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal ThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsm
TyrVal Ser TrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLeuLeulieTyr AspAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu AspGluAlaAspTyrTyrCysGinAlaArgAspSerGlyVal
GlyAla PheValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 6
GluVal GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu ArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet SerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal
SerAla lieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly ArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr
LeuGin MetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg HisTrpTrpAlaAlaMetAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeu
ValThr ValSerSer
SEQID NO, 7
Asplie ValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal ThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal SerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr AspAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu AspGluAlaAspTyrTyrCysGinValArgAspAsnAsnGlu
AsnGlu TrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 8
GluVal GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu ArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet SerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal
SerAla lieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly ArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr
LeuGin MetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg TyrlieAspPheGlyAspHisMetAspPheTrpGlyGinGly
ThrLeu VaiThrValSerSer
SEQID NO. 9
Asplie ValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal ThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal SerTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr AspAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer LysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu AspGluAlaAspTyrTyrCysGinValArgAspLysGluGlu
PheVal PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 10
GluVal GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu ArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet SerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyCeuGluTrpVal
SerAla lieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly ArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrCeuTyr
18LeuGin Met AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg Asn ValTyrAsnliePheAspAlaTrpGlyGinGlyThrLeu
ValThr Val SerSer
SEQID NO. 11
Asplie Val LeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal Thr lieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal Ser TrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr Asp AsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer Lys SerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu Asp GluAlaAspTyrTyrCysGinAlaLysAspAlaSerLeu
LeuPhe Val PheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 12
GluVal Gin LeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu Arg LeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet Ser TrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal
SerAla lie SerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly Arg PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr
LeuGin Met AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg Gin ThrTyrGlyArgMetAspTyrTrpGlyGinAlaLeuTrp
SEQID NO. 13
Asplie Val LeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin
ArgVal Thr lieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn
TyrVal Ser TrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu
lieTyr Asp AsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer
GlySer Lys SerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGin
SerGlu Asp GluAlaAspTyrTyrCysGinValArgAspAsnAspAsp
PheSer Phe ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 14
GluVal Gin LeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly
SerLeu Arg LeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr
AlaMet Ser TrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal
SerAla lie SerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal
LysGly Arg PheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr
LeuGin Met AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
AlaArg Gin HisTyrSerValPheAlaMaTrpGlyGinGlyThrLeu
ValThr Val SerSer
SEQID NO. 15
SerTyr Glu LeuThrGinProProSerValSerValAlaProGlyGin
ThrAla Arg lieThrCysSerGlyAspAlaLeuGlyAsp乙ysTyrAla
SerTrp Tyr GinGinLysProGlyGinAlaProValLeuVallieTyr
GluAsp Ser LysArgProSerGlylieProGluArgPheSerGlySer
AsnSer Gly AsnThrAlaThrLeuThrlieSerGlyThrGinAlaGlu
AspGlu Ala AspTyrTyrCysGinValArgAspGlySerLeuPheAla
LeuVal Phe GlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuSEQ ID NO. 16
GluValGinI>euValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly Gly
SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSer Tyr
AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrp Val
SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSer Val
LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeu Tyr
LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyr Cys
AlaArgTrpArgArgPhelieArgGlyValAspProTrpGlyGin Gly
ThrLeuValThrValSerSer
SEQID NO. 17
SerTyrGluLeuThrGinProProSerValSerValAlaProGly Gin
ThrAlaArglieThrCysSerGlyAspAlaLeuGlyAspLysTyr Ala
SerTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProValLeuVallie Tyr
GluAspSerLysArgProSerGlylieProGluArgPheSerGly Ser
AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrlieSerGlyThrGinAla Glu
AspGluAlaAspTyrTyrCysGinSerLysSerAlaAlaLeuLeu Arg
ValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
SEQID NO. 18
GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly Gly
SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSer Tyr
AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrp Vsl
SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSer Val
LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeu Tyr
LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyr Cys
AlaArgLeuTrpArgSerLysArgTrpValArgSerLeuGlyGin Gly
Thr二euValThrValSerSer
SEQ ID NO. 19
gatatcgttctgactcaacctccgtctgtttctggtgcaccgggtc咖gtgttactatt60
agctgctctggcagctctagc肌tattggtagt犯ctatgttagctggtatcagc朋ctg120
ccggg化ctgcaccgaaactgctgatttatgataataaccagcgcccctcaggtgttccg180
gatcgttttagtggcagcaaaeigcggtacceigcgctagtctggcaattactggtctgcaa240
agcg鄉atgaggcggactattactgccaggtgcggg自tgagtgggtg300
tttggcggtggC3CC315
SEQ ID NO. 20
gtCtggtgC3gccgggtggcagcctgcgtctgagctgcgc柳gsgcggc60
ttcacctttagcagctacgcgatgagctgggtgcgccaggcaccgggtaaaggtctgg犯120
tgggtgagcgCg3tt3gCggtagcggcggcagcacctactatgcggatagcgtga卿gc180
cgttttaccatctcgcgtgataactcg犯3a^caccctgtacctgcsgatg貼C3gCCtg240
cgtgcgg卿ataccgcggtgtattattgcgcacgttatattgattttggggatcatatg300
gatttctggggtcagggcactctggtgaccgtgtcg柳339
SEQ ID NO. 21
gatatcgttctgactcaacctccgtctgtttctggtgcaccgggtc犯cgtgttactatt60
agctgctctggcagctctagcaatattggtttagctggtatcagcaactg120ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg 180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag tcgcgggatg acagcgattc gttgcttgtg 300
tttggcggtg gcacc 315
SEO ID NO, 22
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa 120
tgggtg鄉g cgattagcgg tagcggcggc 3gc3cctact 3tgcgg3tag cgtg犯aggc 180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa acaccctgta cctgcagatg acagcctgcg 240
tgcgg卿tsL ccgcggtgta ttattgcgca cgtggttctg attttgggga ttctttcgct 300
ttctggggtc agggcactct ggtgaccgtg tcgagc 336
SEQ ID NO, 23
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt 60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg 120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg 180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gcgcgggata gcggcgttgg ggcgtttgtg 300
tttggcggtg gcacc 315
SEQ ID NO, 24
agcggtggcg gtctggtgcei gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa 120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaa鄉c 180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattetttgc gcacgtcatt ggtgggcggc gatggattac 300
tggggtcagg gcsctctggt gaccgtgtcg age 333
SEQ ID NO. 25
gatategtte tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac egggtcaacg tgttactatt 60
agetgetctg gcagctctag c犯tattggt agt肌ctatg ttagctggta tcagc朋ctg 120
ccgggtactg caccg肌act gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg 180
gatcgtttta gtggcagceia aageggtace agegctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agcg鄉atg aggeggacta ttactgccag gtgegggata acaacg卿a tgagtgggtg 300
tttggcggtg gcacc 315
SEQ ID NO. 26
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agectgegix tgagctgege agegetgegge 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgegecagg cacegggtaa aggtctggaa 120
tgggtgagcg cgatt,gg tageggegge agcacctact atgeggatag cgtgaaaggc 180
cgttttacca tctcgcgtga ta^ctcga朋朋caccctgt acctgeagat gaacagcctg 240
cgtgcggaag ataccgeggt gtattattgc geaegttata ttgattttgg ggatcatatg 300
gatttctggg gtcagggcac tctggtgacc gtgtcgagc 339
SEQ ID NO. 27
gatategtte tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac egggtcaacg tgttactatt 60
agetgetctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttegctggta tcagcaactg 120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg 180gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agcga卿tg aggcggacts ttactgccag gtg郷gata agg鄉agtt tgtgtttggc 300
ggtggcacc 309
SEQ ID NO. 28
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa 120
tgggtgagcg cgattagcgg ta^gcggcggc agcEtcctax;t atgcggatag cgtgaaeiggc 180
cgttttacca tctcgcgtga taactcg犯a肌caccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
cgtgcggaag ataccgcggt gtetttattgc gcacgtaatg tgtataatat tttcgatgcc 300
tggggtcagg gcactctggt gaccgtgtcg age ^
SEQ ID NO. 29
gatategtte tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac egggtcaacg tgttactatt 60
agetgetctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg 120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataat朋cc agcgcccctc aggtgttccg 180
gategtttta gtggcagcaa aageggtace agegctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agegaggatg aggeggacta ttactgccag gcgaaggatg ccagcttgct gtttgtgttt 300
ggcggtggca cc 312
SEQ ID NO. 30
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgege agegagegge 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgegecagg.cacegggtaa aggtctggaa 120
tgggtgagCg Cgatt3gCgg t柳ggCggC 3gC3CCt￡tCt 3tgCgg3t3g Cgtg3犯ggC 180
cgttttacca tctcgcgtga taactcg犯a aacaccctgt acctgeagat gaacagcctg 240
cgtgcgg犯g ataccgeggt gtattattgc geaegtcaga cttatgggcg gatggattac 300
tggggtcagg cactctggtg accgtgtcga gc 332
SEQ ID NO. 31
gatategtte tgactc犯cc tccgtctgtt "tctggtgcac egggtcaacg tgttactaXt 60
agetgetctg gcagctctag caatattggt agt犯ctatg ttagctggta tcagcaactg 120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg 180
gategtttta gtggcagcaa aageggtace agegctagtc tggcaattac tggtctgcaa 240
agegaggatg aggeggacta ttactgccag gtgegggata acgacgattt ttcttttgtg 300
tttggcggtg gcacc 315
SEQ ID NO. 32
sgcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc 3gcctgcgtc tg兆ctgcgc 3gCg3gCggC 60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgegecagg cacegggtaa aggtctggaa 120
tgggtgagcg egattagegg tageggegge agcacctact atgeggatag cgtgaaaggc 180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgeagat gaacagcctg 240
cgtgcggaag ataccgeggt gtattattgc gcacgtcagc attatagtgt gttcgctgcc 300
tggggtc犯g gcacixtggt gaccgtgtcg age 333
SEQ ID NO. 33
gLgctacg肌c tgacccagcc gecgagegtg tcggtggcgc egggtcagae cgcgcgtatc 60
acctgctcgg gegatgeget gggcgataaa tacgegaget ggtatcagca gaaaccgggt 120
caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180
ttt3gcggct cg朋ttcggg c^c3ccgcg 3ccctgacca tt兆cggc3c ccaggcgg兆 240gatgaggcgg actattactgccaggtgcgggatggcagcttgtttgctctggtgcttggc300
ggtggC3CC309
SEQ ID NO. 34
agcggtggcg gtctggtgcagccgggtggcagcctgcgtctggtgctgcgcagcgagcggc60
ttcaccttta gcagctacgcgatgagctgggtgcgcc郷C3CCgggtd3鄉tctgg3a120
tgggtgagcg cgattagcggtagcggcggcagcacctactatgcgg由gcgtga卿gc180
cgttttacca tctcgcgtgataactcg犯a aacaccctgtacctgcagatgaacagcctg240
cgtgcggaag ataccgcggtgtattattgcgC3Cgttgg3t鄉ggggtg300
gatccctggg gtc鄉gcactctggtgaccgtgtcgagc339
SEQ ID NO, 35
gccgagcgtg tcggtggcgcCgggtC3g3Ccgcgcgtatc60
acctgctcgg gcgatgcgcttacgcgagctggtatcagcaga犯ccgggt120
caggcaccgg tgctggtgatttacgaag3ttctaaacgcccgtctggcatcccggaacgc180
tttagcggct cgaattcgggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcacccaggcggsg240
g3tg鄧gcgg 3ctettactgccagtcg犯gtctgccgccttgctgagggtgtttggcggt300
ggcacc306
SEQ ID NO. 36
agcggtggcg gtctggtgcagccgggtggcagcctgcgtctg,tgcgcagcgagcggc60
ttcaccttta gcagctacgcgatgagctgggtgcgcc鄉caccgggtaa aggtctgga^120
tgggtgagcg cgattagcggtetgcggcggcagcacctactatgcggatagcgtga犯ggc180
cgttttacca tctcgcgtgataactcgaaa aacaccctgtg肌cagcctg240
cgtgcgg卿由ccgcggtgtattattgcgcacgtttgtgcggtgggtt300
cgatccctgg ggcaaggcactctggtgaccgtgtcgagc339
SEQ ID NO. 37
catgccatgg ccgatatcgttctgac26
SEQ ID NO. 38
ccgctcgagg ctcgacacggtcaccagag29
SEQ ID NO. 39
agcccacctc aacgcaatt19
SEQ ID NO. 40
gt犯CtCg3g 3gCggtggCggtctggtg28
SEQ ID NO. 41
g犯gctagcg ctcgscacggtcaccagagtg31
SEQ ID NO. 42
gtaagagctc acccagccgccgagcgtg28
SEQ ID NO. 43
gtaagagctc actcaacctccgtctgtttctgg33
SEQ ID NO. 44cttgaagctt ggtgccaccg ccaaac 26 SEQ ID NO. 45
gagaggcagc gaactcatct 20 SEQ ID NO. 46
agctctgaca ccgacatgg 19 SEQ ID NO. 47
gcagaacggc tgcctaattt 20 SEQ ID NO. 48
tcaggcattt catcgtcatc 20 SEQ ID NO. 49
ctgg肪cggt gaaggtgaca 20 SEQ ID NO. 50
aagggacttc ctgtaacaat gca 23
2權利要求
1、人源抗huIFN-α抗體，其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3以及重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自如下各組中的一組L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3 H-CDR1 H-CDR2 H-CDR31)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QVRDNNENEW SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGYIDFGDHMDF2)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QSRDDSDSLL SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGGSDFGDSFAF3)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QARDSGVGAF SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGHWWAAMDY4)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QVRDKEEFSYAMS AISGSGGSTYYADSVKGNVYNIFDA5)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QAKDASLLF SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGQTYGRMDY6)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS QVRDNDDFSF SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGQHYSVFAA7)SGSSSNIGSNYVS DNNQRPS SSKEGGAKA SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGTRWMIFDD8)SGDALGDKYASEDSKRPS QVRDGSLFAL SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGWRRFIRGVDP9)SGDALGDKYASEDSKRPS QSKSAALLR SYAMS AISGSGGSTYYADSVKGLWRSKRWVRS。
2、 如權利要求l所述的抗體，其特征在于，其輕鏈可變區氨基酸序列和重 鏈可變區氨基酸序列選自以下各組中的一組SEQIDNo.l和2所示的氨基酸序 列、SEQ ID No.3和4所示的氨基酸序列、SEQ ID No.5和6所示的氨基酸序列、 SEQ ID No.7和8所示的氨基酸序列、SEQ ID No.9和10所示的氨基酸序列、SEQ IDNo.ll和12所示的氨基酸序列、SEQIDNo.l3和14所示的氨基酸序列、SEQ IDNo.15和16所示的氨基酸序列以及SEQIDNo.l7和18所示的氨基酸序列。
3、 如權利要求2所述的抗體，其為單鏈抗體或全抗體免疫球蛋白IgG。
4、 權利要求1 3任一項所述的抗體經過改造得到的衍生抗體，所述改造包 括氨基酸的缺失、替換和/或插入，并且不改變抗體的活性，所述氨基酸的替換 按如下各組進行組1:亮氨酸，異亮氨酸,正亮氨酸，纈氨酸,正纈氨酸,丙氨酸,2-氨基丁酸,蛋 氨酸,2-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸,叔丁基丙氨酸,環己基丙氨酸；組2:天門冬氨酸，谷氨酸，異天門冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；組3:天門冬酰胺，谷氨酰胺；組4:賴氨酸,精氨酸,烏氨酸，2,4-二氨基丁酸，2,3-二氨基丙酸； 組5:脯氨酸，3-羥基脯氨酸,4-羥基脯氨酸； 組6:絲氨酸,蘇氨酸，高絲氨酸； 組7:苯丙氨酸，酪氨酸，組內各氨基酸之間的替換并不改變抗體蛋白的活性，由這些改變得到衍生抗體。
5、 編碼權利要求l-4任一項所述抗體的基因。
6、 如權利要求5所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列 和編碼重鏈可變區的核苷酸序列選自以下各組中的一組SEQIDNo.l9和SEQ IDNo.20所示的核苷酸序列、SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示的核苷酸序列、 SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的核苷酸序列、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示的核苷酸序列、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的核苷酸序列、 SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的核苷酸序列、SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示的核苷酸序列、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的核苷酸序列、 SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示的核苷酸序列。
7、 含有權利要求5或6所述基因的表達載體。
8、 含有權利要求7所述表達載體的宿主。
9、 權利要求1 4任一項所述抗體在制備治療huIFN-a過量引起的疾病的藥 物中的應用，尤其是系統性紅斑狼瘡。
10、 含有權利要求1 4任一項所述抗體的藥物或檢測試劑。
全文摘要
本發明提供了一種人源抗huIFN-α抗體，本發明通過基因工程手段和噬菌體表面呈現技術結合運用，從人全合成單鏈抗體庫中篩選出抗人干擾素α(huIFN-α)的基因工程單克隆抗體，并獲得其抗體基因，完成抗體蛋白的免疫活性和生物活性鑒定，為將來臨床治療系統性紅斑狼瘡提供新的特異性抗體藥物。
文檔編號A61K39/395GK101580546SQ20091008523
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者孫麗娜, 孫志偉, 川 李, 李德新, 李金枝, 梁米芳, 雙 王, 穎 王, 斌 龔 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所;中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所;上海市免疫學研究所