專利名稱：吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑及其制備方法。
背景技術：
吡柔比星(THP)，別名吡喃阿霉素，屬于蒽環類抗生素。吡柔比星抗癌作用的機理 為在細胞核迅速嵌入DNA核酸堿基對間，干擾轉錄過程，阻止mRNA的合成，抑制DNA聚合 酶的活性，從而干擾DNA的合成。目前，吡柔比星主要用于惡性淋巴瘤和急性白血病的治療，還用于乳腺癌、頭部頸 癌、胃癌、泌尿系統等惡性腫瘤和卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌的治療。單獨使用吡柔比星 的治療有效率為20% -70%，吡柔比星與多種化合物如Ara-C、CTX、6-MP、MTX、5-FU、DDP等 聯合應用的抗癌作用會增加，但仍然存在嚴重不良反應，主要表現為白細胞減少、血小板 減少、輕度至中度的貧血、惡心和嘔吐等。在解決抗腫瘤藥物的毒副作用方面，納米脂質體載藥系統是較好的選擇。公開號 為CN1931178A的專利中首次公開了 “吡柔比星脂質體及其制備方法”，該制劑可以降低藥 物的毒副作用，并提高其抗腫瘤靶向性，初步體現了脂質體載藥系統的優勢；但其采用的薄 膜擠壓法制備工藝則無法滿足工業化大規模生產的要求，因而限制了其大規模的應用。公 開號為CN101181280A的專利中公開了一種“吡柔比星凍干制劑及其制備方法”，提供了吡 柔比星長循環脂質體凍干制劑的制備方法，該制劑的穩定性好，抗腫瘤活性高，可以顯著提 高藥物在腫瘤組織內的濃度，并能以較高的藥物濃度在腫瘤組織中維持較長時間，然而其 制備工藝也是采用薄膜擠壓法，不能滿足產業化的要求。目前脂質體的制備方法主要有以下三大類薄膜蒸發法，通過人為成膜將藥物包 埋進脂質體，因此限制了其大規模工業化生產的可行性；逆相蒸發法，需要制備混勻的油 水兩相體系，從而引入大量的有機溶劑，如氯仿、甲醇或乙醚等，不僅嚴重限制了其工業可 操作性，另外殘留溶劑對人體產生的隱患也是工業化不得不考慮的因素；單相溶液凍干法 即將藥物和輔料混勻后直接凍干，該方法因其制備工藝簡單在國內曾盛行一時，然而其中 引入的有機溶劑叔丁醇也存在一定的安全隱患，并且該方法局限于利用沸點較低的藥物制 備脂質體，且傾向于制備亞微米級的脂質體。另外還有交叉流注入技術，該方法為澳大利亞 Polymun Science公司的專利，國外很常用，但其需要特殊的儀器設備，且制備的是脂質體 混懸液，相對于凍干劑而言，存在穩定性差、不易儲存和運輸等缺點。
發明內容
本發明的目的是提供吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑及其制備方法。本發明所提供的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備方法，包括以下步 驟1)將下述組合物A或B的有機溶液與水混合，制備均相溶液；組合物A 由吡柔比星、磷脂和固醇組成；
組合物B 由鹽酸吡柔比星、磷脂和固醇組成；2)除去步驟1)中均相溶液中的有機溶劑，得到脂質體混懸液；3)將步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，然后加入凍干支持劑，反復凍融 后，凍干得到吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑。上述方法中，所述吡柔比星或鹽酸吡柔比星與磷脂、固醇的質量比為 (8-9) (59-61) (20-21)，具體可為 1 7.5 2.5。上述方法中，所述磷脂為下述組合物a、b或c中的任意一種組合物a 由二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)組成；組合物b 由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二棕櫚酸磷脂酰甘油(DPPG)組成；組合物c 由二肉豆蔻酰磷酯酰膽堿(DMPC)和二肉豆蔻酰磷酯酰甘油(DMPG)組 成。上述方法中，所述固醇為膽固醇、豆固醇、谷固醇或麥角固醇。上述方法中，所述步驟1)中，所述組合物A或B的有機溶液是將組合物A或B分 別溶于無水乙醇或叔丁醇中得到的有機溶液。所述步驟1)中，所述組合物A或B的有機溶液與水的體積比為1 (2-8)，具體可 為 1 4。所述步驟1)中，采用微射流或高壓乳勻方法制備均相溶液。所述微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。上述方法中，所述步驟2)中，采用旋蒸法除去所述均相溶液中的有機溶劑。上述方法中，所述步驟3)中，所述微射流處理的條件為先將所述步驟2)的脂質 體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 100psig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。所述步驟3)中，所述凍干支持劑為乳糖或海藻糖，所述乳糖和所述磷脂的質量比 至少為5 1。所述步驟3)中，所述凍融條件為_80°C冷凍12小時，再60°C融解；所述凍融的次 數至少為5次。采用上述方法制備的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑也屬于本發明的保 護范圍。本發明制備的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體為凍干粉，用注射用水復溶后得到 的脂質體混懸液為粉紅色的澄清透明液體，平均粒徑小于300nm，包封率為90%以上。本發 明的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑可以大大降低其對血管的刺激性，減少對心臟 等組織的毒副作用，并提高生物利用度。本發明的制備吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的主要機理為首先將吡柔 比星或鹽酸吡柔比星分別與磷脂、固醇溶解在醇水溶液中，借助微射流的高剪切作用，使磷 脂、固醇和吡柔比星或鹽酸吡柔比星混合的更加均勻，形成均相溶液；然后在氮氣保護下減 壓旋蒸去除乙醇，在去除乙醇的同時，磷脂分子的疏水尾端重新排列，將吡柔比星或鹽酸吡 柔比星包裹入脂質體中，從而形成亞微米級的脂質體；隨后的微射流可以對亞微米脂質體 進行整核和重組；最后加入凍干保護劑，反復凍融后凍干得到吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂 質體凍干劑。本發明的制備方法具有以下優點工藝簡單、工業可操作性強、安全性高、重現性較好、所有的制備條件均有固定的參數控制。
圖1為鹽酸吡柔比星脂質體的冰凍蝕刻電鏡圖片(X 19000)圖2為鹽酸吡柔比星脂質體的粒徑分布圖
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取40mg鹽酸吡柔比星、270mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、30mg 二硬脂 酰磷脂酰甘油(DSPG)和IOOmg膽固醇溶于20ml無水乙醇中，超聲溶解；然后在上述溶液 中加入80ml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去無水乙醇，得到20ml的 脂質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g乳糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔 比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例2、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取45mg鹽酸吡柔比星、270mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、30mg 二棕櫚 酸磷脂酰甘油(DPPG)和IOOmg膽固醇溶于20ml無水乙醇中，超聲溶解；然后在上述溶液 中加入40ml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去無水乙醇，得到20ml的 脂質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g乳糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔 比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例3、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取40mg鹽酸吡柔比星、275mg 二肉豆蔻酰磷酯酰膽堿(DMPC)、25mg 二肉豆蔻酰磷酯酰甘油(DMPG)和IOOmg膽固醇溶于20ml無水乙醇中，超聲溶解；然后在上述溶 液中加入160ml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為 25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去無水乙醇，得到20ml的 脂質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g乳糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔 比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例4、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取45mg鹽酸吡柔比星、270mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、30mg 二硬脂 酰磷脂酰甘油(DSPG)和IOOmg豆固醇溶于20ml無水乙醇中，超聲溶解；然后在上述溶液 中加入60ml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去無水乙醇，得到20ml的 脂質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g乳糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔 比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例5、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取45mg鹽酸吡柔比星、275mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、30mg 二硬脂 酰磷脂酰甘油(DSPG)和IOOmg豆固醇溶于20ml無水乙醇中，超聲溶解；然后在上述溶液中 加入IOOml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去無水乙醇，得到20ml的 脂質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g海藻糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例6、鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備1)準確稱取40mg鹽酸吡柔比星、270mg 二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、25mg 二硬脂 酰磷脂酰甘油(DSPG)和IOOmg豆固醇溶于20ml叔丁醇中，超聲溶解；然后在上述溶液中 加入120ml水，采用微射流處理使之充分混合，得到均相溶液；微射流處理的條件為25 30psig，6次循環。2)將上述步驟1)的均相溶液在40°C進行減壓旋蒸，除去叔丁醇，得到20ml的脂 質體混懸液。3)將上述步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，處理前先將上述步驟2)的脂 質體混懸液在60°C預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環； 最后30 35psig，6次循環。4)在上述步驟3)的溶液中加入2g乳糖，60°C攪拌使之混合均勻。5)將上述步驟4)的混合溶液置于-80°C條件下冷凍12小時，然后在60°C條件下 迅速融化并混勻，如此反復操作5次。最后置于冷凍干燥機中凍干，得到粉紅色的鹽酸吡柔 比星脂質體凍干粉。凍干條件為_60 -55°C、0. 1 0. 3psi、凍干24小時。實施例7、吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的效果實驗觀察上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的形態、分別測定其粒徑及 分布、測定包封率、穩定性、生物利用度、動物耐受性、潛在毒性、刺激性、過敏性和溶血性， 具體的實驗如下1、形態觀察將上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉置于容器中，用液氮迅速冷 凍，將冷凍后的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉轉移至冷凍蝕刻儀中，在3X liTmbar的高真空 和-120°C條件下蝕刻樣品；一分鐘后，于45°C條件下噴Pt，然后再90°C條件下噴C ；取出樣 品，放入水中，用銅網撈膜，晾干，置于電鏡上觀察并照相。結果表明，電鏡下，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉呈分散均勻 的橢球形粒子，19000倍放大倍數下的冷凍蝕刻電鏡圖片如圖1所示。2、粒徑及其分布測定將上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉溶于適量的注射用水中，用激 光粒度散射儀測定其粒徑及分布。鹽酸吡柔比星脂質體的粒徑分布圖如圖2所示。實驗設三次重復，結果表明，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體的粒徑分 布均勻，平均粒徑為128. 6nm，多分散系數0. 128，呈Gauss分布，符合脂質體的粒徑要求。3、穩定性測定1)影響因素實驗將上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉分別置于60°C烘箱和4°C冰箱 中放置，分別于第0天、第5天和第10天末取樣，用注射用水復溶，進行熱循環實驗。熱循環 實驗的具體方法為分別將60°C烘箱和4°C冰箱中放置0天、5天和10天的樣品置于-20°C 條件下放置2天，然后再加熱到40°C放置兩天。考察樣品的外觀性狀、粒徑分布、包封率和
含量等。實驗設三次重復，結果表明，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的各項指標均無明顯變化，平均包封率大于90 %。2)加速實驗將上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉置于隔水式電熱恒溫培養箱 中，40°C放置6個月，分別于第0、1、2、3、6月的月末取樣進行測定。考察樣品的外觀性狀、 粒徑分布、包封率和含量等，同時于第6個月的月末進行無菌檢查和熱原檢查。實驗設三次重復，結果表明，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的 粒徑分布、包封率和含量等均無明顯的變化。4、生物利用度和靶向性試驗取昆明種雄性小鼠(體重為18 22g)，給藥前12小時禁食，自由飲水，按小鼠體 重折合計算給藥劑量，約為0. 4mg/20g體重。其中10組小鼠(每組10只)尾靜脈注射上 述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉，另外10組小鼠(每組10只)尾靜脈注射 相同劑量的市售注射用鹽酸吡柔比星凍干粉做為對照組。實驗組和對照組小鼠分別于給藥 后 2min、5min、7min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min 摘目艮球取血，取血后 立即將小鼠斷頸處死，并迅速取心臟、肝、脾、肺、腎等組織樣品。參照生物樣品處理方法處 理樣品，采用內標法計算心臟、肝、脾、肺和腎中鹽酸吡柔比星的濃度，采用HPLC法測定小 鼠血漿中鹽酸吡柔比星的血藥濃度，以此評價上訴實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍 干粉的生物利用度和靶向性。色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測波長為254nm，以乙 腈-0.4%的醋酸氨緩沖鹽(35 65)為流動相，流速為0.8ml/min。實驗設三次重復，結果表明，實驗組小鼠的肺和脾組織中鹽酸吡柔比星脂質體的 濃度較高，而心臟、腎和肝組織中鹽酸吡柔比星脂質體的濃度很低；而對照組小鼠的肺、心 臟和腎組織的鹽酸吡柔比星脂質體的濃度均較高。說明上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星 脂質體比市售注射用鹽酸吡柔比星凍干粉的生物利用度高，但無顯著性差異(P > 0. 05)， 總的而言，鹽酸吡柔比星脂質體在小鼠體內的生物分布發生了改變，相對于市售注射用鹽 酸吡柔比星凍干粉而言，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的毒副作用更 小，安全性更高、利用度更高。5、動物的耐受性和潛在毒性試驗選擇健康的昆明種雌性小鼠(體重為18 22克)，隨機分為兩組(實驗組和對照 組)，每組4只小鼠，按小鼠體重折合計算給藥劑量，約為30mg/kg體重。實驗組小鼠尾靜 脈注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉，對照組小組尾靜脈注射相同劑量 的市售注射用鹽酸吡柔比星凍干粉(購自深圳萬樂藥業有限公司，規格10mg)。給藥后25 天內觀察藥物的潛在毒性和耐受性，包括體重的改變。實驗設三次重復，結果表明，從體重的減少以及給藥時小鼠的生理反應來看，尾靜 脈注射市售注射用鹽酸吡柔比星凍干粉(購自深圳萬樂藥業有限公司，規格10mg)后，小 鼠尾巴通紅，體溫明顯降低(小鼠打寒戰)，50%的小鼠抽搐而死，而存活的小鼠部分皮毛 臟亂、不柔順、無生氣、萎靡不振，實驗結束時體重顯著減輕，體重減少最高可達23% ；而尾 靜脈注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干粉的小鼠100%能存活下來，個別 小鼠出現短暫的抽搐，但很快能恢復過來，實驗前期小鼠體重略微減輕，但基本上能恢復過 來，并有所增加，體重增加最高可達4%。說明相對于市售注射用鹽酸吡柔比星凍干粉(購自深圳萬樂藥業有限公司，規格10mg)而言，上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍 干粉更為安全。 6、刺激性、過敏性和溶血性試驗選取豚鼠，體重250_300g，雌雄各半；選取大耳家兔，體重2. 5-2. 8kg，雄性。1)血管刺激性試驗取家兔6只，雄性、體重2. 5-2. 8kg，隨機分為兩組，每組三只。實驗組家兔每天于 耳緣靜脈緩慢注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體5. 0ml，對照組家兔注射相同 劑量的質量百分含量為0. 9 %的氯化鈉溶液，每天注射一次，連續注射三天，于末次給藥后 30分鐘處死家兔，剪取注射部位耳，標記后放入體積百分含量為10 %的甲醛溶液中固定， 石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察血管有無變形和組織壞死。實驗設三次重復，結果表明，光鏡下觀察，實驗組家兔的血管無變形和壞死，說明 上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體對血管無明顯刺激性。2)過敏性試驗取豚鼠18只，體重250_300g，雌雄各半，隨機分為實驗組、陰性對照組和陽性對 照組，每組6只豚鼠。實驗組豚鼠每兩天腹腔注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質 體，約1. 4ml/只；陰性對照組豚鼠每兩天腹腔注射質量百分含量為0. 9%的氯化鈉溶液，約 1. 4ml/只；陽性對照組豚鼠每兩天腹腔注射質量百分含量為5%的卵蛋白溶液，約1. 4ml/ 只。連續注射三次，然后再將實驗組、陰性對照組和陽性對照組豚鼠分別隨機分成兩小組， 每小組3只豚鼠，第一小組于注射后第14天、第二小組于注射后第21天，分別由耳緣靜脈 注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體1ml，注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星 脂質體后15分鐘內豚鼠有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干咳或咳嗽3聲等現象中的兩種或兩種以 上者，或者有羅音、抽搐、虛脫或死亡現象之一者，判斷為有過敏現象。實驗設三次重復，結果表明，實驗組豚鼠于首次注射后第14d，再由耳緣靜脈注射 上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體1ml，15分內3只豚鼠均未出現明顯的顫抖、豎 毛、咳嗽、呼吸困難、痙攣、抽搐乃至死亡現象；實驗組豚鼠于首次注射后第21d，再由耳緣 靜脈注射上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體1ml，15分內3只豚鼠仍未出現明顯的 顫抖、豎毛、咳嗽、呼吸困難、抽搐乃至死亡現象；說明上述實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂 質體對豚鼠沒有致敏性。3)溶血性試驗取家兔血10ml，放入潔凈的盛有玻璃球的三角燒杯中振搖lOmin，除去纖維蛋白 原，然后加入約10倍體積的質量百分含量為0. 9%的氯化鈉溶液，搖勻，3000r/min離心，棄 去上清液，得到紅細胞沉淀；將紅細胞沉淀再用0. 9%的氯化鈉溶液反復洗滌至無紅色為 止；量取血球，用0. 9%的氯化鈉溶液配制成2%紅細胞懸液。取潔凈試管7支，按表1的配比量加入上述制備的2%紅細胞懸液和0. 9%的氯化 鈉溶液；混勻后，于37°C恒溫水浴中放置30min，然后再分別加入不同量的上述實施例1制 備的鹽酸吡柔比星脂質體，第6支試管不加鹽酸吡柔比星脂質體作為陰性對照，第7支試管 也不加鹽酸吡柔比星脂質體，而將0.9%的氯化鈉溶液改為蒸餾水，做陽性對照；各試管均 搖勻后，置于37°C恒溫水浴中，觀察放入后15min、30min、45min、lh、2h、3h、4h內有無溶血 和紅細胞凝集現象。
實驗設三次重復，結果表明，在觀察時間內，實驗組和對照組均未無溶血和紅細胞 凝集現象。表1紅細胞懸液和氯化鈉溶液的配比量 同時還對上述實施例2-6制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑進行了形態觀察、穩 定性、生物利用度和靶向性、動物耐受性和潛在毒性、刺激性、過敏性和溶血性實驗，結果表 明，實施例2-6制備的鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑與實施例1制備的鹽酸吡柔比星脂質體 凍干劑的效果無明顯差異。
權利要求
吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的制備方法，包括以下步驟1)將下述組合物A或B的有機溶液與水混合，制備均相溶液；組合物A由吡柔比星、磷脂和固醇組成；組合物B由鹽酸吡柔比星、磷脂和固醇組成；2)除去步驟1)中均相溶液中的有機溶劑，得到脂質體混懸液；3)將步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，然后加入凍干支持劑，反復凍融后，凍干得到吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述吡柔比星或鹽酸吡柔比星與磷脂、固 醇的質量比為(8-9) (59-61) (20-21)，優選為 1 7. 5 2. 5。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述磷脂為下述組合物a、b或c中 的任意一種組合物a 由二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰甘油組成； 組合物b 由二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二棕櫚酰磷脂酰甘油組成； 組合物c 由二肉豆蔻酰磷酯酰膽堿和二肉豆蔻酰磷酯酰甘油組成。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述固醇為膽固醇、豆固醇、谷固醇 或麥角固醇。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述組合物A或 B的有機溶液是將組合物A或B分別溶于無水乙醇或叔丁醇中得到的有機溶液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述組合物A或B的有機溶液與水的體 積比為1 (2-8)，優選為1 4。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，采用微射流或 高壓乳勻方法制備均相溶液；所述微射流處理的條件為25 30psig，6次循環；所述步驟2)中，采用旋蒸法除去所述均相溶液中的有機溶劑； 所述步驟3)中，所述微射流處理的條件為先將所述步驟2)的脂質體混懸液在60°C 預熱2-5分鐘，然后95 lOOpsig，5次循環；再65 70psig，6次循環；最后30 35psig， 6次循環。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述凍干支持 劑為乳糖或海藻糖，優選為乳糖；所述乳糖和所述磷脂的質量比至少為5 1。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述凍融條件 為-80°C冷凍12小時，再60°C融解；所述凍融的次數至少為5次。
10.按照權利要求1-9中任一所述的方法制備的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑。
全文摘要
本發明公開了吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑及其制備方法。該方法包括以下步驟1)將下述組合物A或B的有機溶液與水混合，制備均相溶液；組合物A由吡柔比星、磷脂和固醇組成；組合物B由鹽酸吡柔比星、磷脂和固醇組成；2)除去步驟1)中均相溶液中的有機溶劑，得到脂質體混懸液；3)將步驟2)的脂質體混懸液進行微射流處理，然后加入凍干支持劑，反復凍融后，凍干得到吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑。采用本發明方法制備的吡柔比星或鹽酸吡柔比星脂質體凍干劑的平均粒徑小于300nm，包封率為90％以上，對血管的刺激性較小，對心臟等組織的毒副作用也較小，生物利用度較高。
文檔編號A61K47/28GK101879144SQ200910083478
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者王義明 申請人:王義明