專利名稱：多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒感染的預(yù)防和治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及多價(jià)重組 人乳頭瘤病毒疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國際衛(wèi) 生組織資料)，成為世界范圍內(nèi)僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二號殺手?？茖W(xué)研究 證實(shí)，導(dǎo)致宮頸癌的罪魁禍?zhǔn)资且环N名為人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，簡稱HPV) 的DNA致癌病毒。該病毒主要通過兩性接觸傳染，專性侵染人體上皮細(xì)胞特別是生殖器官， 部分病毒攜帶者在反復(fù)感染后表現(xiàn)出多種臨床癥狀。女性受高危險(xiǎn)型(HPV16、HPV18等) 病毒感染后，小部分患者由最初的宮頸細(xì)胞學(xué)異常，發(fā)展成I-III的宮頸內(nèi)皮細(xì)胞瘤樣變 (CINI-III)和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發(fā)展成致命的子宮頸癌。部分低危險(xiǎn)型(HPV6、 HPVl 1)病毒感染可導(dǎo)致男女兩性生殖器官部位的尖銳濕疣。最新研究表明HPV除了直接導(dǎo)致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口腔癌和皮膚 癌有重大關(guān)系。根據(jù)國際衛(wèi)生組織WHO的有關(guān)資料，除了導(dǎo)致宮頸癌，HPV感染還可能解釋 60 %的皮膚癌，60 %的食管癌，50 %的肺癌、50 %的乳腺癌、25 %的口腔癌等人類重大癌癥。HPV病毒在長期的進(jìn)化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、HPV18等13種高危 險(xiǎn)型確認(rèn)能夠?qū)е聦m頸癌癥。HPV6、HPVll等低危險(xiǎn)型是造成男女生殖部位尖銳濕疣的關(guān) 鍵病原體。根據(jù)《Vaccine》專刊增刊(25S(2007)C27-C219)中關(guān)于中國HPV類型分布頻率 的報(bào)道，HPV58是僅次于HPV16和HPV18的分布最廣的類型。全球除亞洲以外HPV 58的平 均分布頻率低于2%。但在亞洲，特別是中國，HPV 58在子宮頸癌患者中的分布頻率高達(dá) 7. 1%，在高等級傷害患者中的分布頻率甚至高達(dá)13. 1%。因此，研制多價(jià)重組人乳頭瘤病 毒疫苗刻不容緩。
發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的之一是提供多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗；本發(fā)明的另一目的是提供 該重組人乳頭瘤病毒疫苗在制備藥物中的應(yīng)用。( 二 )技術(shù)方案本發(fā)明所述一種多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學(xué)上可接受的 輔料組成，所述的活性成分包括至少一種重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基 本單元組成的多聚體。其中，所述的以五聚體為基本單元組成的多聚體包括五聚體，十二五聚體(T = 1， 二十面體)、三十六五聚體(τ = 3，二十面體)、四十八五聚體(T = 4，二十面體)、七十二五 聚體(T = 7，二十面體)和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
定義十二五聚體表示十二個(gè)五聚體自發(fā)聚合而成的多聚體。三十六五聚體、 四十八五聚體、七十二五聚體的定義依此類推。T表示三角可分體(Triangular division)數(shù)目。當(dāng)T = 1時(shí)，表示只能有十二個(gè) 五聚體自發(fā)聚合而成多聚體。T = 3，T = 4，T = 7的定義依此類推。所述的HPV型包括流行病學(xué)意義上的HPV高危險(xiǎn)型和低危險(xiǎn)型。優(yōu)選地，所述的HPV型指HPV16，得到重組HPV16疫苗；優(yōu)選地，所述的HPV型指HPV16、HPV18，得到HPV16、HPV18 二價(jià)重組子宮頸癌疫苗。優(yōu)選地，所述的HPV型指HPV6、HPV11，得到HPV6、HPVll 二價(jià)重組尖銳濕疣疫苗。優(yōu)選地，所述的HPV 型指 HPV16、HPV18、HPV6、HPV11，得到 HPV16、HPV18、HPV6、 HPVll四價(jià)重組疫苗。更優(yōu)選地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥33，得到HPV16、HPV18、 HPV6, HPVlU HPV33五價(jià)重組疫苗。最優(yōu)選地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥58，得到HPV16、HPV18、 HPV6、HPV11、HPV58五價(jià)重組疫苗。所述輔料包括但不限于佐劑、賦型劑、穩(wěn)定劑。其中，所述佐劑選自鋁鹽、3-0-去 ?；瘑瘟姿犷愔⒅|(zhì)A衍生物中的一種或多種，所述穩(wěn)定劑選自基于磷酸鹽的生理緩沖 液中的一種或多種，所述賦型劑選自生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑中的一種或多 種。所述每種HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體的含 量均為10-200 μ g/支疫苗。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)上述疫苗的方法，它包括如下步驟(1)表達(dá)、分離、純化所需要的重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本 單元組成的多聚體；(2)將所得Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體與輔料混合制 劑，得到多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗。其中，表達(dá)、分離、純化重組HPV的Ll蛋白多聚體的方法參見專利PCT/ CN2008/000314, CN200810055700. 5，得到純度均為95%以上的Ll蛋白多聚體。本發(fā)明公開了上述疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由HPV引起的感染和疾病的藥 物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸 癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的疾病。更優(yōu)選地，所述的感染和 疾病是尖銳濕疣和子宮頸癌。本發(fā)明所述的疫苗可采用多種方法作用于人體，包括肌肉和皮下注射。該疫苗在 能引發(fā)對Ll蛋白免疫反應(yīng)的有效劑量范圍內(nèi)使用。用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)的復(fù)合物的特定劑 量依照Ll復(fù)合物不同而變化。一般而言，Ll蛋白多聚體的用量在1_20μ g/Kg體重之間。 上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。例如，具體的劑量會(huì)根據(jù)是否伴隨有其他 藥物劑量而定，或取決于個(gè)人的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物積累和代謝速率。(三)有益效果本發(fā)明所述的多價(jià)疫苗能夠有效預(yù)防包括尖銳濕疣、子宮頸癌在內(nèi)的多種與HPV感染相關(guān)的疾病。因?yàn)槲寰垠w與HPV Ll蛋白的VLP(類病毒顆粒，為HPV Ll蛋白的七十二五 聚體)具有相同的免疫原性和抗原性，且相對于VLP而言具有結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、工業(yè)成本大幅降 低的優(yōu)點(diǎn)，所以本發(fā)明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉，防治范圍 更大，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1重組HPV16人乳頭瘤病毒疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1多聚體的制備1、克隆HPV16L1衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質(zhì)粒(購自美國Promega 生物試劑公司)上。2、修飾HPV16L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達(dá)將含有堿基替代突變的載 有HPV16L1基因插入片段的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6-l通過熱激法導(dǎo)入大腸桿菌BL21細(xì)胞之后， 使用LB培養(yǎng)基(配方見《(分子克隆》第三版，科學(xué)出版社，2002年8月出版)進(jìn)行攝氏37 度培養(yǎng)，菌種接入后生長12小時(shí)開始用表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG(購自美國Promega公司)誘導(dǎo)， 9小時(shí)后收獲細(xì)胞，細(xì)胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質(zhì)機(jī)在800bar下重復(fù)破碎細(xì)胞2 次，顯微鏡檢查細(xì)胞破碎率達(dá)到90%以上。3、HPV16L1蛋白多聚體的分離、純化上清溶液中的Ll蛋白經(jīng)親和色譜純化蛋白 預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產(chǎn)的Glutathiones印harose 4B)色譜柱， 取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4B勻漿放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要 5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的緩沖液A (組分為:50mmol/L Tric-HCl，200mmol/ L NaCl,lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在 室溫下作用20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察 純化產(chǎn)物，得到HPV16L1的五聚體和以五聚體為基本單元組成的多聚體。二、活性成分與輔料混合將純化的HPV16L1的多聚體與含有IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn) 磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，)通過緩沖液置換(bufferexchange，見《分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll多聚體保存在pH值為7. 2的磷酸緩沖液中， 通過調(diào)整使得重組HPV16蛋白多聚體含量為50μ g/支疫苗，制劑成為重組HPV16人乳頭瘤 病毒疫苗，在4°C保存。實(shí)施例2 二價(jià)重組人乳頭瘤病毒(HPV16、HPV18)疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1五聚體的制備同實(shí)施例1。二、采用與前述相同的方法制備HPV18L1蛋白的五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV16和HPV18L1蛋白的五聚體與含有IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffer exchange,見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚體保存在pH值為7. 2的磷酸緩沖液中，同時(shí)加入氫氧化鋁150 μ g，通過調(diào)整使得重組HPV16蛋白五聚體含量為 10 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五聚體含量為20 μ g/支疫苗，制劑成為二價(jià)重組人乳頭瘤病毒 疫苗，在4°C保存。實(shí)施例3 二價(jià)重組人乳頭瘤病毒(HPV6、HPVl 1)疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白三十六五聚體(VLP)的制備同實(shí)施例1。二、采用與前述相同的方法制備HPVll Ll蛋白的三十六五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6和HPVll Ll蛋白的三十六五聚體與含有 IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffer exchange，見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll三十六五聚體保存在pH值為 7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白三十六五聚體含量為150 μ g/支疫苗、 HPVll蛋白三十六五聚體含量為200 μ g/支疫苗，制劑成為二價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，在 4°C保存。實(shí)施例4四價(jià)重組人乳頭瘤病毒(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18)疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白七十二五聚體(VLP)的制備同實(shí)施例1。二、采用與前述相同的方法制備HPVll、HPV16、HPV18L1蛋白的七十二五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18 Ll蛋白的 七十二五聚體與含有IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，) 通過緩沖液置換(buffer exchange，見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll 七十二五聚體保存在PH值為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白七十二五 聚體含量為20 μ g/支疫苗、HPVll蛋白七十二五聚體含量為25 μ g/支疫苗、HPV16蛋白 七十二五聚體含量為20 μ g/支疫苗、HPV18蛋白七十二聚體含量為35 μ g/支疫苗，制劑成 為四價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。實(shí)施例5五價(jià)重組人乳頭瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV58)疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1五聚體的制備同實(shí)施例1。二、采用與前述相同的方法制備HPV11、HPV16、HPV18和HPV58L1蛋白的五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58的五聚體 與含有IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，)通過緩沖液置換 (buffer exchange，見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚體保存在pH值 為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗、HPVll 蛋白五聚體含量為30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五 聚體含量為20 μ g/支疫苗和HPV58蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗，制劑成為五價(jià)重組 人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。實(shí)施例6五價(jià)重組人乳頭瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV33)疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1十二五聚體的制備同實(shí)施例1。二、采用與前述相同的方法制備HPV11、HPV16、HPV18和HPV33 Ll蛋白的十二五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的朋￥6、朋￥11、朋￥16、朋￥18和朋￥33 Ll蛋白的 十二五聚體與含有IOOmM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，)通過 緩沖液置換(buffer exchange，見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版)方式混合，使得Ll十二五 聚體保存在PH值為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白十二五聚體含量為 30 μ g/支疫苗、HPVll蛋白十二五聚體含量為30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白十二五聚體含量 為30 μ g/支疫苗、HPV18蛋白十二五聚體含量為30 μ g/支疫苗和HPV33蛋白十二五聚體 含量為30 μ g/支疫苗，制劑成為五價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。
權(quán)利要求
一種多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學(xué)上可接受的輔料組成，其特征在于所述的活性成分包括至少一種重組HPV型的L1蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，其特征在于所述的以五聚體為 基本單元組成的多聚體包括五聚體，十二五聚體、三十六五聚體、四十八五聚體、七十二五 聚體和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型包括流行病學(xué)意義上的HPV 高危險(xiǎn)型和低危險(xiǎn)型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV6、HPV11。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPVllo
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV33。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV58。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述輔料包括但不限于佐劑、賦型劑、穩(wěn) 定劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗，其特征在于所述佐劑選自鋁鹽、3-0-去?；瘑瘟姿?類脂、脂質(zhì)A衍生物中的一種或多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗，其特征在于所述穩(wěn)定劑選自基于磷酸鹽的生理緩沖 液中的一種或多種。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗，其特征在于所述賦型劑選自生理鹽水及其它藥物上 可接受的賦型劑中的一種或多種。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述每種HPV型的Ll蛋白五聚體和/或 以五聚體為基本單元組成的多聚體的含量均為10-200 μ g/支疫苗。
15.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-14之任一權(quán)利要求所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1)表達(dá)、分離、純化所需要的重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元 組成的多聚體；(2)將所得Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體與輔料混合制劑， 得到多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14之任一權(quán)利要求所述的疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由HPV 引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳 濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的 疾病。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于所述的感染和疾病是尖銳濕疣和子宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多價(jià)重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學(xué)上可接受的輔料組成，其中活性成分包括至少一種重組HPV型的L1蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體。本發(fā)明所述的多價(jià)疫苗能夠有效預(yù)防包括尖銳濕疣、子宮頸癌在內(nèi)的多種與HPV感染相關(guān)的疾病。本發(fā)明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉，防治范圍大，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
文檔編號A61P17/12GK101890160SQ200910082730
公開日2010年11月24日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者陳小江, 馬潤林 申請人:北京康樂衛(wèi)士生物技術(shù)有限公司