專利名稱：：一株擬盤多毛孢屬內生真菌及所產生的抗腫瘤活性化合物的發現及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一株擬盤多毛孢屬內生真菌無花果擬盤多毛孢(尸^to/o"o/w^,/)N56及所產生的抗宮頸癌(HeLa)及結腸癌(HT29)活性化合物的發現及應用，屬醫藥
技術領域：
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背景技術：
：惡性腫瘤是目前嚴重危害人類生命和生活質量的主要疾病之一，發病率逐年上升。在第18屆國際抗癌聯盟大會上，世界衛生組織的一項研究報告表明，今后20年新發腫瘤患者人數將由目前每年1000萬增加到1500萬，每年因惡性腫瘤而死亡的人數也將由600萬增至1000萬。據國家衛生部統計，20世紀卯年代我國腫瘤發病率已上升為127/10萬。近年來我國每年新增腫瘤患者160萬170萬，總數估計在450萬左右。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。在合成化學類抗腫瘤藥物中絕大多數都是以天然抗腫瘤活性成分為先導化合物。據報道，19841995年，天然產物占上市抗腫瘤藥的60%以上；1983年以前在美國上市以及19831994年全世界批準廣泛使用的92種抗腫瘤藥中，約62種來源于天然產物；19951999年，3個天然產物的衍生物作為新抗腫瘤藥上市，由此可見，天然產物是結構新穎和作用獨特的抗腫瘤化合物的重要來源。本發明涉及的化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC是已報道過的化合物，但抗腫瘤活性是首次報道。本發明專利在真菌次生代謝產物活性化合物篩選基礎上，發現了生產菌株無花果擬盤多毛孢CPy"')N56的固體發酵提取物具有抗宮頸癌及結腸癌活性；以活性跟蹤為指導，分離純化得到了兩個活性化合物。通過對化合物進行抗腫瘤活性評價，發現其具有顯著的抗腫瘤活性
發明內容本發明的目的是發現具有抗腫瘤活性的菌株、產生的抗腫瘤(宮頸癌/結腸癌)活性次生代謝產物及其應用價值研究。在一個方面中，本發明提供生產抗腫瘤化合物的菌株，其為無花果擬盤多毛孢(尸"to/o^;^,c/)菌株N56，該菌株分離自杭州地區的茶樹枝上，并于2008年12月24日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)保藏(保藏號為CGMCCNo.2826)。在一個實施方案中，所述抗腫瘤化合物為Chloropupukeananin(l)和PestalofoneC(2)是從菌株PN56的固體發酵提取物分離得到的，其結構式為12本發明的活性化合物的物化常數、氫譜和碳譜數據分別見表1、2和3。表1.化合物Chloropupukeananin禾BPestalofoneC的物化常數名稱分子式ESIMSIR(neat)v隨3443,2960,2929，1746，ChloropupukeananinC33H35C10ii6421730,1662，1643,1571,1449,1368,1262,1190,1092cm-13423(br),2971,2929,1709,PestalofoneCG32H40O65201674,1440,1378,1233,1028cm-15表2.化合物Chloropupukeananin的氫譜和碳譜數據(Acetone-^)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.化合物PestalofoneC的氫譜和碳譜數據(Acetone《)position3H(mult.,JHH)11.61，s18.1，CH321,67，s25.9,CH33135.7,qC45,00,t(7,5)118.0,CH2.42，dd(16，7.5)27.5,CH25b2.82,dd(16，7.5)662.8，qC73.46,d(1.5)61.9，CH84.16，dddd(10,6.0,65.6,CH4.5，1,5)9a1.70，dd(14,10)35.2，CH29b1.98，dd(14，4.5)1052.8,qC11135.9,qC125.92，s135.1，CH13144.5,qC14a4.78,s115.6,CH214b4.93,s151.65,s22.2，CH316205.3,qCr1.63，s18.0，CH32,1.69,s25.9,CH33,135.5,qC4,5.06，t(7.5)118.6，CH5'a2.39，dd(15,7.5)28.4，CH25'b2.72，dd(15，7.5)6,63.6，qC7,3.49,d(1.5)62.8,CH8,4.12，dddd(12，6.3,67.5,CH5.5，1.5)9'a2.58,dd(15,12)34.2,CH29'b3.06，dd(15,5,5)10'127.5,qC11'148.6，qC12'7.12,s122.2，CH13'143.1，qC14'a1.84,d(18)44.8，CH214'b3.11,d(18)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在一個實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。在一個方面中，本發明提供生產抗腫瘤化合物的方法，所述方法包括用上述無花果擬盤多毛孢(Py^)菌株N56進行發酵，并從發酵產物中得到所述抗腫瘤化合物。在一個實施方案中，所述抗腫瘤化合物為Chloropupukeananin或PestalofoneC。在一個實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。在一個實施方案中，所述發酵為固體發酵。在一個方面中，本發明提供所述Chloropupukeananin或PestalofoneC在制備抗腫瘤藥物中的應用。在一個實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌°在一個方面中，本發明提供一種抗腫瘤藥物，其包含Chloropupukeananin或PestalofoneC作為活性成分。在一個實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。本發明涉及的化合物Chloropupukeananin對HeLa細胞和HT29細胞增殖抑制的ICso值分別為0,9、4.3〃g/mL，化合物PestalofoneC對HeLa細胞增殖抑制的IQ。值為1.2pg/mL。陽性對照物5-氟尿嘧啶的ICsQ為5、^g/mL。本發明對研究與開發新的抗腫瘤(宮頸癌和結腸癌)藥物提供了候選化合物，為開發利用微生物來源的天然活性物質提供了科學依據。圖1是化合物Chloropupukeananin的氫譜(400MHz,氘代丙酮)圖2是化合物Chloropupukeananin的碳譜(100MHz，氘代丙酮)圖3是化合物PestalofoneC的氫譜(400MHz,氖代丙酮)圖4是化合物PestalofoneC的碳譜(100MHz,氘代丙酮)具體實施例方式本發明將借助下面的實施例進行進一步的說明，但是本發明并不受限于下面的實施例。實施例l菌株N56的分離鑒定及其菌學特性1.分離方法釆用常規內生真菌分離方法，具體步驟如下將健康的植物枝條和葉片用水洗凈、晾干，用75%的酒精浸泡消毒60秒，25%(1.3%有效氯)的次氯酸鈉浸泡消毒5分鐘，再用75%的酒精浸泡消毒30秒，后用無菌水洗3次，將消毒后的組織塊剪切成邊長約5mm的小塊，放置于PDA培養基上，置25。C培養。用稀釋法作單孢純化，對不易產孢菌株用滅過菌的康乃馨(Z)fa^/n^cc^vo/7/^//^)葉片組織誘發產孢。參照Steyeart(1949)，Sutton(1980)和NagRaj(1993)[SteyeartR.L,Bull.Jard.Bot.6tatBruxelles,1949,19:285-354;SuttonB.C.TheCoelomycetes.Kew，Surrey,England:CommonwealthMycologicalInstitute,1980,263-266;NagRagT.R.Coelomycetousanamorphswithappendage-bearingconidia.Canada:MycologuePublication.Waterloo,Ontario,Canada.1993,llOl.]擬盤多毛孢屬的分類系統，結合Guba(1961)[GubaE.F.MonographofMo"oc/zaetoand尸e加/oft'a.HarvardUniversityPress,Massachusetts.1961，342]盤多毛孢屬(Pestalotia)5細胞組的檢索表以及查閱多年來發表的新種資料，對分離到的內生擬盤多毛孢菌株進行鑒定。2.形態學特征如下在PDA培養基+康乃馨葉片上，分生孢子盤黑色，半球形或球形，埋藏于表皮下，后突破表皮。分生孢子5細胞，長梭形，有的稍彎曲，21-2S.6x5-7.2pm;中間3色孢長14-18pm，上2色胞褐色，第3色孢顏色略淺，淡褐色；頂端無色孢圓柱形，具頂端附屬絲2-4根，3根為主，頂端附屬絲長13-28.6pm，末端呈匙狀膨大；基部無色胞三角形，據中生式柄1根，長2.6-6.5)im，末端呈球狀膨大。PDA培養基上菌落白色，背面有黑色素沉積。分生孢子堆排列密集。實施例2化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC的分離制備a.無花果擬盤多毛孢(/5,c/)菌株N56的活化PDA培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL，制成試管斜面，挑取菌絲體接種于試管斜面上，25。C培養7天；b.無花果擬盤多毛孢CRy^)N56的固體發酵大米培養基的制備(將100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡過夜，滅菌冷卻待用)；將制備好的無花果擬盤多毛孢菌N56菌株懸液(孢子濃度為1x106個/mL)5mL接種于大米培養基上，25°C培養40天；c.待發酵完畢，將200mL乙酸乙酯加入三角瓶中室溫提取三次，減壓蒸干有機溶劑，得到粗提物2.8g;d.將粗提物用石油醚-乙酸乙酯體系(石油醚:乙酸乙酯=9:1;4:1;7:3;3:2;1:1;2:3;3:7;1:4;1:9)進行減壓硅膠柱層析(8x30cm,薄層層析硅膠)；e.以活性跟蹤指導，將活性組分(石油醚:乙酸乙酯=4:1;7:3)通過SephadexLH-20分離(氯仿甲醇=1:1)，進一步通過反相HPLC(KramosilC'8柱；10(im;10x250mm;2mL/min;70%甲醇/水20min后增加到85%;70%甲醇/水20min后增加到80%)制備得到活性化合物Chloropupukeananin禾口PestalofoneC。通過應用質譜、核磁共振波譜及紅外光譜等技術[參見Liu,L.;Liu,S.;Jiang,L.;Chen,X.;Guo,L.;Che,Y.Og.Ze//.2008,/0，1397—1400.和Liu，L.;Liu,S.;Chen,X.;Guo,L,;Che,Y.MedC/zem.2009,/7,606-613.]確定化合物為Chloropupukeananin和PestalofoneC(氫譜和碳譜見附圖1-4)實施例3采用MTT(噻唑藍，Koparal,A.T.;Tuylu,B.A.;Turk，H.Ato.戶rad2006，20，1300-1307.)法檢測Chloropupukeananin和PestalofoneC對于腫瘤細胞的抑制活性1.試驗用試劑將本發明制備的Chloropupukeananin和PestalofoneC用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑分別配制0.4，2，10，40mg/mL的待測溶液；陽性對照物為5-氟尿嘧啶。本實驗所用腫瘤細胞株為HeLa細胞株和HT29細胞株(ATCC)。2.試驗方法(1)將HeLa和HT29腫瘤細胞培養于coming96孔板(華粵行儀器有限公司)中，每孔細胞數為104個，DMEM培養基(含4500mg/ID-葡萄糖和L-谷氨酰胺，Invitrogen公司生產)100微升。(2)在37。C，5。/。C02條件下培養16-18小時，用PBS洗滌，加入適當濃度的化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC溶液，孵育4小日寸。(3)培養結束后，用新鮮DMEM培養基替換化合物溶液，在37。C，5%C02條件再培養48小時。(4)培養結束后，每個孔中加入50微升(濃度為0.5毫克/毫升)的MTT(噻唑藍)溶液，在37。C條件下培養3小時。(5)除去培養基和MTT溶液，在每孔中加入200微升DMSO(二甲基亞砜)溶液。(6)使用microplateELISAreader(SUNRISE-basicTECAN,TECANAustriaGmbh,Austria)讀取培養后的混合物在570納米下的光吸收值。.(7)以未處理細胞的吸收值相對于初始值的增長為增殖率100%。IC50表示導致50%細胞增殖的藥物濃度。實驗結果需要通過三次獨立實驗決定。3.試驗結果本發明制備的化合物Chloropupukeananin對HeLa細胞和HT29細胞增殖抑制的IC5Q值分別為0.9、4.3〃g/mL，化合物PestalofoneC對HeLa細胞增殖抑制的ICs。值為1.2^g/mL。陽性對照物5-氟尿嘧啶的ICs。為5〃g/mLo結果表明本發明的Chloropupukeananin和PestalofoneC對HeLa細胞和HT29細胞的活性明顯強于5-氟尿嘧啶的抑制活性。因此，本發明對研究與開發新的抗腫瘤(宮頸癌和結腸癌)藥物提供了候選化合物，也為開發利用微生物來源的天然活性物質提供了科學依據。ii權利要求1.生產抗腫瘤化合物的菌株，其菌株名為無花果擬盤多毛孢(Pestalotiopsisfici)N56，保藏號為CGMCCNo.2826。2.權利要求1的菌株，其中抗腫瘤化合物為Chloropupukeananin(1)或PestalofoneC(2)，結構式分別為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.權利要求2的菌株，其中所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。4.生產抗腫瘤化合物的方法，所述方法包括用權利要求1的菌株進行發酵，從發酵產物中得到所述抗腫瘤化合物。5.權利要求3的抗腫瘤化合物，其為Chloropupukeananin(l)或，PestalofoneC(2)，結構式分別為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.權利要求3的方法，其中所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。7.Chloropupukeananin或PestalofoneC用于制備抑制腫瘤的藥物的應用。8.權利要求7的應用，其中所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。9.一種抗腫瘤藥物，其包含Chloropupukeananin或PestalofoneC作為活性成分。10.權利要求9的藥物，其中所述腫瘤為宮頸癌或結腸癌。全文摘要本發明涉及一株擬盤多毛孢屬內生真菌(Pestalotiopsisfici)N56菌株及所產生的抗宮頸癌(HeLa)及結腸癌(HT29)活性化合物的發現及應用，屬醫藥
技術領域：
。將無花果擬盤多毛孢(P.fici)菌株N56進行固體發酵，對發酵產物進行分離純化得到活性化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC，并利用質譜、核磁共振波譜等技術確定其結構。通過對化合物進行抗腫瘤活性評價，發現其具有顯著的抗腫瘤活性。本發明對研究與開發新的抗腫瘤(宮頸癌及結腸癌)藥物提供了備選化合物，并為開發利用真菌來源的天然活性物質提供了科學依據。文檔編號A61P15/00GK101538537SQ20091007772公開日2009年9月23日申請日期2009年2月13日優先權日2009年2月13日發明者玲劉,車永勝,郭良棟申請人:中國科學院微生物研究所