專利名稱：含人組織因子途徑抑制因子和gfp的真核雙表達載體及構建方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及含人組織因子途徑抑制因子(TFPI) 和綠色熒光蛋白(GFP)的真核雙表達載體及構建方法。
背景技術：
目前在防治血管再狹窄的所有措施中，藥物支架是目前臨床上最常用的手段，但 它可能會導致部分患者出現支架內或全身系統性高敏反應，并可能導致血栓形成，最終形 成再狹窄。人組織因子途徑抑制因子(TFPI)具有抗血栓、抑制血管平滑肌細胞增生以及抑 制炎癥反應的三重功能，在血管再狹窄的防治中具有巨大的應用潛力。但是，由于TFPI重 組蛋白的生物半衰期短、靜脈滴注所需量大、給藥時間長，在使用上存在安全性較差、作用 效果較慢、沒有示蹤作用的指標等不足因素的存在，直接采用TFPI重組蛋白靜脈滴注方式 防治血管再狹窄受到了極大限制。因此，突破目前防治血管再狹窄所有措施在保證安全性、 提高基因投遞效率、使蛋白示蹤且功能完整等方面存在的局限具有重大臨床意義。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種含人組織因子途徑抑制因子和 GFP的真核雙表達載體，通過載體攜帶的TFPI基因的轉錄表達，以發揮TFPI蛋白抗血栓、抑 制血管平滑肌細胞增生以及抑制炎癥反應的防治血管再狹窄的功能。并且，該真核雙表達 載體使得TFPI和GFP從同一個雙順反子mRNA互不干擾地同時表達，通過對GFP的觀察即 可有效示蹤TFPI在細胞內的表達。因此，該發明不但保證了防治血管再狹窄治療中的安全 性、提高了 TFPI基因投遞效率，而且使TFPI蛋白示蹤且功能完整，為相關研究提供強有力 的技術支持。本發明的第二個目的是提供一種含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表 達載體的構建方法。本發明的技術方案概述如下含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體，用下述方法制成以序 列表SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3所述序列為PCR引物，以ρ IRES-TFPI為模板，擴增出人 組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列，與 Pires2-AcGFP1-Nuc加入T4DNA連接酶進行反應，制成含人組織因子途徑抑制因子和GFP的 真核雙表達載體 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi。本發明運用基因工程技術成功構建并鑒定了含人組織因子途徑抑制因子和GFP 的真核雙表達載體，使得TFPI和GFP的基因從同一個雙順反子mRNA互不干擾地同時表達， 實現了通過觀察GFP即可確定TFPI基因表達的目的，同時經檢測證明了該載體不但能夠在 細胞內互不干擾的同時表達TFPI和GFP基因而且能夠分泌TFPI蛋白到細胞外，為人類組 織因子途徑抑制因子用于疾病防治研究提供了有效研究工具。
圖1為本發明技術路線；
圖2為PCR擴增片段TFPI 片段大小為937bp ；
圖3 為雙酶切后的 TFPI 和 pIRES2-AcGFP1-Nuc ；
圖4為重組質粒的PCR鑒定；
圖5為重組質粒的酶切圖譜鑒定；
圖6為倒置熒光顯微鏡觀察細胞內綠色熒光蛋白的表達(20X10)；
圖7為RT-PCR檢測TFPI的mRNA表達；
圖8為內參標定后TFPI的mRNA表達量(η = 3)；
圖9為ELISA檢測不同時間點細胞培養液上清中的TFPI蛋白量(η
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1制備含人組織因子途徑抑制因子和綠色熒光蛋白(gfp)的真核雙表達載體1.分別設計上、下游PCR引物，如序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示，由上 海生工生物工程技術服務有限公司負責合成并純化，以pIRES-TFPI為模板，采用PCR擴 增出人組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸 序列。反應體系為 50μ 1 無菌去離子水 34. 5μ l，10XEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1， dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y 1，模板 DNA(5. 73ng/ μ 1)2 μ 1，上、下游引物(20 μ Μ)各 1μ 1， TaKaRa Ex Taq (0. 5U/μ 1)2. 5μ 1 ；反應條件為① 94°C 預變性 2min ；② 94°C 變性 30sec ； ③55°C復性30sec ；④72°C延伸Imin ；⑤72°C延伸5min ；其中②③④重復30個循環；將 PCR反應產物上樣于1. 5%瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘(結果見圖2，圖中M表示DNA分子量 標準，100-6，OOOWide Range DNAMarker (TaKaRa) ； 1 表示 PCR 擴增片段 TFPI 片段大小為 937bp)，并用DNA純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化PCR擴增DNA片段；2.用限制性內切酶EcoR I和Sac II雙酶切純化的PCR擴增片段；反應體系為 20 μ 1 純化的 PCR 擴增片段1 μ g ；IOXT Buffer 2μ 1 ；0. 1%BSA 2μ 1 ；EcoR I 1 μ 1 ； Sac II 1μ 1 ；無菌去離子水補足20μ 1。反應條件為37°C，5小時；3.用限制性內切酶雙酶切載體piRES2-acgfp1-nuc ；首先用sac ii進行酶切處理， 反應體系為 20 μ 1 =Pires2-AcGFP1-Nuc 1 μ g ；IOXT Buffer 2 μ 1 ；0. 1%BSA 2μ 1 ； Sac II 1μ 1 ；無菌去離子水補足20 μ 1。反應條件為37°C，3小時；用DNA純化試劑盒(天根生化 科技有限公司)純化后再使用ecor i進行酶切處理，反應體系為20 μ 1 =Pires2-acgfp1-nuc lug ；IOXH Buffer 2μ 1 ；EcoR I 1 μ 1 ；無菌去離子水補足20 μ 1。反應條件為37°C，3 小時；4.將酶切后的pcr擴增片段和載體piRES2-acgfp1-Nuc分別上樣于1. 5%瓊脂 糖凝膠，電泳30分鐘(結果見圖3，圖中M表示DNA分子量標準，100-6, 000 Wide Range DNAMarker (TaKaRa) ；1表示雙酶切后的tfpi片段；2表示雙酶切后的Pires2-AcGFP1-Nuc)， 用DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，分別回收純化；
5.將上述片段進行連接反應，反應體系為25μ 1 :10XT4DNA Ligase Buffer 2· 5 μ 1 ； TFPI 片段約 0. 3pmol ；載體 ρ I Res2-AcGFP1-Nuc 約 0. 03pmol ； T4DNA Ligase (350U/ μ 1)1μ 1 ；無菌去離子水補足25 μ 1。反應條件為16°C，16小時；上述反應液直接轉化感受態大腸桿菌DH5 α，并將100 μ 1轉化后菌液直接涂布在 LB卡那(卡那霉素含量為100yg/ml)培養瓊脂平板上，37°C，12小時；6.挑取單菌落至IOml LB卡那(卡那霉素含量為ΙΟΟμ g/ml)培養基，250rpm， 37°C培養10小時，各取1μ 1菌液進行PCR鑒定，其余菌液4°C保存；反應體系為50 μ 1 無 菌去離子水 35. 5 μ 1，10 X Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ 1， 菌液 1 μ 1，上、下游引物(20 μ Μ)各 1μ 1，TaKaRa Ex Taq (0. 5U/y 1)2. 5μ 1 ；反應條件為 ①94°C預變性2min ；②94°C變性30sec ；③55°C復性30sec ；④72°C延伸Imin ；⑤72°C延 伸5min ；其中②③④重復30個循環；將PCR反應液上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘(結果見圖4，圖中M表 示DNA分子量標準，Ikb plus DNA Marker (TaKaRa) ； 1表示PCR產物)，將陽性結果對 應的菌液從4°C取出，使用質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)，小量提取質粒 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；7.將上述質粒分別用限制性內切酶EcoR I, Sac II進行單酶切和雙酶 切處理；反應體系和反應條件同上；將反應液上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，電泳30分 鐘(結果見圖5，圖中M表示DNA分子量標準，Ikb plus DNAMarker (TaKaRa) ； 1表示 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；2 表示 EcoR ι 單酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；3 表示 Sac π 單 酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi ；4 表示 ecor ι 和 Sac π 雙酶切 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi)， 結果符合理論預期；8.將質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司和寶生物工程有限公司 (TaKaRa)進行測序，測序結果符合模板中人組織因子途徑抑制因子序列。pIRES-TFPI的構建已在《殼聚糖載基因納米粒子的研究》《生物醫學工程學雜志》 (2005年)第22卷第6期，1171-1176頁公開。實施例2含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體在NIH 3T3細胞內的表達1.用含10%胎牛血清的DMEM培養基、在含5% CO2的孵箱內培養NIH 3T3細胞； 轉染前的1天，用含血清不含抗生素的DMEM培養基以IX IO5的密度將細胞接種于6孔培 養板中(每孔2ml培養基)，細胞長到50%融合時，用Opti-MEM培養基輕輕換洗兩遍后進 行轉染；轉染過程按照Lipofectamine 2000的產品說明書進行操作；DNA 濃度為 0.67yg/ml，Lipofectamine 2000 體積濃度為 0. 08 %, DNA Lipofectamine 2000 =Iyg 1. 25 μ 1 ；轉染分為三組樣品，分別為①轉 Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi②轉Pires2-Acgfp1-Nuc③不轉dna。轉染后24小時在倒置熒光顯 微鏡下觀察到GFP的表達(結果見圖6，圖中1表示熒光下轉Pires2-AcGFP1-Nuc-TFPI的細 胞；2表示明場下轉Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi的細胞；3表示熒光下轉Pires2-Acgfp1-Nuc 的細胞；4表示明場下轉PIRES2-AcGFP1-NUc的細胞；5表示熒光下不轉DNA的細胞；6表示 明場下不轉DNA的細胞)，同時分別在轉染后24小時、36小時、48小時、60小時收取三組樣 品90 μ 1的細胞上清，同時用等量完全培養基補足，收取的液體凍存 于-80°C，作為ELISA檢測的樣品；2.轉染72小時后用Trizol試劑分別提取三組樣品的細胞總RNA，RT-PCR方法 檢測TFPI基因mRNA的表達。同時檢測GAPDH的表達，作為內參照；其中，擴增TFPI片 段的上、下游引物以序列表SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5所示，擴增GAPDH片段的上、下游 引物以序列表SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示；反應體系為50 μ 1 :DEPC水31. 5 μ 1， 10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 5 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y 1，轉錄反應液 5 μ 1，上、下游 引物(20μΜ)各 1μ 1，TaKaRaTaq(0. 5U/μ 1)2. 5 μ 1。反應條件為① 95°C預變性 3min ； ②95°C變性30sec ；③65°C復性30sec ；④72°C延伸30sec ；⑤72°C延伸7min ；其中②③④ 重復30個循環；將PCR反應液上樣于1. 5%瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘(結果見圖7，圖中M表示 DNA 分子量標準，150bp DNAmarker (TaKaRa) ；1 表示轉 pIRESfAcGFPfNuc-TFPI 細胞 cDNA 擴增的GAPDH片段；2表示轉Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi細胞cDna擴增的tfpi片段；3表示 轉 Pires2-AcGFP1-Nuc 細胞 cDNA 擴增的 GAPDH 片段；4 表示轉 Pires2-AcGFP1-Nuc 細胞 cDNA 擴增的TFPI片段；5表示不轉DNA細胞cDNA擴增的GAPDH片段；6表示不轉DNA細胞cDNA 擴增的TFPI片段)。用凝膠掃描系統掃描測定各組樣品TFPI片段與GAPDH片段的凈光密 度值，然后將前者比后者的比值進行分析(結果見圖8)；5.將凍存于-80°C的用于ELISA檢測的樣品取出，使其在室溫下自然融化， 4671rpm 高速離心 10 分鐘，取上清用 ELISA 試劑盒(AssayMax Human Tissue Factor Pathway Inhibitor(TFPI)ELISA Kit)檢測，每組樣品每個時間點設三個復孔，將各孔的
OD450的值代入標準曲線，所得對應的TFPI蛋白濃度進行分析(結果見圖9)。
序列表
<110>中國醫學科學院生物醫學工程研究所
<120>含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體及構建方法
<160>7
<210>1
<211>937bp
<212>DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221>gene
<222>⑴…(937)
<400>1
cgaccgaattcatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggcttctgtatgcc60
tgctgcttaatcttgcccctgcccctcttaatgctgattctgaggaagatgaagaacaca120
caattatcacagatacggagttgccaccactgaaacttatgcattcattttgtgcattca180
aggcggatgatggcccatgtaaagcaatcatgaaaagatttttcttcaatattttcactc240
gacagtgcgaagaatttatatatgggggatgtgaaggaaatcagaatcgatttgaaagtc300
tggaagagtgcaaaaaaatgtgtacaagagataatgcaaacaggattataaagacaacat360
tgcaacaagaaaagccagatttctgctttttggaagaagatcctggaatatgtcgaggtt420
<213>人工合成<220><221>gene<222>(1)... (25)<400>5cttggttgat tgcggagtca gggag25<210>6<211>21bp<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1)... (21)<400>6accacagtcc atgccatcac t21<210>7<211>20bp<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222> ⑴…(20)<400>7tccaccaccc tgttgctgta20
8
權利要求
含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體，其特征是用下述方法制成以序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列為PCR引物，以pIRES TFPI為模板，擴增出人組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，與pIRES2 AcGFP1 Nuc加入T4連接酶進行反應，制成含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體pIRES2 AcGFP1 Nuc TFPI。
2.權利要求1的含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體的構建方法， 其特征是由下述步驟組成以序列表SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所述序列為PCR引物，以 pIRES-TFPI為模板，擴增出入組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得序列表SEQID NO. 1所述的核苷酸序列，與PIRES2-AcGFP1-Nuc加入T4連接酶進行反應，制成含人組織因 子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體Pires2-Acgfp1-Nuc-Tfpi。
全文摘要
本發明公開了含人組織因子途徑抑制因子和GFP的真核雙表達載體及構建方法，載體是用下述方法制成以序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述序列為PCR引物，以pIRES-TFPI為模板，擴增出人組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，與pIRES2-AcGFP1-Nuc加入T4連接酶進行反應制成。本發明的載體，使得TFPI和GFP的基因從同一個雙順反子mRNA互不干擾地同時表達，實現了通過觀察GFP即可確定TFPI基因表達的目的，同時經檢測證明了該載體不但能夠在細胞內互不干擾的同時表達TFPI和GFP基因而且能夠分泌TFPI蛋白到細胞外。
文檔編號A61P9/10GK101955974SQ200910070830
公開日2011年1月26日 申請日期2009年10月16日 優先權日2009年10月16日
發明者冷希崗, 劉蘭霞, 宋麗萍, 朱敦皖, 樓莎, 董霞 申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所