專利名稱：：一種抗漢坦病毒藥物阿比朵爾的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗病毒藥物，更具體涉及一種阿比朵爾抗漢坦病毒的藥物，具體地說，本發明是一種具有良好抗病毒活性的新化合物，其能在細胞和動物體內及人體內發揮抗漢坦病毒的作用，該藥物對漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱(HFRS)既有預防作用，也有治療作用，未發現毒副作用。
背景技術：
：腎綜合征出血熱(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS)是由漢坦病毒(Hantaviruses,HV)引起的經嚙齒類動物傳播的自然疫源性疾病，人通過氣溶膠吸入、傷口、消化道等途徑感染，該病死亡率高，危害性大，曾被世界衛生組織(WHO)列為可通過氣溶膠傳播的潛在生物武器。中國的發病人數占世界總發病人數的90.94%，是HFRS的重疫區。文獻報道，在HFRS早期使用利巴韋林，可減輕病毒血癥，降低死亡率，因此利巴韋林是目前公認的治療HFRS有效的藥物。但在臨床應用中，發現其可引起溶血、降低血紅蛋白，患者不能耐受治療等毒副作用，故研發新的抗漢坦病毒藥物具有現實意義。阿比朵爾是非核苷類免疫剌激劑，在體內可誘導產生干擾素，對巨噬細胞的吞噬功能有顯著的活化作用，具有免疫調節作用D我們采用新的合成方法及原料，合成了具有我國知識產權的新藥(CN200510018613.9)，并證明了該藥動物體內具有抗柯薩奇病毒B3、柯薩奇病毒B5、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等呼吸道病毒的作用，但其對漢坦病毒的作用還未見報道和發現。
發明內容本發明的目的是在于提供了一種阿比朵爾抗漢坦病毒的藥物，阿比朵爾在制3備治療或預防漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱的藥物中的應用，阿比朵爾是非核苷類抗病毒藥物，具有誘生干擾素、增強吞噬細胞的吞噬功能及免疫調節作用，在體外能保護細胞免受漢坦病毒的感染，在體內可提高漢坦病毒致死感染動物的生存率及平均生存天數；阿比朵爾在體內和體外均有抑制漢坦病毒的作用，臨床上可用于漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱(HFRS)病人的治療，人群能較好耐受，未發現毒副作用，該藥物無毒。為了達到上述目的，本發明釆用以下技術措施一種抗病毒新藥一一阿比朵爾(ArbidolHydrochloride),化學名為6-溴-4-(二甲氨甲基)-5-羥基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-111-吲哚-3-羥酸乙酯鹽酸鹽-水合物，其化學結構式如下其中HO-表示羥基，Br-表示溴，CHr表示甲基，CH2N(CH3)2-表示二甲氨甲基，COOC2Hr羧酸乙酯，CH2S-表示硫甲基，HCL表示鹽酸，H20表示水。阿比朵爾為白色晶狀粉末，分子量為531.89,不含影響生物活性的額外化合物和其他雜質。阿比朵爾是申請人合成的，其具體合成工藝見文獻(一種抗呼吸道病毒的藥物及用途，專利號CN200510018613.9)阿比朵爾為水溶性藥物，但溶解度一般，DMSO(二甲基亞砜)可促進其溶解。藥物對小鼠i性作用表現為食欲減退、聳毛、消痩、死亡。藥物對細胞的毒性表現一定濃度范圍內細胞變圓、細胞壁增厚，脫落且吸收度A值下降。阿比朵爾在體外具有明顯抑制漢坦病毒的作用。具體體現在感染前給藥及感染后給藥，病毒感染細胞陽性率、熒光強度隨濃度增加下降，具有劑量效應;5pg/ml阿比朵爾在-24h、-12h、0h、2h四個時間點作用后，可明顯降低病毒感染陽性率，具有時間效應；-24h、-12h作用后，病毒mRNA表達水平下降。阿比朵爾對乳鼠感染坦病毒具有保護和治療作用。感染前24h給藥，隨著藥物劑量的增加，小鼠死亡率降低，平均生存時間延長。感染后24h給藥組，不能提高動物的生存率，但可延長動物的平均生存天數。阿比朵爾在動物體內對漢坦病毒具有抑制作用。感染前24h給藥，可減輕組織(肺、腎、腦)病理改變，降低病毒抗原與mRNA表達水平，調節血清中a腫瘤壞死因子水平。本發明與現有技術比較，具有以下優點和效果1、對漢坦病毒感染既有預防作用，也有治療作用；2、既有抑制病毒復制作用，亦有誘導細胞抗病毒狀態作用；3、可口服給藥，使用方便；4、為非核苷類藥物，毒性不明顯，腎綜合征出血熱(HFRS)病人耐受性好。圖l為5微克/毫升阿比朵爾不同時間作用對漢坦病毒感染細胞陽性率作用示意圖，圖中結果顯示于-24h、-12h、0h、+21^以5微克/毫升阿比朵爾作用￥61"0E6細胞，均可以降低病毒抗原的表達，與病毒對照組比較，p<0.05，并具有時間效應。其中*與病毒對照組比較，AO.05l.VC;2.+2h;3.Oh;4.-12h;5.-24h;圖2為5微克/毫升阿比朵爾不同時間作用對漢坦病毒核酸影響示意圖，A為PCR圖片，B為半定量結果。結果顯示感染前24h、12h給藥，可降低病毒mRNA的表達，與病毒對照組比較，；X0.05，而0h、+211給藥組與對照組比較，病毒mRNA表達量無統計學意i,p>0.05.其中BC.空白對照；M.分子量對照；VC.病毒對照l.VC;2.+2h;3.Oh;4.-12h;5.-24h;*與病毒對照組比較，p<0.05圖3為阿比朵爾對漢坦病毒致死性乳鼠感染的保護作用，圖中A結果提示感染前24h起始灌胃，可明顯提高乳鼠的生存率及平均天數，感染乳鼠的體重于感染后28d恢復；B結果提示感染后24h起始灌胃，雖不能提高乳鼠生存率，但可以延長平均生存天數。A.感染前24h用藥組；B.感染后24h用藥組J/K0.05vs.安慰劑對照組#;<0.05vs.5mg/kg/d.圖4為半定量RT-PCR檢測不同時間組織中病毒inRNA表達水平，結果提示感染前24h給乳鼠灌藥，可明顯降低肝腎腦組織中病毒mRNA的表達水平，并具有時間效應。其中HD:20mg/kg/d;MD:10mg/kg/d:LD:5mg/kg/d;VC:安慰劑對照組；Al.感染后8d檢測結果；A2.感染后12d檢測結果；A3.感染后16天檢測結果；.*;〈0.05vs.安慰劑對照組#<0.05vs.HD.§p<0.05vs.MD.具體實施例方式實施例1:阿比朵爾對VeroE6細胞的毒性作用按照之前的合成工藝(一種抗呼吸道病毒的藥物及用途，專利號-CN200510018613.9)，我們合成了阿比朵爾，并經高效液相檢測其中無雜質及其他成分。將阿比朵爾溶于二甲基亞砜(DMSO)，再溶于雙蒸水中，制成200pg/ml的儲備液，濾過除菌，保存于4。C。用含2。/。小牛血清的MEM細胞維持液將阿比朵爾稀釋成不同的濃度，200W加入96孔培養板的單層VeroE6細胞中，同時設細胞對照，IO天后，觀察細胞形態學變化并用MTT法進行活細胞染色，讀取ffi570值，根據OD值計算細胞存活率判斷不同濃度藥物對細胞毒性的大小，同時設溶劑對照(DMSO:ddH20為1:9混合后過濾除菌，與實驗組相同稀釋比例加入細胞)。實驗結果顯示阿比朵爾對VeroE6細胞的毒性表現為細胞變圓、細胞壁增厚，脫落且吸光度A值下降。其最大無毒濃度為8^/ml，以SPSS11.5的Probit回歸法處理數據.，其半數無毒濃度(CC50)為15.6化g/ml。實施例2:阿比朵爾體外抗漢坦病毒作用將Vero-E6細胞接種至6孔板，待長成單層。以O.5-8^g/ml對倍稀釋的阿比朵爾，按不同方式給藥。具體如下，I(藥物對細胞的保護作用)藥物與細胞37。C作用2h后，棄去含藥維持液，PBS洗滌兩次，吸附病毒37'C2h，洗滌兩次后更換細胞維持液；II(直接殺傷)病毒液與不同濃度藥物37。C作用2h,后將混合液與細胞孵育37。C2h，棄混合液，PBS洗滌兩次，更換細胞維持液；III(抑制病毒復制)病毒液吸附細胞37。C2h，洗滌兩次，加含藥維持液；同時設立未感6染細胞對照、病毒對照組，每組設3個復孔。37°C、5%C02培養，根據細胞狀況適時換維持液或含藥維持液，第10天消化細胞，點片以間接免疫熒光法(IFA)檢測病毒抗原；剩下細胞取l/2體積細胞懸液，以含1。/。BSA的PBS(PH7.2)洗兩次，棄上清，l毫升90。/。甲醇4。C固定15min，PBS洗滌兩次，棄上清，計數，調整細胞濃度，加入50(il不同濃度A35單克隆抗體37。C孵育lh，同上洗滌2次，加50nl不同濃度的FITC標記羊抗鼠抗體避光孵育45min,同上洗滌2次,重懸于500ialPBS中，過膜，以至少l(^個細胞在Beclanan流式細胞儀上進行分析；剩余細胞以TRAZOL按照試劑說明提取細胞總RNA，取ly1RNA樣品100倍稀釋后在熒光酶標儀上分別測0D260和0D280值；確定其濃度和純度定量。各樣本取l.0ug總RNA逆轉錄，體系中包括10xBufferRT2^、10mMdNTPMixl|xl、lOURnasin、20pmol隨機引物和轉錄酶M-MLVlpl(200U4U)，無RNase水補足體積至20y1，充分混勻，短暫離心收集反應液至管底，將反應管放入PCR(E卯endorf公司)儀進行逆轉錄42°C60min，95°C5min得到cDNA模板。在50W的PCR反應體系中加入10XBuffer5W,SMF、SMR引物各lOpmol，10mMdNTPH10^1cDNA模板，Taq酶(200u/ri)l叱以DEPC處理的去離子水，補足終體積50Pl。以hctin為內參，同時設陰性對照和空白對照。將反應管放入PCR(Eppendorf公司)儀進行擴增94。C預變性180s，94°C45s，55°C45s,72°C45s共30個循環，72。C延伸420s。取5WPCR產物在1多瓊脂糖凝膠上電泳，并設分子量對照，EB染色后在紫外透射儀下觀察結果，以Bandscan5.0(Glyko,Japan)軟件對結果進行分析。另取5卩g/ml的阿比朵爾，分別于-24h、-12h、0h及2h(感染時為0h)給藥，病毒核酸抗原檢測同f。實驗結果提示，分別以0.5、1、2、4、8Pg/nil濃度阿比朵爾按三種方式作用至病毒感染細胞，經流式細胞檢測結果顯示，藥物抗吸附組，病毒感染細胞陽性率有明顯降低；藥物抑制病毒復制組次之；藥物對病毒直接作用組，各濃度對病毒感染后抗原的表達無明顯影響，見表l。在熒光顯微鏡下觀察，陰性對照細胞未見熒光，病毒對照細胞可見胞漿中有翠綠色熒光，強度為++—+++，藥物抗吸附組與藥物抑制病毒復制組，隨著藥物濃度的增加，可見有熒光的細胞數目減少及熒光強度減弱，與流式細胞計數結果一致。5化/ml阿比朵爾在感染的不同時間作用后，流式細胞儀計數檢測各組病毒感染細胞的陽性率，-24h、-12h組陽性率明顯降低，3次不同實驗陽性率的均數分別為19.73%、25.16%，0h、.2h組的陽性率均數為28.63%,34.70°/。，各組陽性率與病毒對照組(40.97%)比較，/X0.05，結果見圖l。RT-PCR擴增，進行半定量分析(n=3)，結果顯示-24h、-12h給藥，病毒mRNA表達量與病毒對照比較，有統計學差異(;X0.05);Oh、2h組病毒mRNA表達量與病毒對照比較，無統計學差異(pX).05);見圖2。表l阿比朵爾對漢坦病毒感染VeroE6細胞的抑制作用濃度(lVml)I(抗感染)II(直接殺傷)ffi(抑制病毒復制)FACS(%)IFAFACS(%)IFAFACS(o/o)IFA0.5*8.57±1.17+25.60±1.08++*6.67±0.78+1*2,90±0.60+/-20.37±1.21++/+*8.50±1.35+2*8.00±0.85+20.23±1.12++/+*11.40±1,10+4*3.23±1.22+/-25.33±0.91++*7.87±0.75+8*2.47±1,58+/-26.37±1.40++*1.60±1.37+/-VC26.6±0.74++26.8±2.71++19.03±2.91++aX±SD承與VC組比較，/XO.05注aX±SD*與病毒對照組比較，p<0.05實施例3:阿比朵爾對乳鼠的毒性作用首先做最大耐受量試驗。最大耐受量(MTD)試驗即以最大允許濃度和動物能耐受的最大容積給藥一次，觀察14天，記錄動物反應情況。觀察期內如動物不出現死亡或中毒癥狀，則認為該藥對某種動物某種給藥途徑的MTD為某一數值(mg'kg"或g'kg'1)。阿比朵爾灌胃給藥，lmg'kg-1，0.5mH0g'1鼠觀察14天，觀察動物有無中毒和死亡的情況，根據最大耐受量試驗結果決定是否進行急性毒性和亞急性試驗。Balb/C1日齡乳鼠灌胃給藥lmg'kg",14d內動物無中毒和死亡情況，說明阿比朵爾對Balb/cl日齡乳鼠灌胃給藥途徑MTD為lmg'kg-l，為實際8無毒物質。結果提示，阿比朵爾對1日齡乳鼠的LD50為78.42mg.kg:d—、在40mg.kg—'.d—'之下各劑量組，動物無死亡，且體重與正常組間比較，無明顯差異。實施例4:阿比朵爾在乳鼠體內的抗漢坦病毒作用隨機將乳鼠分組(F30/組)，即正常對照組、安慰劑對照組、5mg/kg/d組、10mg/kg/d組、20mg/kg/d組。將正常對照組顱內注射2%MEM培養基，其余組顱內接種20W100LDs。的漢坦病毒。灌藥起始時間為-24h、+24h(以接種病毒時間為Oh)，按體重分別灌胃以0.5%羧甲基纖維素混懸的不同濃度藥物2(H4qd，正常對照組與安慰劑對照組灌20W0.5y。羧甲基纖維素，各組動物每日稱重，根據體重變化調整灌胃藥物濃度，連續灌藥10天。于28天內觀察動物癥狀體征的變化及死亡率。分別于感染后4、8、12、16天處死4只動物，取肺、腦、腎及血清。各組織樣本1/3經4%多聚甲醛固定，病理切片；1/3用于冰凍切片，間接免疫熒光(IFA)檢測病毒抗原；余下部分，提取組織總RNA，半定量RT-PCR檢測病毒mRNA表達水平。存活動物28d處死，處理同前。血清中TNF-a含量以雙抗體夾心法ELISA檢測。實驗結果為感染后ll-13d內動物出現體重減輕，聳毛，弓背，尾強直，反應性增高，后肢癱瘓，發病后三天內死亡。在肺、腎、腦組織中可檢測到病毒'的特異性抗原。器官組織勻漿液接種至Vero-E6細胞15d,IFA法可在胞漿中檢測到翠綠色的顆粒狀或片狀熒光。提前給藥組中，10mg/kg/d、20mg/kg/d組動物出現癥狀的時間較安慰劑對照組晚，且癥狀輕微，初始死亡時間延后，存活鼠發病后7-10d癥'狀逐漸消失，體重恢復正常。5mg/kg/d組與安慰劑對照組間在出現癥狀的時間及病情輕重上均無差異；感染后給藥組中，10mg/kg/d組、20mg/kg/d組出現癥狀時間較對照組延后。經阿比朵爾感染前給藥，10mg/kg/d、20rag/kg/d組存活率為33.3%，60%，平均生存天數為21.50、23.80d，與安慰劑對照組比較，顯示統計學差異，代0.05，5mg/kg/d組的存活率及平均生存天數與安慰劑對照組比較，無統計學差異，/">0.05;感染后給藥，各組動物存活率均為0，10mg/kg/d、20mg/kg/d組的平均生存天數分別為16.44、16眉，與安慰劑對照組比較，有統計學差異(代0.Q5)。結果見圖3實驗結果提示，感染后12天，可明顯降低用藥組動物肺組織中病毒抗原的表達，感染后28天的存活動物腦組織中病毒抗原消失，除1只動物外，肺組織與腎組織中亦無病毒抗原表達。見表3。表3阿比朵爾對漢坦病毒感染乳鼠組織中病毒抗原表達的作用官20mg/kg/d.10mg/kg/d5mg/kg/dplacebocontrols12dpi28dpi12dpi28dp12dpi28dpi12dpi28dpi++++++/+++ND+++/+++NDb+b++++/+++++/+++++/+++ND+++/+++NDb十b++++/++++-/++++/+++ND+++/+++NDb_^_b+_a.熒光以"+"判斷.-0%;+00/。~25%;++25%~50o/o;+++50%~750/o;++++75%~100%;b.感染28天無存活動物ND:未檢測實驗結果提示，感染后12天，可明顯減輕用藥組動物肺組織中病理改變，感染后28天的存活動物肺組織中病變消失，腦組織與腎組織中出血灶減少。半定量RT-PCR結果顯示，感染后4天，組織中檢測不到病毒mRNA;感染后8天，用藥組動物肺組織中病毒mRNA水平表達下降，呈劑量效應；感染后16天，用藥組動物肺、腦組織中病毒mRNA水平表達下降，呈劑量效應，腎組織大劑量組(20mg/kg/d)mRNA水平表達下降。結果見圖4.血清中TNF-a檢測結果表明，感染后第4天，病毒對照組可誘生高水平的TNF-a(183.58pg/ml)，各用藥組TNF-a血清水平降低，呈劑量效應。見表4。實施例5:阿比朵爾治療流行性出血熱(HFRS)的臨床研究采用隨機、雙盲和安慰劑對照的臨床實驗設計。受試對象為年齡》18歲，《65歲；發熱》37.8。C，HFRSIgM抗體陽性，符合HFRS病例診斷標準；出現癥狀后不超過36h，共入組32例。合格的受試者隨機接受阿比朵爾膠囊治療或安慰劑治療，300mg/次，2次/d,歷時5d。實驗結果顯示按照規定服用藥物并完肺+/++-/+腎+++-/+腦+++-成所有隨訪且實驗室檢查證明為漢坦病毒感染的病例，實驗組為16例，對照組為16例。兩組疾病緩解率經生存分析Logrank檢驗，試驗組緩解率高于對照組。試驗組疾病持續時間中位數為76h，對照組疾病持續時間中位數為98h，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)。試驗組癥狀總分下降值的曲線下面積中位數為758，對照組中位數為632，兩組經Wilcoxon檢驗差異有顯著性(P<0.01)。所有受試對象未出現明顯的可能與研究藥物有關的不良反應。實驗結果表明阿比朵爾在HFRS發病后早期使用可以縮短疾病的持續時間，減輕癥狀的嚴重程度和死亡率，對HFRS有很好的治療作用，而且安全性和耐受性好，適合在臨床使用。表4阿比朵爾對漢坦病毒感染乳鼠血清中TNF-a的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a.感染前24h起始灌胃10db.最低檢測限為15.63pg/mlc.病毒對照組灌胃0.5%羧甲基纖維素ND:未檢測**與病毒對照組比較，^<0.01。權利要求1、一種阿比朵爾在制備治療或預防漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種抗漢坦病毒藥物阿比朵爾的用途，阿比朵爾在體外具有明顯抑制漢坦病毒的作用，病毒進入細胞前給藥抗病毒作用強于病毒進入細胞后給藥。具體體現在感染前給藥及感染后給藥，病毒感染細胞陽性率、熒光強度隨濃度增加下降，具有劑量效應；可明顯降低病毒感染陽性率，病毒mRNA表達下降。阿比朵爾對乳鼠感染漢坦病毒具有保護和治療作用，保護作用強于治療作用。感染前24h給藥，隨著藥物劑量的增加，小鼠死亡率降低，平均生存天數延長。感染后24h給藥組，不能提高動物的生存率，但可延長動物的平均生存天數。阿比朵爾在動物體內對漢坦病毒具有抑制作用。感染前24h給藥，可減輕組織(肺、腎、腦)病理改變，對HFRS有治療作用。該藥物對漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱(HFRS)病人既有預防作用，也有治療作用，未發現毒副作用。文檔編號A61K31/404GK101461805SQ20091006053公開日2009年6月24日申請日期2009年1月16日優先權日2009年1月16日發明者劉穎娟,楊占秋,王又又,石麗橋,凡羅,紅肖,鄧海英,瓊鐘申請人:武漢大學