β-欖香烯脂質體及凍干粉的制備方法

專利名稱：：β-欖香烯脂質體及凍干粉的制備方法
技術領域：
：本發明涉及3-欖香烯脂質體及凍于粉的制備方法，屬醫藥領域。
背景技術：
：P-欖香烯(P-elemene)是從中藥溫莪術(CurcumawenyujinY.H.ChenetC丄ing)中提取分離得到的單體，是強脂溶性藥物，目前己開發出口服乳劑與注射用乳劑用于臨床治療惡性腫瘤。e-欖香烯脂溶性大，刺激血管和組織，用藥時出現疼痛、發熱等癥狀，影響在臨床上的推廣應用，將3-欖香烯制成脂質體注射液，可降低對注射部位的刺激，起到緩釋和耙向作用。脂質體(liposomes)的載體材料磷脂類和膽固醇類，具有類似生物膜的雙分子層結構。脂質體根據其結構和所包含的雙層磷脂膜層數，可分為單室脂質體和多室脂質體。凡由一層類脂質雙分子層構成者稱為單室脂質體，它又分大單室脂質體(LUVs，教徑在0.1-lum之間)和小單室脂質體(SUVs，粒徑0.02-0.08um，亦稱納米脂質體)。由多層類脂質雙分子層構成的稱為多室脂質體(MLVs)，粒徑在l-5um之間。單室脂質體中水溶性藥物的溶液包封于類脂質雙分子層所形成的空腔中，脂溶性藥物則分散于雙分子層中。多室脂質體中有幾層脂質雙分子層將被包含有水溶性藥物的水膜分開，形成不均勻的聚合體，脂溶性藥物則分散于幾層雙分子層中。脂質體的制備方法較多，如薄膜分散法、逆相蒸發法、冷凍干燥法、注入法和超聲波分散法、pH梯度法、前體脂質體法等。凡經超聲波分散的脂質體混懸液，絕大部分為單室脂質體；LUVs通過膜濾后也可得到SUVs。即使相同的原料藥物制備成脂質體，采用不同的制備方法，制備的脂質體的理化性質不同，藥效也不相同。載藥脂質體具有細胞親和性和靶向性，載藥脂質體進入體內可被巨噬細胞作為外界異物而吞噬，脂質體以靜脈給藥時，能選擇地集中于網狀內皮系統，70%-89%集中于肝、脾，可用于治療肝腫瘤和防止腫瘤擴散轉移。(崔福德，藥劑學，人民衛生出版社，2008年1月第6版)。脂質體的粒徑大小直接影響藥物的生物利用度，大的脂質體缺乏血管通透性，不能通過肝血管的狄氏間隙，小于150mn的脂質體不易被肝、脾所攝取，因此應嚴格控制脂質體的大小范圍100400nm之間(楊秀芬.藥物脂質體的穩定性[J].國外醫學藥學分冊，1990，17(1):19-22.)。3目前報道的P-欖香烯脂質體具有抗腫瘤、免疫增強等作用。如高天慧等，脂質體瘤苗抗小鼠H22腹水型肝癌作用研究，胃腸病學和肝病學雜志，2005年第14巻第04期，報道了P-欖香烯對脂質體瘤苗抗小鼠H22肝癌的免疫增強作用；雷冬梅等，欖香烯對人胃腺癌BGC-823細胞中HPA表達的影響，中國現代醫生-2008年第24期，報道了欖香烯對人胃腺癌BGC-823細胞中HPA表達的影響的研究。作者認為欖香烯通過降低胃腺癌細胞HPA蛋白表達水平，從而遏制了腫瘤血管、淋巴管轉移，為腫瘤靶向治療提供了理論基礎和實驗依據；朱永堅等，納米脂質體承載欖香烯誘導C6膠質瘤細胞凋亡的實驗研究，中國中西醫結合雜志，2008年,第7期，報道了欖香烯具有促進C6膠質瘤細胞凋亡和Caspase-3蛋白表達的作用，經納米脂質體承載后欖香烯的這種作用有增強的趨勢。吳琳華等，e-欖香燁脂質體在大鼠體內的藥動學研究，中國中醫藥科技2007年11月第14巻第6期，指出在進行體內分布實驗之前還不能得到有關此脂質體是否具有靶向及緩釋作用的結論。宋笑丹等，(3-欖香烯脂質體在大鼠體內的組織分布，中國藥學雜志，2007年第42巻第19期，與欖香烯注射液相比，e-欖香烯脂質體在大鼠體內的分布特性有不同程度的改變，P-欖香烯脂質體及欖香烯注射液在大鼠的心、脾、腎組織中分布具有顯著性差異。宋笑丹等，3-欖香烯脂質體的制備及其在大鼠體內的組織分布，中國新藥與臨床雜志，2007年第26巻第IO期，采用薄膜分散法制備P-欖香烯脂質體，P-欖香烯脂質體在肝、脾、腎組織中分布相對較多，在心臟中分布較少，3-欖香烯脂質體在大鼠體內的分布特性有不同程度的改變，可提高療效，降低心臟毒性。專利文獻及非專利文獻報道的P-欖香烯脂質體制備方法為單用乙醇注入法、反相蒸發法、擠出法、機械法等或者聯用超聲-擠壓過濾法、薄膜超聲分散法等，其中，超聲波分散法或薄膜超聲分散法制備脂質體更適合于水溶性藥物脂質體的制備，雖然能制備脂質體，但所制得的脂質體包封率不高，制備量極小；薄膜分散法吹膜時有團塊凝結，較厚，抽真空時起泡太少，水合時粘在試管壁上，顆粒大，成塊，擠壓濾過也困難，影響其制備收得率。另外，由于脂質體的粒徑大小直接影響其生物利用度，采用目前公開的方法制備的脂質體多針對多個靶向器，不能確定其針對哪些器官有較佳的效果。如針對P-欖香烯固體脂質納米粒的報道王艷芝等，RP-HPLC法測定固體脂質納米粒中e-欖香烯的含量，沈陽藥科大學學報，2005年第22第4期；固體脂質納米粒中P-欖香烯含量的氣相色譜法測定，鄭州大學學報，2008年第43巻第1期，報道了固體脂質納米粒中6-欖香烯的含量和包封率的測定方法研究。該研究人員還報道了工藝因素對超聲-擠壓過濾法制備P-欖香烯固體脂質納米粒(SLN)平均粒徑的影響的研究。其方法為，以超聲-擠壓過濾法制備P-欖香烯SLN，研究超聲強度、超聲時間以及制備溫度等因素對其平均粒徑的影響。結果表明，絕大多數p-欖香烯脂質體的平均粒徑小于150nm。其平均粒徑隨超聲時間的延長和制備溫度的提高而有所下降,但是受持續超聲時間的影響較小；考察的制劑中，在超聲強度為400W、超聲溫度為80°C、超聲時間為6min條件下制備的3-欖香烯SLN的平均粒徑最小。該研究的結論認為，采用超聲-擠壓過濾法可制備e-欖香烯SLN，超聲強度、總體超聲時間以及溫度等是影響其平均粒徑的主要工藝因素。劉紅梅等，薄膜-超聲分散法制備P-欖香烯固體脂質納米粒，中草藥2008年第39巻第2期，則報道采用薄膜-超聲分散法制備，并以包封率為指標采用正交設計法優化P-欖香烯固體脂質納米粒的制備工藝的研究。結果所得P-欖香烯固體脂質納米粒的最佳制備條件是e-欖香烯20iiL，卵磷脂90mg，硬脂酸90mg，2.5X聚山梨酯805mL，2.5%泊洛沙姆1885mL。該研究結論認為該處方可用于e-欖香烯固體脂質納米粒的制備，工藝可行。申請號02117219.6，發明名稱:欖香烯注射劑及其制備方法和用途，涉及(3-欖香烯納米脂質體劑型，前體脂質體劑型，長循環脂質體劑型，長循環納米脂質體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質納米球劑型和脂肪乳劑型。其制備方法是用總倍半砲類含量>70%的從植物中提取的提取物作為原料，添加表面活性劑，利用旋轉蒸發儀成膜或C02臨界或超臨界方法來混合均勻，添加注射用水，進行高壓均質化處理和/或超聲波處理，一直處理到獲得分散相平均粒徑《100nm的穩定水性分散體為止，從而制得注射劑，其中提取物與表面活性劑的重量比是0.5-1.5:3.5-6.0，注射劑總倍半萜烯類的最終濃度為1~10mg/ml。杜霞等，P-欖香烯脂質體的制備方法及質量研究，中國醫院藥學雜志，2007年第27巻第12期，報道了通過測定包封率，正交設計優選P-欖香烯脂質體制備工藝，將一定比例的卵磷脂和膽固醇溶于氯仿內，置于旋轉蒸發器中，減壓回收氯仿成膜。另取pH磷酸鹽緩沖液適量，置于成膜的梨形燒瓶中，旋轉將膜洗下，超聲處理10min。將一定量的P-欖香烯樣品與等量的無水乙醇稀釋后，加入到超聲后的溶液中繼續超聲40min，該方法是將薄膜分散法與超聲分散法聯合使用，制備的脂質體的粒徑是152.3nm。黃漢昌等，e-欖香烯脂質體的制備工藝研究，中草藥，2006年第37巻第12期，報道確定了3-欖香烯脂質體較佳的配方組成和制備方法，對薄膜水化(TFH)、逆相蒸發(REV)和REV結合高壓擠壓法制備P-欖香烯脂質體的方法進行了比較,優選出較優的制備方法;光子相關衍射法測量P-欖香烯脂質體的粒徑;氣相色譜法測定包封率。其結果表明，薄膜水化法制備的P-欖香烯脂質體的包封率大于逆相蒸發法脂質體的包封率，但該法不易于批量生產。逆相蒸發法脂質體經高壓擠壓后在一定擠壓程度內，粒徑減小、包封率和載藥量增加。綜上可知，不同的制備方法制備的脂質體的粒徑、包封率等理化性質是不同的，更由于其中藥物的復雜藥效，決定了制備的脂質體具有多種藥效和不同的靶向性。目前尚無3-欖香烯脂質體用于主要用于肝靶向的報道，也沒有制備成這種特定藥效的P-欖香烯脂質體的制備方法的報道。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供了一種主要用于肝組織耙向的P-欖香烯脂質體的制備方法。本發明提供了3-欖香烯脂質體的制備方法，它包括下述步驟a、取磷脂、膽固醇、P-欖香烯，其中e-欖香烯與磷脂的重量比為1:(0.7-4.7)，磷脂與膽固醇的摩爾比為(40-80):(60-20);加無水乙醇溶解，以注射器注入磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩；b、通過擠壓器擠壓，得脂質體混懸液，脂質體為大單室脂質體。a步驟所述的e-欖香烯與磷脂的重量比為1:2.7，磷脂與膽固醇的摩爾比為55:45;a步驟中磷酸鹽緩沖溶液與磷脂、膽固醇、P-欖香烯的無水乙醇溶解物的體積比與為14:1;所述的磷脂為卵磷脂、大豆磷脂。進一步優選地，所述的磷脂為蛋黃卵磷脂。其中，所述的b步驟中擠壓過程采用擠壓器擠壓，400nm濾膜一次，200nm濾膜二次，氮氣壓力為2Mpa。其中，a步驟所述的P-欖香烯的提取方法為采用G-排式同步精餾裝置進行多排式同步精餾取收集到的餾份，加入一條精密分餾柱下的燒瓶內進行精密分餾，再進行二次分離；所得的餾份為原料進行二次硅膠柱層析，干法裝柱；用石油醚306(TC進行洗脫，去溶劑，制得重量百分含量為98.0%以上的e-欖香烯。本發明還提供了一種P-欖香烯脂質體凍干粉的制備方法，它是由上述制備方法制備得到的脂質體混懸液，加乳糖、維生素E，進行冷凍干燥，將凍干粉無菌分裝，即得。其中，c步驟所述的乳糖、維生素E的用量與e-欖香烯的重量配比為e-欖香烯2-16份、乳糖20-150份、維生素E0.1-6.0份。進一步優選地，c步驟所述的乳糖、維生素E的用量與P-欖香烯的重量配比為P-欖香烯8.74份、乳糖71.52份、維生素E0.94份。其中，c步驟所述的冷凍干燥的條件為預凍溫度為-45'C，預凍時間為6小時，開始抽真空，并升溫至-4(TC，保持8小時；再升溫至-3(TC，保持66小時；升溫至-20°C，保持6小時；升溫至-l(TC，保持4小時；升溫至0。C，保持4小時；升溫至15。C，保持3小時；升溫至30。C，保持3小時。其中，a步驟所述的e-欖香烯的提取方法為采用G-排式同步精餾裝置進行多排式同步精餾取收集到的餾份，加入一條精密分餾柱下的燒瓶內進行精密分餾，再進行二次分離(e-欖香烯含量為93.0%以上)。所得的餾份為原料進行二次硅膠柱層析，干法裝柱。用石油醚G06(TC)進行洗脫，去溶劑，制得98.0%以上的0-欖香烯。本發明還提供了上述方法制備的P-欖香烯脂質體凍干粉，其中P-欖香烯脂質的平均粒徑為150nm300nm;包封率為90%-96%。進一步優選地，P-欖香烯脂質的平均粒徑為218nm-262nm;更進一步優選地，,-欖香烯脂質的平均粒徑為240nm-262nm。本發明方法制備的脂質體屬于大單室脂質體，用于肝靶向給藥。本發明方法聯合采用乙醇注入-擠壓-冷凍干燥法制備P-欖香烯脂質體，乙醇注入與擠壓法聯用，制得的P-欖香烯脂質體粒徑更均勻，包封率更高，將P-欖香烯脂質體混懸液冷凍干燥，制成凍干粉，增加了脂質體的穩定性，防止了其在液體中的泄漏，制得的P-欖香烯脂質體平均粒徑為230nm左右，符合肝靶向的要求；三批試制樣品平均包封率達93.60%,—次性制備量為100g，收得率平均95.66%，高于目前報道的e-欖香烯的制備方法，且通過藥效試驗證明，本發明e-欖香烯脂質體對肝癌的治療能發揮其最大功效，其對肝組織靶向性最強，還具有一定緩釋作用，藥效明顯，為臨床治療肝癌提供了一種新的選擇。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。具體實施例方式實施例l本發明P-欖香烯脂質體的制備取卵磷脂16.61g、膽固醇6.91g、e-欖香烯8.74g，加乙醇50ml溶解，以注射器緩緩注入磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8，油水體積比為1:14)中，振蕩40分鐘，再通過擠壓器，400nm濾膜一次，200nm濾膜二次，氮氣壓力約2Mpa，得脂質體混懸液。本發明方法可使用Lipex(B)擠壓器(加拿大北方脂質體公司制造)，也可以采用目前市售的其它擠壓器。實施例2本發明脂質體凍千粉的制備取所得脂質體混懸液加乳糖71.52g、維生素E0.94g，按以下條件進行冷凍干燥預凍溫度為-45r，預凍時間為6小時，開始抽真空，并升溫至-40'C，保持8小時；再升溫至-3(TC，保持6小時；升溫至-20°C，保持6小時;升溫至-l(TC，保持4小時；升溫至(TC，保持4小時；升溫至15"C，保持3小時；升溫至3(TC，保持3小時。將凍干粉無菌分裝，即得。實施例3e-欖香烯的制備采用G-排式同步精餾裝置進行多排式同步精餾取收集到的餾份，加入一條精密分餾柱下的燒瓶內進行精密分餾，再進行二次分離(P-欖香烯含量為93.0%以上)。所得的餾份為原料進行二次硅膠柱層析，干法裝柱。用石油醚(30~60°C)進行洗脫，去溶劑，制得純度大于98.0%的0-欖香烯。進一步詳細的制備0-欖香烯的工藝為取莪術揮發油，采用G-排式同步精餾裝置進行多排式同步精餾，真空度為l3HHmg，收集柱溫為7888。C的餾份，取收集到的餾份，加入一條精密分餾柱下的燒瓶內進行精密分餾，精密分餾柱內以2.5mmX2.5mmQ型不銹鋼為填料，真空度為l3HHmg，收集柱溫為90110。C的餾份(e-欖香烯含量為93%以上)。按以上條件進行二次分離，真空度為25，溫度范圍為86~93°C，分餾比為5:l或4:1，反應時間為10小時，最佳條件為真空度2，分餾比5:1，反應時間10小時，三個餾份，86~88°C、8990。C及91~93°C，e-欖香烯主要處于8990。C的餾份中，接收899(TC的餾分。再同法操作，重新進行一次，也收集899(TC的餾分，其中精餾柱高l.4m，直徑6cm，內裝用120目不銹鋼巻3mmX3mm空心圓柱體為填料，塔板數為N=40。所得的餾份為原料進行柱層析。玻璃柱長100cm，直徑10cm，用115125'C活化1.5小時后的硅膠(薄層層析硅膠H，粒度1015um)2kg，冷后干法裝柱。用石油醚G060。C)進行洗脫，每接收200ml為一序號。收集No.33~56洗脫液(收得率6%)，去溶劑，經鑒定為e-欖香烯及Y-欖香烯。將所得產品再上柱，收集No.3356洗脫液，去溶劑，即得。實施例4本發明脂質體凍干粉的制備取所得脂質體混懸液加乳糖20g、維生素E0.1g，按實施例2的方法制備成脂質體凍干粉。實施例5本發明脂質體凍干粉的制備取所得脂質體混懸液加乳糖150g、維生素E6g，按實施例2的方法制備成脂質體凍干粉。實施例6本發明脂質體及制備工藝的篩選試驗一、輔料的選擇不同的磷脂如卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿等的質量對脂質體包封率及穩定性的影響較大，國內脂質體的制備多用大豆磷脂，不穩定。蛋黃卵磷脂純度高，經試驗預試，用注入法制得e-欖香烯脂質體混懸液，室溫下放置15天較穩定。確定用蛋黃卵磷脂，符合衛生部藥品標準二部第6冊卵磷脂標準。膽固醇為上海伯奧生物科技有限公司生產，符合衛生部藥品標準二部第6冊膽固醇標準。e-欖香烯脂質采用實施例3的方法制備。采用乙醇注入法，按處方比例分別以卵磷脂和大豆磷脂制備3-欖香烯脂質體混懸液，所得脂質體質量及在室溫下放置15天后質量變化情況如下表:所用磷脂類別制備時脂質體質量放置15天后￥，，徑包封率(％)氧化指數(咖)平均粒徑(nm)包封率(％)氧化指數.卵磷脂26382.060.12128676,810.209大豆磷脂26171.390.12429441.270.276從結果可以看出，制備時P-欖香烯脂質體質量以卵磷脂制備的e-欖香烯脂質體，其在包封率和氧化指數較以大豆磷脂制備的脂質體質量更優，放置15天后，以卵磷脂制備的P-欖香烯脂質體包封率明顯降低，氧化指數明顯升高，即質量明顯下降，表明以卵磷脂制備的0-欖香烯脂質體質量較優,穩定性較好。二、制備方法的篩選脂質體常用的制備方法有薄膜分散法、逆相蒸發法、注入法、冷凍干燥法、融熔法、PH梯度法等。由于P-欖香烯為強脂溶性藥物，適用于薄膜分散法、注入法等制備。因此，按蛋黃卵磷脂與膽固醇之摩爾比為i:i，磷脂質量與e-欖香烯質量比為io:i的處方比例，分別用薄膜分散法和注入法制備，結果如下(1)薄膜分散法取蛋黃卵磷脂209.0mg、膽固醇86.9mg、P-欖香烯110.0mg于試管中，加氯仿約2.5ml溶解，以N2吹成膜，在-0.1Mp真空下抽干溶劑(約2小時)，加入20ml磷酸鹽緩沖溶液(PH6.8)中，振蕩30分鐘。實驗結果吹膜時有團塊凝結，較厚，抽真空時起泡太少，水合時粘在試管壁上，顆粒大，成塊。因此，薄膜分散法不適宜制備P-欖香烯脂質體。(2)注入法取蛋黃卵磷脂209.0mg、膽固醇86.9mg、P-欖香烯110.0mg于試管中，加乙醇約2.5ml溶解，以注射器注入20ml磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8)中，振蕩30分鐘。再通過擠壓器，以控制脂質體的粒徑大小。擠壓過程為400nm濾膜一次，200nm濾膜二次，氮氣壓力約2MPa。實驗結果注入法制得的脂質體混懸均勻，室溫放置5天后未分層，表明注入法制備e-欖香烯脂質體可行。三、工藝條件的篩選注入法制備脂質體的影響因素有蛋黃卵磷脂與膽固醇之比(摩爾比)、9藥物與磷脂量之比(質量百分比)、加緩沖溶液比例(藥物、磷脂量之和與所加緩沖溶液體積比)、振蕩時間、孔徑、擠壓次數等，本試驗采用均勻試驗的方法以包封率為指標對以上因素進行篩選。1、e-欖香烯含量測定方法(1)材料與方法(2)儀器TRACEGC型氣相色譜儀；檢測器FID。(3)藥品與試劑欖香烯(樂清市溫特莪術油研究所，批號:050301)無水乙醇(西安化學試劑廠)，正辛醇(西安化學試劑廠)。(4)標準液和內標液的配制對照品溶液的制備精密稱取e-欖香烯對照品98.2mg，置50ml容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為P-欖香烯母液。內標溶液的制備精密稱取正辛醇110.Omg置25ml容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內標溶液。供試品溶液的制備精密吸取P-欖香烯脂質體溶液lml，置10ml容量瓶中，精密加入內標溶液lml，再加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。陰性樣品溶液的制備精密吸取空白P-欖香烯脂質體溶液lml，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。(5)色譜條件色譜柱SE-54。汽化室溫度240°C，檢測室溫度240°C，程序升溫，14(TC保持4.5分鐘，然后以40。C/min的速率升至185。C，再保持8分鐘。載氣氮氣30ml/min，氫氣80ml/min，空氣350ml/min。流速1.5。分流比10:1，range:l(Tl.(6)專屬性考察分別吸取對照品溶液及內標溶液，注入氣相色譜測定，P-欖香烯保留時間為10.4分鐘，正辛醇保留時間為4.41分鐘，再注入空白脂質體溶液，對對照品和內標物均無干擾。(7)線性關系精密吸取e-欖香烯母液O.1、0.5、1、2、4、8ml，分別置10ml容量瓶中，各加入內標溶液lml，加入無水乙醇定容，分別進樣2ul進行測定。以樣品與內標的峰面積之比(Y)對濃度(X)進行線性回歸。結果見表l。表l線性關系的考察結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實驗結果表明樣品在0.02002~1.6016mg/ml范圍內線性關系良好。2、包封率的測定常用的包封率測定方法有離心法、透析法、凝膠柱層析法、導數光譜法等，本試驗采用超濾法測定。超濾法是一種能夠將溶液進行凈化、分離或者濃縮的膜透過法分離技術，超濾非對稱結構的多孔膜孔徑為120nm，主要濾除5100nm的顆粒。本實驗采用了A/G超濾器超濾，此方法耗時短，脂質體樣品不需稀釋即可超濾，可降低稀釋所帶來的藥物滲漏，且超濾加樣回收率良好，可用于卩-欖香烯脂質體的測定。本實驗超濾器所用超濾柱為UFP-300-C-MMO6A切向流超濾柱，其聚砜膜截留相對分子量為30000，可以阻滯脂質體的濾過，而p-欖香烯的相對分子量很小為204，可順利透過超濾膜。(1)游離藥物超濾加樣回收率精密稱取e-欖香烯適量，加入到空白脂質體混懸液中，使P-欖香烯濃度分別為0.1001、0.2002、0.8008mg/ml，取上述溶液各10ml至超濾器中進行超濾，按以上色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表2。表2游離藥物超濾加樣回收率實驗結果加入濃度(mg/ml)測得濃度(mg/ml)回收率％平均值/%0.10010.097297.100.20020.191695.7096.88%0.80080.783597,84(2)超濾膜對空白脂質體截留能力的考察取空白脂質體混懸液10ml至超濾器中進行超濾，收集濾液，用定磷法測定濾液中磷的含量。結果表明，濾液中檢測不到磷，說明超濾器對脂質體能夠完全截留。(3)包封率的測定取P-欖香烯脂質體10ml蒸餾水復溶，至超濾器中超濾，收集濾液，精密量取該濾液適量，用無水乙醇稀釋至適當濃度進行測定，計算游離藥物含量m，精密稱取P-欖香烯脂質體，用無水乙醇溶解并稀釋至適當濃度測定，計算脂質體中藥物總含量m,g,，并計算包封率。包封率二(mrm^/nuX10(Fo。3、均勻實驗設計蛋黃卵磷脂與膽固醇之比(摩爾比)、藥物與磷脂量之比(質量百分比)、加緩沖溶液比例(油水體積比)、振蕩時間(min)四個因素各擬9水平，因素水平表見下表11表3均勻設計實驗因素水平表因素水平A蛋黃卵磷脂與膽固醇之比B藥物與磷脂量之比c加緩沖溶液比例D振蕩時間135:651:o.7620240:601.1.2825345:5511.71030450:5012.21235555:4512.71440660:4013.21645765:3513.71850870:3014.22055975:2514.72260根據均勻實驗方法，按U(94)表安排實驗。表4均勻實驗表列號因素試驗結果YABCD包封率(％)1137966.262264883.37試3391774.814428678.43驗5555593.986682476.35號7719371.228846273.179973155.34根據實驗結果分析，5號為最佳試驗結果，即最佳工藝條件為蛋黃卵磷脂與膽固醇之比(摩爾比)為55:45、藥物與磷脂量之比(質量百分比)為1:2.7、加緩沖溶液比例(油水體積比)為1:14、振蕩時間40min，再通過擠壓器，以控制脂質伴的粒徑大小。擠壓過程為400nm濾膜一次，200nm濾膜二次，氮氣壓力約2MPa。4、脂質體的粒徑(1)粒徑的選擇脂質體的粒徑大小直接影響其生物利用度，大的脂質體缺乏血管通透性，不能通過肝血管的狄氏間隙，小于150nm的脂質體不易被肝、脾所攝取，因此應嚴格控制脂質體的大小范圍100400nm之間。P-欖香烯脂質體用于治療肝癌，需要其在肝聚集，所以將P-欖香烯脂質體的粒徑控制在150nm300nm之間。(2)粒徑的測定采用激光散射粒徑儀(Nicomp370submicronparticlesizer，SantaBurbara，CA，制造)測定脂質體粒徑，它是一種基于光全散射原理的新型顆粒粒度儀，用于測量超細顆粒的粒度分布，顆粒粒徑測量范圍為0.001~100um。(3)擠壓方法對粒徑的影響分別通過擠壓和通過高壓乳勻機20分鐘的粒徑變化考察:表5擠壓和高壓乳勻前后粒徑變化結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>小不均勻，通過擠壓后平均粒徑180nm，粒徑均勻，通過高壓乳勻后粒徑為llOmn，粒徑較均勻，本制劑要求將e-欖香烯脂質體的粒徑控制在150nm300nm之間，因此選擇擠壓。5、滅菌脂質體不宜加熱滅菌，其滅菌方法國外通常采用的是加抑菌劑或濾過除菌，如用200400nm濾膜過濾。本制備方法在控制粒徑時即是通過400nm濾膜一次，通過200nm濾膜兩次，已經達到滅菌效果，因此只需無菌環境下進行工藝制備操作，不需再滅菌。6、冷凍干燥按優化工藝制備的P-欖香烯脂質體是混懸液，根據考察結果，其在室溫條件下和冷凍保存條件下的穩定性都不太好，為提高脂質體的穩定性，考慮將脂質體混懸液通過冷凍干燥使之成為凍干粉，臨用前加注射用水重建。6.1冷凍參數的篩選以外觀、水分和包封率為指標進行篩選，取適量3-欖香烯脂質體混懸液，加入10%乳糖，分別按以下條件A、B、C進行冷凍干燥包封率的測定取凍干后的e-欖香烯脂質體凍干粉，加注射用水2.4.2所確定的包封率的測定方法測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表7冷凍干燥條件篩選結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分別以條件A、B、C進行冷凍干燥，實驗結果顯示，三種條件所制得的成品水分均符合標準，條件B、C所制得成品外觀性狀優于條件A，而條件B所制得的成品包封率較高，條件C所制得的成品包封率低，因此，擬選擇冷凍干燥條件為B:即預凍溫度為-45t:，預凍時間為6小時，開始抽真空，并升溫至-40°C，保持8小時；再升溫至-3CTC，保持6小時；升溫至-20°C，保持6小時；升溫至-l(TC，保持4小時；升溫至0。C，保持4小時；升溫至15。C，保持3小時；升溫至30"C，保持3小時，得成品。6.2支撐劑的選擇冷凍干燥常用的支撐劑有甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻酸、蔗糖等。而所加比例一般為固形物的9%12%。分別以甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻酸、蔗糖為支撐劑，每種支撐劑所加比例分別為6%、9%、12%,按上冷凍干燥條件進行冷凍干燥，考察凍干粉的外觀性狀。評價指標外觀以可以維持原液體積，不塌陷，不皺縮，表面光潔為佳。色澤以均勻，無花斑，質地細膩為佳。再分散性，取各凍干產品，加注射用水2ml，振搖后能在30s之內完全溶解均勻為佳。表8支撐劑及其用量考察結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表可知9%和12%乳糖為凍干支撐劑，凍干品均無氣泡，無塌陷，無皺縮，表面光潔，呈白色，色澤均勻，無花斑，質地細膩，加注射用水2ml，振搖后能在30s之內完全溶解均勻。而考慮盡可能載藥量大，故確定以9%乳糖作為(3-欖香烯脂質體的凍干支撐劑。6.3凍干粉復溶后與凍干前混懸液的粒徑及包封率的比較.在脂質體凍結過程和升華干燥過程中由于塌陷等原因可能引起脂質體粒徑變化，還可能會引起脂質體包容藥物的泄漏(即引起包封率的變化)，影響其在體內的作用效果。因此，以判斷脂質體藥物質量兩個重要指標——脂質體粒徑及包封率對凍干粉復溶后與凍干前混懸液的粒徑及包封率進行了比較。表9凍干前后粒徑及包封率變化結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結果表明，本品凍干前后粒徑有所增大，但變化不大，包封率變化亦不大，而冷凍干燥可以大大增加樣品的穩定性，所以本研究采用冷凍干燥法將脂質體混懸液冷凍干燥成凍干粉。6.4抗氧化劑維生素E加入量的考察卵磷脂易氧化，因此制備脂質體時必須使用抗氧化劑。維生素E因其氧雜萘滿環上6-位羥基氫可提供自由基給過氧化物自由基，使其失活，可終止脂肪酸過氧化反應，是一種常用的脂質體抗氧化劑。因此，在制備前加入適量維生素E，以防止脂質體氧化。為考察維生素E的用量，在制備時分別加入卵磷脂2%、4%、6。/。的維生素E，分別放置l、2、5、10、15、20、30日，測定脂質體的氧化指數。維生素E加入量的考察結果見下表表IO維生素E加入量考察結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>根據以上實驗結果，表明加入4%維生素E后可明顯防止脂質體的氧化，因此，在工藝制備時加入4。/。維生素E。以下通過具體藥效學試驗證明本發明的有益效果。試驗例l3-欖香烯脂質體在大鼠體內分布試驗將24只大鼠隨機分為4組，雌雄各半，給藥前禁食不禁水16h。第4組為正常對照組，"生理鹽水，其余3組iv實施例2制備的3-欖香烯脂質體凍干粉100mg/kg。給藥組分別于注射后15min、30min、180min各取6只大鼠于頸動脈插管取血并處死，離心取血清，置-2CTC冰箱備用；剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、脂肪，置-2(TC冰箱備用。對照組同法處理。實驗時稱取各臟器組織，在冰浴下用生理鹽水制成組織勻漿，測定藥物含量及血清藥物濃度c各組織分布結果:__含暈(Ug/g)組織-^-OASg-10n組織/血槳比值(15min時)15min30min180min為正確的評價本發明e-欖香烯脂質體的肝靶向性，建立了e-欖香烯在小鼠體內的含量測定方法，通過組織中最高藥物濃度、組織/血漿比值等靶向性指標的分析，與文獻報道P-欖香烯注射液相比較，欖香烯脂質體在肝、脾、肺的藥物濃度較高，說明脂質體可明顯提高藥物在這些組織器官中的分布，對肝、脾、肺均有靶向性，而肝組織中藥物濃度在15、30、180min均為各組織中最高，因此，P-欖香烯脂質體用于對肝癌的治療能發揮其最大功效，其對肝組織耙向性最強，而且30min、180min的藥物濃度消除較緩慢，說明本發明P-欖香烯脂質體不僅有靶向作用，還具有一定緩釋作用。試驗例2本發明0-欖香烯脂質體的藥效藥理1、本發明P-欖香烯脂質體對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用昆明種小鼠60只，雄性，體重1822g，取腹腔接種S180瘤株7天的荷瘤小鼠，無菌操作下抽取腹腔瘤液，以滅菌生理鹽水稀釋成l:3的瘤細胞懸液(鏡檢含瘤細胞數為6X107個/ml)，按0.2ml/鼠的劑量于小鼠右前肢腋窩皮下接種。接種后24小時稱重，按體重隨機分成6組，每組10只。設模型對照和陽性對照(環磷酰胺)，欖香烯注射劑(50mg/kg)、實施例2制備的3-欖香烯脂質體3個劑量組(25、50、100mg/kg)。模型對照組腹腔121.0888.3817.292.94354.61201.3551,068,62317.99198.7038.357.73222.95151.5848.545.4298.2338.165.122.39101.9056.6824.512.48152.0530.1512.813.7041.1510.662.75—心肝脾肺腎腦ij16注射生理鹽水，陽性對照組腹腔注射環磷酰胺25mg/kg，3-欖香烯注射劑、e-欖香烯脂質體3個劑量組采用尾靜脈注射給藥，注射容積為0.2ml/10g體重，每日1次，連續10天。給藥IO日后次日處死小鼠，解剖瘤體稱重，計算抑瘤率。結果P-欖香烯脂質體所試100mg和50mg/kg劑量組與對照組比較，其瘤重均顯著減小(P〈0.05或0.01)，并呈一定的量效關系，此外3-欖香烯注射液50mg/kg也能顯著抑制小鼠S180瘤株的生長，但藥效較脂質體50mg/kg弱一些。表明P-欖香烯脂質體對S180荷瘤小鼠有明顯的抑瘤作用，脂質體較注射液的作用更好。2、本發明P-欖香烯脂質體對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用昆明種小鼠60只，雄性，體重1822g，取腹腔接種H22瘤株7天的荷瘤小鼠，無菌操作下抽取腹腔瘤液，以滅菌生理鹽水稀釋成l:3的瘤細胞懸液(鏡檢含瘤細胞數為6xl07個/ml)，按0.2ml/鼠的劑量于小鼠右前肢腋窩皮下接種。接種后24小時稱重，按體重隨機分成6組，每組10只。設模型對照和陽性對照(環磷酰胺)，P-欖香烯注射劑(50mg/kg)、實施例2制備的P-欖香烯脂質體3個劑量組(25、50、100mg/kg)。模型對照組腹腔注射生理鹽水，陽性對照組腹腔注射環磷酰胺25mg/kg，0-欖香烯注射劑、e-欖香烯脂質體3個劑量組采用尾靜脈注射給藥，注射容積為0.2ml/10g體重，每日1次，連續10天。給藥IO日后次日處死小鼠，解剖瘤體稱重，計算抑瘤率。結果0-欖香烯脂質體所試100mg和50mg/kg劑量組與對照組比較，其瘤重均顯著減小(P〈0.05或0.01)，并呈一定的量效關系；^-欖香烯注射液50mg/kg能一定程度抑制小鼠H22瘤株的生長，但沒有顯著性差異，表明藥效較脂質體50mg/kg弱。結果表明P-欖香烯脂質體對H22荷瘤小鼠有明顯的抑瘤作用，脂質體較注射液的作用更好。3、本發明P-欖香烯脂質體對環磷酰胺所致免疫底下小鼠溶血素抗體生成的影響昆明種小鼠70只，雌雄各半，隨機分為7組，第7組為正常對照組，iv生理鹽水，其余各組分別iv相應藥物，l次/日，連續7日。此外，除正常對照組外其余各組皮下注射環磷酰胺20mg/kg，l次/2日，共3次；首次給藥lh后每鼠以5%雞血球0.2ml腹腔注射免疫，第7日各鼠于眼眶取血20ul，加入lml生理鹽水，再加入4%雞紅血球0.5ml、10%豚鼠血清0.5ml，于37。C水浴中孵育40min，冰浴終止反應，于2000rpm離心10min，取上清液lml，加入3ml都氏液，混勻，10min后于540nm以都氏液調零，測定各管吸收度。結果正常對照組與環磷酰胺組比有明顯差異(P<0.01)，說明模型組造型成功；欖香烯脂質體所試100mg劑量組與環磷酰胺組比較，其吸收度顯著增加(P<0.01)，此外0-欖香烯脂質體及P-欖香烯注射液50mg/kg不能明17顯抑制環磷酰胺致小鼠溶血素抗體生成的減少，但本發明P-欖香烯脂質體較注射液有一定數量上的提高，表明藥效較注射液強。結果表明e-欖香烯脂質體對環磷酰胺致小鼠溶血素抗體低下有明顯的抑制作用，脂質體較注射液的作用更好。4、本發明P-欖香烯脂質體對小鼠網狀內皮系統對血流中惰性炭粒吞噬能力的影響昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，第6組為正常對照組，iv生理鹽水，其余各組分別iv相應藥物，1次/日，連續7日。末次給藥24h于鼠尾靜脈注入稀釋印度墨汁0.lml/10g，于注入墨汁后30s及6min從小鼠眼眶后靜脈叢取血0.025ml，立刻吹入O.1^Na2C03液2ml中，于分光光度計上675nm處比色，計算吞噬指數K及吞噬系數a，剖取小鼠肝臟、脾臟、胸腺稱重，比較各組差異。結果3-欖香烯脂質體所試100mg和50mg/kg劑量組與對照組比較，其吞噬指數顯著增加(P<0.01)，雖然這兩個劑量組的吞噬系數較對照組在數量上有一定的提高，但無明顯差異；e-欖香烯脂質體50mg/kg與同等劑量的注射液組比較，在吞噬系數及吞噬指數都有一定數量上的提高，表明藥效較注射液強。結果表明P-欖香烯脂質體對小鼠網狀內皮系統有明顯的增強作用，能刺激小鼠巨噬細胞的增殖，脂質體及注射液對小鼠的免疫器官沒有明顯影響。綜上所述，本發明制備的P-欖香烯脂質體對肝癌的治療能發揮其最大功效，尤其對肝組織靶向性最強，還具有一定緩釋作用，藥效明顯，為臨床治療肝癌提供了一種新的選擇。18權利要求1、β-欖香烯脂質體的制備方法，它包括下述步驟a、取磷脂、膽固醇、β-欖香烯，其中β-欖香烯與磷脂的重量比為1∶(0.7-4.7)，磷脂與膽固醇的摩爾比為(40-80)∶(60-20)；加無水乙醇溶解，以注射器注入磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩；b、通過擠壓器擠壓，得脂質體混懸液，脂質體為大單室脂質體。2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于a步驟所述的3-欖香烯與磷脂的重量比為1:2.7，磷脂與膽固醇的摩爾比為55:45;a步驟中磷酸鹽緩沖溶液與磷脂、膽固醇、欖香烯的無水乙醇溶解物的體積比與為14:1;所述的磷脂為蛋黃卵磷脂、大豆磷脂。3、根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的磷脂為蛋黃卵磷脂。4、根據權利要求1的制備方法，其特征在于所述的b步驟中擠壓過程采用擠壓器擠壓，400nm濾膜一次，200nm濾膜二次，氮氣壓力為2Mpa。5、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于a步驟所述的P-欖香烯的提取方法為采用G-排式同步精餾裝置進行多排式同步精餾取收集到的餾份，加入一條精密分餾柱下的燒瓶內進行精密分餾，再進行二次分離；所得的餾份為原料進行二次硅膠柱層析，干法裝柱；用石油醚306(TC進行洗脫，去溶劑，制得重量百分含量為98.0%以上的3-欖香烯。6、一種P-欖香烯脂質體凍干粉的制備方法，它是由權利要求1-5任一項所述的制備方法制備得到的脂質體混懸液，加乳糖、維生素E，進行冷凍干燥，將凍干粉無菌分裝，即得。7、根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于c步驟所述的乳糖、維生素E的用量與P-欖香烯的重量配比為P-欖香烯2-16份、乳糖20-150份、維生素E0.1-6.0份。8、根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于c步驟所述的乳糖、維生素E的用量與P-欖香烯的重量配比為P-欖香烯8.74份、乳糖71.52份、維生素E0.94份。9、根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于c步驟所述的冷凍干燥的條件為預凍溫度為-45。C，預凍時間為6小時，開始抽真空，并升溫至-40°C，保持8小時；再升溫至-3(TC，保持6小時；升溫至-20°C，保持6小時；升溫至-10。C，保持4小時；升溫至OX:，保持4小時；升溫至15。C，保持3小時；升溫至3(TC，保持3小時。10、權利要求6-9所述的任一方法制備的P-欖香烯脂質體凍干粉，其特征在于P-欖香烯脂質的平均粒徑為150nm300nm;包封率為90%_96%。全文摘要本發明提供了一種制備β-欖香烯脂質體的方法及該方法制備得到的β-欖香烯脂質體。本發明方法聯合采用乙醇注入-擠壓-冷凍干燥法制備β-欖香烯脂質體，乙醇注入與擠壓法聯用，制得的β-欖香烯脂質體粒徑更均勻，包封率更高，將β-欖香烯脂質體混懸液冷凍干燥，制成凍干粉，增加了脂質體的穩定性，防止了其在液體中的泄漏，制得的β-欖香烯脂質體平均粒徑為230nm左右，符合肝靶向的要求，通過藥效試驗證明，本發明β-欖香烯脂質體對肝癌的治療能發揮其最大功效，其對肝組織靶向性最強，還具有一定緩釋作用，藥效明顯，為臨床治療肝癌提供了一種新的選擇。文檔編號A61K31/01GK101461793SQ20091005807公開日2009年6月24日申請日期2009年1月9日優先權日2009年1月9日發明者馮建安,廖志航,曹定知,希李,楊士明,胥國勛,謝守德,陳開國申請人:四川省中醫藥科學院