專利名稱：姜黃素聯合絲裂霉素c在制備治療乳腺癌的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，尤其涉及姜黃素聯合絲裂霉素C在制備治療乳腺 癌的藥物中的應用。
背景技術：
本發明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權利要求書。Curcumin 姜黃素，購自中國藥品生物制品檢定所；MMC 絲裂霉素C (mitomycin C)，購自美國ICN公司；RPMI 1640培養基購自美國GIBCO公司；FBS 胎牛血清(Fetal Bovine Semm)，購自美國 PAA 公司；Insulin 牛胰島素，購自美國Sigma公司；HEPES :輕乙基喊嚷乙石黃酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid), 購自美國ICN公司；MTT 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium)，購自美國 sigma 公司；DMSO 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide)，購自美國 sigma 公司；A0:吖啶橙(acridine orange)，購自美國 sigma 公司；基因組DNA提取試劑盒購自天根生物；人乳腺癌細胞株MCF-7 中國科學院健康所荊清課題組惠贈；Cr 血肌酐(Serum creatinine)，Cr檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BUN 血尿素氮(blood urea nitrogen)，BUN檢測試劑盒購自南京建成生物工程研 究所；GPT 谷丙轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase)，GPT檢測試劑盒購自南京建 成生物工程研究所；GOT 谷草轉氨酶(glutamic oxalacetic transaminase)，GOT 檢測試劑盒購自南 京建成生物工程研究所；TUNEL 末端脫氧核苷酰基轉移酶介導性dUTP切口末端標記(terminal deoxynucIeotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling), TUNEL 檢測試劑盒 購自凱基生物科技發展有限公司；ELISA 酶標記免疫吸附測定(enzyme-labeled immunosorbent assay)，ELISA 檢 測試劑盒購自德國Roche公司；GRP58 糖調節蛋白(Glucose regulatory protein)，GRP58siRNA 購自美國 Ambion 公司；注射用絲裂霉素購自浙江海正藥業股份有限公司。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國每年約有13萬人被診為乳腺癌。據中 國抗癌協會最新統計數字顯示，我國近年來乳腺癌發病率正以每年3%的速度遞增，成為城 市中死亡率增長最快的癌癥，高發地區主要集中在沿海的大城市，其中以上海為最高。目前中醫藥在防治乳腺癌的基礎研究和臨床治療方面取得了一定進展，已經成為乳腺癌術后有 效的輔助療法之一，彌補了現代醫學的不足，但其作用機理尚不明確。隨著現代生命科學技 術的發展和對乳腺癌生物學行為的分子和基因水平了解的加深，中藥現代化的不斷深入研 究，基礎與臨床研究緊密結合，進一步探討中藥和中西藥配伍治療乳腺癌的效果及其作用 機制顯得尤為必要。目前，乳腺癌的防治尚缺乏理想的治療藥物。臨床上認為乳腺癌是一種全身性疾 病，其治療效果取決于遠處微小轉移的控制程度，而非局部處理范圍的大小，故手術范圍的 大小不是預后的決定性因素。隨著全身性治療作用的日益突出，化療和內分泌治療成為當 前確有成效的全身性治療方法。目前臨床上應用的化療藥物主要有絲裂霉素、紫杉醇類、多 西他賽、去甲長春花堿、吉西他濱；內分泌治療主要有雌激素、抗雌激素藥物如三苯氧胺、芳 香化酶抑制劑如氨魯米特、福美坦、瑞寧得、來曲唑。上述有些化學合成藥物毒副作用大，影 響生存質量。如三苯氧胺(TAM)是治療絕經婦女惡性乳腺癌的一線藥物，根據瑞典對其臨 床研究結果，該藥可增加患子宮內膜癌的危險，同時提示有增加胃腸道癌的可能。姜黃素是以傳統中藥材姜黃為原料，采用現代先進科學提取精制而得的食用天然 黃色素。已有文獻報道姜黃素具有抗病毒、消炎、降低膽固醇、抑制血小板聚集、增加纖溶活 性等作用。MMC是一種細胞周期非特異性廣譜抗瘤藥物，可使細胞的DNA解聚，同時阻礙DNA 的復制，從而抑制癌細胞分裂。但當其作為化療藥物時有損害腎功能的副作用，對周圍神經 的毒性作用與所用劑量呈正相關，此藥可抑制骨髓及引起明顯的血小板減少，有的患者有 出血傾向且恢復緩慢。當前紫杉醇與鉬類抗癌藥的配伍應用已成為癌癥的標準化療方案，使晚期患者的 中位生存期進一步延長。盡管此聯合化療較其他的聯合化療方案的毒性作用有所減輕，但 依然存在著較嚴重的骨髓抑制、腎臟毒性、神經毒性、胃腸道反應和過敏反應及偶發的低血 壓和心動過緩等。如林純青報道了紫杉醇與卡鉬聯合用藥產生了諸多的副作用。因此，尋 找一個更好的配伍應用的藥物組合具有重要的意義。
發明內容
針對上述臨床運用化療藥物產生的諸多不足，本發明所要解決的問題是用一種 來源于中藥且作為食品添加劑的curcumin聯合臨床上行之有效的化療藥物MMC在人乳腺 癌細胞和異種移植瘤裸鼠中的應用后，不僅降低了 MMC的用量、提高了療效，而且緩解了單 獨應用MMC的毒副作用，同時觀察了其作用的關鍵靶點。本發明針對現今臨床運用化療藥物產生毒副作用所存在的問題，選擇了中藥來源 的curcumin與小劑量的MMC聯合，抑制人乳腺癌細胞增殖、腫瘤生長及改善臨床MMC用量 引起的毒副作用，提供了一種低劑量聯合治療乳腺癌的方法，開拓了用藥思路，為增效減毒 治療方案提供參考。本發明是curcumin聯合MMC在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。其中所述 curcumin與MMC抗人乳腺癌細胞增殖的濃度分別為5 8(^] 與0. 1 7. 5 μ M ;curcumin 聯合MMC的優選濃度為curcumin 40 μ M聯合MMC 2. 5 μ Μ。curcumin與MMC抑制異種移植 瘤裸鼠體內腫瘤生長的濃度分別為curcumin 100mg/kg與1 2mg/kg ；curcumin聯合MMC 的優選濃度為 curcumin 100mg/kg 聯合 MMC 1. 5mg/kg。
上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效效果的方法是體外抗人乳腺癌細胞 MCF-7增殖時，將IC50濃度的curcumin (40 μ M)與1/2IC50濃度的MMC (2. 5 μ Μ)聯合用藥， 與單獨運用IC50濃度的MMC(5yM)比較，觀察聯合用藥抗人乳腺癌細胞增殖效果；體內抑 制人乳腺癌細胞MCF-7異種移植瘤裸鼠腫瘤生長時，將curcumin 100mg/kg與降低MMC臨 床成人用量至1. 5mg/kg聯合用藥，與單獨運用臨床成人用量折算的MMC 2mg/kg比較，觀察 聯合用藥抑制異種移植瘤裸鼠體內腫瘤生長及緩解單獨運用臨床成人用量MMC引起的毒 副作用的效果。為了更好地理解本發明的實質，下面用藥理實驗及結果來說明curcumin聯合MMC 在治療乳腺癌起到減毒增效效果中的應用。Curcumin與MMC藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果，由以下步驟完成。1.人乳腺癌細胞株MCF-7細胞培養人乳腺癌MCF-7細胞采用開放式單層貼壁 培養，培養液即 RPMI1640(10% FBS，青霉素 100U/ml，鏈霉素 ΙΟΟμ g/ml，Insulin 0. Olmg/ ml，HEPES20mM)，恒溫37°C，5% CO2，相對飽和濕度。每日觀察生長情況，貼壁2_5天傳代一 次。傳代時PBS緩沖液洗滌，0.25%胰蛋白酶消化后，加入等量培養液吹打成為細胞懸液， 1000rpm/min離心2分鐘，吸取上清液，加入培養液吹打成為單細胞懸液，分盤，傳代，實驗 時取對數生長期細胞。2. curcumin對細胞生長的抑制作用選用對數生長期人乳腺癌MCF-7細胞， 0. 25%胰蛋白酶消化，以5X 104/ml細胞濃度接種于96孔板，每孔200 μ 1，培養24h后換新 鮮培養基，空白與細胞對照組每孔200 μ 1，溶媒對照與各用藥處理組180 μ 1，每組設4個平 行孔。再分別加入不同濃度溶媒DMSO及curcumin 5 μ M、10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ Μ、80 μ M后繼 續培養，24h、48h、72h后，避光環境下每孔加入MTT(5mg/ml)溶液20 μ 1，37°C，5% CO2培養 箱內繼續培養4h，吸棄上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0，微量振蕩10分鐘，使結晶物充分溶 解。用MTT比色法測定光密度值，即對應的活細胞數。選擇490nm波長在酶聯免疫檢測儀 上測各孔的光吸收值，分別記錄各種藥物各自作用于MCF-7細胞的濃度效應數據，用下列 公式計算藥物對細胞增殖的抑制率，并繪制效應曲線。同樣的實驗重復過3次。實驗結果
(ODtsm λ
用以下藥物抑制率公式計算Xl00%
藥物抑制率(％) = I )3. MMC對細胞生長的抑制作用選用對數生長期人乳腺癌MCF-7細胞，調整細胞濃 度為5Χ 104/ml接種于96孔板，每孔200 μ 1，培養24h后換新鮮培養基，空白與細胞對照組 每孔200μ 1，溶媒對照與各用藥處理組180 μ 1，每組設4個平行孔。再分別加入不同濃度 溶媒生理鹽水及 MMC 0. 1μΜ、0·5μΜ、2·5μΜ、5μΜ、7·5μΜ#20μ1 后繼續培養，24h、48h、 72h后，避光環境下每孔加入MTT(5mg/ml)溶液20 μ 1，37°C，5% CO2培養箱內繼續培養4h， 吸棄上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0，微量振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。用MTT比色法 測定光密度值，即對應的活細胞數。選擇490nm波長在酶聯免疫檢測儀上測各孔的光吸收 值，分別記錄各種藥物各自作用于MCF-7細胞的濃度效應數據，用下列公式計算藥物對細 胞增殖的抑制率，并繪制效應曲線。同樣的實驗重復過3次。實驗結果用上述藥物抑制率 公式計算。4.與單獨運用IC50濃度(5 μ Μ)的匪C比較，IC50濃度的curcumin (40 μ M)與 1/2IC50濃度(2.5μΜ)的MMC聯合應用對細胞生長的抑制作用選用對數生長期人乳腺癌MCF-7細胞，調整細胞濃度為5 X 104/ml接種于96孔板，每孔200 μ 1，培養24h后換新鮮培 養基，空白與細胞對照組每孔200 μ 1，各用藥處理組180 μ 1，每組設4個平行孔。再分別加 入藥物 MMC 5 μ M、MMC 2. 5 μ Μ、curcumin 40 μ M 及 curcumin 40 μ M 聯合 MMC 2· 5 μ M (兩 藥物合用時采用兩藥合用比例為1 1的方案，每種單藥劑量濃縮1倍)后繼續培養，24h、 48h、72h后，避光環境下每孔加入MTT (5mg/ml)溶液20 μ 1，37°C，5 % CO2培養箱內繼續培養 4h，吸棄上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0，微量振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。用MTT比色 法測定光密度值，即對應的活細胞數。選擇490nm波長在酶聯免疫檢測儀上測各孔的光吸 收值，分別記錄各種藥物各自作用于MCF-7細胞的濃度效應數據，用下列公式計算藥物對 細胞增殖的抑制率，并繪制效應曲線。同樣的實驗重復過3次。實驗結果用上述藥物抑制 率公式計算。5.人乳腺癌MCF-7細胞異種移植瘤裸鼠模型的制備按每只雌性裸鼠乳房頰脂墊 接種細胞數2X 106/0. 2ml,即IX 107ml再加入無血清RPMI1640培養基制備成單細胞懸液 后，接種MCF-7人乳腺癌細胞，且在接種細胞前24h造模裸鼠均腹腔注射5g/kg苯甲酸雌二 醇(短效)一次，每隔5天補加一次。6周后頸脫位法處死小鼠。6.與單獨運用臨床用量的MMC 2mg/kg 比較，curcumin 100mg/kg 與MMC 1. 5mg/kg 聯合用藥對MCF-7異種移植瘤裸鼠體內腫瘤質量的影響為了觀察curcumin與不同劑量 MMC聯合用藥對移植瘤裸鼠體內腫瘤生長的影響，本實驗運用人乳腺癌MCF-7細胞株建立 了移植瘤裸鼠模型，給藥組分別為匪C lmg/kg(Ml)、匪C 1. 5mg/kg(Ml. 5)、匪C2mg/kg(M2)、 curcumin 100mg/kg (Cur)及Ml+Cur、Ml. 5+Cur、M2+Cur，對照組給予等量的溶媒，給藥途徑 均為腹腔注射，給藥4周。與單獨運用MMC比較，觀察各聯合用藥組對異種移植瘤裸鼠體內 腫瘤生長的影響。7.與單獨運用臨床用量的MMC 2mg/kg 比較，curcumin 100mg/kg 與MMC 1. 5mg/kg 聯合用藥對異種移植瘤裸鼠生存時間及體質量、腎功能、骨髓抑制的影響對乳腺癌模型給 藥過程中記錄每只實驗動物的生存時間，處死前稱量其體質量；眼球取血后觀察各用藥組 實驗動物肝腎功能的變化；處死后取其右側股骨，觀察各用藥組的骨髓生長抑制狀況。8. Curcumin 40 μ M與MMC 2. 5 μ M聯合用藥對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡、細胞周 期及其相關蛋白的影響Α0熒光染色，即收集MCF-7細胞，以PBS制成單細胞懸液，調整細 胞濃度為1Χ106，取出95 μ 1細胞懸液與5μ 1 0.01% AO混勻后，涂片后鏡檢拍照，觀察 細胞凋亡的形態學變化；DNA ladder，即依細胞基因組DNA提取試劑盒說明，提取細胞基因 組DNA，鑒定其純度并測定提取的DNA濃度，取20 μ 1上樣，1 %瓊脂糖膠，50V, l_2h，觀察 細胞凋亡后出現的典型的斷片化變化；流式細胞儀測定細胞的凋亡率，即收集細胞，用預冷 的PBS洗滌細胞，細胞于70 %乙醇中4°C固定過夜，2000r/min離心，以PBS洗兩遍，依據 annexin V_PI雙染試劑盒說明操作后，上流式細胞儀檢測。流式細胞儀PI單染法觀察細胞 周期分布。Western blot方法觀察細胞凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、caspase-8、 bax、bcl-2 的表達及細胞周期相關蛋白 cyclin DUcyclin A、cyclin E、CDK2、p21、p27 的 表達。9. Curcumin 100mg/kg與MMC 1. 5mg/kg聯合用藥對異種移植瘤裸鼠體內腫瘤組 織中細胞凋亡及其相關蛋白的影響用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒觀察腫瘤組織中細 胞凋亡情況；用細胞凋亡ELISA檢測試劑盒觀察細胞質中核小體的富集量，評價細胞凋亡；Western blot方法觀察腫瘤組織細胞凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、caspase-8、 bax、bcl_2 的表達。10. Curcumin與MMC聯合運用對GRP58介導的DNA交聯的影響(1)退火寡核苷 酸序列5—-CTACATCGTGTCATGCACAGGAT-3—與其互補鏈等量混合，70°C退火15min，漸漸冷卻 至室溫。(2)標記用 DNA polymerase I large (klenow) fragment 選擇性將[a_32P] dCTP 于 上游鏈末端。(3)分離、純化標記了的寡核苷酸用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離、純 化。(4)DNA cross-linking 標記了 32P 的寡核苷酸與 0. 5mg 蛋白、IOOmM PBS (PH5. 8)、ImM NADH、150yM MMC、5yM FAD、0· 01 % Tween 20,0. 18mg BSA 于 37°C孵育 lh，加入乙醇、IOmM MgC 12 與 1. 5M ammonium acetate 終止反應。DNA 于 4°C 13，700rpm 離心 30min，棄上清,沉 淀的寡核苷酸用Speed-Vac離心至干燥。(5)DNA檢測用DNA sequencing dye-containing formamide重懸沉淀的寡核苷酸，95°C變性15min，迅速至冰上冷卻。樣品用含8M尿素的 15%聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳后膠置暗盒中用Kodak-max MS膠片于_70°C曝光18h，即可 見交聯的及未結合的寡核苷酸。11.統計學處理每組實驗重復3次，數據采用t檢驗或方差分析。實驗結果上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟2和3所述的curcumin或 MMC對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用均呈時間和劑量依賴性，且結果顯示curcumin 與MMC的IC50濃度分別為40 μ M與5 μ M。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟4所述的實驗結果顯 示，與單獨運用MMC 5μΜ相比較，在不同時間點24h、48h、72h，curcumin 40 μ M聯合MMC 2. 5μ M對MCF-7細胞增殖的抑制率分別提高了 19. 2%、24. 9%、26. 2% (P < 0. 05)。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟6所述聯合用藥起到增效 效果的實驗結果發現，與單獨運用MMC 2mg/kg比較，curcumin 100mg/kg聯合MMC 1. 5mg/ kg致移植瘤裸鼠體內腫瘤質量降低了 9. 2 %。聯合用藥提高了單獨運用MMC的抑瘤效果。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟7所述聯合用藥起到 減毒效果的實驗顯示，單獨運用臨床劑量的MMC 2mg/kg致該組實驗動物死亡一半，未 死亡的實驗動物生存質量較差，出現食欲減退、皮膚蒼白、萎靡不振、惡液質等現象。單 獨運用MMC1.5mg/kg組實驗動物死亡一只。而curcumin 100mg/kg分別聯合MMC 2mg/ kg、MMC1. 5mg/kg、MMC lmg/kg組實驗動物無任何死亡現象，實驗動物體質量比單獨運用 MMC2mg/kg、MMC 1.5mg/kg、MMC lmg/kg 分別提高了 12%、24%、18%，基本恢復至正常實驗 動物體重。MMC 2mg/kg、MMC 1. 5mg/kg、MMC lmg/kg致血清中Cr水平較模型組分別升高 了82%、27%、14%，8^水平分別升高了54%、52%、37%;與匪0 2mg/kg、MMC 1. 5mg/kg、 MMC lmg/kg 相比較，curcumin lOOmg/kg+MMC 2mg/kg、curcuminlOOmg/kg+MMC L 5mg/kg、 curcumin lOOmg/kg+MMC lmg/kg 聯合用藥后致 Cr 水平分別降低了 43%、25%、19%，BUN 水平分別降低了 34%、41%、37%。提示Curcumin 100mg/kg與不同濃度的MMC聯合用藥 緩解了單獨運用MMC引起的腎功能損傷。匪C lmg/kg、MMC 1. 5mg/kg、MMC 2mg/kg組骨髓 造血細胞分別呈現輕、中、重度抑制，骨髓腔內血管擴張，并見大量脂肪細胞增生；curcumin lOOmg/kg+MMC lmg/kg、curcuminlOOmg/kg+MMC 1. 5mg/kg、curcumin lOOmg/kg+MMC 2mg/ kg用藥后明顯改善了骨髓抑制狀況，呈現正常或輕微抑制狀態，骨髓腔內造血細胞明顯增多，血管擴張及脂肪細胞減少。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟8所述聯合用藥產生增效 的作用機制為增加細胞凋亡，結果顯示，curcumin 40 μ M聯合MMC 2. 5μ M作用細胞后，熒 光顯微鏡下觀察到典型的細胞凋亡特征性變化凋亡細胞胞核呈固縮狀的或半月形綠色熒 光或橘黃色熒光。DNA ladder實驗結果顯示，curcumin 40 μ M+MMC 2. 5 μ M明顯誘導了 DNA 的斷片化，基因組DNA斷裂成180-200bp及其倍數的片段。流式細胞儀分析結果顯示，聯合 用藥后誘導的細胞凋亡率比單獨運用MMC提高了 26.53% (P <0.05)。聯合用藥后致GO/ Gl期細胞較單獨運用MMC增加了 23.6%。Curcumin與MMC聯合用藥可激活caspase_3、 caspase-9、caspase-8活性，下調bcl_2表達，上調bax表達，與單獨運用MMC比較，bax 與bcl-2比值增加了 3. 38倍；同時抑制了細胞周期依賴性蛋白激酶CDK2、細胞周期蛋白 cyclin DUcyclin A與cyclin E的表達，提高了細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p21、p27 的表達。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟9所述實驗結果顯示， curcumin 100mg/kg+MMC 2mg/kg、curcumin 100mg/kg+MMC 1. 5mg/kg 致細胞釋放的單 /低聚核小體片段的特別聚集值，比單獨運用臨床劑量MMC 2mg/kg處理組分別升高了 1.53和1.61倍。表明，curcumin 100mg/kg聯合MMC 1. 5mg/kg明顯誘導了腫瘤組織中 腫瘤細胞凋亡。curcumin 100mg/kg 聯合 MMC 1. 5mg/kg 激活了 caspase—3、caspase—9 與 caspase-8的活性，下調了抗凋亡蛋白bcl_2的表達，上調了促凋亡蛋白bax的表達。可見 curcuminl00mg/kg與MMC 1. 5mg/kg聯合用藥誘導腫瘤細胞凋亡的機制與對這些細胞凋亡 相關蛋白的調節有關。上述藥物聯合治療乳腺癌起到減毒增效的效果中步驟10所述實驗結果顯示， siRNAGRP58致DNA交聯明顯減少，MMC單獨運用誘導了 DNA交聯，curcumin與MMC聯 合用藥抑制了 DNA交聯，當轉染siRNAGRP58入MCF-7細胞提取的蛋白再分別加入MMC、 MMC+curcumin、curcumin，此時三組藥物對DNA交聯無明顯不同影響，可見當GRP58蛋白被 抑制后即取消了藥物誘導的DNA交聯的變化，因此GRP58介導了藥物誘導的DNA交聯。提 示curcumin與MMC聯合用藥降低單獨運用MMC引起毒副作用的作用機制與聯合用藥抑制 GRP58介導的DNA交聯有關。利用本發明的實驗方案可以成功地使聯合用藥治療乳腺癌起到減毒增效的效果， 即在降低了化療藥物用藥劑量的同時，亦未削弱其治療效果，而且對化療藥物產生的毒副 作用有一定的緩解作用。本發明從聯合用藥角度出發，為臨床藥物聯合用藥方案提供了參考。
圖1是Curcumin與匪C聯合用藥在24h、48h、72h不同時間點對MCF-7細胞增殖的 影響示意圖(a，b，c，表示 P<0.01，分別于 24，48，72h 與 curcumin 40μΜ 聯合 MMC 2. 5 μ M 進行比較)。圖2是Curcumin與MMC聯合用藥對異種移植瘤裸鼠體內腫瘤生長的抑制作用示 意圖(與 M2 比較，*，P < 0. 05 ；#，P > 0. 05)。圖3是Curcumin與MMC聯合用藥對單獨運用MMC引起的毒副作用的緩解效果示意圖。圖3A是聯合用藥對異種移植瘤裸鼠體質量的影響示意圖(與M2比較，*，P < 0. 05)。圖3B是聯合用藥對血清中Cr、BUN的影響示意圖(與M2比較，*，P < 0. 05)。圖 3C是聯合用藥對實驗動物骨髓增生狀態的影響示意圖(一指向血管擴張，一指向脂肪細 胞)。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說 明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限 定的范圍。實施例11.藥物curcumin，體外細胞實驗時，以少量二甲亞砜(DMSO)溶解粉末，配制成 40mM溶液(儲存液)，置4°C避光保存，臨用時稀釋成所需濃度(DMS0終濃度< 0. 1% )；體 內動物實驗時，以DMSOUO % Tween80的生理鹽水溶解粉末，配制成10mg/ml溶液，置 4°C避光保存，實驗動物行腹腔注射100mg/kg。藥物MMC，體外細胞實驗時，以生理鹽水溶 解，配制成ImM溶液(儲存液)，4°C避光保存，臨用時稀釋成所需濃度；體內動物實驗采用 注射用絲裂霉素C。2.利用發明內容部分所述的藥物配制方法可成功進行藥物聯合實驗。實施例21.與單獨運用MMC 5μ M比較，curcumin 40 μ M聯合MMC 2. 5 μ M對細胞增殖的 抑制作用調整人乳腺癌MCF-7細胞濃度為5Χ 104/ml接種于96孔板，每孔200 μ 1，培養 24h后換新鮮培養基，空白與細胞對照組每孔200 μ 1，各用藥處理組180 μ 1，每組設4個平 行孑L。再分另Ij力口入藥物 MMC 5 μ M、MMC 2. 5 μ Μ、curcumin 40 μ M 及 curcumin 40 μ M 聯合 MMC2.5yM(兩藥物合用時采用兩藥合用比例為1 1的方案，每種單藥劑量濃縮1倍)后 繼續培養，24h、48h、72h后，避光環境下每孔加入MTT(5mg/ml)溶液20 μ 1，37°C，5% CO2培 養箱內繼續培養4h，吸棄上清液，每孔加入150 μ 1 DMS0，微量振蕩10分鐘，使結晶物充分 溶解。用MTT比色法測定光密度值，即對應的活細胞數。選擇490nm波長在酶聯免疫檢測 儀上測各孔的光吸收值。同樣的實驗重復過3次。用下列公式計算藥物對細胞增殖的抑制 率
權利要求
姜黃素聯合絲裂霉素C在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。
2.權利要求1所述的用途，其特征是，抗人乳腺癌細胞MCF-7增殖的濃度為姜黃素 5 80 μ M，絲裂霉素C 0. 1 7. 5 μ Μ。
3.權利要求2所述的用途，其特征是，抗人乳腺癌細胞MCF-7增殖的濃度為姜黃素 40 μ M，絲裂霉素C 2. 5 μ Mo
4.權利要求1所述的用途，其特征是，抑制人乳腺癌細胞MCF-7異種移植瘤裸鼠體內腫 瘤生長的濃度為姜黃素100mg/kg，絲裂霉素Cl 2mg/kg。
5.權利要求4所述的用途，其特征是，抑制人乳腺癌細胞MCF-7異種移植瘤裸鼠體內腫 瘤生長的濃度為姜黃素100mg/kg，絲裂霉素Cl. 5mg/kg。
全文摘要
本發明公開了姜黃素聯合絲裂霉素C在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。姜黃素聯合絲裂霉素C(MMC)應用于體外人乳腺癌細胞模型與體內異種移植瘤裸鼠模型，較單獨運用MMC起到了減毒增效的效果，其中運用于體外人乳腺癌細胞中的藥物濃度分別為姜黃素40μM聯合MMC 2.5μM、單獨運用MMC 5μM；運用于體內異種移植瘤裸鼠中的藥物濃度分別為姜黃素100mg/kg聯合MMC 1～2mg/kg、單獨運用MMC 1～2mg/kg。本發明從姜黃素和MMC聯合用藥增加對細胞及腫瘤生長抑制、改善腎功能、減輕骨髓抑制與增加細胞凋亡、引起細胞周期阻滯、減少MMC的DNA交聯角度，闡明其對乳腺癌的治療較單獨運用化療藥物MMC起到減毒增效的效果與機理，為臨床用藥奠定基礎。
文檔編號A61K31/407GK101991571SQ20091005778
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者周錢梅, 蘇式兵 申請人:上海中醫藥大學