通過調節gat-1表達促進肝再生的制作方法

專利名稱：通過調節gat-1表達促進肝再生的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過調節GAT-I表達促進肝再生。
背景技術：
人類和哺乳動物的肝臟在物理、化學、感染或缺血性損傷后具有很強的再生能力。 在某些條件下(如外科因腫瘤或移植手術切除部分肝臟或肝葉；移植一個小的供體肝臟到 一個大的受體；因化學藥物、病毒等引起肝細胞破壞等)，肝臟的體積發生變化，觸動肝臟 再生。自20世紀以來，肝臟疾病的發病率的逐漸攀升成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。 我國各型肝病患者正在呈上升趨勢，每年有近40萬人死于肝臟疾病。目前，肝臟切除手術 已被許多醫院廣泛應用于治療多種肝臟疾病。當部分肝臟切除后，肝臟面臨著剩余肝臟功 能的代償問題。剩余肝臟功能若能代償，則會引起肝再生而逐漸康復。反之，則會走向急性 肝功能衰竭，導致患者死亡。研究表明對肝再生的人為誘導可能會提高肝切除導致的急性 肝衰竭患者的生存率和縮短其康復時間。如何有效地提高及促進肝臟再生、肝功能恢復成 為目前亟待解決的問題。研究肝再生最常用的動物模型是小鼠或大鼠的部分肝切除(約70%肝臟切除)模 型。在肝臟切除后的短短幾分鐘之內，肝細胞的活化即被觸動。在這一過程中，多種細胞因 子、生長因子、神經內分泌調節因子等均參與調節激酶的活化、轉錄因子的激活以及肝細胞 的增殖和肝功能的恢復。評價肝再生的指標有肝臟重量的變化、肝細胞有絲分裂指數等。γ -氨基丁酸(GABA)作為重要的抑制性神經遞質，與興奮型神經遞質谷氨酸相互 平衡維持中樞神經系統的正常功能。由神經元釋放至突觸間隙的GABA部分與位于突觸后 膜的GABA受體結合，而大部分GABA則通過突觸前膜的GABA轉運體轉運至細胞內。GAT-I 作為抑制性神經遞質的主要轉運體之，最早被科學家們所發現，目前認為其主要表達在嗅 球、神經皮質、小腦、上丘、基質核，并且主要分布在突觸前膜末端、神經元及膠質細胞，對于 維持體內較低濃度的GABA起著重要的作用。目前有研究證明，GABA可以負向調節肝再生， 但是對于GAT-I是否參與這一過程尚不清楚。

發明內容
本發明利用肝再生的動物模型，證明了 GAT-I的表達在肝切后的24小時明顯上 升。利用GAT-I基因缺陷小鼠，首次發現GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明顯下降，證實了 GAT-I在肝再生病理生理機制中發揮重要作用。進一步的研究顯示，利用RNAi技術干擾小 鼠肝臟中GAT-I表達后，小鼠肝再生能力明顯減弱。因此，本發明提供Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1或其編碼序列在制備促進肝再生 用的物質中的用途。在一優選實施例中，所述物質是含有所述編碼序列的表達載體。在另一優選實施例中，所述物質是Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動劑。在其它優選實施例中，所述物質為用于促進肝再生用的藥劑。在優選實施例中，所
3述藥劑含有本發明所述的供Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1、其編碼序列或含有所述編碼序 列的表達質粒。在其它優選實施例中，所述藥劑含有Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動 劑。本發明提供Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動劑在制備促進肝再生用的藥物中 的用途。在一優選實施例中，所述的Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動劑選自(但不限 于)雌激素、蛋白酶C激動劑、磷脂酶抑制劑。在其它優選實施例中，所述藥劑含有有效促進肝再生的量的所述Y-氨基丁酸轉 運蛋白亞型1的激動劑。在其它實施例中，所述藥劑還含有藥學上可接受的載體和/或賦 形劑。本發明提供含Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的編碼序列的表達載體在制備促進肝 再生用的藥物中的用途。本發明提供一種篩選用于促進肝再生的潛在物質的方法，所述的方法包括(1)將候選物質與表達Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測候選物質對Y -氨基丁酸轉運蛋白亞型1的影響；若所述候選物質可提高Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達、活性或分泌，則表明 該候選物質是可用于促進肝再生的潛在物質。在一優選實施例中，所述步驟(1)包括在測試組中，將候選物質加入到組成性表 達或誘導性表達Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達或活性， 并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達Y-氨基丁酸轉運蛋白 亞型1的體系；如果測試組中Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達、活性或分泌在統計學上高于 對照組，就表明該候選物質是可用于促進肝再生的潛在物質。在一優選實施例中，所述體系選自細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、 器官體系或動物體系。在一優選實施例中，所述方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗 和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于促進肝再生有用的組合物。


圖1顯示在肝切后的不同時間點，GAT-I在肝臟中的表達情況。C57BL/6小鼠(每 個時間點3-4只)，通過給小鼠在第0天進行肝臟切除術(約70%肝臟切除)，觸動剩余肝 臟再生。在肝切后的第0小時、12小時、24小時和48小時，處死小鼠，取出小鼠的肝臟抽取 RNA。通過實時定量PCR的方法檢測GAT-I的表達水平。所示數據代表3次試驗的結果。圖2顯示肝切后，GAT-I-/-小鼠肝臟再生明顯下降。對照組(野生型)和實驗組 (GAT-1-/-)，每組9-10只小鼠，通過給小鼠在第0天進行肝臟切除術(約70%肝臟切除)， 以觸動剩余肝臟再生。在肝切后的第24小時、48小時和72小時，分別稱量小鼠體重，處死 小鼠，取出小鼠的肝臟并稱其重量。根據小鼠肝臟重量/小鼠的體重X 100計算每只小鼠 的肝臟與體重比率。所示數據代表3次試驗的結果。
圖3顯示通過RNAi技術干擾GAT-I表達后，小鼠肝臟再生明顯下降。對照組和實 驗組(GAT-1 siRNA)，每組3-4只小鼠，在第0天，給小鼠尾靜脈注射2ml的0.9%生理鹽水 或GAT-I siRNA。48小時后，給小鼠實施肝臟切除術(約70%肝臟切除)，觸動小鼠肝再生。 肝切后48小時，處死小鼠，按照圖2所述的方法計算每只小鼠的肝臟與體重比率。圖4顯示利用分子生物學技術上調肝臟中GAT-I表達后，小鼠肝臟再生明顯增加。 對照組和實驗組(GAT-1質粒)，每組3-4只小鼠，在第0天，給小鼠尾靜脈注射2ml的空質 粒或GAT-I的表達質粒。48小時后，給小鼠實施肝臟切除術(約70%肝臟切除)，觸動小鼠 肝再生。肝切后48小時，處死小鼠，按照圖2所述的方法計算每只小鼠的肝臟與體重比率。圖5顯示GAT-I質粒圖譜。
具體實施例方式γ -氨基丁酸(GABA)作為重要的抑制性神經遞質，與興奮型神經遞質谷氨酸相互 平衡維持中樞神經系統的正常功能。由神經元釋放至突觸間隙的GABA部分與位于突觸后 膜的GABA受體結合，而大部分GABA則通過突觸前膜的GABA轉運體轉運至細胞內。Y -氨 基丁酸轉運蛋白亞型I(GAT-I)作為抑制性神經遞質的主要轉運體之一，最早被科學家們 所發現，目前認為其主要表達在嗅球、神經皮質、小腦、上丘、基質核，并且主要分布在突觸 前膜末端、神經元及膠質細胞，對于維持體內較低濃度的GABA起著重要的作用。本發明利用GAT-I基因缺失動物，首次發現GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明顯下 降，證實了 GAT-I在肝再生病理生理機制中發揮重要作用。進一步的研究顯示，利用RNAi 技術干擾小鼠肝臟中GAT-I表達后，小鼠肝再生能力明顯減弱。因此，本發明一方面涉及促進對象肝再生的方法，該方法包括促進該對象GAT-I 基因的表達。GAT-I基因的核苷酸序列的GenBank登錄號為NM_178703，氨基酸序列的GenBank 登錄號為NP_848818。所述對象包括各種哺乳動物，例如人、各種馴養動物、寵物等等。促進GAT-I基因表達的方法包括采用生物技術向對象細胞中轉入含有該GAT-I基 因的表達載體，該表達載體能夠在所述對象細胞中表達GAT-I蛋白。或者，通過給予GAT-I 基因表達的激動劑來促進細胞中GAT-I基因的表達。本發明另一方面涉及促進對象肝再生的方法，該方法包括向該對象提供GAT-I蛋 白或GAT-I的激動劑。所用的GAT-I蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外， 所述的GAT-I蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據常規的基因工程重組技術來生產重 組GAT-I蛋白。優選的，本發明可采用重組的GAT-I蛋白。任何適合的GAT-I蛋白均可用于本發明。所述的GAT-I蛋白包括全長的GAT-I蛋 白或其生物活性片段。優選的，所述的GAT-I蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號 NP_848818所示的序列基本上相同。經過一個或多個(例如幾個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的GAT-I蛋 白的氨基酸序列也包括在本發明中。GAT-I蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸 的替代序列，所述經氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換
5氨基酸是本領域公知的技術，所述技術可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生 物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區域改變單個氨 基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版， 1987, TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。具體而言，氨基酸一般被分成四類(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿 性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例如，有 理由預測單獨用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇 氨酸，或者用結構上相關的氨基酸取代類似的保守的氨基酸，這樣的替代將不會對生物活 性有重要影響。例如，本發明的GAT-I蛋白可包括多達約5-10個保守的或不保守的氨基酸 取代，甚至多達約15-25個保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之間任何整數，只要該 分子的所需功能仍維持完整。本領域的熟練技術人員可結合本領域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測定感興趣的分子中可耐受改變的區域。任何一種GAT-I蛋白的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這里，GAT-I蛋白 的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的GAT-I蛋白的全部或部分 功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長GAT-I蛋白的活性。在更優 選的條件下，所述活性片段能夠保持全長GAT-I蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。本發明也可采用經修飾或改良的GAT-I蛋白，比如，可采用為了促進其半衰期、有 效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的GAT-I蛋白。所述經過修飾或改良的 GAT-I蛋白可以是一種GAT-I蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經 過修飾或改良的GAT-I蛋白可以是與天然存在的GAT 1蛋白具有較小的共同點，但也能促 進肝再生，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響GAT-I蛋白的生物活性 的變化形式都可用于本發明中。根據GAT-I蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相應的核苷酸編碼序列。優選 的，所述的GAT-I蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號NM_178703所示的序列基本上 相同。因此，本發明的蛋白質包括(1)如GenBank登錄號NP_848818所示的蛋白質；和 (2)在GenBank登錄號NP_848818所示的氨基酸序列中，經過取代、缺失或添加一個或幾個 氨基酸且具有GenBank登錄號NP_848818所示蛋白的活性的由GenBank登錄號NP_848818 衍生的蛋白質。可采用各種方法制備本發明的蛋白質。通常用重組方法制備本發明的蛋白質。可 以用標準分子生物學方法制備編碼本發明蛋白質的多核苷酸。例如，用重組方法可以獲得 編碼上述分子的多核苷酸序列，例如通過從表達該基因的細胞篩選cDNA和基因組文庫，或 通過從已知的包括該基因的載體衍生該基因。也可合成而非克隆制備感興趣的基因。可用 適當的特定序列的密碼子消化該分子。然后將用標準方法制備的重疊的寡核苷酸裝配完 整的序列，并裝配入完整的編碼序列中。參見如Edge (1981)Nature 292 :756 ;Nambair等 (1984)Science223 1299 ；和 Jay 等(1984) J. Biol. Chem. 259 :6311。
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因此，從攜帶所需序列的載體可獲得具體的核苷酸序列，或用本領域已知的各 種寡核苷酸合成方法，如定位誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)，完全或部分合成。參見如 Sambrook，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning :aLaboratory Manual)，第二版， 1989。具體說，獲得編碼所需序列的核苷酸序列的方法是用常規的自動多核苷酸合成儀制 備的退火補集的重疊的合成的寡核苷酸，然后用適當的DNA連接酶連接，并用PVR擴增連接 的核苷酸序列。參見如 Jayaraman 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088。另 外，在本發明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等，(1986)Nature 54:75-82)、先有 核苷酸區域的寡核苷酸定向誘變(Riechmann等，(1988)Nature 332 :323_327和Verhoeyen 等(1988) Science 239 1534-1536)和用T4DNA聚合酶進行的酶促補平帶缺口的寡核苷酸 合成(Queen 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 10029-10033)。一旦制備或分離了編碼序列，就可將這些序列克隆入任何合適的載體或復制子 中。對本領域技術人員而言，各種克隆載體是已知的，且適當的克隆載體的篩選只是選擇問 題。合適的載體包括(但并非限制于)質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體或當與適當的 控制元件結合時能復制的病毒。然后將克隆序列置于合適的控制元件的控制下，這取決于用于表達的系統。因此， 可以將編碼序列置于啟動子、核糖體結合位點(用于細菌表達)和任選地操縱子的控制下， 從而由合適的轉化體將感興趣的DNA序列轉錄到RNA中。該編碼序列可以包含或不包含 信號肽或前導序列(隨后可由宿主在翻譯后加工除去)。參見如美國專利No. 4，431，739; 4，425，437 ；4，338，397。除了控制序列外，可以添加調節序列，從而可以相對于宿主細胞的生長調節序列 的表達。調節序列是本領域技術人員已知的，其實例包括那些能導致應答化學或物理刺激 (包括調節化合物的存在)啟動或關閉基因表達的調節序列。載體中還可存在其它類型的 調節元件。例如，可以使用增強子元件以增加構建物的表達水平。實例包括SV40早期基因 增強子(Dijkema等(1985) EMB0J. 4 :761)；從Rous肉瘤病毒的長末端重復序列(LTR)衍生 的增強子 / 啟動子(Gorman 等(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 6777)；和從人 CMV 衍 生的元件(Boshart等，(1985) Cell 41 :521)，如CMV內含子A序列中包括的元件(美國專 利No. 5，688，688)。表達盒中還可包括在合適的宿主細胞中自主復制的復制起點、一種或多 種可選擇的標記物、一個或多個限制酶切位點、高拷貝數量的勢能和強啟動子。構建表達載體，使具體的編碼序列位于該具有適合調節序列的載體中，與控制序 列有關的編碼序列的位置和取向使編碼序列在控制序列的“控制”下轉錄(即，結合于控制 序列中DNA分子的RNA聚合酶轉錄該編碼序列)。可能需要對編碼感興趣分子的序列進行 修飾來實現此目的。例如，在一些情況中可能需要修飾該序列，從而使其連接于適合取向的 控制序列，即維持讀框。在插入到載體之前，控制序列和其它調節序列可能連接于編碼序 列。或者，可以將編碼序列直接克隆入已包含控制序列和合適的限制酶切位點的表達載體 中。通過缺失一部分編碼感興趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代該序列內 的一個或多個核苷酸，可以制備用于分析的本發明蛋白的突變體或類似物。修飾核 苷酸序列的方法，如定向誘變等是本領域技術人員所熟知的。參見如Sambrook等， 上述；Kunkel，T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82 448 ；Geisselsoder 等(1987)BioiTechniques 5 :786 ;Zoller 禾口 Smith(1983)Methods Enzymol.100 468 ； Dalbie-McFarland 等(1982)Proc. Natl. Acad. SciUSA79 :6409。這種分子可以在各種系統中表達，包括本領域熟知的昆蟲、哺乳動物、細菌、病毒 和酵母表達系統。例如，昆蟲細胞表達系統如桿狀病毒系統是本領域技術人員已知的，描述于如 Summers 禾口 Smith，Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo. 1555 (1987)。 用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法都是可以試劑盒形式購得的，尤其是 Invitrogen, San Diego CA(" MaxBac"試劑盒)。類似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統 也是本領域熟知的，其描述見如Sambrook等，如上。酵母表達系統也是本領域熟知的，其描 述見如《酵母遺傳工程》(YeastGenetic Engineering) (Barr 等編輯，1989)Butterworths， London。許多用于上述系統的適合的宿主細胞也是已知的。例如，哺乳動物細胞系是本 領域已知的，其包括可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖化的細胞系， 如(但并非限制于)中國倉鼠卵巢細胞(CH0)、Hela細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細 胞(COS)、人胚腎細胞、人肝細胞癌細胞(如H印G2)、Madin-Darby牛腎(〃 MDBK")細 胞等。類似地，在本發明的表達構建物中也可使用細菌宿主，如大腸桿菌、枯草桿菌和鏈 球菌。在本發明中還可用酵母宿主，特別包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形漢遜酵 母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯 維酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙氏畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴 斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)和 yarrowia lipolytic^。可與桿狀病毒表達系統一起使用的昆蟲細胞特別包括埃及伊 岐(Aedes aegypti)、苜猜丫 紋夜蛾(Autographacalifornica)、家香(Bombyx mori)、黑
(Drosophila melanogaster) >(Spodoptera frugiperda)禾口D"!^*.
(Trichoplusia ni)。用本領域熟知的各種基因送遞的方法，可將包含感興趣的核苷酸序列的核酸分子 穩定地整合入宿主細胞基因組中或在合適的宿主細胞中的穩定的附加型元件上維持。參見 如美國專利No. 5，399，346。根據所選用的表達系統和宿主，在表達蛋白質的條件下，培養用如上所述的表達 載體轉化的宿主細胞制備該分子。然后從宿主細胞分離出表達的蛋白質并純化。如果表達 系統將蛋白質分泌到培養基中，則直接從培養基純化產物。如果不是分泌的，則從細胞裂解 液分離。適合的培養條件和回收方法的選擇都是在本領域技術人員能力之內。因此，本發明也包括編碼本發明GAT-1蛋白質的核苷酸序列和含有該核苷酸序列 的表達載體，以及使用這類核苷酸序列或其表達載體促進肝再生。本發明還涉及所述GAT-1蛋白、其編碼序列以及含有所述編碼序列的表達載體在 制備促進肝再生用的物質中的用途。所述制備也包括基于所述GAT-1蛋白、其編碼序列以 及含有所述編碼序列的表達載體而篩選能夠促進肝再生的物質。因此，再一方面，本發明提供一種篩選用于促進肝再生的潛在物質的方法，該方法 包括
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(1)將候選物質與表達、_氨基丁酸轉運蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測候選物質對、_氨基丁酸轉運蛋白亞型1的影響；若所述候選物質可提高氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達、活性或分泌，則表明 該候選物質是可用于促進肝再生的潛在物質。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到GAT-1的表達或活性 的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達GAT-1的體系。所述的表達GAT-1的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可 以是內源性表達GAT-1的細胞；或可以是重組表達GAT-1的細胞。所述的表達GAT-1的體 系還可以是(但不限于)亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物 模型)等。作為本發明的一種優選方式，所述的體系是表達GAT-1的細胞體系。較佳地，表達 GAT-1的免疫細胞可來源于以下3種制備方法①來源于正常哺乳動物的單個核細胞取正常哺乳動物單個核細胞(淋巴結、外周血、脾臟)經過，例如(但不限于) anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和離子酶素刺激后，該細胞可表達GAT-1蛋白。將該種細 胞作為用于篩選促進肝再生的藥物的細胞模型。②T淋巴細胞系，選自(但不限于)0VA-特異性T細胞系、M0G-特異性T細胞系、 MBP-特異性T細胞系、Jurkat細胞系、YAC-1細胞系、人T淋巴細胞系(H9)、Hut-102等。取T淋巴細胞系經過抗原或anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和離子酶素刺激后， 該細胞可表達GAT-1蛋白。將該種細胞作為用于篩選促進肝再生的藥物的細胞模型。③來源于抗原免疫后或疾病狀態的哺乳動物的單個核細胞取抗原免疫后或疾病狀態的哺乳動物的單個核細胞(外周血、淋巴結、脾臟、病灶 部位等)經過刺激(抗原、anti-⑶3和anti-⑶28、佛波脂和離子酶素)活化后，該細胞可 表達GAT-1蛋白。將該種細胞作為用于促進肝再生的藥物的細胞模型。作為本發明的另一種優選方式，所述的體系是動物模型體系。較佳地，可采用具有 致病性的抗原或致病性的免疫細胞來制備致病的動物模型。所述的動物包括但不限于小 鼠、大鼠、豚鼠、兔等。誘導方法可如下經抗原免疫主動誘導致病；經被動轉移致病性(但 不限于)T細胞或B細胞或免疫因子(如抗體等)誘導致病。所述的動物模型也可以是自 發性的發病的動物模型。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細 胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于促進肝再生真正有用的物質。本發明對于GAT-1蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況的檢測方法沒有特別 的限制。可以采用常規的蛋白定量或半定量檢測技術，例如(但不限于)SDS_PAGE法， Western-Blot 法，ELISA 等。因此，本發明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于促進肝再生的潛在物質。 這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠對于促進 肝再生真正有用的物質，從而用于臨床。因此，本發明再一方面還包括GAT-1的激動劑及其在制備促進肝再生用的藥物方 面的用途。
如本文所用，所述的GAT-1的激動劑包括促進劑、上調劑等。任何可提高GAT-1蛋 白的活性、維持GAT-1蛋白的穩定性、促進GAT-1蛋白的表達、促進GAT-1蛋白的分泌、延長 GAT-1蛋白有效作用時間、或促進GAT-1的轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，作為可用于 促進肝再生的有效物質。作為本發明的優選方式，所述的GAT-1的激動劑包括(但不限于)雌激素、蛋白 酶C激動劑(佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制劑(環胞酶素A、Okadaic Acid
寸J <>作為本發明的優選方式，所述的GAT-1蛋白的激動劑包括(但不限于)在轉入細 胞后可表達(優選過表達)GAT-1的表達載體或表達構建物。通常，所述表達載體包含一基 因盒，所述的基因盒含有編碼GAT-1的基因及與之操作性相連的表達調控序列。所述的“操 作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控 制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操 作地連于編碼序列。本發明中，GAT-1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。只要能在宿主體內復 制和穩定，任何質粒和載體都可以用于本發明。表達載體的一個重要特征是通常含有復制 起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。如前文所述，本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含GAT-1的DNA序列和合 適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體 內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合 成。轉化載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ；較佳的 0. 00001-20襯％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的GAT-1蛋白或其激動劑，以及藥學上可 接受的載體。本發明的組合物可直接用于促進肝再生。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯 合使用。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其 中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術語“含有”表示各種成分可一起應用于本發明的混合物或組合物 中。因此，術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”中。如本文所用，術 語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物 所接受的量。如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發明的組合物含有安全有效量的GAT-1蛋白以及藥學上可接受的載體。這類載 體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與 給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄 糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。 活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
本發明所述的GAT-1蛋白或其激動劑的有效量可隨給藥的模式和待處理的肝損 傷的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來 確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的GAT-1蛋白或其激動劑的 藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者 的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的GAT-1蛋白或其激動劑每天以 約0. 00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0. 0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得 到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑 量按比例地減少。作為本發明的優選方式，所述的激動劑是雌激素，當每天以0. 1-800 yg/kg動物 體重給藥時，具有較好的效果；優選地每天以0. 5-300 u g/kg動物體重給藥；更優選地每天 以1-200 u g/kg動物體重給藥。本發明還提供了一種促進肝再生的方法，包括給予受試者有效量的GAT-1蛋白或 其激動劑。本發明的GAT-1蛋白或其激動劑的給藥方式沒有特別的限制，可以是全身的或局 部的。例如，本發明的GAT-1蛋白或其激動劑可通過腹腔注射、靜脈注射、口服、皮下注射、 皮內注射等的方式給予動物，較為優選的是靜脈注射。在得知了所述的GAT-1蛋白的用途后，可以采用本領域熟知的多種方法來將所述 的GAT-1蛋白或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。優選的，可采用基因治療的 手段進行，比如可直接將GAT-1蛋白通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定 的途徑將攜帶GAT-1基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表 達活性的GAT-1蛋白。作為本發明的一種實施方式，可將所述的GAT-1蛋白直接給藥于哺乳動物(比如 人)，或者，可將編碼GAT-1蛋白的基因通過常規的方法克隆到適當的載體(如常規原核或 真核表達載體、或病毒載體如皰疹病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導入到可表 達所述GAT-1蛋白的細胞中，使所述的細胞表達GAT-1蛋白。可通過將適量的所述細胞引 入到哺乳動物身體的適當部位，實現GAT-1蛋白的表達。GAT-1蛋白的激動劑的給藥方式主要取決于所述激動劑的類型和特性，這是本領 域人員可以評估的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。實施例1實施例中實驗所用材料及試劑1.動物:C57BL/6小鼠、GAT-l-/-小鼠的構建方法參考Cai YQ等，Journalof Neuroscience Research, 2006,84 :255_67。2.試劑GAT_1和0 -actin引物合成于上海英駿生物技術有限公司；RNA抽 提試劑盒、RNA 逆轉試劑盒購 Invitrogen ;SYBR Green PCR master mix 購自 Applied
11Biosystems ；自GAT-1 siRNA合成于上海吉瑪制藥技術有限公司。3.測試方法實時定量PCR1)RNA的提取和逆轉錄①RNA的提取使用Qiagen公司Rneasy Mini Kit，按照說明書操作，簡述如下從-80°C取出裝有350 u 1細胞裂解液的EP管，等待其融化|加入等體積350 ill 70 %乙醇，顛倒混勻數次|全部轉移至Rneasy mini colume，放在2ml收集管上|>= 8000g( >= 10000轉/分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內液體(如果樣品超過700 ill，再重復一次)|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 轉 / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內液體，置換新2ml收集管|加入80 ill DNA酶(盡量直接加到膜上)，室溫作用15分鐘|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 轉 / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內液體，置換新2ml收集管|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作濃度)，>=8000g( > = 10000 轉 / 分鐘)，常溫離心約15秒，倒去收集管內液體|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作濃度)，>=8000g( > = 10000 轉 / 分鐘)，常溫離心約2分鐘，倒去收集管內液體|將Rneasy mini colume放在新的1. 5ml收集管上|加入 30-50 ii 1 RNAse-free 水，>=8000g( >= 10000 轉 / 分鐘)，常溫離心約1分鐘，收集管內液體，測0D值|如果 RNA > 30u g,重復加入 30-50 u 1 RNAse-free 水，>= 8000g( >= 10000轉/分鐘)，常溫離心約1分鐘，收集管內液體，測0D值|紫外分光光度儀檢測RNA濃度|分裝并標記，于_80°C保存
②逆轉錄使用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit，按照說明書操作，簡述如下(合成cDNA的引物為核苷酸的隨機六聚體)
權利要求
γ 氨基丁酸轉運蛋白亞型1或其編碼序列在制備促進肝再生用的物質中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質是含有所述編碼序列的表達載體。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述物質是Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的 激動劑。
4.Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動劑在制備促進肝再生用的藥物中的用途。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的激動 劑選自雌激素、蛋白酶C激動劑、和磷脂酶抑制劑。
6.含Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的編碼序列的表達載體在制備促進肝再生用的藥物 中的用途。
7.一種篩選用于促進肝再生的潛在物質的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將候選物質與表達Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的體系接觸；(2)檢測候選物質對Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的影響；若所述候選物質可提高Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達、活性或分泌，則表明該候 選物質是可用于促進肝再生的潛在物質。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質加 入到組成性表達或誘導性表達Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達或活性，并與 對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達Y-氨基丁酸轉運蛋白業型 1的體系；如果測試組中Y-氨基丁酸轉運蛋白亞型1的表達、活性或分泌在統計學上高于對照 組，就表明該候選物質是可用于促進肝再生的潛在物質。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的體系選自細胞體系、亞細胞體系、溶 液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對獲得的潛在物質進行 進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于促進肝再生有 用的組合物。
全文摘要
本發明提供γ-氨基丁酸轉運蛋白亞型1(GAT-1)的編碼序列或γ-氨基丁酸轉運蛋白亞型1在制備促進肝再生用的物質中的用途。本發明還涉及基于所述GAT-1基因或GAT-1蛋白制備或篩選促進肝再生用的物質的方法。
文檔編號A61K45/00GK101935673SQ20091005435
公開日2011年1月5日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者徐凌云, 王瑩 申請人:中國科學院上海生命科學研究院