富含氨基酸的無細胞真皮基質移植物及其制法和用途的制作方法

專利名稱：富含氨基酸的無細胞真皮基質移植物及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，更具體地涉及用于皮膚移植的、富含氨基酸的無細 胞真皮 基質移植物及其制備方法和用途，所述的無細胞真皮基質可顯著促進無細胞真皮基質血管 化。
背景技術：
皮膚組織創傷后，增生性瘢痕的形成一直是困擾患者的一大難題。如何有效地防 治創傷后增生性瘢痕的形成，受到人們廣泛的關注和期待。全層皮膚缺損創面的現代治療以移植刃厚自體皮(即薄皮)為主。由于刃厚自體 皮含有較少的真皮成分，創面愈合后會產生不同程度的疤痕增生。若移植較厚的自體皮，則 往往在供皮區造成明顯的疤痕增生。1981年Bell等人利用提取的天然膠原蛋白與成纖維細胞按一定的比例混合，形 成一個真皮層。再將表皮細胞懸液接種在這個真皮層上，制成一個類似正常皮膚的復合皮。Hznsbrough也利用可被生物降解的聚合物作為細胞生長的基質框架，在體外將新 生兒成纖維細胞接種于基質框架內。隨著細胞在框架上的生長，它們不斷地分泌出許多蛋 白質和糖蛋白等成分，充填在網狀框架中，形成一個天然的細胞外基質。經過實驗表明這個 具有生命活性的真皮替代物覆蓋在深度創面上能夠迅速血管化，并且覆蓋在其上的自體表 皮也隨之上皮化。Heck于1985年報道，以同種異體真皮作為自體表皮的移植載體并應用于大鼠和 人體上。他采用經過冷凍處理過的天然同種異體皮膚通過真空吸引法將所得的自體皮覆蓋 在異體真皮表面。上述的一些復合移植方法，已部分建立具有類似真皮的結構和功能。植皮區創面 變得光滑、平整；減少了疤痕增生，愈后功能也較為完善。Cuono等人借助體外培養后的單層表皮細胞，覆蓋于去除表皮的異體真皮表面。這 種方法雖然已初步應用于臨床，但效果難以肯定。原因是這種方法雖然脫除了表皮，從而降 低了免疫抗原性，不會招致急性排斥反應，但是由于保留了真皮層內含有的表皮細胞成分、 成纖維細胞和血管內皮細胞等，它們依然會引發機體產生免疫排斥反應。1995 年美國生命細胞公司的 Livesey[Livesey SA, Herndon DN, Hollyoak MA, et al :Transplanted Acellular Allograft Dermal Matrix. Transplantation, 1995,60(1) 1 9]等首先報道了無細胞真皮基質的制備方法。同年美國的WainwrightDVainwright DJ :Use of an Acellular Allograft Dermal Matrix(AlloDerm)in the Management of Full-thickness Burns. Burns, 1995, 21 (4) :243 248]首先報道了無細胞真皮基質的臨 床應用，引起了國際燒傷學界的廣泛重視；國內許多單位也相繼開展了臨床應用，其應用范 圍擴大到整形外科，領面外科等，取得了較好的臨床效果。無細胞真皮基質(Acellular Dermal Matrix，ADM)是一種用于全層皮膚缺損創面 的真皮替代物，來源于天然皮膚。它是天然皮膚經過一定的理化方法處理后，去除了表皮和真皮中所有細胞成分，但保留了真皮的膠原成分和其三維空間結構，同時也保留了基底膜 復合物。由于去除了皮膚中具強抗原性的細胞成分，而僅殘留具微弱抗原性的膠原蛋白等 細胞外基質成分，同時由于它具有天然真皮結構，可以誘導移植后宿主的細胞成分(如成 纖維細胞、內皮細胞等)循其支架結構生長，真皮基質還可支持成纖維細胞的浸潤、新生血 管形成，使成纖維細胞合成和分泌具有正常結構和功能的細胞外基質如膠原，使肉芽組織 快速成熟及真皮深層再生，減少成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，并與其上移植的自體表 皮成分融合，形成較為完整的皮膚結構，基本恢復了皮膚原有的功能，從而產生了良好的少 疤或無疤的臨床效果。無細胞真皮基質與自體表皮復合移植是目前治療需要植皮的全層皮 膚缺損中很有前途的方法。
然而，無細胞真皮基質應用過程中遇到的突出問題是無細胞真皮基質移植后，在 短時間(3 5天)內，如未能與創面基底建立良好的血液循環，則可引起嚴重的不良后果， 表現為(1)移植物抗感染能力差，易因發生感染導致移植失敗；(2)未能為其上移植的自 體表皮提供足夠的營養，從而影響后者的存活。目前市場上已經開發了 一些脫細胞真皮的產品，如Integra，Dermagraft_TC， AlloDerm，皮耐克等，但從臨床效果來看，仍不盡人意。其最大的缺陷之一是皮片存活率較 低。國內作者報道，將厚約0.3-0. 5mm的脫細胞真皮與自體刃厚皮片復合移植，存活率只有 60.0%左右。[馮祥生，潘銀根，譚家駒等.異種(豬)脫細胞真皮與自體表皮復合移植研 究·中華整形外科雜志，2000，16(1) 40-42]國外學者用脫細胞真皮修復先天缺損的牙齦粘膜及鼻中隔穿孔等，但由于脫細胞 真皮血管化率低，在臨床推廣應用受到限制。因此有人推測，無細胞真皮基質的廣泛應用仍 為時過早。隨著近年來對無細胞真皮的研究逐漸深人，如何促進ADM的血管化，逐步成為組 織工程皮膚研究的關鍵，也是臨床迫切需要解決的難題。因此，本領域迫切需要提供新的、有效促進基質血管化的，可用于治療全層皮膚缺 損創面的移植物。

發明內容
本發明的目的就是提供一種新的、有效促進基質血管化的，可用于治療全層皮膚 缺損創面的移植物及其制法。在本發明的第一方面，提供了一種移植物，它包括(a)真皮基質，所述的真皮基質中細胞數量小于5%，按真皮基質的體積計；(b)按真皮基質的重量計，含量為0. 5-30重量％的游離氨基酸，所述的游離氨基 酸結合或吸附于所述的真皮基質；和(c)按真皮基質的重量計，含量為0-30重量％的殼聚糖，其中所述的游離氨基酸指未形成肽鍵的、具有游離的氨基和游離的羧基的氨基 酸。在另一類優選例中，所述的氨基酸選自下組色氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴 氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲 氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸。在另一類優選例中，所述氨基酸至少包括10、11、12、13、14、15、16、17、18種天然氨基酸。在另一類優選例中，組分(b)的含量為2-20重量％，更佳地為4-20重量％，按真 皮基質的重量計。在另一類優選例中，組分(b)和組分(c)的干重重量比為1 5至5 1，更佳地 為 2 1 至 1 2。在另一類優選例中，所述的真皮基質中細胞數量< 4，較佳地< 3%，更佳地 (2%，最佳地< 1%，按真皮基質的體積計。在另一類優選例中，所述的真皮基質還含有基底膜復合物。在另一類優選例中，所述的移植物還含有選自下組的一種或多種物質(dl)細胞因子，所述的細胞因子包括成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長 因子、血小板衍生生長因子、轉化生長因子-α或其混合物；
(d2)用于防止傷口感染發炎的抗生素；(d3)防止生長因子降解的保護劑(如肝素)。更佳地，所述的細胞因子的含量為0. 0001-0. 1重量％，按真皮基質的重量計。在另一類優選例中，所述的細胞因子的有效量是100-30000AU/立方厘米真皮基質。在另一類優選例中，所述的真皮基質的厚度是0. 1-5毫米，更佳地為0. 2-2毫米。在另一類優選例中，所述的真皮基質來自下列動物的皮膚豬、牛、人、鼠。在另一類優選例中，所述的移植物是用本發明第二方面中所述的方法制備。在本發明的第二方面中，提供了一種制備移植物的方法，包括步驟(i)提供一真皮基質，所述的真皮基質中的細胞數量小于5%，按真皮基質的體積 計；(ii)將真皮基質與游離氨基酸和/或殼聚糖接觸，從而使真皮基質含有按真皮基 質的重量計，含量為0. 5-30重量％的游離氨基酸，所述的游離氨基酸結合或吸附于所述的 真皮基質；以及按真皮基質的重量計，含量為0-30重量％的殼聚糖。在另一類優選例中，在步驟(b)中，用無針高壓注射槍將含游離氨基酸的溶液、或 者含有游離氨基酸和殼聚糖的溶液注入真皮基質中。在另一類優選例中，在步驟(ii)中還包括步驟將(b)將真皮基質與細胞因子接 觸，從而使真皮基質中含有濃度為100-30000AU/立方厘米真皮基質的所述細胞因子，其中 所述的細胞因子包括成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因 子、轉化生長因子-α或其混合物。在另一類優選例中，用無針高壓注射槍用所述細胞因子的溶液注入真皮基質中。在另一類優選例中，所述的真皮基質中細胞數量小于1%，按真皮基質的體積計。在本發明的第三方面，提供了一種試劑盒，它含有本發明第一方面中所述的移植 物和使用說明書。在本發明的第四方面，提供了本發明上述移植物的用途，它用于制備用于治療皮 膚表面創傷的皮膚移植物。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具 體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再--累述。附圖簡述

圖1顯示了淺二度創面情況下，與不補充氨基酸的對照(A區)相比，在補充氨基 酸時(B區)壞死組織去除早，創面愈合速度快。圖2顯示了深二度創面情況下，與不補充氨基酸的對照(A區)相比，在補充氨基 酸時(B區)創面愈合速度快。對照A區壞死組織多，炎癥明顯。圖3顯示了在不含氨基酸成分的對照培養液培養時，對照組內皮細胞生長不良， 數量不擴增。圖4顯示了在含氨基酸成分的為M199培養液培養時，實驗組細胞生長良好，細胞
tS朱。圖5顯示了在不添加氨基酸的對照組支架內，細胞數量少(移植5天)。圖6顯示了在添加了氨基酸的實驗組支架內，細胞血管數量多(移植5天)。
具體實施例方式針對上述本領域存在的問題，本發明人經過深入而廣泛的研究，意外地發現，通過 加入能游離態的氨基酸和任選的殼聚糖組分，可促使無細胞真皮基質的血管化，從而使得 移植物在移植后較短時間內就與創面基底建立良好的血液循環，提高移植成功率，并改善 其移植效果。本發明人在此基礎上完成了本發明。術語術語“純化的或分離的”指純化的或分離的物質基本上不含有其他細胞、蛋白質或 多肽，例如純化的細胞因子或分離的細胞因子。術語“異種移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某一物種中取出并再施用于另 一物種對象的方法。術語“自體移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某病人中取出并再施用于同一 病人的方法。術語“異體移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某病人中取出并再施用于另一 不同病人的方法。術語“同基因移植”指在遺傳上相同的人之間發生的細胞移植。無細胞真皮基質可用于本發明的無細胞真皮基質沒有特別限制，可以是用來源人、豬、牛等哺乳動 物的天然皮膚，通過已知方法制備的無細胞真皮基質。就無細胞真皮基質的主要成分而言，為去除了正常皮膚中的表皮成分和真真皮中 所有細胞成分，而保留了真皮中的膠原成分和其三維空間結構，同時較佳地還保留了基底 膜復合物。無細胞真皮基質中的膠原為存在于基質中的I和III型膠原，存在于基底膜中 的IV型膠原。另外，基質中還有彈力纖維、硫酸軟骨素、纖維連接蛋白、氨基聚糖。在本發明的真皮基質中，細胞數量小于5 %，較佳地小于1 %，更佳地小于0. 5 %， 最佳地小于0. 1%，按真皮基質的體積計。一種簡便的檢測方法是在光學顯微鏡高倍視野 (X40)下觀察時，細胞計數小于3只，較佳地小于2個，更佳地小于1只。一種優選的真皮基質還含有基底膜復合物，其作用是加強真皮和表皮之間的連接，并改善皮片愈合后的質量。無細胞真皮基質的厚度沒有特別限制，通常約為0. l_5mm，較佳地約為0. 2_2mm， 更佳地約為0. 30-0. 50mm。無細胞真皮基質的大小沒有特別限制，可以根據創面不同而制作，也可以制作成 例如IOOmmXlOOmm的特定規格，然后在使用時裁剪下所需大小的真皮基質。氨基酸
如本文所用，術語“游離氨基酸”或“游離態氨基酸”指未形成肽鍵的、具有游離的 氨基和游離的羧基的氨基酸。簡言之，指未化合的氨基酸。應理解，在本發明的移植物中，游離態氨基酸可以是處于液態或固態，當然通常游 離態氨基酸結合或吸附于所述的真皮基質。可用于本發明的氨基酸沒有特別限制，可以是任何的天然氨基酸，代表性的氨基 酸包括(但并不限于)色氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨 酸、天冬氨酸、和精氨酸。在優選的本發明的移植物中，所述游離氨基酸至少包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18種天然氨基酸。較佳地，本發明的移植物中含有精氨酸、谷氨酸和脯
氨酸這三種必需氨基酸；更佳地含有亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、 色氨酸、和甲硫氨酸這8種必需氨基酸。—種優選的游離態氨基酸的原料是常規的、醫用的復方氨基酸注射液。在本發明的移植物中，游離態氨基酸的一般大于0. 1重量％，通常為0.5-30重 量％，較佳地為1-20重量％，更佳地為1.5-20重量％，按真皮基質的重量計。殼聚糖在本發明的移植物中，殼聚糖是一種任選的組分。然而，為了使得移植物攜帶更多 的游離態氨基酸，宜同時使用殼聚糖。殼聚糖是由甲殼類動物提取的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖組成的多聚糖，具有 來源廣泛，成本低廉，其黏度高、黏結力大，流動性和溶解性好，且具有良好的生物黏附性、 生物相容性、安全性，可以穩定地攜帶藥物黏附于組織材料上，同時延長藥物在患處的滯留 時間。另外，殼聚糖是一種線性長鏈高聚物分子，含有大量可以與其他細胞分子形成氫 鍵的-OH和-NH2基團，當環境pH小于其離子解離常數(6. 5)時，-NH2質子化形成-NH3+使 分子帶正電。上述分子特性使殼聚糖成為優良的生物黏附材料，既可以有效攜帶氨基酸成 分，又可以促進細胞的黏附和遷移。再者，無細胞真皮基質經脫細胞物質和戊二醛交聯處理后，支架內的膠原的天然 性質難以重現，影響了對正常細胞的黏附，是無細胞真皮基質難以血管化的重要原因之一。本發明人的研究表明，當殼聚糖結合后，無細胞真皮支架表面獲得改性，可以促進 細胞向支架的黏附、遷移和浸潤，同時釋放氨基酸成分營養細胞，加速細胞增殖和血管化。 因此殼聚糖是一種較為理想的促進游離態氨基酸吸附或粘附的載體材料。在本發明中，殼聚糖的含量沒有特別限制，按真皮基質的重量計，其含量通常為 0-30重量％，較佳地為0. 5-25重量％，更佳地為1-20重量％。
當本發明的移植物同時含有游離態氨基酸和殼聚糖時，兩者的重量比沒有特別限 制。為了獲得較佳的效果，游離態氨基酸和殼聚糖的干重重量比為通常為1 10至10 1 ； 較佳地為1 5至5 1，更佳地為2 1至1 2。其他添加劑在本發明的活性無細胞真皮基質中，除了含有上述的游離態氨基酸和殼聚糖之 外，還可以含有其他一些添加劑，例如促進血管生成的細胞因子、防止傷口感染發炎的抗生 素、防止生長因子降解的保護劑(如肝素)。一種優選的其他添加劑是促進血管生成的細胞因子。如本文所用，術語“促進血管生成的因子或細胞因子”指對血管生成有促進或激 活作用的物質，主要包括成纖維細胞生長因子(fibroblast growthfactor，FGF)、血管 內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因 子(Platelet-derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子-a (transforming growth factor- a，TGF- a )等。優選的細胞因子是FGF (包括堿性成纖維細胞生長因子bFGF)和 VEGF。VEGF血管內皮細胞生長因子被認為是作用最強、特異性最高的促內皮細胞增殖、 遷移的調控因于。在創面愈合過程中，VEGF促進創面血管化；迄今只發現血管內皮細胞對 VEGF有高特異性的增殖反應，還未見其它細胞對VEGF反應的報道。因此，創面組織中VEGF 的多少與血管形成密切相關。此外，VEGF參與調節血管內皮細胞(endothelial cell, EC) 遷移、增殖和管樣結構的形成。VEGF不足會導致血管腔閉合、血管退化。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是哺乳動物和人體內存在的一種非常微量的多 肽類物質，能刺激中胚胎層和外胚胎層來源的細胞如成纖維細胞、血管內皮細胞等的分裂 和增殖，生理功能非常廣泛。bFGF對創傷修復過程的三個階段，即局部炎癥反應階段、細胞 增殖分化及肉芽組織形成階段、組織重建階段均有顯著的促進作用。在細胞增殖和修復期， 最關鍵的步驟之一是肉芽組織的形成，肉芽組織的本質是大量的毛細血管和豐富的成纖維 細胞，bFGF正是成纖維細胞、血管內皮細胞及血管平滑肌細胞的高效促生長劑，能夠強烈刺 激新生毛細血管的形成，顯著增加肉芽組織毛細血管數量和血液流量，改善創面微循環，為 組織修復提供所必須的氧及豐富的營養物質。所以，創面bFGF的含量與創面愈合中新生血 管的形成密切相關。利用bFGF和VEGF等生長因子的這種生物作用，可以進一步提高無細胞真皮基質 移植后的存活率，進而改善其移植效果。可用于本發明的各細胞因子的來源沒有特別限制，可以使用天然的、分離的、重組 的或合成的細胞因子，而分離、重組表達和/或人工合成各種細胞因子的技術是本領域中 已知的。此外，還可從市場上購得各細胞因子，例如bFGF可購自珠海東大集團東大生物工 程公司。其他藥物載體除了使用殼聚糖作為優選的氨基酸載體之外，在本發明的移植物中還可使用其他 作為藥物載體的黏附材料，只要這些材料對于傷口的愈合無副作用。代表性的其他藥物載 體包括(但并不限于)膠原凝膠、明膠、西黃芪膠、黃原膠、植物凝集素、羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na)、羥乙基纖維素、羥丙甲纖維素和羥丙基纖維素、卡波姆、或其組合。
制備方法在獲得了無細胞真皮基質后，將真皮基質與游離態的氨基酸和任選的殼聚糖接 觸，從而制得富含游離態氨基酸的無細胞真皮基質移植物。在本發明中，制備方法沒有特別限制，只要該方法能使游離態氨基酸均勻地分布 在真皮基質之中和或之上即可。一種方法是將無細胞真皮基質在含游離態氨基酸的溶液中放置(孵育)一段時 間，然后進行干燥(例如冷凍干燥)。其中，在溶液中放置然后進行干燥的步驟可進行一次或多次。如果需要使得無細胞真皮基質含有攜帶氨基酸的藥物載體(如殼聚糖)，可以將 無細胞真皮基質在含殼聚糖和氨基酸的混合溶液中浸潤，或者依次在殼聚糖溶液和氨基酸 溶液中浸潤。另一種方法是用無針高壓注射槍(例如可購自MadaJet XL, USA的無針高壓注射 槍)將游離態的氨基酸注入無細胞真皮基質中。這種方法的優點是利用壓力使游離態氨基 酸均勻地滲透到真皮基質之中。這兩種方法都能促使無細胞真皮基質的血管化，從而提高無細胞真皮基質移植成 功率從而改善其移植效果。創面愈合過程中血管化的檢測，可通過常規方法進行，例如，通過檢測以下指標進 行。1)HE染色，利用光鏡可直接觀察組織中血管的大致形態和數量分布，方法相對簡 單，但不夠準確。2)CD31 血小板內皮細胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesi0nm0leCule)。CD31是一種130Kda整合粘膜蛋白，屬于免疫球蛋白超基因家族，介導 細胞與細胞粘附。⑶31在內皮細胞中持續表達，因此可以作為血管化標志。3)⑶34，在內皮細胞粘附過程中，扮有重要角色，是血管形成的重要標志。實驗研 究顯示，在創面新生生成的血管，其⑶34表達普遍增加，抗⑶34抗體能很好標記內皮細胞， 并能區分新生血管和正常組織血管。上述這些指標可應用免疫學和組織化學原理進行檢測，并對創面組織切片中血管 內皮細胞帶有的抗原進行顯色，利用光學顯微鏡對創面組織中的微血管計數，從而得出創 面組織中的微血管密度，反映創面的血管化程度。本發明的實驗已表明，使用本發明的活性無細胞真皮基質后，能促使無細胞真皮 基質移植后在短時間內就形成優良的血管化，從而建立良好的血液循環，提高移植成功率， 從而改善其移植效果。本發明的主要優點包括(a)材料價格低廉，制作方法相對簡單，對機體細胞無毒無害。(b)本發明移植物可顯著促進無細胞真皮支架血管化。(c)本發明移植物的制備方法適合產業化批量生產。(d)使用殼聚糖作為藥物載體時，有助于提高氨基酸的攜帶量并且控制氨基酸的 釋放。(e)本發明殼聚糖作為藥物載體時，還可添加如細胞因子，抗生素等成分達到組織修復目的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1補充氨基酸成分有利于創傷組織的修復將復合氨基酸與殼聚糖混合制成凝膠，分別應用于志愿者的燒傷淺II度和深II 度創面，標記為B區。對照組使用磺胺嘧啶銀，標記為A區。每日一次，隔日應用。結果如圖1和2所示。實驗組創面(B區)炎癥明顯減輕，壞死組織去除早，愈合 速度大大快于對照組(A區)。這表明局部氨基酸應用能極大促進創面愈合，同時減輕局部 炎癥反應。實施例2氨基酸成分有利于細胞的生長選擇常規的臍靜脈內皮細胞進行培養，其中實驗組為M199培養液培養(富含多種 氨基酸成分)，而對照組為不含氨基酸成分的同等培養液。結果如圖3和4所示，對照組細胞生長不良，增殖率明顯下降。實施例1和2的結果提示，局部氨基酸的應用能促進內皮細胞增殖，促進組織生長。實施例3無細胞真皮基質的制備在該實施例中，通過以下步驟制備無細胞真皮基質，以下步驟均要求無菌操作。步驟一清潔級SD大鼠，背部脫毛后24小時，切取背部全厚皮膚(大小約15X20 平方厘米)；在取皮鼓上反取中厚皮；①去表皮處理加入2. 5單位/ml分散酶II (Dispase II，Roche公司)，4°C條件下作用24小時，在作用結束后以彎頭皮鑷揭除表皮，并吸去去表 皮液。②脫細胞處理加入0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS，簡稱去污劑)160ml，20 26°C作 用24小時；吸除去污劑，用Hanks液沖洗兩遍，最后，吸除Hanks液，即可得到無細胞真皮基 質。然后將其置于含青霉素(lOOu/ml)、氯霉素(100ug/ml)和卡那霉素(100ug/ml)的 Hanks液中，4°C保存備用。合格的無細胞真皮基質符合以下要求去除了表皮和真皮中所有細胞成分，包括 完整的細胞和細胞碎屑(細胞碎屑< 1/10個高倍視野)，但保留了真皮的三維空間結構。實施例4制備富含游離態氨基酸的移植物在本實施例中，采用具有生物黏附性能的殼聚糖作為支架材料與氨基酸的媒介。 將殼聚糖與氨基酸成分有效混合后，通過無細胞真皮基質的反復浸提與晾干(或凍干)，然 后將無細胞真皮基質冷凍干燥，從而制得富含游離態氨基酸的移植物。材料復方氨基酸注射液(18AA)為復方制劑，是由18種氨基酸配制而成的滅菌水溶液， 總氨基酸含量為8.5%。各氨基酸濃度(毫克/1000毫升)
L-丙氨酸 1220L-異亮氨酸420L-精氨酸 840L-亮氨酸 590L-天門冬氨酸250醋酸L-賴氨酸950L-胱氨酸 20L-谷氨酸 420L-甘氨酸 590L-蛋氨酸 420L-組氨酸 500L-苯丙氨酸340L-脯氨酸 420L-蘇氨酸 420L-絲氨酸 340L-色氨酸 140L-酪氨酸 20L-纈氨酸 550方法如下將市售的18種氨基酸含量為8. 5%的復方氨基酸溶液與殼聚糖進行混合，制得殼 聚糖和氨基酸的混合液。所述混合液中，總氨基酸的濃度為8. 5%，殼聚糖的濃度為3%。將實施例1中制備的無細胞真皮，依照無細胞真皮質量與浸提介質體積之比 0. 2g/ml，浸入制備的殼聚糖和氨基酸的混合液中，經過三次浸提與晾干，進行冷凍干燥，制 得富含游離態氨基酸的移植物。經過測定，在制備的移植物中，每克無細胞真皮含復方氨基酸成分約0. lg(約為 10%氨基酸含量)。實施例5活性無細胞真皮基質的動物試驗在該實施例中，利用動物實驗進行測試。測試方法如下選擇一定數量的清潔級 SD大鼠，背部脫毛后24小時，用手術刀在人鼠背部切取一定大小的全層皮膚，在鼓式取皮 刀上反取刃厚皮，作為自體皮。創面隨機分為三組組1創面作為實驗創面，止血后，先移植在實施例4中制備的活性無細胞真皮基 質，然后在其上移植自體皮，加壓包扎；組2創面作為對照創面，止血后，同樣先后移植實施例3中制備的無細胞真皮基質 和自體皮，加壓包扎。7天，14天和21天后，上述每組動物分別取材后處死。標本固定，石蠟切片后HE 染色與免疫組織化學檢測CD31和CD34，利用光學顯微鏡對上述切片創面組織中所標記的 微血管計數，可以得出創面組織中的微血管密度。根據創面組織中所標記的微血管計數值，比較添加與不加游離氨基酸所產生的創面不同血管化程度。結果如下(1)加入游離氨基酸后的活性無細胞真皮基質，能促使無細胞真皮基質移植后在 短時間內與創面基底建立良好的血液循環，提高了移植成功率、改善移植效果。(2)組1的效果優于組2的效果。這表明，添加了氨基酸的實驗組細胞遷入多和血管化早，而對照組細胞和血管數 目少(圖5和圖6)。實施例6活性無細胞真皮基質的制備基本上按實施例3的步驟制備活性無細胞真皮基質，不同點僅在于選用的皮膚是 脫毛后的豬皮。實施例7活性無細胞真皮基質的制備基本上按實施例3和4的步驟制備活性無細胞真皮基質，不同點僅在于，額外添加 了濃度為2500AU的bFGF(每克無細胞真皮基質)。實施例8 活性無細胞真皮基質的制備基本上按實施例3和4的步驟制備活性無細胞真皮基質，不同點僅在于，分別將無 細胞真皮基質依次浸在3%殼聚糖溶液和8. 5%復合氨基酸溶液中，而不是浸在殼聚糖和 氨基酸的混合溶液中。經過測定，在制備的移植物中，每克無細胞真皮含復方氨基酸成分約0.07g(約為 氨基酸含量)。實施例9市售的氨基酸含量為8. 5%的復合氨基酸溶液，取2ml、4ml、6ml以無針高壓注射 槍(購自Madajet XL, USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮基質，冷凍干燥后，得到富 含氨基酸的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中氨基酸濃度分別約為 0. 02g/克真皮基質，0. 04g/克真皮基質和0. 06g/克真皮基質。或者將無細胞真皮基質直接使用氨基酸溶液浸提，晾干后無細胞真皮的氨基酸含 量約為0. 03g/克真皮基質。實施例10配制氨基酸含量為精氨酸含量2% (w/v)、谷氨酸含量2% (w/v)和脯氨酸(w/ v)的三元氨基酸復合溶液。取5ml以無針高壓注射槍(購自Madajet XL, USA)注入重量 為10g的無細胞真皮基質，冷凍干燥后。取5ml氨基酸溶液，再次以無針高壓注射槍注入， 冷凍干燥后，得到富含氨基酸的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中氨基 酸濃度約為0. 05g/克真皮基質。實施例11將氨基酸含量為8. 5%且殼聚糖為3%的混合溶液，取5ml以無針高壓注射槍(購 自MadaJ et XL, USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮基質，冷凍干燥后，得到富含氨基 酸的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中氨基酸濃度約為0. 05g/克真皮 基質，殼聚糖濃度為約0. 03g/克真皮基質。
實施例12將氨基酸含量為8. 5%且殼聚糖為5%的混合溶液，取5ml以無針高壓注射槍(購 自Madajet XL,USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮基質，冷凍干燥后，得到富含氨基酸 的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中氨基酸濃度約為0. 05g/克真皮基 質，殼聚糖濃度為約0. 04g/克真皮基質。實施例13將氨基酸含量為3%且殼聚糖為5%的混合溶液，取5ml以無針高壓注射槍(購自 Madajet XL, USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮基質，冷凍干燥后，得到富含氨基酸的 無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中氨基酸濃度分別約為0. 02g/克真皮 基質，殼聚糖濃度為約0. 08g/克真皮基質。實施例14將氨基酸含量為3%且殼聚糖為5%并含2400AU bFGF/ml (lng/ml)的混合溶液， 取5ml以無針高壓注射槍(購自Madajet XL, USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮基 質，冷凍干燥后，得到富含氨基酸的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質中 氨基酸濃度分別約為0. 02g/克真皮基質，殼聚糖濃度為約0. 08g/克真皮基質，bFGF的濃 度分別約為15000AU/立方厘米。實施例15將氨基酸含量為3%且殼聚糖為5%并含24000AU bFGF/ml (10ng/ml)的混合溶 液，取5ml以無針高壓注射槍(購自Madajet XL, USA)分別注入重量為10g的無細胞真皮 基質，冷凍干燥后，得到富含氨基酸的無細胞真皮基質。其中，獲得的活性無細胞真皮基質 中氨基酸濃度分別約為0. 02g/克真皮基質，殼聚糖濃度為約0. 08g/克真皮基質，bFGF的 濃度分別約為15000AU/立方厘米。實施例16活性無細胞真皮基質的動物試驗基本上按實施例5的方法，對實施例6-15中制備的活性無細胞真皮基質進行動物 實驗。結果表明，這些富含氨基酸的活性無細胞真皮基質可在短時間內與創面基底建立 良好的血液循環，提高移植成功率，并改善移植效果。
13移植物試驗結果備注實施例6細胞遷入多和血管化早實施例7細胞遷入多和血管化早實施例8細胞遷入多和血管化早實施例9細胞遷入較多和血管化較早氨基酸含量越高，效果越好。移植至大 鼠背部創面，亦能促進無細胞真皮血管 化，與不添加氨基酸組比較有明顯優 勢。但效果不及殼聚糖載體組實施例10細胞遷入較多和血管化較早僅含三種關鍵氨基酸的移植物也能夠促 進血管化，但效果稍遜于18種復合氨基 酸的效果。實施例11細胞迀入多和血管化早實施例12細胞遷入多和血管化早實施例13細胞遷入多和血管化早實施例14細胞遷入多和血管化更早實施例15細胞遷入多和血管化更早討論為了便于理解，本發明人提供以下討論和機理。然而應理解，本發明的保護范圍并 不受這些討論和機理的限制。臨床研究發現淺度燒傷愈合后不遺留或僅遺留輕微的瘢痕，而深度燒傷愈合后 則易形成明顯的瘢痕增生。皮膚缺損后植皮越厚，瘢痕形成越少，植全厚皮則不遺留瘢痕。 本發明人通過研究脫細胞真皮支架對成纖維細胞生物學功能影響，發現脫細胞真皮具有 “模板樣”作用，能夠調控成纖維細胞生物學行為向著減少瘢痕的方向發展，減少TGF- 3 1和 膠原等的產生，從而減少瘢痕的形成。由此提出了瘢痕形成的“真皮模板缺損學說”。創傷修復是一個組織再生的過程，生物合成是組織細胞最主要的活動。其中氨基 酸元素是細胞生物合成需求的基本原料。所有細胞都需要8種必須氨基酸作為原料參與組 織修復，包括亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。此外 還需要谷氨酰胺，其中所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的原料，也是合成ATP，ADP，AMP 所需要的基本物質。對創傷大鼠血漿游離氨基酸譜的檢測發現，血漿游離氨基酸在創傷后三天不論必
需氨基酸或非必需氨基酸，其總和均顯著降低。原因主要有三個方面一是創面滲出液中丟
失大量游離氨基酸；二是因為創傷后氨基酸的分解代謝增加；三是局部組織修復使機體需
求量大大增加。從個體氨基酸的改變看，大致可分為以下幾類。第一類創傷后含量下降。
包括異亮、亮、纈、丙、谷、精、絲氨酸。第二類創傷后含量一度升高，但以后均恢復，有苯丙氨酸和組氨酸。第三類創傷后含量基本無改變，有蛋氨酸等。發明人認為，有關氨基酸促進創面愈合的機制可能與以下因素有關。首先，氨基酸對細胞內蛋白質合成和降解過程中有重要的調節功能。當把支鏈氨 基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)注入老鼠正常濃度的原生質中，可以加速蛋白質合成的 磷酸化過程，促進蛋白質的合成，同時抑制蛋白質的分解，為細胞蛋白質和酶的合成提供充 分的底物。其次還與精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等等具有抗氧化功能和促進免疫細胞功能 的作用有關，保護細胞免受氧自由基的攻擊，促進中性粒細胞和巨噬細胞活化。再者，氨基酸的組合添加物可以提高內皮細胞N0S和NO的表達，促進線粒體功能 和內皮細胞的增殖和血管化，同時促進局部血流灌注。一方面，殼聚糖可有效地攜帶氨基酸吸附于無細胞真皮基質。另一方面，當殼聚糖 結合于無細胞真皮基質后，無細胞真皮支架表面獲得改性，可以促進細胞向支架的黏附、遷 移和浸潤，同時釋放氨基酸成分營養細胞，加速細胞增殖和血管化。因此殼聚糖是一種較為 理想的促進游離態氨基酸吸附或粘附的載體材料，有助于提高氨基酸的攜帶量并且控制氨 基酸的釋放。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
一種移植物，其特征在于，它包括(a)真皮基質，所述的真皮基質中細胞數量小于5％，按真皮基質的體積計；(b)按真皮基質的重量計，含量為0.5-30重量％的游離氨基酸，所述的游離氨基酸結合或吸附于所述的真皮基質；和(c)按真皮基質的重量計，含量為0-30重量％的殼聚糖，其中所述的游離氨基酸指未形成肽鍵的、具有游離的氨基和游離的羧基的氨基酸。
2.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的氨基酸選自下組色氨酸、蛋氨酸、 蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、 精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸。
3.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，所述氨基酸至少包括10、11、12、13、14、 15、16、17、18種天然氨基酸。
4.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，組分(b)和組分(c)的干重重量比為 1 5 至 5 1。
5.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物還含有選自下組的一種或 多種物質(dl)細胞因子，所述的細胞因子包括成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、 血小板衍生生長因子、轉化生長因子-α或其混合物；(d2)用于防止傷口感染發炎的抗生素；(d3)防止生長因子降解的保護劑。
6.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基質的厚度是0.1-5毫米，更 佳地為0. 2-2毫米。
7.如權利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基質來自下列動物的皮膚 豬、牛、人、鼠。
8.一種制備移植物的方法，其特征在于，包括步驟(i)提供一真皮基質，所述的真皮基質中的細胞數量小于5%，按真皮基質的體積計；( )將真皮基質與游離氨基酸和/或殼聚糖接觸，從而使真皮基質含有按真皮基質的 重量計，含量為0. 5-30重量％的游離氨基酸，所述的游離氨基酸結合或吸附于所述的真皮 基質；以及按真皮基質的重量計，含量為0-30重量％的殼聚糖。
9.一種試劑盒，其特征在于，它含有權利要求1所述的移植物和使用說明書。
10.一種權利要求1所述的移植物的用途，其特征在于，用于制備用于治療皮膚表面創 傷的皮膚移植物。
全文摘要
本發明提供了一種富含氨基酸的無細胞真皮基質移植物及其制法和用途。所述的基質含有(a)真皮基質，所述的真皮基質中細胞數量小于5％，按真皮基質的體積計；(b)按真皮基質的重量計，含量為0.5-30重量％的游離氨基酸，所述的游離氨基酸結合或吸附于所述的真皮基質；(c)按真皮基質的重量計，含量為0-30重量％的殼聚糖。本發明的活性無細胞真皮基質可在短時間內與創面基底建立良好的血液循環，提高移植成功率，并改善移植效果。
文檔編號A61F2/10GK101843922SQ20091004815
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者王西樵, 陸樹良 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院