專利名稱：香豆素類化合物九里香酮在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及香豆素類化合物九里香酮制備抗 腫瘤藥物的新用途。
背景技術：
九里香酮(murrayone)是一種香豆素類化合物，可以從蕓香科植物 九里香(Murray a exotica L.)禾口千里香(Murrayapaniculata (L.) Jack)中提 取獲得，也可采用香豆素類化合物前體進行半合成的方法獲得(中華人民 共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典I部.2005: 9.)。九里香酮 的化學結構式如下
九里香酮具有較好的抗菌、抗炎作用(l.鄒聯新，鄭漢臣，楊紫仁.九 里香屬植物研究進展.藥學實踐雜志.1997;15(4):214-219. 2.顏杰，裴建梅. HPLC法測定三九胃泰顆粒中九里香酮的含量.中草藥.2005;36(3):375-376. 3.睢大員，李淑惠.九里香化學及抗生育作用研究概況.中草藥. 1994;25(8):435-437,448.)，但至今未見有關其具有抗腫瘤活性的報道。
發明內容
本發明提供一種應用香豆素類化合物九里香酮制備抗腫瘤藥物的新 用途。
本發明經體內、體外實驗表明，九里香酮對腫瘤細胞的生長和對動物 皮下移植瘤的生長均具有抑制作用，并經動物急性毒性實驗，表明九里香 酮的急性毒性較低，因此，可用于制備抗腫瘤藥物。
本發明九里香酮價格低廉、安全性高，輔以藥學上可接受的輔料，采 用常規制劑技術即可制成各種口服、注射、外用制劑，具有良好的開發利 用前景。
圖1為九里香酮對5種腫瘤細胞株細胞生長的抑制曲線圖。
圖2為九里香酮對5種腫瘤細胞株細胞生長的半數抑制濃度IQ。值圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一歩闡述，但本發明的保護范圍 并不限于此。
實施例l九里香酮對腫瘤細胞生長的抑制作用實驗(MTT法) 細胞株
采用常規使用的5種腫瘤細胞株人白血病細胞株K562，人肝癌細胞 株Hep3B和HepG2，人結腸癌細胞株SW480和人宮頸癌細胞株HeLa，由上 海東方肝膽外科醫院腫瘤免疫與基因治療研究中心提供(下同)。
九里香酮
購買于成都普思生物科技有限公司，純度大于98% (HPLC法，下同)。 分別用含體積分數為10。/。小牛血清的DMEM培養液或用含體積分數為1()0/。 小牛血清的RPMI1640培養液配制成不同濃度的九里香酮溶液，濃度分別為5、 10、 20、 40、 80mg/mL。
3_(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT): 購買于Sigma-Aldrich公司，用PBS磷酸鹽緩沖液配制成1 mg/mL溶液。 實驗方法(MTT法)
取對數生長期的腫瘤細胞株，Hep3B和HepG2分別用含體積分數為 10。/。小牛血清的DMEM培養液培養，K562、 SW480和HeLa細胞株分別用含 體積分數為10。/。小牛血清的RPMI1640培養液培養，制成單細胞懸液后，分 別將5種腫瘤細胞株接種于96孔板，每孔細胞懸液為200 (iL，細胞接種密度 為^104個/孔，每種腫瘤細胞株各設3個組，即空白對照組、陰性對照組和 九里香酮實驗組。細胞先在體積分數5 % C02、 37 "C及飽和濕度下培養24 小時，小心吸棄上清液，然后將含有不同濃度九里香酮的培養液200 pl加 入相應孔中，九里香酮濃度分別為5、 10、 20、 40、 80 mg/mL，每個濃度 各設6個復孔；陰性對照組的相應孔中則加等體積的腫瘤細胞懸液，空白 對照組的相應孔中則為等體積細胞培養液，不含腫瘤細胞，空白對照組和 陰性對照組也各設6個復孔；將該96孔板在體積分數5 % C02、 37°C、飽和 濕度下培養44小時后，將96孔板置于離心機離心5分鐘，去上清，小心用 PBS沖洗2遍后，各孔加入IOO (^L濃度為1 mg/mL的3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)， 37 "C繼續培養4小時；再將96孔板置于離心 機離心5分鐘，去上清，每孔加入二甲基亞砜150pL，震蕩混勻，使沉淀充 分溶解，IO分鐘后于酶標儀上測定吸光度A值，測定波長為490 nm，按下 列公式計算抑制率和半數抑制濃度(ICso)。抑制率(％)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值X100e/。；半數抑制濃度(IC5Q)采用對數機率單 位法，以直線回歸方程計算腫瘤細胞生長抑制率為50%的藥物濃度。結果 見圖l、圖2。由圖l、圖2可見，九里香酮對5種細胞株的增殖均有較強的 抑制作用，其中對人白血病K562細胞的抑制作用最強。
5實施例2九里香酮對動物皮下移植瘤生長的抑制作用實驗 動物
昆明種小鼠，雌雄各半，體重18g士2g，由上海醫科大學動物中心提供。
動物以顆粒詞料喂養，自由攝食和飲水(下同)。
細胞株
H22小鼠肝癌細胞株、HepS小鼠肝癌細胞株由中科院上海細胞研究 所提供。
環磷酰胺粉針劑(CTX):上海華聯制藥有限公司產品。
九里香酮同上。
臺盼藍
臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒購買于上海碧云天生物技術有限 公司。
實驗方法
取8只雌性小鼠，隨機分成2組，按常規分別腹腔接種H22小鼠肝癌細 胞株和HepS小鼠肝癌細胞株，第9天，各選l只健康較好的小鼠，頸椎脫臼 處死，腹部皮膚消毒后，抽取腹腔積液，1000rpm離心5分鐘，PBS洗2次， 采用臺盼藍染色進行細胞計數，其活肝癌細胞大于95%，根據活細胞計數， 分別用生理鹽水稀釋成HepS細胞懸液和H22細胞懸液，細胞濃度均為lx107 個/mL。
取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接種上述H22細胞懸液 0.2 mL。另取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接種上述HepS細 胞懸液0.2mL。小鼠于接種后次日各隨機分為5組，即陰性對照組、陽性對 照組、九里香酮低、中、高劑量組，每組各10只，尾靜脈注射給藥，給藥 體積按小鼠體重每10g給藥0.2mL。九里香酮低、中、高劑量組的九里香酮 給藥劑量按體重依次為50mg/kg、 100mg/kg和200mg/kg，每日1次，連續
6IO天；陰性對照組小鼠尾靜脈注射等容積生理鹽水注射液，每日1次，連
續10天；陽性對照組注射環磷酰胺(CTX)溶液，CTX給藥劑量為30 mg/kg，隔日1次，連用3次。第ll天處死動物，解剖并完整分離腫瘤，稱瘤重量，計算腫瘤抑制率。
腫瘤抑制率(％)=(陰性對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/陰性對
照組平均瘤重xiooy。。
結果見表l。
表l九里香酮對小鼠HepS、 H22移植性肝癌的作用(Mean士SD)
~- H印S移植瘤 H22移"5^ ""^"~
_平均瘤重(g)率(％) 干均瘤重(g)率(0/0
九里香酮高劑量組~~0. 94±0. 64* 62. 70 0.83±0. 33* 56. 08~~
九里香酮中劑量組1.61 ±0.79* 36.11 1.14±0.34* 39.68
九里香酮低劑量組1.98±1.02* 21.43 1.35±0.72 28.57
陰性對照組2.52±1.30 0 1.89±1.28 0
陽性對照組0.70±1.12* 72.22 0.72±0.49* 61.90
*P<0.05 vs生理鹽水組
由表1可見，九里香酮三個劑量組與陰性對照組相比，對HepS、 H22皮
下移植瘤的生長均有顯著的抑制作用，特別是高劑量組，其腫瘤抑制率接近陽性對照組。
實施例3九里香酮的急性毒性實驗
按常規以藥物最大溶解度，給小鼠最大的給藥容量，按體重單次灌胃給予九里香酮2.5 g/kg，或單次腹腔注射給予九里香酮1.5 g/kg，觀察給藥后動物14天內的毒性反應及死亡情況。結果如下
1)小鼠單次灌胃給藥后4小時內未見異常，給藥后14天內，小鼠未出現死亡，第15天，處死全部小鼠，解剖，肉眼檢查各臟器，均未見明顯病變。
72)小鼠腹腔注射給藥后20分鐘，3只小鼠出現精神萎靡、蜷縮、活動減少，給藥后l小時后，全部小鼠恢復正常，給藥后14天內，小鼠未出現死亡，第15天，處死全部小鼠，解剖，肉眼檢査各臟器，均未見明顯病變。
上述結果表明，九里香酮的急性毒性較低，因此安全性好。
實施例4九里香酮片劑的制備
取九里香酮200g，羥丙基甲基纖維素50g，微晶纖維素100g、交聯羧甲基纖維素鈉20g，混勻，加入適量60%乙醇制成軟材，過24目篩制粒，50°C干燥2小時，干燥顆粒過30目篩整粒，加入硬脂酸鎂2.5g，混勻，壓成2000片。
8
權利要求
1、香豆素類化合物九里香酮在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是香豆素類化合物九里香酮用于制備抗腫瘤藥物的新用途。經體內、體外實驗表明，九里香酮對腫瘤細胞的生長和對動物皮下移植瘤的生長均具有抑制作用，并經動物急性毒性實驗，表明九里香酮的急性毒性較低，因此，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K31/366GK101474173SQ200910045510
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者劉厚佳, 衛立辛, 吳孟超, 黎 張, 王曉黎, 芮耀誠, 高平揮 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學