專利名稱：貽貝多糖在制備抗衰老藥物或食品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是從海洋生物貽貝的提取物中分離到的貽 貝多糖用于制備抗衰老藥物或食品的一種新用途。
背景技術：
貽貝是海產雙殼貝類，俗稱胄口、海紅，是我國海水養殖的主要產品 之一。國外有從貽貝中分離純化甘露聚糖酶、凝集素及抗菌物質等方面的
研究[Searching for Alternatives to Heparin Sulfated Fucans from Marine Invertebrate Paulo A.S.Moirao and Mariana S.Pereira 2000,Elsevier Science Inc.All right reserved. 1050- 1738，研究表明貽貝提取物具有抗腫瘤、抗病 毒等活性。貽貝提取物的主要活性成分為貽貝多糖，其具有抗腫瘤、抗病 毒、抗肝損傷和增加機體免疫能力的功效Hongli Xu, Tingling Guo， Yl-feng Guo, Jianpeng Zhang, Yang Li， Weihua Feng, a/. Characterization and Protection on Acute Liver Injury of a Polysaccharide MP-I from Mytilus Coruscus[J].G/;;coWo/ogy， 2008,18: 97-103;徐紅麗，郭婷婷，郭一鋒，張
建鵬，馮偉華，焦炳華.貽貝多糖MP-I的分離純化及體外抗腫瘤活性研究 LJJ.第二軍醫大學學報，2006， 27 (9) :998-1001。但至今尚未見有關貽貝
多糖具有抗衰老活性的報道。
發明內容
本發明提供一種貽貝多糖用于制備抗衰老藥物或食品的新用途。1.制備貽貝提取物
取東海厚殼貽貝的新鮮貽貝肉，用高速攪拌器將K攪拌勻漿，按常規 加水煮沸后改用小火煮約4-5h，過濾得濾液，此為貽貝提取液； 2.制備貽貝多糖 將制得的貽貝提取液濃縮后，離心棄沉淀，上清液用體積比為氯仿
正丁醇=4: l的sevage法分次萃取，直至水相不見蛋白質沉淀，再加三倍 體積的90-95%乙醇，攪拌均勻，室溫靜置過夜，離心棄上清，將沉淀冷凍 干燥，得貽貝多糖。
貽貝多糖的糖含量和蛋白含量的測定 將上述制得的貽貝多糖lg復溶于100ml蒸餾水，離心棄沉淀，分別 按常規用硫酸-苯酚法測定上清液中糖的含量，用BCA法測定上清液屮蛋白 的含量，檢測結果，貽貝多糖的糖含量為91%，蛋白含量為5%。
貽貝多糖抗衰老活性動物實驗
SD大鼠的壽命以月齡計算，通常認為24月齡后就進入袞老階段，因
此，本^驗將24月齡SD大鼠設為老年大鼠，3月齡SD大鼠為青年大鼠。 取24月齡SD大鼠，分為老年正常對照組、貽貝多糖低劑量組和貽貝多 糖高劑量組，并設一組3月齡SD大鼠為青年對照組。根據24月齡SD大鼠每天 的平均進食量，接貽貝多糖不同的給藥劑量，將貽貝多糖和嚙齒類動物飼 料按一定比例混合，分別制成混合飼料，使貽貝多糖高劑量組大鼠按體重 每天口服400mg/kg貽貝多糖，即貽貝多糖的給藥劑量為400mg/kg/d;貽貝 多糖低劑量組大鼠按體重每天口服200mg/kg貽貝多糖，即貽貝多糖的給藥 劑量為200mg/kg/d，老年對照組和青年對照組大鼠則喂食嚙齒類動物飼料。 連續飼養90天，分別觀察大鼠心臟、肝臟、腎、脾的臟器指數；對其心臟、肝臟、腦進行切片觀察病理學變化；測定大鼠血清、肝臟及腦中超氧化物 歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)水平，測定 血清主要生化指+示，測定e-半乳糖苷酶在腦組織的分布和量。實驗發現，
與老年對照組相比，貽貝多糖高劑量組的心臟、肝臟、腦組織病理切片HE 染色觀察未見明顯衰老性改變；其血清、肝臟、腦組織中SOD水平增高，MDA 含量降低；血清、肝臟組織中GSH-px水平增高；血清主要生化指標測定結 果顯示血糖(Glu)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、 肌苷(CRE)、膽固醇(CH)生化指標中，貽貝多糖組與青、老年對照組相 比無統計學差異；貽貝多糖組、青年對照組、老年對照組的甘油三酯(TG) 水平有統計學差異。免疫組化測定0 -半乳糖苷酶在大腦皮質的分布和量發 現，老年對照組e-半乳糖苷酶表達較多，而貽貝多糖、fr年對照組大鼠大 腦皮質中的表達均明顯減少。實驗結果表明，本發明貽貝貽貝多糖具有抗 袞老活性，閔此，町用于制備抗衰老藥物或食品。
本發明貽貝多糖制備方法簡便，為貽貝多糖開辟r一種新用途，有利于
海洋生物的開發利用。
圖1 .貽貝多糖低、高劑量組和青、老年對照組SD大鼠心、肝、腦組織
切片對照圖譜
圖I-A SD大鼠心臟HE染色組織學觀察X200 圖l-B SD大鼠肝臟HE染色組織學觀察X 200 圖1-C SD大鼠大腦皮質HE染色組織學觀察X 200
圖2.貽貝多糖低、高劑量組和青、老年對照組SD大鼠大腦皮質0-半乳
糖苷酶表達量及分布比較圖譜
圖3 .貽貝多糖低、高劑量組和青、老年對照組SD大鼠腦組織SOD總活
5力比較圖
圖4貽貝多糖低、高劑量組和青、老年對照組SD大鼠腦組織MDA的含量 比較圖。
具體實施方式
現結合附圖和實施例，對本發明作洋細描述。 實施例l:制備貽貝多糖
1. 材料
東海厚殼貽貝由浙江省嵊泗嵊山鎮貽貝養殖基地提供。
2. 試劑
苯酚、硫酸、氯仿、乙醇(分析純)，中國醫藥集團上海化學試劑公司產品。
葡萄糖標準品，SIGMA公司產品。BCA-100蛋白定量試劑盒由上海申能博彩公司 提供。 '
3. 儀器
BEC隨N CUOLTER J-251型高速離心機，BECKMAN CUOLTER公司產品。 制備貽貝多糖
1. 制備貽貝提取液
取東海厚殼貽貝的新鮮貽貝肉1000g，用高速攪拌器將其攪拌勻漿，
按常規加水煮沸后改用小火煮約4h，紗布過濾得提取液；
2. 制備貽貝多糖
將貽貝提取液濃縮后，低速離心棄沉淀，上清液用體積比為氯仿正
丁醇=4: l的sevage法萃取3次，水相無蛋白質沉淀出現，再加三倍體積的 95%乙醇，攪拌均勻，室溫靜置過夜，離心棄上清，將沉淀冷凍干燥得貽貝 多糖51g,呈淡黃色粉末狀,吸水性強，溶解性好。貽貝提取物和貽貝多糖的糖含量和蛋白含量測定
1. 用分光光度法測定貽貝多糖的糖含量
(1) 葡萄糖標準曲線的繪制先用標準葡萄糖配制成濃度分別為50
ug/ml 、 100yg/ml、 200iig/ml、 400yg/ml、 800ug/ml的水溶液，然后使用苯酚硫酸法分別進行顯色反應，再用分光光度計測定OD值，以糖濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。
(2) 測定貽貝多糖的糖含量將貽貝多糖配制成10mg/ml濃度的溶液，按常規用苯酚硫酸法進行顯色反應，然后用分光光度計測定OD值，對照葡萄糖標準曲線，得對應的糖濃度。計算出貽貝多糖的糖含量為91%。
2. 用BCA法測定貽貝多糖的蛋白含量
將貽貝多糖配制成10mg/ml濃度的溶液，按BCA法蛋白定量試劑盒說明書操作，測定貽貝多糖溶液的蛋白濃度，計算出貽貝多糖的蛋白含量為5%。
貽貝多糖的抗衰老活性動物試驗
1. 材料
貽貝多糖由實施例l制得。
雄性SD大鼠24月齡20只，3月齡5只，由上海西普爾-必凱實驗動物公司[SYXK (滬)2003-0018]提供，嚙齒類飼料喂養，自由飲食，分籠飼養于第二軍醫大學實驗動物中心SPF級動物房。
2. 試劑
甲醛溶液由上海太平洋化工(集團)公司產品提供，批號GB685-93。BCA-100蛋白定量試劑盒由上海申能博彩公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，丙二醛(MDA)試劑盒，谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-px)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，P -半乳糖苷酶染色試劑盒由上海杰美基因醫藥科技有限公司提供。
3. 儀器
酶標儀Versa Max (Molecular Devices)H-S電熱恒溫水浴鍋(江蘇東臺電器廠)Bechman coulter J-251型高速離心機(Bechman )
4. 實驗方法及結果4.1實驗方法
雄性SD大鼠24月齡15只，隨機分成3組，即老年對照組、貽貝多糖低劑量組和貽貝多糖高劑量組，每組5只;3月齡SD大鼠5只，作為青年對照組。
老年對照組和青年對照組大鼠喂食嚙齒類動物飼料，貽貝多糖低、高劑量組分別喂食貽貝多糖和嚙齒類動物飼料按相應比例混合的混合詞料，貽貝多糖低劑量組的給藥劑量為200mg/kg/d，貽貝多糖高劑量組的給藥劑量為400mg/kg/d，連續飼養90天。
觀察如下指標l).大鼠活動、反應、毛色等一般情況；2)大鼠心臟、肝臟、腎、脾的臟器指數；3)心臟、肝臟、腦組織的組織切片病理學變化；4)血清、肝臟和腦組織中SOD、 MDA、 GSH-px水平；5)血清主要生化指標；6) e-半乳糖苷酶在大腦皮質的分布和量。4.2結果
4. 2. 1 _動物一般情況
老年對照組大鼠遲鈍少動，反應緩慢，缺少靈敏性，毛發枯黃；貽貝多糖低、高劑量組，大鼠在初期煩躁不安，毛蓬亂少光澤，隨后逐漸活潑好動，反應靈敏，毛發尚光滑；青年對照組大鼠明顯活潑好動，反應靈敏，
8毛發光潔呈白色。
4.2.2臟器指數測定結果
所謂臟器指數，是指臟器與體重之比(％)=內臟重量(g) /體重(g)
X100%。經統計分析，各組大鼠的心、肝臟、腎、脾的臟器指數見表l。
表l SD大鼠臟器指數結果n-5，單位％ )
心臟指數肝臟指數腎臟指數 一—；指數~~老年對照組 0. 32±0,052. 48±0. 46 0. 29±0. 02 0, 32土0. —
貽貝多糖低劑量組0.42±0.092. 13±0.63 0.37±0. 14 0. 18土0. 04
貽貝多糖高劑量組0.37±0.06 2.47±0.210.32±0.03 0,21±0.05
青年對照組 0. 39士0.03___3.61士0. 46*___0. 42±0.08__0. 27土0. 02 —
'P<0.05，與老年對照組由表1可見，除青年對照組的肝臟指數比老年對照組高(有統計學差異，*P<0.05)#，余各臟器指數無組間差異。貽貝多糖未造成器官的肥大或者蔞縮，間接提示貽貝多糖無臟器毒性。
4.2.3 'SD大鼠心、肝、腦組織切片病理學變化
對大鼠的心臟、肝臟、腦組織進行切片觀察，結果見圖l。由圖1-A、圖1-B和圖1-C可見，老年對照組中，心臟局部小灶性心肌蔞縮伴少量纖維組織增生，肝臟中央靜脈周圍肝細胞中度脂肪變性，大腦出現大量空泡樣衰老性變化，說明老年對照組大鼠的心臟、肝臟、腦組織均出現了袞老性變化；而貽貝多糖低、高劑量組和奢年對照組中，除貽貝多糖低劑量組出現輕度脂肪變形外，心臟、肝臟、腦組織均正常，未見特殊變化，從而提示貽貝多糖可以延緩重要臟器的衰老進程。
4.2.4 '大鼠腦組織0 -半乳糖苷酶含量測定
免疫組化測定P -半乳糖苷酶在大腦皮質的分布和含量結果見圖2 。由圖2可見，老年對照組大鼠大腦皮質中e-半乳糖苷酶表達較多，而在貽貝多糖低、高劑量組和青年對照組大鼠大腦皮質中的表達均明顯減少，P-半乳糖苷酶的含量通常被視為腦組織衰老的相關牛物標記，從而說明貽貝多糖可以延緩腦組織衰老進程。
4.2.5血清主要生化指標測定
血清的血糖(Glu)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌苷(CRE)、膽固醇(CH)檢測的統計分析結果見^2。
表2.各組大鼠血清主要生化指標的測定結果G土s ， n=5)
Glu ALTASTBUN CRE TG CH
老年對照祖 5.3il :i 52.:ii112 IBS l±il 2 29 9I±S. ，K () 3:i:tl' O'J | W 55=zq. .57±〃) W
貽貝多糖低劑l組 5.(>±l)2 ti2.5±IH. I I76.3±.it)4 39 2<*±5 II (13I±(U)2 75 11 = 10 61 K 3<J±I()21
斷貝多糖條別S組 5 2士().3 47 ()±7 2 242.6±II5 2() H7±h 59 (' l()土()().隱> |W. I5±24 4 * H(l C二l2 l
夷年對照組 5.4±0.2 49.9±ll.fi I33.7±lb.() :，7b4工fi.41 ().33±).()9 168.52±2b. 73* 111.5f>±lh. 20
' *P<0.05
由表2可見，貽貝多糖低、高劑量組和青年、老年對照組相比各項指標無統計學差異，說明貽貝多糖無心、肝、腎毒性，對血糖也無明顯影響。
4.2.6血清中SOD、 MDA、 GSH-px測定，結果見表3。由農3可見
(l)貽貝多糖高劑量組SOD活性較老年對照組顯著增高(P<0.01)，貽貝多糖低劑量組較老年對照組高(P<0.05)，而與青年對照組相比均無統計學
差異(P>0.05);
(2) 貽貝多糖高劑量組GSH-px活性比老年對照組顯著增高(P<0.01)，貽貝多糖低劑量組比老年對照組高(P<0.05)，而與青年對照組相比均無統計學差異；
(3) 貽貝多糖高劑量組MDA含量顯著低于老年對照組(P<0.01)，與青年對照組相比無統計學差異。
由此可見，貽貝多糖具有較明顯的抗衰老作用，抗氧化作用可能是其抗衰老作用的機理之一。
10表3.各組大鼠血清S0D、 MDA、 GSH-PX酶活力的測定結果(；土《，n二5)
老年對照組 貽貝多糖低劑量組 貽貝多糖離劑鼉組 育年對照組
SOD (U/ml) 107,04±24.03 135. 62± 13. 74神157. 51十17. 6(T 1S7.92土9.31
GSH-PX(U/ml) 728.28±96.10 798.28±96.03935.17± 140.25神 943.45±95.49
MDA(nmol/ml) 10.53 ±1.96 8.75上1.5* 7.29土0.96神6.94 ±0.54
"P<0.01,與老年對照組；*P<0.05，與老年對照組貽貝多糖在此劑量下對老年SD大鼠具有較明顯的抗衰老作用，抗氧化
作用可能是其抗衰老作用的機理之一 。
4.2.7大鼠肝臟組織中SOD、 MDA、 GSH-px測定，結果見表4。由表4可見
(1) 貽貝多糖高劑量組SOD活性較老年對照組明顯增高(P<0.05)，而與青年對照組比較無統計學差異(P>0.05);
(2) 貽貝多糖高劑量組GSH-px活性與老年對照組相比，具有顯著性差異(P<0.01)且明顯高于貽貝多糖低劑量組(P<0.05)，而與青年對照組相
比無統計學差異；
(3) 貽貝多糖高劑量組MDA含量低于老年對照組(P<0.05)。
表4,各組大鼠肝臟組織S0D、 MDA、 GSH-PX酶活力的測定結果G士^n二5)老年對照組貽貝多糖低劑量組貽貝多糖萬劑量組 靑年對照沮SOD (U/m抑ro)107.0±24.03 135.62±13.74 157.51 ± 17.60** 167.92土9.31GSH-PX(U/mgpro) 183.18±24.14 257. 26±28. 94** 303.91±24. 85** 328.79±37.11MDA(nmozm印ro) 5.51±1.44 4.24±0.62 3. 17±1. 11* 2.6丄±0.49
*><0.01，與老年對照組；'P<0.05，與老年對照組
由此可見，貽貝多糖具有較明顯的抗氧化作用，表明其具有抗衰老作用。
114.2.8火鼠腦組織中SOD、 MDA測定，結果見圖3 。由圖3可見
(1) 大腦皮質SOD活性發現，貽貝多糖低、高劑量組大鼠的大腦皮質SOD活性顯著高于老年對照組(p<0.01)，而與青年對照組相比無統計學差異；
(2) 貽貝多糖高劑量組大腦皮質MDA含量顯著低:P老年對照組(p<0.01)，與而青年對照組無統計學差異；表明貽貝多糖具有較明顯的抗衰老作用，抗氧化作用可能是其抗衰老作用的機理之一 。
上述動物實驗結果表明，貽貝多糖能分別提高血清、肝臟、腦組織中SOD和GSH-px的活性，降低MDA的含量，肉此貽貝多糖具有抗衰老的活性，可用于制備延緩衰老的藥物或食物。
權利要求
1. 貽貝多糖在制備抗衰老藥物或食品的應用。
2. 權利要求1所述貽貝多糖的制備方法，步驟如下 1)制備貽貝提取物取東海厚殼貽貝的新鮮貽貝肉，用高速攪拌器將其攪拌勻漿，按常規 加水煮沸后改用小火煮4-5h，過濾得濾液，此為貽貝提取液； 2)制備貽貝多糖將貽貝提取液濃縮后離心棄沉淀，上清液用體積比為氯仿正丁醇二4: 1的sevage法分次萃取，直至水相不見蛋白質沉淀，再加三倍休積的 90-95%乙醇，攪拌均勻，室溫靜置過夜，離心棄i:清，將沉淀冷凍千燥， 得貽貝多糖。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是從海洋生物貽貝的提取物中分離到的貽貝多糖用于制備抗衰老藥物或食品的一種新用途。本發明從東海厚殼貽貝的新鮮貽貝肉提取貽貝多糖，經動物實驗，貽貝多糖能分別提高血清、肝臟、腦組織中SOD和GSH-px的活性，降低MDA的含量，因此貽貝多糖具有抗衰老的活性，可用于制備延緩衰老的藥物或食物。本發明為貽貝多糖提供了一種新的用途。有利于海洋生物的開發利用。
文檔編號A61K31/715GK101455676SQ20091004488
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月5日 優先權日2009年1月5日
發明者馮偉華, 劉軍華, 周婷婷, 周文麗, 張建鵬, 焦炳華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學