專利名稱：可控釋中藥的骨修復支架材料及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種具有中藥控釋功能的骨修復支架材料及 其制備方法。
背景技術：
生物可降解支架材料復合藥物或細胞生長因子應用于骨缺損修復，為骨修復重建 提供了合乎生物學原則的思路，被認為是理想的骨修復方法。其中，利用載體支架的可降解 特性使藥物在體內緩慢釋放，達到局部較高濃度，以促進成骨細胞增殖、分化及功能表達， 或促進細胞的有絲分裂并誘導成骨，從而加速骨缺損愈合，提高植入成功率。而支架材料作 為藥物的緩釋載體在植入初期可以為細胞附著生長提供力學支撐，之后再緩慢降解，待缺 損愈合后，支架也降解完全，從而避免二次手術取出為患者帶來的痛苦。膠原材料是常用的骨修復材料。膠原是骨的主要有機成分，I型膠原及其交聯纖 維結構是骨細胞外基質中最豐富的蛋白。膠原結構對礦物沉積具有誘導作用，其表面含有 礦物沉積的位點，可有效引發和控制礦化過程，促進新生骨組織形成。骨形態發生蛋白(BMP)是Urist首次從脫鈣骨基質中提取出的具有誘骨活性的 非特異性物質，是目前公認的高效骨誘導因子，它具有誘導成骨細胞分化和誘導體外成骨 能力，而且發現它還可以活化或誘導血管周圍的間充質細胞不可逆地分化為軟骨和成骨細 胞。因此，BMP已成為當前“載體+生長因子”模式生物材料中最為常用的活性因子，并在動 物實驗和臨床試驗中均取得顯著效果。但其中仍有許多問題影響了 BMP在臨床上的廣泛應 用。例如，其臨床應用效果不如動物實驗；BMP在誘導成骨的同時也刺激破骨細胞的增生， 而且破骨細胞的增生早于成骨細胞；不同來源的BMP活性不一等。此外，目前生物材料作為 BMP載體，BMP的用量很大，往往達到毫克級，由于目前市場上BMP很昂貴，僅Sigma公司用 于實驗研究的BMP，每10 y g售價達到500美元，昂貴的費用也是制約其廣泛應用的因素之 一。尋找具有與細胞生長因子作用類似且價格低廉的藥物則是解決該問題的關鍵。傳統中 藥的某些有效成分具有與細胞因子類似的生理活性和廣泛的藥理作用，且價格低廉，理化 性質相對穩定，有作為細胞因子和抗生素替代物應用于骨缺損修復的良好前景。諸多研究表明，中藥具有良好的促進骨折愈合修復和治療骨科疾病的作用，主要 表現在早期中藥促進局部血腫吸收和機化，改善與恢復骨折部位的血液供應；促進骨折部 位骨基質鈣鹽沉積，提高骨痂質量及生物力學性能；促進成骨細胞增殖，提高細胞活性等。 近年來，應用細胞生物學及分子生物學手段研究表明，中藥不僅能夠促進骨髓間充質干細 胞/成骨細胞的增殖、分化及細胞表型，而且能刺激細胞分泌內源性生長因子，對骨形成因 子具有調控作用。例如，淫羊藿能使骨組織中BMP的mRNA表達顯著升高，從而促進成骨細胞 增殖和分化。而且淫羊藿、骨碎補、巴戟天等中藥還含有較豐富的銅、錳、鋅等微量元素，現 代研究發現，微量元素對成骨細胞及骨膠原的形成具有特殊作用，如銅可促進膠原的交聯 反應，對骨形成、維持有重要意義；錳可促進粘多糖合成及骨形成；而鋅能調解細胞增殖、 分化及各種功能表達。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分，實驗表明其能夠促進成骨細胞增殖，提高堿性磷酸酶活性，對自然衰老成骨細胞的增殖能力也有一定的恢復作用。此外，研 究表明，上述天然或植物提取物類中藥物在促進成骨細胞增殖分化的同時，還可抑止破骨 細胞的活性，可加速新生骨組織的形成，同時有不致對人體產生其他不良影響。目前，國內已有研究人員嘗試將中藥復合于骨水泥中，制備含中藥的磷酸鈣骨水 泥粉末作為骨修復材料，并開展了相關臨床應用研究。然而，骨水泥無法預先成型，對細胞 的長入和新骨的形成、生長不能提供適當的生理空間及提供相對穩定的力學支撐，僅可用 以體積較小、血液循環較少的部位骨缺損的填充，但難以修復大面積的，尤其是承力部位的 骨缺損。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能夠控制釋放中藥的骨修復支架材料，可維持植入局 部較長時間內有效的藥物濃度，同時為細胞的長入和新骨的形成提供適宜的三維空間和穩 定力學支撐，從而更好的適應和滿足臨床要求。本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，包括負載特定功能中藥的生物活性 無機納米粉體/聚合物復合微囊、膠原以及輔料，以共混或共聚的方式組成骨修復支架材 料；所述的特定功能中藥是具有改善局部血液循環、促進骨折愈合或治療骨科疾病功能的 單味中藥或無禁忌配伍的復方中藥；所述的生物活性無機納米粉體與特定功能中藥的重量 比為99 1 50 50;所述的復合微囊中，聚合物與生物活性無機粉體的混合比例為重 量比1 99 50 50;所述的生物活性無機納米粉體/聚合物復合微囊與膠原的重量比 為97 3 60 40 ；所述的輔料與膠原重量比為1 99 10 90。所述的特定功能中藥選自天然中藥成分或天然成分提取物形式的淫羊藿提取 物、骨碎補提取物、續斷提取物、川芎提取物、巴戟天提取物、土鱉蟲提取物、丹參提取物、黃 芪多糖、鹿茸多肽中的一種或一種以上的組合。上述天然中藥成分或天然成分提取物都是已經商品化的產品，例如，淫羊藿提取 物可購自陜西禾博天然產物有限公司，骨碎補提取物可購自澤朗醫藥科技開發有限公司， 續斷提取物可購自陜西華天生物工程有限公司，川芎提取物可購自咸陽航空一六八生物 工程有限公司，巴戟天提取物可購自陜西森弗生物技術有限公司，土鱉蟲提取物可購自陜 西森弗生物技術有限公司，丹參提取物可購自西安鴻生生物技術有限公司，黃芪多糖可 購自西安綠達生物化工有限公司，鹿茸多肽的提取方法可參見已有文獻(王豐，梅子青， 周秋麗，王本祥.鹿茸多肽的分離純化及藥理活性.吉林大學學報(理學版)，2003，41 111-114.)的方法獲得。所述的生物活性無機納米粉體包括納米磷酸三鈣、納米羥基磷灰石、納米碳酸羥 基磷灰石、納米含氟磷灰石、生物活性玻璃及它們之間的復合粉體中的至少一種，粉體粒徑 范圍為50 400nm。所述的作為負載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體或聚合物的復合微囊的 壁材選自以下聚合物聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚羥基丁酸酯、聚丙基纖維素、乙基纖 維素、明膠或殼聚糖系列中一種。所述的膠原是從牛跟腱上提取的I型膠原或從牛皮上提取的I型膠原，如廣州創 爾生物技術有限公司生產的I型牛筋腱膠原蛋白、上海其勝生物制劑有限公司生產的I型膠原蛋白等。所述的輔料選自透明質酸、磷酸絲氨酸等。本發明還提供了一種可控釋中藥的骨修復支架材料的制備方法。本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料的制備方法，包括以下步驟A.將生物活性無機納米粉體與特定功能中藥按重量比99 1 50 50充分混 勻，然后將上述混合物加入至聚合物溶液中，聚合物和生物活性無機粉體的混合比例為重 量比1 99 50 50，采用溶劑蒸發法制備成粒徑為100 400 ym的載藥復合微囊，即 得負載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體/聚合物復合微囊；B.將上述載藥復合微囊加入到酸溶的膠原溶液中，同時加入輔料，經過交聯、冷 凍干燥即得可控釋中藥的骨修復支架材料；其中，所述的生物活性無機納米粉體或聚合物 的復合微囊與膠原的重量比為97 3 60 40 ；所述的輔料與膠原重量比為1 99 10 90。所述的輔料選自透明質酸、磷酸絲氨酸等。所述的步驟B中，包括以下步驟a.混合將載藥復合微囊按照重量比97 3 60 40的比例加入到乙酸溶解 的膠原溶液中，同時加入輔助材料，輔助材料與膠原的重量比為1 99 10 90，均勻攪 拌；b.交聯以乙撐磺酸(MES)為緩沖劑，調pH值為5. 5 ；在混合溶液中加入交聯劑 對溶液進行交聯處理，所使用交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，加入量為1 5mg/ml ；將混合物在4°C放置24小時進行交聯反 應；c.冷凍干燥交聯反應后，置入_80°C冰箱冷凍24小時，進行冷凍干燥處理直至完 全去除溶劑，蒸餾水沖洗數次，再次冷凍干燥即可獲得可控釋中藥的骨修復支架材料。本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，與現有技術相比，具有以下優點(1)本發明以特定的傳統中醫藥代替昂貴的骨形態發生蛋白(BMP-2)等生長因 子，具有來源廣泛，理化性能穩定，易存儲等優點，并大大降低醫療成本；(2)本發明從材料組成和結構上進行仿生設計，具有更優良的生物活性和生物相 容性。采用本發明的制備方法，可以制備孔徑尺寸在10 200 iim、且孔內部相互貫通的 骨修復支架材料，生物活性無機納米粉體既是藥物載體，又可提高支架材料的生物力學性 能；該骨修復支架材料的內部復合有特定功效中藥，且藥物分布均勻，隨著材料的降解藥物 可以逐步釋放出來。該材料具有適宜的強度和優良的生物相容性，具有廣闊的骨修復臨床 應用前景。
具體實施例方式實施例一以無水乙醇為介質，將納米羥基磷灰石粉體和淫羊藿提取物(購自陜西禾博天然 產物有限公司，主要成分是淫羊藿苷)按重量比94/6充分混勻，冷凍干燥后，備用。將5g 上述粉體加入到已溶解有5g聚乳酸的二氯甲烷溶液中，超聲波充分分散混懸液，而后將混懸液加入到100ml 明膠溶液中，35°C水浴強力攪拌(1500r/min)5h，微孔過濾三次，蒸 餾水洗滌5次，冷凍干燥，獲得粒徑100 400 y m的載藥復合微囊；取上述載藥復合微囊5g 加入到100ml含0. 5 2wt%膠原蛋白的乙酸溶液中，并加入輔助材料如透明質酸0. 5 lg，均勻攪拌后以乙撐磺酸(MES)為緩沖劑，調pH值為5. 5 ；在混合溶液中加入交聯劑對溶 液進行交聯處理，所使用交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)，加入量為1 5mg/ml。將混合物在4°C放置24小時進行交聯反應。 交聯反應后，置入-80°C冰箱冷凍24小時，進行冷凍干燥處理直至完全去除溶劑，蒸餾水沖 洗數次，再次冷凍干燥即可獲得本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料。實施例二 以無水乙醇為介質，將納米羥基磷灰石粉體和骨碎補提取物(購自澤朗醫藥科 技開發有限公司)按重量比95/5充分混勻，冷凍干燥后，備用。將5g上述粉體加入到已 溶解有5g聚乳酸的二氯甲烷溶液中，超聲波充分分散混懸液，而后將混懸液加入到100ml
明膠溶液中，35°C水浴強力攪拌(1500r/min)5h，微孔過濾三次，蒸餾水洗滌5次，冷凍 干燥，獲得粒徑100 400 y m的載藥復合微囊；取上述載藥復合微囊5g加入到100ml含 0. 5 2wt%膠原蛋白的乙酸溶液中，并加入輔助材料如透明質酸0. 5 lg，均勻攪拌后 以乙撐磺酸(MES)為緩沖劑，調pH值為5. 5 ；在混合溶液中加入交聯劑對溶液進行交聯處 理，所使用交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，加入量為1 5mg/ml。將混合物在4°C放置24小時進行交聯反應。交聯反應后，置 入-80°C冰箱冷凍24小時，進行冷凍干燥處理直至完全去除溶劑，蒸餾水沖洗數次，再次冷 凍干燥即可獲得本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料。實施例三淫羊藿苷-殼聚糖/羥基磷灰石(CS/HA)復合材料的性能研究(一 )淫羊藿苷-CS/HA復合材料的細胞相容性采用材料浸提液法和直接接觸法對淫羊藿苷-CS/HA支架的生物相容性進行評 價。采用不同組別的材料浸提液和普通DMEM培養低密度接種的hBMSCs 48h，與對照組比 較，CS/HA組并未降低hBMSCs的增殖活性，說明CS/HA復合材料本身無細胞毒性；3個劑量 的淫羊藿苷-CS/HA組不同程度地降低了 hBMSCs的增殖活性，且與載藥劑量相關。高密度 接種細胞后，其增殖活性受到抑制，采用3種淫羊藿苷材料浸提液培養hBMSCs 10d，細胞內 ALP含量顯著增加了 7 9倍，說明細胞正向成骨細胞分化。與此同時，掃描電鏡觀察亦發 現接種于CS/HA復合材料上的細胞呈三角形、細長梭形等形態，細胞呈散在性生長，其表 面光滑，細胞外基質分泌不明顯；而接種于3種劑量的淫羊藿苷-CS/HA復合材料上的細胞 呈現出多種不規則形態，聚集生長，細胞表面可見大量細小顆粒分泌，聚集生長的細胞周圍 可見鈣化結節樣結構形成。( 二)淫羊藿苷-CS/HA復合材料的體外釋藥行為對藥物進行良好的緩/控釋是載藥支架材料研究的重要方面，無論是采取物理吸 附、包裹，還是表面改性，均是為了在局部維持有效藥物濃度，從而更好地誘導組織再生。通 過標準曲線換算出每次釋藥量，并將結果按釋藥百分率累積得到釋藥初期(0 3天)，藥 物從支架材料中爆發性地釋放出來，約達載藥量的25% ；而后釋藥速度迅速下降，至第20 天約有40 % -60 %左右的藥物釋出，之后以低速持續釋放，90天后仍有部分藥物存留于支 架材料中，這說明淫羊藿苷-CS/HA復合材料具有良好的控釋效果。
(三)淫羊藿苷-CS/HA復合材料的骨修復性能研究取60只雄性新西蘭大白兔(購于南方醫院實驗動物中心)，清潔級，平均體重 2. 0kg，肌注速眠新麻醉后，于右側橈骨中段截骨，制作長度為1. 5cm的骨缺損模型，將CS/ HA和載10-7、10-6、10-5mol淫羊藿苷-CS/HA復合材料隨機植入骨缺損處(12樣本/組)， 骨缺損模型組不植入材料。放射性核素骨掃描(ECT)檢查術后4周各組隨機選取4只動物于耳緣靜脈注射 99mTc-MDP，5MBq/kg體重，3小時后置單光子核素掃描儀(Millennium VG-8型，美國GE公 司)上檢測骨缺損部位99mTc-MDP濃聚情況。采集條件平面靜態，矩陣256X256，放大倍 數2，計數500K。采集結束后在圖像上選取相同面積的感興趣區域(R0I)進行定量計數，R0I 均值=計數/面積。X線檢查各時間點處死動物后收集右前臂尺橈骨進行拍片(Polydoros 100X光 機，德國Siemens公司)，攝片條件電壓40kV，電流50mA，曝光時間0. 2秒。骨密度(BMD)檢查取各組術后12周標本行骨密度檢查(XR-46雙能骨密度儀， 美國NORLAND公司)，于電腦上選取橈骨缺損區域并計算該區域的骨礦含量(BMC)，BMD(g/ cm2) = BMC/選取面積。組織學觀察術后4、8、12周隨機選取4只動物處死，組織樣本經固定、脫鈣、切片 后行HE染色觀察。兔橈骨骨缺損模型是公認的骨缺損模型之一。從本研究的模型組來看，骨缺損部 位自身修復能力低下，4 8周兩斷端骨髓腔逐漸出現閉合，12周時髓腔已完全封閉形成骨 缺損。ECT是檢測早期骨形成的敏感指標，通過掃描99mTc-MDP在局部的濃聚密度可直接反 映局部的成骨情況。選擇在第4周進行ECT檢測，結果表明4個材料植入組的ECT值均顯 著高于骨缺損模型組(P < 0. 001)，載藥量為10-6mol和10-5mol的淫羊藿苷-CS/HA組顯 著高于單純CS/HA植入組(P < 0. 001)。在第4周的X線檢查亦表明，植入淫羊藿苷-CS/ HA材料可觀察到明顯的骨痂橋接斷端，這充分說明淫羊藿苷-CS/HA復合材料具有早期誘 導成骨性能。后續的X線檢查進一步表明植入8周后，骨痂大量生長，骨缺損基本愈合；12 周后髓腔再通，骨愈合進入塑形期。用BMD對骨修復12周的情況進行了檢測，4個材料植入 組的BMD值均顯著高于骨缺損模型組(P < 0. 001)，載藥量為10-6mol和10-5mol的淫羊藿 苷-CS/HA組顯著高于單純CS/HA植入組(P < 0. 001)。綜合各期影像學檢測結果發現載 淫羊藿苷-CS/HA復合材料的骨修復速度優于單純CS/HA復合材料。從組織學切片的結果來看，CS/HA植入4周，支架材料部分降解，內部孔隙結構消 失，材料中央有炎性細胞浸潤，周圍可見纖維組織形成；8周后，材料大部降解，纖維和部分 類軟骨組織沿材料爬行橋接；到12周時，材料基本由軟骨組織取代，殘留的材料被分割包 裹，骨缺損處主要由新生的軟骨和骨組織填充。淫羊藿苷-CS/HA植入骨缺損后，材料的降 解速度隨載藥劑量的增加而明顯加快，4周時材料即發生明顯的崩解、碎裂，在其周圍可見 有大量新生軟骨形成，并逐漸向材料的中央長入；8周時材料進一步降解，被分割的材料間 隙有大量軟骨組織形成，部分發生骨化；至12周，材料完全降解，軟骨被骨組織替代，新生 的骨組織排列紊亂，其中央可見細小的骨髓腔結構。
權利要求
可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于包括負載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體/聚合物復合微囊、膠原以及輔料，以共混或共聚的方式組成骨修復支架材料；所述的特定功能中藥是具有改善局部血液循環、促進骨折愈合或治療骨科疾病功能的單味中藥或無禁忌配伍的復方中藥；所述的生物活性無機納米粉體與特定功能中藥的重量比為99∶1～50∶50；所述的復合微囊中，聚合物與生物活性無機粉體的混合比例為重量比1∶99～50∶50；所述的生物活性無機納米粉體/聚合物復合微囊與膠原的重量比為97∶3～60∶40；所述的輔料與膠原重量比為1∶99～10∶90。
2.根據權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于，所述的特定功 能中藥選自天然中藥成分或天然成分提取物形式的淫羊藿提取物、骨碎補提取物、續斷提 取物、川芎提取物、巴戟天提取物、土鱉蟲提取物、丹參提取物、黃芪多糖、鹿茸多肽中的一 種或一種以上的組合。
3.根據權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于所述的生物活 性無機納米粉體包括納米磷酸三鈣、納米羥基磷灰石、納米碳酸羥基磷灰石、納米含氟磷灰 石、生物活性玻璃及它們之間的復合粉體中的至少一種，粉體粒徑范圍為50 400nm。
4.根據權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于，所述的作為負 載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體或聚合物的復合微囊的壁材選自以下聚合物聚 乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚羥基丁酸酯、聚丙基纖維素、乙基纖維素、明膠或殼聚糖系列 中一種。
5.根據權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于所述的膠原是 從牛跟腱上提取的I型膠原或從牛皮上提取的I型膠原。
6.根據權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，其特征在于所述的輔料選 自透明質酸、磷酸絲氨酸。
7.如權利要求1所述的可控釋中藥的骨修復支架材料的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟A.將生物活性無機納米粉體與特定功能中藥按重量比99 1 50 50充分混勻， 然后將上述混合物加入至聚合物溶液中，聚合物和生物活性無機粉體的混合比例為重量比 1 99 50 50，采用溶劑蒸發法制備成粒徑為100 400 ym的載藥復合微囊，即得負 載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體/聚合物復合微囊；B.將上述載藥復合微囊加入到酸溶的膠原溶液中，同時加入輔料，經過交聯、冷凍干燥 即得可控釋中藥的骨修復支架材料；其中，所述的生物活性無機納米粉體或聚合物的復合 微囊與膠原的重量比為97 3 60 40 ；所述的輔料與膠原重量比為1 99 10 90。
8.根據權利要求7所述的可控釋中藥的骨修復支架材料的制備方法，其特征在于所 述的輔料選自透明質酸、磷酸絲氨酸。
9.根據權利要求7所述的可控釋中藥的骨修復支架材料的制備方法，其特征在于，所 述的步驟B中，包括以下步驟a.混合將載藥復合微囊按照重量比97 3 60 40的比例加入到乙酸溶解的膠原溶液中，同時加入輔助材料，輔助材料與膠原的重量比為1 99 10 90，均勻攪拌；b.交聯以乙撐磺酸(MES)為緩沖劑，調pH值為5.5 ；在混合溶液中加入交聯劑對溶液 進行交聯處理，所使用交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)，加入量為1 5mg/ml ；將混合物在4°C放置24小時進行交聯反應；c.冷凍干燥交聯反應后，置入-80°C冰箱冷凍24小時，進行冷凍干燥處理直至完全去 除溶劑，蒸餾水沖洗數次，再次冷凍干燥即可獲得中藥控釋功能骨修復支架材料。
全文摘要
本發明涉及一種具有中藥控釋功能的骨修復支架材料及其制備方法。本發明所述的可控釋中藥的骨修復支架材料，包括負載特定功能中藥的生物活性無機納米粉體、聚合物、膠原以及輔料，以共混或共聚的方式組成骨修復支架材料；所述的特定功能中藥是具有改善局部血液循環、促進骨折愈合或治療骨科疾病的單味中藥或無禁忌配伍的復方中藥。本發明所述的骨修復支架材料可維持植入局部較長時間內有效的藥物濃度，同時為細胞的長入和新骨的形成提供適宜的三維空間和穩定力學支撐，從而更好的適應和滿足臨床要求。
文檔編號A61L27/20GK101869724SQ20091003903
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月27日 優先權日2009年4月27日
發明者南開輝, 吳濤, 楊科躍, 江汕, 裴國獻, 趙培冉, 金丹 申請人:裴國獻