用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方的制作方法

專利名稱：：用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方的制作方法
技術領域：
：本發明屬于中醫藥研究開發利用領域，特別涉及一種用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方(主要成分為人參莖葉皂苷、三七總皂甙和天麻素)。
背景技術：
：脂肪肝是由一種或者多種原因引發的以肝臟脂類物質(一般是甘油三酯)蓄積為病理改變的肝臟疾病。隨著我國人民生活飲食結構的變化以及醫學影像檢査技術的提高，脂肪肝在我國的診斷率逐年增加，根據是否飲酒將脂肪肝分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝可在較短期內發展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發生率約高達25%，且約1.5%-8.0%患者可進展為肝硬化。酒精性脂肪肝發生肝纖維化和肝硬化的進程比非酒精性脂肪肝更快，發生率更高。因此，早期積極治療脂肪肝，對于阻止脂肪肝的進一步發展，甚至使其逆轉有著十分重要的意義。由于引起脂肪肝的機制復雜而仍未完全闡釋，臨床上尚無滿意治療脂肪肝的藥物，尋找有效的藥物防治脂肪肝是當今醫學面臨的重要課題。脂肪肝的確切發病機理尚未明確，通常認為是肝細胞脂肪合成增加和氧化減少所致。近來有學者提出了"二次打擊"的假說，初次打擊誘發脂肪肝，脂肪肝發生后，須經脂質過氧化這一生化和結構破壞性反應的打擊才能促進病變進展。有大量文獻報道中藥復方可以防治脂肪肝，但是組方藥物較多，一般至少為510味中藥，多的高達數10味中藥，且多為自買和自煎為主，品質難以保證。發明人先前經研究得出的中藥復方(自定義代號為GST)，由人參、三七、天麻3味中藥組成，經研究證明具有明顯防治脂肪肝的作用。
發明內容為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方。本發明的目的通過下述技術方案實現一種用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方，是由以下重量配比的有效組分組成人參莖葉皂苷0.0150g、三七總皂甙0.0150g、天麻素0.0150g。3上述組方的優選配比為人參莖葉皂苷0.385g、三七總皂甙0.385g、天麻素0.385g。上述組方可采用常規加工方法，制成注射劑、口服液、膠囊劑或片劑。本發明采用培外培養肝細胞脂肪變性模型，觀察中藥主要成分組方對乙醇誘導的肝細胞損傷的保護作用和肝細胞甘油三酯(TG)含量的影響，采用正交實驗，篩選出中藥主要成分組方，并確定了體外培養的最佳用藥劑量人參莖葉皂苷、三七總皂甙、天麻素3種成分濃度均為50mg/L，而小鼠灌胃的有效劑量人參莖葉皂苷、三七總皂甙、天麻素3種成分均為50mg/kg體重/d，換算成人(體重70kg)的最佳有效劑量人參莖葉皂苷、三七總皂甙、天麻素3種成分均為0.385g/d。同時觀察中藥主要成分組方對肝細胞活性氧(用流式細胞儀檢測)、細胞線粒體膜電位(用流式細胞儀檢測)、細胞ATP含量(反相高效液相色譜分析法測定)、肝細胞脂肪變性的影響。并以小鼠高脂血癥性脂肪肝為模型，研究中藥主要成分組方對脂肪肝的治療作用。本發明相對現有技術具有如下的優點及有益效果(1)本發明是對中藥GST復方的進一步研究，篩選出一種用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方，經體內和體外研究證明，本發明中藥主要成分組方具有明顯治療脂肪肝和改善培養肝細胞脂肪變性作用，尋找中西醫兩個不同醫學理論體系相融的切入點，對脂肪肝的防治具有重要的臨床應用價值，研究成果可以開發治療脂肪肝的現代中藥有效成分產品，為研制擁有自主知識產權的治療脂肪肝的現代中成藥奠定了良好的基礎；(2)本發明組方成分較少、易于分離提取、療效肯定，具有良好的市場前景，并且對于推動中藥現代化有一定現實意義。圖1是建立體外肝細胞株脂肪變性模型時對照組的小鼠肝細胞油細胞O染色圖(X200)。圖2是建立體外肝細胞株脂肪變性模型時肝細胞株脂肪變性模型組的小鼠肝細胞油細胞O染色圖(X200)。圖3是中藥主要成分組方對肝細胞株脂肪變性的影響試驗中對照組的小鼠肝細胞油細胞O染色圖(X400)。圖4是中藥主要成分組方對肝細胞株脂肪變性的影響試驗中肝細胞株脂肪變性模型組的小鼠肝細胞油細胞O染色圖(X400)。圖5是中藥主要成分組方對肝細胞株脂肪變性的影響試驗中本發明中藥主要成分組方組的小鼠肝細胞油細胞O染色圖(X400)。圖6是本發明中藥主要成分組方治療脂肪肝試驗中對照組的小鼠肝組織病理切片圖(蘇木素伊紅染色，X400)。圖7是本發明中藥主要成分組方治療脂肪肝試驗中高脂組的小鼠肝組織病理切片圖(蘇木素伊紅染色，X400)。圖8是本發明中藥主要成分組方治療脂肪肝試驗中正常飲食組的小鼠肝組織病理切片圖(蘇木素伊紅染色，X400)。圖9是本發明中藥主要成分組方治療脂肪肝試驗中給藥組的小鼠肝組織病理切片圖(蘇木素伊紅染色，X400)。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1建立體外肝細胞株(L02)脂肪變性模型，觀察本中藥主要成分(參莖葉皂苷、三七總皂甙、天麻素是純化的中藥主要成分標準品，購自中國藥品生物制品檢定所)組方對乙醇誘導的肝細胞損傷的保護作用和肝細胞甘油三酯(TG)含量，采用正交實驗，篩選出中藥主要成分組方，確定最佳用藥劑量；并探討其對肝細胞株脂肪變性的作用機制研究。1、建立體外肝細胞株(L02)脂肪變性模型乙醇作用濃度的確定取對數生長期的L02細胞，調整細胞濃度為5X104cells/mL，取200uL細胞懸液加入96孔培養板中，細胞培養48h待細胞貼壁后，分別加入含不同體積濃度的乙醇(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%)，同時設對照組(用體積濃度為10%的小牛血清培養)，繼續培養36h，用噻唑藍(MTT)比色法測定細胞活性。結合細胞形態觀察，選擇對細胞有一定損傷、又不會導致細胞裂解死亡的濃度作為乙醇作用于肝細胞的濃度。表1不同濃度乙醇對L02細胞活性的影響("=6)乙醇濃度(％)吸光度值(A)細胞存活率(％)(HControl)1.27±0.111000.41.24±0.1297.630.61.23±0.1396.850.81.23±0.1296.85%1.01.21±0.1495.232.01.16±0.1591.343.00.58±0.13**45.67尸<0.01vscontrolgroup.表1顯示，對照組細胞活性為100%，體積濃度為3.0%的乙醇對細胞損傷較大，細胞活性降低至45.67%，顯微鏡下觀察發現細胞大量浮起，故不適宜作為誘導肝細胞脂肪變性的濃度；體積濃度為0.4%1.0%的乙醇對細胞活性影響較小，細胞活性在97.63%-95.23%之間，沒有發現明顯的細胞損傷；體積濃度為2.0。/。的乙醇對肝細胞有一定的損傷，但細胞活性減少不明顯，細胞活性為91.34%;因此，接下來的實驗選用2.0%乙醇作為誘導濃度。L02細胞TG含量變化將培養48h后的L02細胞加體積濃度為2.0。/。的乙醇及體積濃度為50。/。的小牛血清培養36h(模型組)；并設對照組體積濃度為10%小牛血清培養細胞。收集6孔板中的細胞，力叫.5mL的異丙醇，在冰水中制成10%的勻漿，4°C抽提24h，3000r/min離心10min，提取上清液，全自動生化分析儀測定甘油三酯(TG)含量。用Lowry氏法測定蛋白含量，以mg/gprotein表示。結果如表2所示，可以看出，模型組細胞TG含量明顯高于對照組(尸<0.01)。表2L02細胞TG含it變化組別n甘油三酉旨(mg/gprotein)對照組60.50±0.07模型組61.07±0.06"**P<0.01vscontrolgroup油紅O染色光學顯微鏡觀察對照組細胞邊緣清晰，核大，細胞內幾乎都未著色，細胞內少見染色脂滴(如圖l所示)；模型組細胞內有大小不等的橘紅色脂滴聚集,且大部分細胞內含多個脂滴,分布不均勻(如圖2所示)，表明成功建立了體外肝細胞株脂肪變性模型。2、中藥主要成分對乙醇誘導L02細胞損傷的影響由前面的表1可知實驗中體積濃度為3%的乙醇對細胞損傷影響較大，細胞活性明顯降低；因此在培養的L02細胞中加入體積濃度為3%的乙醇，同時加入不同濃度的中藥主要成分，觀察其對乙醇誘導L02細胞損傷的影響。加人參莖葉皂苷，細胞活性明顯增強的2個劑量組是50mg/L和25mg/L;加入三七總皂苷細胞活性最強的2個劑量組是50mg/L和25mg/L;加入天麻素，細胞活性最強的2個劑量組是25mg/L和50mg/L。因此，確定中藥主要成分2個濃度作為正交分析的2個水平，人參莖葉皂苷為50mg/L、25mg/L;三七總皂苷為50mg/L、25mg/L;天麻素為25mg/L和50mg/L，如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>②L02細胞TG含量正交實驗的方差分析表5L02細胞TG含量正交實驗的方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果顯示，L02細胞實驗數據組間差異有顯著意義(尸〈O.OD，而次間差異無顯著意義(尸〉0.05)，說明說明實驗結果的變異來源于組間，而不是來源于次間。表明實驗安排穩定，正交實驗有效，組間差異值得作細致的析因分析，見表5。3、L02細胞TG含量正交實驗的析因分析表6L02細胞TG含量正交系數分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表6和表7可以看出，在正交實驗析因分析中，a藥是主藥，因均方最大，D值為正，是最重要的因素，且劑量較大時療效更好；b藥和c藥單獨分析時對療效影響不大，但與a、b及c藥聯用則有明顯的交互作用(尸<0.01)，均方最大，整個合劑療效更好，且以大劑量療效最佳。雖然a和b，c和a也存在交互作用，但療效都不如a、b及c藥聯用。所以，通過肝組織TG含量正交設計實驗得到有效組方為a、b、c3種中藥主要成分，a、b、c最佳濃度均為50mg/L。4、中藥主要成分組方對肝細胞株脂肪變性的影響油紅0染色光學顯微鏡觀察可見對照組細胞邊緣清晰，核大，細胞核呈藍色，細胞內少見染色脂滴(如圖3所示)；模型組細胞內有大小不等的橘紅色脂滴聚集,且大部分細胞內含多個脂滴，分布不均勻(如圖4所示)；中藥主要成分組方治療組細胞內的橘紅色脂滴明顯減少，大多細胞內只存在少數幾個脂滴(如圖5)，結果說明中藥主要成分組方能明顯改善肝細胞脂肪變性。5、中藥主要成分組方對肝細胞株脂肪變性的作用機制研究①細胞活性氧(ROS)水平變化DCFH-DA染色流式細胞術表8中藥主要成分組方對L02細胞活性氧產生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表8可見，模型組平均熒光強度(MFI)顯著高于對照組(尸〈0.01);陰性對照組MFI與對照組比較無顯著差異(P>0.05);中藥主要成分組方治療組MFI明顯低于模型組(尸<0.01)，提示中藥主要成分組方可明顯抑制細胞內R0S的產生。②細胞線粒體膜電位的變化DiOC6(3)染色流式細胞術采用DIOC6(3)染色流式細胞術測細胞線粒體內染料的吸收量及其熒光強度，可反映線粒體膜電位變化，平均熒光強度(MFI)越高，線粒體膜電位越高。模型組MFI明顯低于對照組平(尸<0.01),表明脂肪變性肝細胞線粒體膜電位顯著降低；陰性對照組MFI與對照組比較無顯著差異(尸〉0.05);中藥主要成分組方組MF明顯高于模型組(尸<0.01)，提示中藥主要成分組方可抑制脂肪變性肝細胞線粒體膜電位的降低，改善線粒體功能(如表9所示)。表9中藥主要成分組方對L02細胞線粒體膜電位的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>③細胞ATP含量變化(采用反相高效液相色譜分析法測定)模型組細胞ATP含量明顯低于對照組，兩組比較差異有顯著意義(尸〈0.01);陰性對照組細胞ATP含量與對照組比較無顯著差異(尸〉0.05);中藥GST主要成分組方組細胞ATP含量明顯高于模型組(尸〈0.01)，提示中藥主要成分組方可抑制脂肪變性肝細胞ATP的降低，增加細胞能量合成(表10)。表10中藥主要成分組方對L02細胞ATP含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>綜上所述，結果表明本發明中藥主要成分組方具有減少肝細胞TG產生、拮抗乙醇誘導的肝細胞損傷及有效改善肝細胞脂肪變性的作用。其作用機制與抑制肝細胞活性氧生成，抗脂質過氧化反應，改善線粒體功能，增加能量合成有關。實施例2以小鼠高脂血癥性脂肪肝為模型，驗證中藥主要成分組方對脂肪肝的治療作用實驗動物健康昆明種小鼠，清潔級(SPF級)，雄性，分籠飼養，每天自由飲食、飲水，在實驗環境(清潔無塵，空氣新鮮，溫度在1822'C，相對濕度5060%，噪音85分貝以下)中適應6d。隨后給小鼠飼高脂飼料，每次稱詞料重量，保證每只小鼠平均攝食量一致，對照組飼基礎飼料(基礎詞料由廣東省實驗動物中心加工制作，包括6.4%的粗灰分、4.9%的粗脂肪、4.6%的粗纖維、19.1%的粗蛋白、8.3%的水分、1.17%的鈣、0.63%的磷，以上組分均以重量百分比計)，12周后小鼠隨機分為4組l組對照組2組高脂組3組正常飲食組4組中藥主要成分組方給藥組高脂組繼續飼高脂飼料，其余各組詞以基礎詞料(基礎飼料由廣東省實驗動物中心加工制作，包括6.4%的粗灰分、4.9%的粗脂肪、4.6%的粗纖維、19.1%的粗蛋白、8.3%的水分、1.17。/。的ef5、0.63%的磷，以上組分均以重量百分比計)。中藥主要成分組方組小鼠每天灌胃人參莖葉皂苷、三七總皂苷、天麻素(3種成分均為50mg/kg體重/d)的中藥溶液，0.1mL/10g，對照組、正常飲食治療組和高脂組灌胃相同體積的雙蒸水，連續給藥14d。實驗結束后，測定血清總膽固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及肝組織TC、TG、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，并觀察肝指數(liverindex)和肝組織病理變化。結果分析1、中藥主要成分組方對高脂飲食小鼠血脂含量的影響ii表ll中藥主要成分組方對高脂飲食小鼠血脂的影響組別只數血清總膽固醇甘油三酯高密劇旨蛋白低密劍旨蛋白膽固醇膽固醇高密劍旨(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)蛋白膽固醇對照組122.37±0.271.37±0.281,88±0.220.48±0.171.26±0.10高脂組124.73±0.67"1.39±0.492.82±0.53*1.44±0.261.72±0.39**正常飲食組133.42±0.55*'AA1.36±0.332.03土0.39'"0.50±0.75AA1.73±0.18'*中藥主要成分組方組133.30±0.57"AA0.84±0.29*'"1.86±0.27'\A0.46±0.08AA1.80±0.41"'尸O.05,"PO.01vs對照組；a尸0.05,AAP<0.01ra高脂組；#尸<0.05^正常飲食組.表11顯示高脂組血清TG含量與對照組比較無顯著差異；其余各項指標均高于對照組；正常飲食組血清TC含量及TC/HDL-C顯著高于對照組組，HDL-C、LDL-C恢復至對照組水平；中藥主要成分組方可降低血清TG含量(戶<0.05)，而其余各項指標與正常飲食組無顯著性差異。2、中藥主要成分組方對脂肪肝小鼠肝指數和肝脂的影響表12中藥主要成分組方對高脂飲食小鼠肝指數、肝組織TC和TG水平的影響組別n肝指數(％)血清總膽固醇(mmol/L)甘油三酉歐mmol/L)對照組123.78±0.271.40±0.371.65±0.57高脂組125.47±0.43**5.85±0.43"6.63±0.86"正常飲食組134.58±0.45"AA3.87±0.80"AA5.14±0.96*'AA中藥主要成分組方組134.08±0.30AA#3.94±0.69"AA3.48±0.66"AA##'戶O.01ra對照組；aa尸O.01vs高脂組；**尸<0.01ra正常飲食組從表12可見，高脂組肝指數、肝組織TC和TG含量明顯高于對照組；正常飲食組肝指數、肝組織TC和TG含量也高于對照組，但低于高脂組；中藥主要成分組方組與正常飲食組比較，其肝指數、肝組織TG含量顯著降低(均PO.Ol)，但TC含量無顯著差異。提示正常飲食組小鼠恢復基礎飼料喂養后，可降低肝指數、肝組織TC和TG含量，但效果不理想。中藥主要成分組方可明顯降低肝指數、肝組織TG含量。3、中藥主要成分組方對脂肪肝小鼠肝組織SOD和MDA水平的影響表13中藥主要成分組方對高脂飲食小鼠肝組織SOD和MDA水平的影響Groupn超氧化物歧化酶(U/mgprot)丙二醛(nmol/mgprot)對照組12高脂組12正常飲食組13中藥主要成分組方組13'><0.01w對照組；AP<0.05，AA尸O.Ol高脂組；##尸<0.01正常飲食組.如表13所示，高脂組肝組織MDA含量明顯高于對照組，而SOD活性顯著低于對照組；正常飲食組肝組織MDA含量高于對照組，但低于高脂組，SOD活性低于對照組，卻較高脂組明顯升高；中藥主要成分組方組與正常飲食組比較，其MDA含量顯著下降，SOD活性明顯上升(均尸O.Ol)。提示中藥主要成分組方可明顯抑制脂質過氧化反應。4、小鼠肝組織病理變化對照組肝臟無異常變化，肝小葉清晰可見。高脂組出現大泡性的肝細胞脂肪變性，變性的肝細胞累及幾乎所有肝小葉,并有炎癥細胞滲出；正常飲食組肝細胞出現彌漫性脂變，與高脂組比較肝細胞脂肪變性程度減輕；中藥主要成分組方組肝細胞排列較整齊，脂滴減少，脂肪變性明顯改善(圖6-9)。病理分級顯示對照組輕度脂肪肝小鼠占O.17，其余均正常；髙脂組重度脂肪肝小鼠占0.83，中度占0.17;正常飲食組重度脂肪肝小鼠占0.08，中度占0.69，輕度占0.23;中藥主要成分組方組中度脂肪肝小鼠占0.23，輕度占0.54，正常占0.23(如表14所示)。表14脂肪肝分級分組正常輕度中度重度對照組10200高脂組00210正常飲食組0391中藥主要成分組方組3"730本實驗結果證實正常飲食組小鼠恢復基礎飼料喂養后，對小鼠脂肪肝有一定的改善作用，但效果不理想。中藥主要成分組方可顯著降低肝指數、血清TG和肝組織TG含量，同時抑制脂質過氧化反應，明顯改善肝細胞脂肪變性，具有有效的治療脂肪肝的作用。286.70±26.021.25±0.09157.34±20.78**5.15±0.64"187.45±15.1(TA4.49±0.33"z229.14±21.87WAA"2.65±0.24'上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。權利要求1、一種用于治療脂肪肝的中藥單體組方，其特征在于它是由以下重量配比的有效組分組成人參莖葉皂苷0.01～50g、三七總皂甙0.01～50g、天麻素0.01～50g。2、根據權利要求l所述的一種用于治療脂肪肝的中藥單體組方，其特征在于它是由以下重量配比的組分組成人參莖葉皂苷0.385g、三七總皂甙0.385g、天麻素0.385g。3、根據權利要求l所述的一種用于治療脂肪肝的中藥單體組方，其特征在于所述中藥單體組方制成注射劑、口服液、膠囊劑或片劑。全文摘要本發明公開了一種用于治療脂肪肝的中藥主要成分組方。它是由以下重量配比的有效組分組成人參莖葉皂苷0.01～50g、三七總皂甙0.01～50g、天麻素0.01～50g。可采用常規加工方法，制成注射劑、口服液、膠囊或片劑。本發明中藥主要成分組方具有明顯治療高脂血癥性脂肪肝和改善培養肝細胞脂肪變性作用，尋找中西醫兩個不同醫學理論體系相融的切入點，對脂肪肝的防治具有重要的臨床應用價值，研究成果可以開發治療脂肪肝的現代中藥有效成分產品，為研制擁有自主知識產權的治療脂肪肝的現代中成藥奠定了良好的基礎；本發明組方成分較少、易于分離提取、療效肯定，具有良好的市場前景，并且對于推動中藥現代化有一定現實意義。文檔編號A61K36/258GK101524386SQ20091003873公開日2009年9月9日申請日期2009年4月17日優先權日2009年4月17日發明者戚仁斌,胡巢鳳,陸大祥申請人:暨南大學