專利名稱：：傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物基因工程領域，具體涉及傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應用。
背景技術：
：自20世紀70年代以來，我國的水產養殖業取得了巨大的成就，先后掀起了藻類、對蝦、魚類和貝類養殖等幾次大的浪潮，使我國水產品養殖總量多年居世界第一。但隨著養殖密度的增大以及養殖生態環境的惡化，經常發生傳染性疾病的暴發性流行，給水產養殖業造成了巨大的經濟損失。腫大細胞病毒是指虹彩病毒科腫大細胞病毒屬，是新近出現的對魚類具有重大危害作用的烈性傳染病的病原，分子流行病學研究發現，有50多種的海水魚類和近10種的淡水魚類是這種病毒的攜帶者。腫大細胞病毒對世界各國，特別是東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區的水產養殖業構成巨大威脅，每年都能造成重大經濟損失。腫大細胞病毒的代表種主要有鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)(也稱為傳染性脾腎壞死病毒)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、條石鯛虹彩病毒(RBIV)、海艫虹彩病毒(SBIV)、大黃魚(LYCIV)、臺灣石斑魚虹彩病毒(TGIV)和斜帶石斑魚虹彩病毒(OSGIV)等。腫大細胞病毒的宿主覆蓋了眾多具有重大經濟價值的養殖魚類，對腫大細胞病毒所引發的系列魚病的控制成為有關國家的共識。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，該疫苗可以用于傳染性脾腎壞病毒的預防，大大降低水產業病毒性疾病的發病率。本發明的另一個目的是提供上述傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，該制備方法簡單，成本低，有利于大規模推廣應用。本發明的再一個目的是提供上述傳染性脾腎壞病毒疫苗在魚類傳染性脾腎壞病毒預防中的應用。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)，就是指鱖傳染性脾腎壞死病毒，它是虹彩病毒科腫大細胞病毒屬的代表種，海水魚類病毒RSIV、RBIV和TGIV等均是和ISKNV具有微小差異的腫大細胞病毒的不同毒株而已，因此本發明是針對ISKNV進行的疫苗研究。一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，該疫苗是通過在魚類細胞中接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。上述傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，其具體步驟如下-(1)細胞的制備將魚類細胞系經酶消化分散后，進行細胞培養成片(即細胞擴大培養)，用于接種傳染性脾腎壞病毒；(2)病毒接種和培養上述魚類細胞培養成片后，吸出培養瓶中的培養基，然后加入傳染性脾腎壞病毒液，進行病毒吸附；病毒吸附結束后，吸出感染上清，加入細胞維持液，再次進行細胞培養，至細胞出現明顯病變為止；(3)病毒收集、滅活和稀釋將上述病變的細胞經三次凍融后，收獲病毒液，用有機溶劑滅活該病毒液，再用鹽類緩沖液稀釋滅活病毒液；(4)疫苗制備將上述稀釋后的病毒液與油性佐劑混合后，振蕩混勻，盡可能使得病毒能夠均勻分散在混合液的各個部分，即得傳染性脾腎壞死病毒疫苗成品。上述步驟(1)中，消化時可用胰酶；細胞培養成片時可采用DMEM完全培養液(市售)中2527'C培養，優選27匸。上述步驟(2)中，病毒吸附可以選擇在2527"的溫度下(優選27。C)吸附l小時；細胞維持液可選擇采用添加有5體積％胎牛血清(FBS)的DMEM;再次細胞培養的溫度可選擇2527'C，優選27'C。本發明的FBS(胎牛血清)和DMEM均為本領域通用試劑，市售。上述步驟(3)中，用于病毒滅活的有機溶劑可以選擇氯仿、乙醚、甲醛、福爾馬林(35體積％40體積％甲醛水溶液)等，優選福爾馬林，用福爾馬林滅活該病毒液，福爾馬林的加入量為該病毒液的0.1%,用于稀釋病毒滅活液的鹽類緩沖液可以選擇無菌磷酸鹽緩沖液，稀釋倍數為20倍。上述步驟(4)中，稀釋后的病毒液與油性佐劑混合的體積比為3:.7，油性佐劑可以選擇ISA763A油性佐劑，混合液在振蕩器上震蕩均勻后，還可以再用超聲波粉碎儀進行適當作用，從而保證病毒能夠均勻分散在混合液的各個部分。本發明的傳染性脾腎壞病毒疫苗可用于預防海魚類、淡水魚類的傳染性脾腎壞病毒感染。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明的傳染性脾腎壞病毒疫苗對魚類預防傳染性脾腎壞病毒感染的保護作用可達100%;2.本發明的疫苗本身不含對人類有害的成分，對注射疫苗的魚類可以安全食用；3.疫苗本身對魚類生長沒有影響，在保證水環境和飼料的情況下，被注射有疫苗的魚類生長狀況良好；4.免疫力持續時間長達半年以上；5.本發明的疫苗制備方法簡單，所用試劑成本低，有利于大規模推廣；6.本發明的疫苗本身不易失效，普通冰箱4度放置一周仍有效。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步具體說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例l傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備本實施例的生物材料選擇發明人自己建立的鱖魚仔魚細胞系，該細胞系的相關內容已經公布于巳發表論文中(Dong,C.,Weng，S.,Shi,X.,Xu，X.,Shi，N.&He,J.(2008).Developmentofamandarinfish5Vm》erc(3c/m她/frycelllinesuitableforthestudyofinfectiousspleenandkidneynecrosisvirus(ISKNV).F潛135,273-81.)。本實施例傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)細胞的制備將鱖仔魚細胞系(MMF-1)用胰酶消化分散，加入DMEM完全培養(市售)在27"C培養成片，用于接種傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV);(2)病毒接種和培養將上述MMF-1細胞培養成片后，吸出培養瓶中的培養基，然后加入傳染性脾腎壞死病毒液，置27"C約lh進行病毒吸附；病毒吸附結束后，吸出感染上清，加入細胞維持液(添加5體積。/。FBS的DMEM)，再次置27'C細胞培養箱培養，至細胞出現明顯病變為止(約46天)；(3)病毒收集、滅活和稀釋病變的細胞經三次凍融后，收獲病毒液，向病毒液中加入40%甲醛溶液，直到甲醛的體積占溶液總體積的0.1%為止，室溫放置24h(滅活)，再4'C放置7d即可將病毒徹底滅活。然后用無菌磷酸鹽緩沖液將滅活病毒液稀釋20倍；(4)疫苗制備將上述稀釋病毒液與ISA763A油性佐劑(ISA763A油性佐劑為Seppic公司產品，魚類疫苗專用)以3:7的體積比混合，振蕩器上先震蕩混勻，然后用超聲波粉碎儀適當作用，盡可能使病毒能夠均勻分散在混合液的各個部分，即為成品。本實施例所用試劑均為本領域技術人員通用試劑，實施例中所涉及的細胞培養、病毒接種、培養、吸附、滅活、稀釋和疫苗制備等操作，均為本領域技術人員的常規操作，詳細步驟可參考相關教科書或試劑盒說明。實施例2傳染性脾腎壞病毒疫苗用于預防ISKNV感染用實施例1制備所得傳染性脾腎壞病毒疫苗進行預防ISKNV感染試驗。1.試驗魚及其飼養條件鱖購自廣東南海某養殖場，暫養于本實驗室的魚池中，平均規格約90g，水溫保持在2527°C，空氣動力泵自動充氣，循環水系統即時將魚池中的廢物吸出，日常投喂鮮活餌料魚，一天投喂一次，免疫前鱖在詞養池中最少暫養2周以上。2.免疫滅活組隨即選擇39尾鱖，腹腔注射實施例l所得傳染性脾腎壞病毒疫苗，0.5ml/尾。對照組隨即選擇40尾鱖，每尾注射0.5ml無菌磷酸鹽緩沖液。將兩組處理后的鱖放養在3.5xl.ox0.5m3的中等水泥魚池中。3.攻毒免疫后30天，無菌PBS將l()8'2TCIDB50B/ml的病毒懸液稀釋20倍，以0.5ml/尾的劑量，腹腔注射兩組鱖。感染期間繼續投喂鮮活餌料魚，池水溫度穩定在2527'C。每日不定時觀察，死魚及時清理，印片法檢測死亡魚類的脾臟腫大情況。4.感染病毒后兩組魚的死亡情況如表1所示。表l注射滅活疫苗再攻毒后鱖的死亡情況<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV，InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus)是一種主要的造成魚類大量死亡的病毒，感染后10天死亡率為90%~100%，目前國內外尚無有效抑制ISKNV的藥物，通常養殖者釆用生石灰、硫酸銅、次氯酸鹽、碘鹽或投放抗生素等方法，通過改變水體環境抑制病毒生長，但是該病毒生命力非常頑強，無法起到預防作用，尤其在水溫2730"C時更有大規模的爆發，傳統的抗生素對該病毒也不起作用。但是從表l可以看出，感染了1SKNV后，對照組的鱖魚死亡了37條，尤其是在感染后的第8、9天，而滅活疫苗組注射了本發明方法制備的傳染性脾腎壞病毒疫苗，感染后的15天內沒有一條死亡，由此可以看出本發明傳染性脾腎壞病毒疫苗其預防傳染性脾腎壞病毒感染的保護作用可達到100%。權利要求1、一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，其特征在于該疫苗是通過對魚類細胞接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。2、一種制備權利要求l所述傳染性脾腎壞病毒疫苗的方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟(1)細胞的制備將魚類細胞系經酶消化分散后，進行細胞擴大培養；(2)病毒接種和培養在上述培養好的細胞中加入傳染性脾腎壞病毒液，進行病毒吸附；病毒吸附結束后，吸出感染上清，再次進行細胞培養，至細胞出現明顯病變為止；(3)病毒收集、滅活和稀釋將上述病變的細胞經凍融后，收獲病毒液，用有機溶劑滅活該病毒液后，用鹽類緩沖液稀釋；(4)疫苗制備將上述稀釋后的病毒液與油性佐劑混合后，振蕩混勻，即得病毒疫苗成品。3、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(1)中，細胞擴大培養的培養溫度為2527'C。4、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，病毒吸附所用溫度為2527"C，吸附時間為l小時。5、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，細胞培養溫度為2527"C。6、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，有機溶劑是氯仿、乙醚或35體積％40體積％甲醛水溶液。7、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述有機溶劑的加入量為病毒液終體積的0.1%8、根據權利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(4)中，稀釋后的病毒液與油性佐劑混合的體積比為3:7。9、權利要求l所述傳染性脾腎壞病毒疫苗在預防海魚類、淡水魚類傳染性脾腎壞病毒感染中的應用。全文摘要本發明公開一種傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應用，該疫苗是通過在魚類細胞中接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。本發明疫苗的制備方法包括細胞的制備，病毒接種和培養，病毒收集、滅活和稀釋以及疫苗制備四個步驟，本發明的傳染性脾腎壞病毒疫苗可用于預防淡水魚類、海水魚類的傳染性脾腎壞病毒感染，其保護作用可達100％。本發明的疫苗本身不含對人類有害的成分，對注射疫苗的魚類可以安全食用；且疫苗本身對魚類生長沒有影響。本發明疫苗的免疫力持續時間長達半年以上。本發明疫苗的制備方法簡單，所用試劑成本低，有利于大規模推廣。文檔編號A61K39/12GK101530613SQ20091003869公開日2009年9月16日申請日期2009年4月17日優先權日2009年4月17日發明者何建國,殷志新,翁少萍,董傳甫申請人:中山大學