專利名稱：：一種防治糖尿病腎病的藥物組合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及中藥制藥領域。具體地說，涉及一種以毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷為活性成分的藥物組合物及其在制備防治糖尿病腎病藥物中的應用。
背景技術：
：糖尿病腎病(diabeticn印hropathy，DN)是糖尿病常見的并發癥，是糖尿病全身性微血管病變表現之一，通常指由于糖尿病引起的腎小球基底膜增厚，系膜擴張以及胞外基質增生，導致腎小球的高濾過和蛋白尿。臨床特征為蛋白尿，漸進性腎功能損害，高血壓，水腫，晚期出現嚴重腎功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。據統計，約30-40%的糖尿病患者會出現腎臟損害。在美國，糖尿病腎病是導致終末期腎功能衰竭的首要原因，在歐洲居第二位。目前，我國糖尿病腎病在終末期腎功能衰竭患者中所占的比例也已上升至15%。隨著糖尿病發生率的不斷增高和社會人口老齡化，這個數字還將繼續攀升。目前針對糖尿病腎病尚無很好的治療藥物，臨床上的主要藥物是降糖藥，降壓藥等，如胰島素、血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI，如卡托普利)等。然而，這些藥物長期應用均會產生較嚴重的毒副作用，如糖尿病患者長期使用有可能加重高血鉀，另外部分患者服用后可因伴功能性或器質性腎動脈狹窄而誘發急性腎功能衰竭，等等。因此，研制開發高效低毒的防治糖尿病腎病的藥物具有十分重要的意義。糖尿病腎病又可稱為"糖尿病腎小球硬化癥"。腎小球系膜細胞是腎小球的主要成分，約占腎小球細胞總數的30-40%。腎小球系膜細胞具有多種功能，如分泌細胞基質、產生細胞因子，并具有吞噬清除大分子物質以及類似平滑肌細胞的收縮功能，是腎小球中功能最活躍的一類細胞。系膜細胞是分泌產生細胞外基質(ECM)的主要細胞之一，而ECM聚集則是腎小球硬化的關鍵機制。因此，系膜細胞病變在糖尿病腎病的發生發展過程中起著極其重要的作用。黃芪為我國傳統常用中藥，具有補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌等功效，應用黃芪治療糖尿病及其腎病并發癥符合中醫藥學的理論與實踐。近年來，大量動物實驗和臨床療效證實，黃芪及其制劑對糖尿病腎病具有明確的治療作用，然而其起治療作用的有效成分尚不清楚。因此，有必要對其進行深入研究，以開發出有效成分明確，作用機理清楚，質量易于控制的防治糖尿病腎病的現代中藥制劑。前期研究表明，黃酮類成分是黃芪中主要活性成分之一，具有清除自由基、調節免疫、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性。毛蕊異黃酮及其糖苷(毛蕊異黃酮苷)是黃芪中兩種含量較高的黃酮類成分。專利CN01126608.2公開了毛蕊異黃酮及其糖苷具有抗心肌缺血作用，專利CN200510110641.3公開了毛蕊異黃酮苷具有抑制柯薩奇病毒及治療病毒性心肌炎的作用。此外，文獻還報道了毛蕊異黃酮或毛蕊異黃酮苷具有抗氧化(BiomedEnvironSci，2005，18(5):297-301)、保護血管內皮細胞(中國藥學雜志，2008，43(8):594-597;中藥藥理與臨床，2000，16(4):16-18)、阻滯f丐通道(ActaPharmacolSin，2006，27(8):1007-1012)、改善紅細胞變形能力(天然產物研究與開發，1999，6(2):1_5)以及減緩骨關節炎病變(OsteoarthritisCartilage,2007，15(9):1086-1092)等作用。雖然文獻報道它們具有多方面的藥理活性，然而，毛蕊異黃酮及其糖苷對糖尿病腎病的防治效果如何，國內外尚無報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種防治糖尿病腎病的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物的活性成分是毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷。解決上述問題的技術方案如下—種防治糖尿病腎病的藥物組合物，該藥物組合物由毛蕊異黃酮或毛蕊異黃酮苷中的一種或兩種作為活性成分，和常規的藥物載體組成，所述活性成分的重量百分比含量為0.1-99.5%。優選地，所述活性成分的重量百分比含量為5-90%。優選地，該藥物組合物由毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷中作為活性成分，和常規的藥物載體組成，毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷的重量比為1:5-5:1。本發明藥物組合物所述常規的藥用載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發明藥物組合物可以通過常規制劑方法制備成常規的劑型，常規劑型主要為口服制劑，如固體制劑片劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、粒劑、膠囊等，液體制劑水或油懸浮劑或其它液體制劑如酏劑等。本發明所述藥物組合物的使用劑量可隨特定的給藥方式、病癥的嚴重程度等而相應調整。一般情況下，本發明藥物的臨床口服用量根據動物(大鼠)體內實驗的治療有效量2-10mg/kg體重/次，按照體表面積換算得到人體的用藥劑量為20-100mg/60kg體重/次。本發明的另一目的是提供上述藥物組合物的制備方法。采用了以下技術方案—種藥物組合物的制備方法，將所述活性成分毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷中的一種或兩種與所述常規的藥物載體混合，即得。所述活性成分的提取包括以下步驟A.取黃芪粉碎，加80%乙醇回流提取后過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得黃芪醇提液，置冰箱冷藏過夜；B.取步驟A的黃芪醇提液上清液用大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再用50%乙醇洗脫至薄層色譜檢測無毛蕊異黃酮苷斑點為止；C.收集50%乙醇洗脫液減壓濃縮，經等體積的醋酸乙酯萃取，合并萃取液濃縮得黃芪總黃酮浸膏；D.浸膏以硅膠柱層析，氯仿_甲醇=50:1-1:l梯度洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同的流份，靜置析晶，抽濾，經甲醇重結晶，得毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷。毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷可以按上述提取方法從其他中藥材中提取。4本發明還提供了毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷在制備防治糖尿病腎病的藥物中的應用，所述糖尿病腎病為I、II、III、IV期糖尿病腎病。本發明藥物組合物具有以下有益效果1.本發明通過藥理實驗發現了毛蕊異黃酮及其糖苷具有防治糖尿病腎病的新醫藥用途，同時也為糖尿病腎病患者提供了新的治療候選藥物。2.本發明的藥物組合物對糖尿病腎病的防治效果優于黃芪水提液，且活性成分結構明確，質量易于控制，克服了傳統中藥中有效成分不明確、質量控制難等的缺點。3.本發明的藥物組合物具有顯著治療和預防糖尿病時腎小球損害的作用，由于可顯著預防糖尿病時血肌酐的升高、顯著降低糖尿病大鼠的尿量和尿蛋白，表明對糖尿病腎病有顯著的防治作用。4.本發明的藥物組合物可加工成口服劑型如滴丸、沖劑、片劑等，使用方便。圖1是毛蕊異黃酮及其糖苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞外基質增生的影響(PAS，200X);其中A:正常對照組；B:高糖組(25mM);C:黃芪水提液(50mg/ml);D:毛蕊異黃酮(100nM);E:毛蕊異黃酮(10nM);F:毛蕊異黃酮(lnM);G:毛蕊異黃酮苷(100nM);H:毛蕊異黃酮苷(10nM):I:毛蕊異黃酮苷(lnM);J:毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷(10Pg/ml:5iig/ml);K:毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(5yg/ml:10yg/ml)。圖2是毛蕊異黃酮及其糖苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞外TGFP_1表達的影響(200X);其中A:正常對照組；B:高糖組(25fflM);C:陰性對照組(未加TGFP_1抗體)；D:毛蕊異黃酮(100nM);E:毛蕊異黃酮(10nM);E:毛蕊異黃酮(lnM);F:毛蕊異黃酮(lnM);G:毛蕊異黃酮苷(100nM);H:毛蕊異黃酮苷(10nM);1:毛蕊異黃酮苷(lnM);J:黃芪水提液(50mg/ml);K:毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(10yg/ml:5yg/ml);L:毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(5yg/ml:10iig/ml)。具體實施例方式以下通過具體實施例來說明本發明。實施例1:毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷的制備取干燥黃芪藥材10kg，以8倍量80%乙醇回流提取3次(2小時，1小時，1小時)，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得黃芪醇提液，置4t:冰箱中冷藏過夜，上清液用DIOI型大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再用50X乙醇洗脫至TLC檢測無毛蕊異黃酮苷斑點為止。收集50%乙醇洗脫液經減壓濃縮后，用等體積的醋酸乙酯萃取7次，合并萃取液后回收溶劑，真空干燥，得到黃芪總黃酮。黃芪總黃酮再經200-300目硅膠柱層析，以氯仿-甲醇50:i-i:l梯度(50:1、25:1、12:1、6:1、3:i、i.5:1、1:1)洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同的流份，靜置析晶，抽濾，甲醇重結晶，分別得到白色針狀結晶(毛蕊異黃酮)和白色粉末狀結晶(毛蕊異黃酮苷)，化學結構經質譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經HPLC檢測大于98X。它們的結構式分別如下毛蕊異黃酮(calycosin)，分子量為284，分子式為QAA，化學名為3'_羥基_4'_甲氧基異黃酮HO、、OCH3毛蕊異黃酮苷為(^H2^。，化學名為3'(calycosin_7_0_P_D_glucopyranoside)，分子量為446，分子式4'-甲氧基異黃酮-7-0-13-D-吡喃葡萄糖苷。OCH3實施例2本發明藥物組合物顆粒劑的制備(活性成分為毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮苷lmg淀粉500mg微晶纖維素500mg制備方法將毛蕊異黃酮苷與各種輔料混合均勻后，用適量水制軟材，制粒、干燥、整粒、分裝即得。實施例3本發明藥物組合物片劑的制備(活性成分為毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮苷20mg乳糖127mg玉米淀粉50mg硬脂酸鎂3mg制備方法將毛蕊異黃酮苷過80目篩，與乳糖和玉米淀粉混合均勻，加入適量的水并將粉末制粒，干燥后，將此顆粒過篩并與其余賦形劑混合，壓片即得。實施例4本發明藥物組合物膠囊的制備(活性成分為毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮30mg毛蕊異黃酮苷70mg乳糖40mg糊精15mg淀粉45mg3%HPMC適量制備方法將毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷過80目篩，與糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均勻，加入預先配好的HMPC溶液制成軟材，制粒，干燥，整粒，裝膠囊即得。實施例5本發明藥物組合物顆粒劑的制備(活性成分為毛蕊異黃酮)毛蕊異黃酮50mg淀粉400mg微晶纖維素550mg制備方法將毛蕊異黃酮過80目篩，再與各種輔料混合均勻后，用適量水制軟材，制粒、干燥、整粒、分裝即得。實施例6本發明藥物組合物膠囊的制備(活性成分為毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮120mg毛蕊異黃酮苷60mg糊精10mg淀粉10mg制備方法將毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷過80目篩，與糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均勻，加入預先配好的HMPC溶液制成軟材，制粒，干燥，整粒，裝膠囊即得。實施例7本發明藥物組合物片劑的制備(活性成分為毛蕊異黃酮)毛蕊異黃酮200mgHPMC2mg制備方法毛蕊異黃酮過80目篩，加入預先配好的HMPC溶液制成軟材，制粒，壓片即得。實施例8本發明藥物組合物片劑的制備(活性成分為毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮苷200mgHPMC2mg制備方法毛蕊異黃酮苷過80篩，加入預先配好的HMPC溶液制成軟材，制粒，壓片即得。實施例9本發明藥物組合物膠囊的制備(活性成分為毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷)毛蕊異黃酮80mg毛蕊異黃酮苷20mg乳糖40mg糊精15mg淀粉45mg3%HPMC適量制備方法將毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷過80目篩，與糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均勻，加入預先配好的HMPC溶液制成軟材，制粒，干燥，整粒，裝膠囊即得。本發明對毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷用于藥理實驗，以證實其對糖尿病腎病的防治作用，同時與黃芪水提液的防治效果進行平行比較。實驗例1:毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷對高糖及AGEs誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響。腎小球系膜細胞是腎小球中最活躍的反應性細胞，其病理變化在糖尿病腎病的發生和發展中居于中心地位，是糖尿病腎病的靶細胞。因此采用體外高糖和AGEs培養大鼠腎7小球系膜細胞，觀察毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷對大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響。1材料與試劑大鼠腎小球系膜細胞株HBZY21(武漢細胞生物研究所提供)；DMEM培養基(GIBC0);新生牛血清(杭州四季青血清廠)；Thiazolyl噻唑藍(Amresco分裝)；二甲亞砜(AR級，上海久仡化學試劑有限公司)。0)2培養箱(NAPC05410，PERCISIONSCIENTIFIC);XSZ-D2倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；超凈工作臺(蘇州百神科技網絡系統有限公司，蘇州市潔凈技術研究所)；MicroplateSpectrophotometer(SPECTRAmaxl90，美國AD公司);醫用離心機(LDZ5-2，北京醫用離心機廠)。2實驗方法2.1模型的建立取對數生長期大鼠腎小球系膜細胞制成單細胞懸液，以100iU/孔接種于96孔板，細胞數5X104/孔，37。C5%(A培養箱培養24h后，加入100yl無新生牛血清的DMEM，再孵育24h使細胞生長同步進入休止期(同步化)。吸棄細胞上清液，分別加入100ii1含不同濃度的葡萄糖和AGEs的含血清DMEM，每個濃度設置6個重復，分別于培養箱中培養24h、48h、72h、96h，MTT法觀察不同濃度葡萄糖或AGEs對鼠腎小球系膜細胞增殖的影響。結果表明，O.25mg/mlAGEs或25mM葡萄糖濃度，培養時間24h時腎小球系膜細胞效果最好，作為本實驗造模條件。2.2高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖實驗取96孔板培養的同步化過的細胞(細胞培養方法同2.l)，每孔均加入葡萄糖終濃度為25mM的高糖DMEM培養基0.lml，再向孔內分別添加0.lml梯度稀釋的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷溶液(終濃度分別為10、100nM)、毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(終濃度10iig/ml:5yg/ml)、毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(終濃度5iig/ml:10yg/ml)，和黃芪水提液(50mg/ml)，每個稀釋度6個復孔。以只加普通DEME培養基(葡萄糖終濃度5.5mM)為正常對照組，以加葡萄糖終濃度為25mM的高糖DMEM培養基為高糖組。于37°C5%C02培養箱培養24h后，MTT法測定細胞增殖情況。2.3AGEs誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖實驗每孔均加入終濃度為0.25mg/mlAGEs的DMEM培養基0.lml，再向孔內分別添加0.lml梯度稀釋的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷溶液(終濃度分別為10、100nM)、毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷(終濃度10Pg/ml:5g/ml)、毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(終濃度5iig/ml:10iig/ml)，和黃芪水提液(50mg/ml)，每個稀釋度6個復孔。以只加DEME培養基為正常對照組，以加DMEM培養基和終濃度為0.25mg/mlAGEs為AGEs組。于37°C5%C02培養箱培養24h后，MTT法測定細胞增殖情況。3實驗結果3.1毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響從表1可以看出，25mM葡萄糖能顯著促進大鼠腎小球系膜細胞增殖，黃芪水提液、單用及合用不同濃度的毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷均能顯著抑制高糖作用下的大鼠系膜細胞的增殖，且高濃度劑量組和毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2)組的效果明顯優于黃芪水提液組，毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2)組的效果略優于毛蕊異黃酮組和毛蕊異黃酮苷組。這表明毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷可以在糖尿病腎病早期治療中發揮一定作用。表1毛蕊異黃酮及其糖苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響(5土S,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷組10ng/ml:5|ig/ml0.35±0.05*(2:1)毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷組5嗎/ml:10叫/ml0.33±0.04*#(1:2)和高糖組比較*p<0.05;和黃芪水提液組比較#p<0.053.2毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷對AGEs誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響從表2可以看出，O.25mg/mlAGEs能顯著促進大鼠腎小球系膜細胞增殖，黃芪水提液、毛蕊異黃酮(100nM)和毛蕊異黃酮苷(10nM、100nM)均能顯著抑制AGEs誘發的大鼠系膜細胞的增殖，單用及合用毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷效果均優于黃芪水提液組，合用毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷組的效果均優于毛蕊異黃酮組。這表明毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷可以在糖尿病腎病早期治療中發揮一定作用。表2毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷對AGEs誘發的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響(x±S,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷組和AGEs組比較*p<0.05實驗例2:毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞外基質增生的影響。腎小球系膜細胞細胞外基質增生，是糖尿病腎病等慢性腎病主要病理特征，是治療糖尿病腎病等慢性腎病的重要靶點。l材料與試劑TGFP-l抗體(CantaCruz產品)；二抗(晶美生物工程有限公司)；即用型SABC免疫組化染色試劑盒(博士德公司產品)；DAB顯色系統(GeneTechBiotechnologyCompanyLimited);免疫組化濕盒(福州邁新生物技術開發公司)。2實驗方法高糖模型的建立同實驗例1，正常對照組、黃芪水提物組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組及毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷組同實驗例1中2.1項，基質增生的評價通過測定培養液中羥脯氨酸含量，系膜細胞TGFI3-1的表達來實現。培養細胞時預先在24孔板孔內放置蓋玻片，讓細胞貼附，經同步化后給予相應藥物。細胞鋪滿玻片后，吸出細胞上清，作羥脯氨酸含量檢測；取出細胞爬片，固定，留作TGFI3-1細胞免疫組化染色、PAS染色。TGFP_1免疫組化染色中，以未加TGFI3-1抗體為陰性對照組。3實驗結果3.1毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞培養液中羥脯氨酸的影響從表3可以看出，25mM的葡萄糖能顯著提高大鼠腎小球系膜細胞培養液中羥脯氨酸的含量，黃芪水提液、單用及合用毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷均能對抗高糖誘發的系膜細胞培養液中羥脯氨酸的含量增高，且高劑量組(100nM)的效果明顯優于黃芪水提液組，毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷組(1:2)組的效果明顯優于(2:1)組。表3毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷對高糖誘發的腎小球系膜細胞培養上清液中羥脯氨酸的影響("S,n=3)組別濃度羥脯氨酸(嗎/ml)正常對照組—4.18±0.37***高糖組—10.06±1.20黃芪水提液組50mg/ml7.58±1.95*毛蕊異黃酮組lOnM7.15±1.19*lOOnM6.65±1,74**#毛蕊異黃酮糖苷組10nM6.25±1.20**#lOOnM6.00±1.53**##毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮普組(2:1)10jjg/ml:5/ig/m7.05士1.04115毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苦組6.10±1,13*##(1:2)5)ug/ml:10fig/ml和高糖組比較*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提液組比較#p<0.05，##p<0.013.2對高糖誘發的大鼠腎小球系膜細胞外基質增生的影響由圖1、2可以看出，黃芪水提物、單用及合用毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷均能對抗由高糖引起的腎小球系膜細胞細胞外基質增生以及TGFI3-1的表達，毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷中高劑量組(10、100nM)的效果優于黃芪水提液，合用的效果略優于單用。由實驗例1、實驗例2可以看出本發明藥物組合物的活性成分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷可以明顯對抗由高濃度葡萄糖引起的腎小球系膜細胞的增殖、細胞外基質增生與TGFI3-1的表達，上述作用支持本發明的藥物組合物具有治療糖尿病腎病的藥理基礎。實驗例3:毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷對鏈脲佐菌素(STZ)誘發的糖尿病腎病模型大鼠的影響。l材料與試劑鏈脲佐菌素(STZ)制作的糖尿病腎病模型的Wistar大鼠(由南方醫科大學實驗動物中心提供)；BIOBASE-PEARL分立式全自動生化分析儀(山東BIOBASE公司)。2實驗方法將確認為糖尿病腎病模型的Wistar大鼠，隨機分為11組，每組10只，即模型組；毛蕊異黃酮高中低劑量組(6、2、0.7mg/kg);毛蕊異黃酮苷高中低劑量組(9、3、lmg/kg);毛蕊異黃酮_毛蕊異黃酮苷(2:1，3mg/kg);毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2，3mg/kg);11黃芪水提液組(5g/kg);陽性對照組(氨基胍，100mg/kg)。另取正常Wistar大鼠IO只為正常對照組。每天各組同體積不同濃度灌胃給予相應藥物或生理鹽水1次，連續給藥14周。給藥結束后，代謝籠收集24小時尿液，計算尿量，并測定尿液中總蛋白、微白蛋白、肌酐含量；眼眶取血，全自動生化儀測定各生化指標；取腎，10%甲醛固定，留作病理組織學檢查。所有測定結果用^士S，表示，采用組間t檢驗進行統計學分析。3實驗結果3.1對STZ糖尿病腎病模型大鼠尿量、尿蛋白及肌酐的影響從表4可以看出，中高劑量毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷均能顯著減少STZ糖尿病腎病模型大鼠的尿量、尿蛋白、微量白蛋白以及尿肌酐，同時毛蕊異黃酮及其糖苷在降低尿蛋白、尿肌酐含量等腎病重要指標方面明顯優于黃芪水提液組，合用效果優于單用或相當。表4毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮苷對STZ糖尿病腎病模型大鼠尿蛋白、尿肌酐等的影響(三士s,n=10)劑量組別尿量(ml)尿蛋白(mg)微白蛋白(mg)尿肌酐(mM)(mg/kg)正常對照組—9.2±1.5**18.5±7.7**0.29士0.07"12.4±2.2"模型組—65.6±25.379.4±29.21.63±0.851.0±0.3氨基胍組畫36.2±21.8*43.2±29.9*1患0.27*4.0±2.3**黃芪水提液組500045.3±20.4*54.1±24.5*1.05士0.52*2.1±1.0*0.759.9±21.869.1±20.41.57±0.561.4±0.6毛蕊異黃酮組241.3±16.8*54.0±17.4*0.93士0.55^2.9±1.2沐*635.9±22.2*46.2±21.3*#0.92±0.42*4.3±2.0**糾毛蕊異黃酮苷組39毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷組3(2:1)_毛蕊異黃酮-毛,藍-異黃酮普組330.7±24.7*#43.5±15.8**0.88±0.26*2.8±0.7(1:2)58.9±20.542.3±12.8*33.處20.2*#35.3±13.0*#67.1±18.455.0±13.4*44.2±20.6**50.9±23.7*1.52±0.560.90±0.45*0.93±0.22*0.89±0.35*1.3±0.62.7土1.1"4.2±1.6**#2.7±0.6**12和模型組比較:*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提液組比較Sp<0.05，##p<0.013.2對STZ糖尿病腎病模型大鼠血清生化指標的影響從表5可以看出，黃芪水提液、中高劑量毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、合用毛蔬異黃酮_毛蕊異黃酮苷均能顯著降低糖尿病腎病模型動物血清中甘油三酯、MDA、Scr、BUN、AGEs、LDL水平，顯著提高血清中SOD的活性，且中高劑量毛森異黃酮和毛森異黃酮苷、合用毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷效果優于黃芪水提液或相當，合用毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2)較單用效果好。。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>和模型組比較*p<0.05，**p<0.01;SOD:超氧化物歧化酶；MDA:丙二醛；Scr:血肌酐；BUN:血尿素氮；AGEs:終末糖基化產物；LDL:低密度脂蛋白。[OH9]3.3對STZ糖尿病腎病模型大鼠病理組織學的影響從表6可以看出，毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷均能顯著減少由STZ誘發的糖尿病腎病模型大鼠中細胞外基質增生和TGFP-1的表達，降低損傷病理學評分，其中毛潔異黃酮苷高劑量組和毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2)組在減少TGFP-l表達方面優于黃芪水提液組，毛蕊異黃酮-毛蕊異黃酮苷(1:2)組效果略優于單用。表6毛蕊異黃酮及其糖苷對STZ糖尿病腎病模型大鼠病理組織學的影響(5士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>和模型組比較:*p<0.05，**p<0.01;和黃芪水提液組比較:#p<0.05實驗例3結果表明本發明藥物組合物的活性成分對抗糖尿病腎病發生、發展細胞病理環節，對STZ糖尿病腎病模型大鼠有保護作用；還有降低腎臟氧化應激程度、減少終末糖基化產物引起纖維化，且防治效果明顯優于黃甚水提液。權利要求一種防治糖尿病腎病的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由毛蕊異黃酮或毛蕊異黃酮苷中的一種或兩種作為活性成分，和常規的藥物載體組成，所述活性成分的重量百分比含量為0.1-99.5％。2.根據權利要求1所述的防治糖尿病腎病的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷作為活性成分，和常規的藥物載體組成，所述毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷的重量比為i:5-5:i。3.根據權利要求1或2所述的防治糖尿病腎病的藥物組合物，其特征在于所述的常規的藥物載體為稀釋齊U、賦形齊U、填充齊U、粘合齊U、濕潤劑、崩解齊iJ、吸收促進齊iJ、表面活性齊u、吸附載體、潤滑齊u、香味劑或甜味劑中的至少一種，其中賦形劑為水，填充劑選自淀粉、蔗糖或乳糖；粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑為甘油；崩解劑選自瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉；吸收促進劑為季銨化合物；表面活性劑為十六烷醇；吸附載體為高嶺土或皂粘土；潤滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇。4.根據權利要求3所述的防治糖尿病腎病的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物為片劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、粒劑、膠囊或液體制劑。5.—種制備權利要求1所述的防治糖尿病腎病的藥物組合物的方法，其特征在于將所述活性成分毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷中的一種或兩種與所述常規的藥物載體混合，即得。6.根據權利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述活性成分的毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷提取包括以下步驟a.取黃芪粉碎，加乙醇回流提取后過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得黃芪醇提液，置冰箱冷藏過夜；b.取步驟a的黃芪醇提液上清液用大孔樹脂吸附，先用純水洗脫至流出液澄清，再用50%乙醇洗脫至薄層色譜檢測無毛蕊異黃酮苷斑點為止；c.收集50%乙醇洗脫液減壓濃縮，經等體積的醋酸乙酯萃取，合并萃取液濃縮得黃芪總黃酮浸膏；d.浸膏以硅膠柱層析，氯仿-甲醇=50:i-i:i梯度洗脫，薄層跟蹤檢測，合并相同的流份，靜置析晶，抽濾，經甲醇重結晶，得毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮苷。7.毛蕊異黃酮和/或毛蕊異黃酮苷在制備防治糖尿病腎病的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種藥物組合物及其在制備治療糖尿病并發癥藥物中的應用，該藥物組合物由活性成分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷的一種或兩種，以及藥學上可接受的載體組成，所述活性成分的含量為0.1-99.5wt％。該藥物組合物主要應用于制備治療糖尿病腎病藥物中。本發明的藥物組合物對糖尿病腎病有顯著的防治作用，使用方便，質量可控，為患者提供了新的治療候選藥物。文檔編號A61K31/352GK101780069SQ20091003671公開日2010年7月21日申請日期2009年1月16日優先權日2009年1月16日發明者何寶,朱荃,段婷婷,湯丹,王汝上,石興華,程慧荃,鄭兆廣,顧斐,黃曉玲,黃艷霞申請人:廣州康臣藥物研究有限公司