專利名稱：腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物載體，特別涉及一種可以在腫瘤組織局部革巴向性投遞藥 物的抗腫瘤的腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法。
目前，腫瘤的內科治療最主要的手段是化療。但是，化療藥物存在的毒副作 用非常大，使得化療的應用受到局限。許多和化療相關的毒副作用是與化療藥物 劑量大小成正相關關系。降低給化療藥劑量可以減輕毒副作用，但這同時又會降 低抗腫瘤療效。因此，在化療藥物的療效和毒性之間因此存在著矛盾。
解決這一矛盾的思路，是采用把向性的藥物載體對藥物進行投遞，使其在肺 瘤局部扭向性釋放。乾向性藥物投遞可以使化療藥物在腫瘤局部達到高濃度，但 在其余正常的器官組織濃度較低，既可以提高藥物療效，又可避免產生嚴重的毒 副作用。
在本發明之前，已有許多靶向藥物栽體被報道，例如熱靶向、即在腫瘤局部 進行熱療，使得藥物在熱療部位靶向性釋放，又如磁靶向，是在腫瘤部位外加磁 場，使得磁性載體定向到腫瘤。但上述靶向策略都存在的一個不足是，由于熱靶 向和磁耙向都需要外界的熱療設施或磁場。在實施時，病灶的部位必須明確，因 此，對于病灶不明、病灶深在或者廣泛轉移性的病灶，就不能充分發揮作用。從 手段上來說，也相對豐支為復雜。
另外，已經合成的PEG-PEP-阿霉素和輕乙基淀粉-PEP-MTX (曱氨蝶呤)的 藥物投遞體系，證明這種體系可以使藥物在腫瘤部位特異性釋放，提高療效，減 少毒副作用。但是，這種方法構建的藥物投遞體系，牽涉到化學鍵與藥物(比如 阿霉素、MTX)的結合，在工藝上難度大，而且難以推廣到其他的化療藥物。此 夕卜，化療藥物分子上引入新的化學鍵，也很有可能改變化療藥物本身的活性，影 響藥物的療效，這是它致命的弱點。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述缺陷，研究、發明一種抗腫瘤納米酶靶向藥物 栽體的制備方法。
本發明的技術方案是
腫瘤酶扭向納米載藥高分子微球的制備方法，其主要技術步驟如下 (1)疏水片段PCL的制備及活化
以s-己內酯為原料，采用自由基聚合法，合成含有羧基的PCL-C00H ,然 后采用EDC將PCL-C00H末端氨基化，合成末端帶有活性氨基的PCL-冊2,具體 反應如下<formula>formula see original document page 5</formula>
(2)親水片段單曱氧基聚乙二醇與肽鏈的連接
采用活化的單甲氧基聚乙二醇-N-幾基琥珀酰亞胺，與PEP的氨基端反應,合成為親水片段mPEG-PEP,具體反應為
<formula>formula see original document page 5</formula>
(3 ) 親水片段mPEG-PEP和疏水片段PCL-C00H的連接
在EDC、 DMAP、 NHS存在的情況下，mPEG-PEP末端的羧基和PCL-NH2末端的氨基反應，形成mPEG-PEP-PCL兩嵌段共聚物；(4 )載體的制備
將嵌段共聚物溶于等體積比的乙醇和丙酮中，再將所制得的溶液滴入25倍體積的冷純水中，減壓抽除有機溶劑，將溶液冷凍干燥，即得到栽體，-2(TC冷凍保存。
本發明的優點和效果在于能夠制備出一種智能型納米靶向藥物栽體，這種載體對藥物的包載為非化學鍵結合，其中的親水片段作為外殼包裹疏水片段內核形成兩親嵌段共聚物膠束，膠束中含有PEG親水嵌段，因此，可以保護載體在人體內長循環不被清除。由于載體中含有肺瘤局部特異性高分泌的酶MMP2/9的底物肽段，因此，固P2/9可作為載體結構變化的觸發介質。栽體在循環到MMP2/9高表達的部位時，便會被MMP2/9解離，PEG段和PCL段分離，使載體的疏水段暴露，并在腫瘤組織部位聚集，與周圍組織發生作用，使疏水片段作為栽體所攜帶的化療藥物在腫瘤組織細胞處釋放，達到靶向釋放藥物的目的。本發明制備出的智能型抗肺瘤納米酶靶向藥物載體，解決了現有化療藥物應用中，藥物在腫瘤組織分布不高的缺陷，減少了化療藥物對人體正常組織和細胞的損害。
本發明利用了腫瘤組織特異性高表達的基質金屬蛋白酶-2/9 (Matrixmetallopeptidase-2/9, MMP-2/9,又稱明膠酶、IV型膠原酶)的特性，將MMP2/9特異性水解的底物肽鏈(下文簡稱PEP)作為載體親水段和疏水段的連接， 一旦微球到達鐘瘤組織，MMP2/9即可將該PEP水解，微球形態發生改變，疏水部分暴露，使藥物得以特異性釋放或被腫瘤組織攝取。對于畫P2/9不表達或低表達的組織，毒性較小。
本發明的其他優點和效果將在下面繼續說明。
圖1一一本發明顧P2/9特異性底物肽段序列示意圖。
圖2——本發明中納米微球水溶液中加入IV型膠原酶后的宏觀變化示意閨。
圖3—一本發明中納米樣i球水溶液中加入不同濃度的IV型膠原酶后的變化示意圖。
1. 固P2/9特異性底物肽段序列H2N-PVGLIG-C00H;
2. 酶耙向微球和IV型膠原酶反應22小時后的情況圖1中左邊僅加入了酶的緩沖液，液體為澄清，并有膠束特有的藍光；右邊加入了 500ug/mL的IV型膠原酶，液體渾濁，無膠束特有的藍光，并有絮狀沉淀。
3. 圖2顯示了納米微球水溶液中，加入不同濃度的IV型膠原酶后的變化，可以看出隨著時間的變化，溶液的吸光度逐漸增大，提示溶液渾濁度增加(即載體團聚、沉淀)，IV型膠原酶濃度越高，載體形變量越大。
具體實施例方式
首先是疏水片段PCL的制備及氨基化，將s-CL,亮氨酸，按照設計分子量的比例，加入反應管，真空下封管，160°C,攪拌反應24小時，產物溶于二氯甲烷，除去未反應的小分子物質，在冷乙醚中沉淀，真空干燥，得到末端羧基化的PCL，其反應方程式為
0 I
打r^ ^-
COOH
O^CO(CH2)SOH
最后進行共聚物的連接，將mPEG-PEP和PCL-NH2按照摩爾比1: 1溶于DMF中，加入1. 5倍摩爾量的DMAP, 1. O倍摩爾量的EDC, 1. O倍摩爾量的NHS，室溫下反應18h，將反應后液體置于透析袋，純水中透析24h，冷凍干燥，即得產
然后，進行親水片段mPEG與肽鏈(PEP)的連接。采用特異性對于MMP2/9敏感的肽鏈(H2N-PVGLIG-COOH,圖1),將活化的mPEG-NHS和肽鏈以1: 1. 2的摩爾比溶于DMF (含2%三乙胺)中，室溫下攪拌反應3小時。將產物置透析袋，在純水中透析24h除去溶劑和小分子物質，冷凍干燥，得到mPEG-PEP。具體反應方程式為
o
----------— --0~I + PEP"NH: ,' CH3(OCH2CHi)nOCCH2CH2CNH-PEP
o=
o=
=c
c
c
=c
o
Hi
c
H
c
，物。
將嵌段共聚物按照50mg/mL的濃度溶于等體積比的乙醇和丙酮中，在將所制得的溶液滴入25倍體積的冷純水中，減壓抽除有機溶劑。嵌段共聚物在水相中自發形成膠束結構。將溶液冷凍干燥，即得到載體，4'C保存。
嵌段共聚物由于具有親水和疏水片段，很容易在水溶液中自發形成膠束，其疏水片段互相纏繞，形成疏水性"內核"，而親水片段則環繞在外，形成柔韌的親水性"外殼"。疏水性內核作為化療藥物的載體為疏水性化療藥物提供了一個穩定的微環境，親水性外殼使膠束可以穩定地存在于水溶液或體液中。
mPEG和PCL間的連接肽鏈，為MMP2/9的特異性底物肽段，可被這兩種酶特異性降解。體外模擬該過程，在兩份同樣的微球中， 一份加入了 IV型膠原酶，另一份僅加入酶緩沖液，反應22小時后，僅加入了酶的緩沖液的一組，液體為澄清，并有膠束特有的藍光；加入了 500ug/mL的IV型膠原酶的一組，液體渾濁，無膠束特有的藍光，并有絮狀沉淀，提示載體中的肽鏈^皮水解，載體發生沉積(圖2)。定量考察這一過程，可以發現，在微球中加入不同濃度的IV型膠原酶后，隨著時間的變化，溶液的吸光度逐漸增大，提示溶液渾濁度增加(即載體團聚、沉淀)，IV型膠原酶濃度越高，載體形變量越大(圖3)。
生理條件下，水分子與聚合物之間，通過氫鍵相互作用，使聚合物呈伸展狀態，高親水性，可溶于水，因此親水片段的聚合物所構成的親水性外殼使膠束穩定地存在于水溶液或體液中，保護載體在體內長期循環而不背集體清除； 一旦到達腫瘤組織，局部微環境內MMP2/9高表達，則親水和疏水片段間的連接被切斷，聚合物疏水基團之間的作用力占優勢，聚合物鏈皺縮，水分子從聚合物中被擠出，聚合物沉淀，成為高疏水性，不溶于水的物質，所載化療藥物得以在腫瘤組織處釋放。此外，聚合物的疏水段暴露，則更有利于腫瘤細胞對納米微球的胞吞，二者共同使化療藥物在腫瘤組織局部達到高濃度，避免了化療藥物對人體正常組織細胞的損害。
載體的粒徑范圍在200nm以下，有利于在體內長循環而不被清除。
親水片段采用分子量5000的mPEG，以利于人體通過腎臟排出體外。
疏水片段采用的是聚己內酯，為生物可降解材料，水解后對人體無毒性，其他具有想同或類似特性的物質也可采用。
采用本發明制備的藥物載體，可以輸送多種治療腫瘤的化療藥物(例如紫杉醇，多希紫杉醇，阿霉素)、中藥單體(例如漢防己曱素，藤黃酸)和分子靶向藥物(例如C-225 )。
本發明請求保護的范圍不局限于本具體實施方式
的說明。
權利要求
1. 腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法，其步驟如下(1)疏水片段PCL的制備及活化以ε-己內酯為原料，采用自由基聚合法，合成含有羧基的PCL-COOH，然后采用EDC將PCL-COOH末端氨基化，合成末端帶有活性氨基的PCL-NH2，具體反應如下R＝CH2CH(CH3)2；(2)親水片段單甲氧基聚乙二醇與肽鏈的連接采用活化的單甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺，與PEP的氨基端反應，合成為親水片段mPEG-PEP，具體反應為；(3)親水片段mPEG-PEP和疏水片段PCL-COOH的連接在EDC、DMAP、NHS存在的情況下，mPEG-PEP末端的羧基和PCL-NH2末端的氨基反應，形成mPEG-PEP-PCL兩嵌段共聚物；(4)載體的制備將嵌段共聚物溶于等體積比的乙醇和丙酮中，再將所制得的溶液滴入25倍體積的冷純水中，減壓抽除有機溶劑，將溶液冷凍干燥，即得到載體，-20℃冷凍保存。
2.根據權利要求1所敘述的腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法，其特征 在于步驟(1)疏水片段PCL的制備及活化；具體步驟為將s -CL和亮氨酸按 設計分子量的比例混合，真空下160。C反應2化，反應產物在二氯曱烷中溶解， 再沉淀于乙醚中，真空干燥。<formula>formula see original document page 2</formula>
3. 根據權利要求1所敘述的腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法，其特征在于步驟(2)親水片段inPEG與肽鏈(PEP)的連接；具體步驟為將活化的mPEG-NHS和對于MMP2/9敏感的肽鏈按照1: 1. 2的摩爾比溶于含2%三乙胺的DMF中，室溫下攪拌反應3小時，將產物置透析袋，在純水中透析24h，冷凍干燥。
4. 根據權利要求1所敘述的胂瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法，其特征在于步驟(3 )將PEG-PEP、 PCL-C00H、 DMAP、 EDC、 NHS按照1. 1: 1: 1. 5: 1: 1的摩爾比，溶于DMF中，室溫反應18小時，產物置透析袋，在純水中透析24h，冷凍干燥。
全文摘要
本發明涉及一種腫瘤酶靶向納米載藥高分子微球的制備方法。本發明采用以ε-己內酯為原料的疏水片段PCL的制備及活化、單甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺，與PEP的氨基端反應的親水片段單甲氧基聚乙二醇與肽鏈的連接、親水片段mPEG-PEP和疏水片段PCL-COOH的連接、載體的制備等構成。本發明解決了抗腫瘤靶向藥物載體、藥物投遞體系各自存在的缺陷。本發明利用腫瘤組織特異性高表達基質金屬蛋白酶-2/9(Matrix metallopeptidase-2/9，MMP-2/9的特性，將PEP作為載體親水段和疏水段的連接，一旦微球到達腫瘤組織，MMP2/9即可將該PEP水解，微球形態發生改變，疏水部分暴露，使藥物得以特異性釋放或被腫瘤組織攝取。對于MMP2/9不表達或低表達的組織，毒性較小。
文檔編號A61K9/16GK101480377SQ20091002817
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月16日 優先權日2009年1月16日
發明者劉寶瑞, 李茹恬, 錢曉萍 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院