專利名稱：：抗人血管性血友病因子a3區的雙功能性單克隆抗體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種單克隆抗體，特別涉及抗人血管性血友病因子A3(VWFA3)區的雙功能性單克隆抗體及其制備方法，本發明進一步涉及所述雙功能抗體在制備抗血小板黏附和抗血栓形成的藥物中的應用。
背景技術：
：隨著人口老齡化和不良飲食習慣等因素的增加，心肌梗死、缺血性腦卒中等血栓性疾病的發生率和死亡率已位居首位，深入研究血栓形成機制以及開發新型抗血栓藥物是目前醫藥領域急待解決的問題。近年來，對血小板在血栓形成過程中分子機制研究促進了分子靶向藥物的發展，其中以針對血小板糖蛋白(GP)1Ib/IIIa的單克隆抗體阿昔單抗(abciximab,Reopro)為代表，臨床應用已取得了良好的抗血栓治療效果。然而，由于阿昔單抗也存在引起嚴重出血的潛在危險，所以在一定程度上阻礙了這類藥物的臨床應用。為了克服抗血栓藥物的缺陷，近來抗血小板粘附作為新的抗血栓治療手段正在興起，人們試圖通過抑制膠原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPIb軸來阻斷血小板與膠原的起始粘附，即在早期階段阻止血小板的黏附和活化，以達到既能對抗血栓形成，又能減少出血的危險性的目的。現有的研究表明VWF主要由內皮細胞合成，但表達合成的VWF存在非常明顯的異質性，血漿中VWF為分子量不等的多聚體。在蛋白質合成的初期，VWF經歷了翻譯后的修飾過程，包括二聚化與多聚化，以及D1D2區間的裂解。VWF的多種功能存在于不同的蛋白功能區里，如Al區與VWF和血小板糖蛋白Ib的結合有關，D3區與VWF和FVDI的結合有關，C2區與VWF和血小板糖蛋白IIb-ma受體的結合有關，A3區與VWF和膠原的結合有關。因此，研制和開發阻斷血管性血友病因子A3區與膠原或Al區與血小板GPIb之間相互作用的單克隆抗體，不僅能從血栓形成的早期階段阻斷血栓的形成，而且可能能夠利用該單克隆抗體探討A3區和Al區是如何通過其構型改變來調節止血功能，從而進一步研究動脈血栓形成和發展的機理，為預防和早期治療血栓性疾病開辟新的領域；目前未見其他單位具有特異性的雙重功能抑制性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體的報道。
發明內容本發明目的是提供一種具有雙重功能的特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體，既能阻斷血管性血友病因子A3區與膠原的結合，又能阻斷血管性血友病因子Al區與血小板糖蛋白Ib的結合；本發明的另一目的是提供能產生上述特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體的雜交瘤細胞系；本發明的再一目的是提供上述特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體在制備抗動脈血栓中的應用。為達到上述目的，本發明具體技術方案是，一種雜交瘤細胞株，其制備方法包括以下步驟(1)使用重組人血管性血友病因子A3區(rVWFA3)蛋白作為免疫原(參見實施例l)，以常規方法免疫Balb/C小鼠；(2)獲取融合細胞生長克隆從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞，按常規方法，將B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0株融合，然后利用常規的融合細胞HAT篩選方法進行篩選，進而獲取融合細胞生長克隆；(3)應用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學技術篩選和鑒定后，挑選出兩株具有髙抗體分泌水平的雜交瘤細胞株SZ-123(1B9)和SZ-125(3D2)(參見實施例2);上述技術方案中，使用rVWFA3蛋白作為免疫原，常規三次免疫接種8周齡雌性Balb/c小鼠(每次間隔4周)；用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測被免疫動物血清中單克隆抗體的存在和濃度免疫完成后，選擇產生足夠髙濃度抗血清的小鼠，分離動物脾臟并制備脾細胞懸液；按照已知的雜交瘤技術(參見K6hlerandMilstein,Nature,215:495-497,1975;K6hleretal，ImmunologyToday,4:72-76，1983)將所得到的小鼠脾細胞與骨髓瘤相融合，制備可持續傳代并分泌抗血管性血友病因子A3區單克隆抗體的雜交瘤細胞系。由于兩株雜交瘤細胞株的功能相同，因此選擇其中一株進行保藏，所述雜交瘤細胞系的保藏信息為保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研宄所；保藏日期2008年5月14日；保藏編號CGMCCNO.2501;分類命名雜交瘤細胞株(鼠)為達到上述目的，本發明的具體技術方案為一種抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體，所述單克隆抗體屬于IgGl亞類抗體，由上述雜交瘤細胞系產生，制備所述單克隆抗體的方法有兩種(1)在雜交瘤培養液中接種上述雜交瘤細胞，培養后培養液中分離純化得所需的特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體；(2)在動物腹腔內接種上述雜交瘤細胞，動物腹水液中分離和純化得所需的特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體。可使用雙抗體夾心法測定IgG濃度，并可進一步用免疫印跡法(Westerii-Blot)檢測所得單克隆抗體的特異性。本發明中，由兩株雜交瘤細胞產生的單克隆抗體被分別命名為SZ-123和SZ-125(參見實施例3)。經用免疫雙擴散方法檢測，本發明的單克隆抗體屬于IgGl亞類抗體。酶聯免疫分析方法檢測結果顯示，本發明的單克隆抗體可與rVWFA3和野生型的人VWF特異性結合，而與重組的血管性血友病因子Al和A2區(rVWFAl和rVWFA2)沒有交叉反應。另外，我們的免疫印跡分析顯示，本發明的單克隆抗體能夠與還原性的VWF特異性結合，且兩株單克隆抗體(SZ-123和SZ-125)分別與還原性的VWF在分子量為250KDa和170Kda的兩蛋白結合(參見實施例3)。我們的生物學活性研宄表明，本發明的單克隆抗體可以有效地阻斷人血管性血友病因子A3區與膠原的結合(參見實施例4)。我們的研究首次證明，本發明的抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125既可抑制瑞斯脫霉素(Ristocetin),博托霉素(Botrocetin)和牛血漿誘導的人血小板聚集(參見實施例5-A),也可抑制瑞斯脫霉素(Ristocetin)誘導的VWF與固相化的rGPIb(Hl-V289)活性片段及血小板的結合(參見實施例5-B)。因此，本發明的單抗是雙功能抑制型單抗，即SZ-123和SZ-125不僅能夠抑制人VWF與III型膠原相互作用，而且抑制VWF與血小板GPIba相互作用。為達到上述目的，本發明的具體技術方案為所述抗人血管性血友病因子A3區的雙功能性單克隆抗體制備具有抗血小板粘附活性的抗動脈血栓藥物中的應用。本發明的原理是抗VWFA3區單抗可與VWFA3區結合，影響A1區構型，從而破壞原來能與血小板GPIba結合的Al區構型，達到阻斷VWFAl-GPIbci相互作用的目的。我們的實驗結果提示(參見實施例4和5),VWFAl區功能受單抗SZ-123或SZ-125-VWFA3結合環的間接調節。同時證實，VWFA3和Al的功能活性受其各自構型的調節。因此，既能阻斷血小板在III型膠原分子上的黏附，又能阻斷血小板在層粘蛋白分子上的黏附。首先，我們證明，在體外模擬高剪切力狀態下，本發明的抗VWFA3區單克隆抗體能夠以劑量依賴性地方式抑制人全血血小板在人胎盤和牛皮膚III型膠原上的黏附(參見實施例6-A)。其次，體外實驗證明，本發明的抗VWFA3區的單克隆抗體，以劑量依賴性方式抑制人、獼猴或Begle犬血漿VWF與膠原的結合(參見實施例6-B)。再次，體外實驗證明，本發明的抗VWFA3區的單克隆抗體也抑制瑞斯托霉素(1.25mg/ml)誘導獼猴血小板聚集(參見實施例6-C)。最后，進一步的實驗研究結果顯示，在髙剪切力狀態下，本發明的單克隆抗體足以抑制人全血中血小板在層粘蛋白(laminin)分子上的黏附(參見實施例6-D)。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點(1)本發明的單克隆抗體可與人VWFA3特異性結合，而與重組的人血管性血友病因子Al和A2區沒有交叉反應，因此可以有效地阻斷人血管性血友病因子A3區與膠原的結合。(2)本發明的單克隆抗體可與VWFA3區結合，影響A1區構型，從而破壞原來能與血小板GPIba結合的Al區構型，達到阻斷VWFAl-GPIba相互作用的目的。雜交瘤細胞系的保藏信息為保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研宄所；保藏日期2008年5月14日；保藏編號CGMCCNO.2501;分類命名雜交瘤細胞株(鼠)fl^6〃'rfo/MflCe〃("Afo5^;圖1為12%SDS-PAGE鑒定分析純化的重組VWFA3蛋白的電泳圖；圖2顯示ELISA法檢測單克隆抗體SZ-123和SZ-125與rVWFA3特異性結合反應；圖3顯示以Western-Blot印跡法測定SZ-123和SZ-125與rVWFA3和VWF特異性結合；圖4顯示單克隆抗體SZ-123和SZ-125分別抑制純化的人VWF在人胎盤或牛皮膚的III型膠原上的結合；圖5顯示單克隆抗體SZ-123和SZ-125抑制瑞斯托霉素、博托酶素和牛血槳誘導人血小板聚集作用；圖6顯示單克隆抗體SZ-123和SZ-125抑制瑞斯托霉素誘導的人VWF與固相化的的重組血小板GPIba活性片段(rGPIbaH1-V298)的結合；圖7顯示單克隆抗體SZ-123和SZ-125抑制人全血中血小板在人胎盤或牛皮膚m型膠原分子上的黏附；圖8顯示單克隆抗體SZ-123和SZ-125抑制人全血中血小板在人胎盤層粘蛋白(laminiii)分子上的黏附。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:實施例l:免疫原""一重組人血管性血友病因子A3區(rVWF-A3)的制備(l)PCR引物設計和合成設計并合成一對分別位于編碼VWF-A3區(氨基酸1681-1877)cDNA序列(594bp)的上下游兩側的引物，上游引物，見SEQIDNO.l所述的堿基序列5，-ATAAGCTTTCCCCTGCACCTGACTGC-3',5，端含Hindffl酶切位點；下游引物，見SEQIDN0.2所述的堿基序列5，-TGCTCGAGAACAAATCCAGAGCA-3，，5'端含XhoI酶切位點；利用上述引物，以VWF全長cDNA為模板，進行PCR擴增，得到PCR產物。(2)目的基因的克隆和序列分析在T4DNA連接酶作用下，將純化的PCR產物直接與pUCm-T載體連接，得到pUCm-T-VWF-A3重組質粒。用所得重組質粒轉化TG1，經藍白斑篩選，再用Hindm和XhoI酶切鑒定。以重組質粒為模板全自動測序儀測定DNA序列，測得克隆片段的DNA序列與已知的VWF-A3區cDNA序列完全一致，進一步表明克隆的A3區基因片段是正確的。(3)pET20b(+)-VWF-A3表達載體的構建與表達用XhoI、Hindm雙酶切pUCm-T-VWF-A3重組質粒，回收目的基因片段。在T4DNA連接酶存在下，將目的基因與經過同樣處理的表達載體pET20b(含有6XHis的Tag)連接。酶切鑒定重組子pET20b(+)-VWF-A3，用于轉化宿主菌TG1、DE3。取單個菌落接種于3ml含氨芐青霉素(100Ug/ml)、氯霉素(25ixg/ml)的LB培養基中，37'C振蕩培養過夜。然后按5%接種于3ml含氨芐青霉素、氯霉素的LB中，培養至A6()()nm=0.6-0.8,加IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導4-6小時。取樣進行15%SDS-PAGE電泳，以薄層掃描確定表達的目的蛋白占細菌總蛋白的百分比。收集菌體并超聲破菌后，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳，以觀察表達產物的存在形式。用金屬螯合層析柱Ni-NTA樹脂(QIAGEN為公司產品)純化后，其純度達到95%以上。Western印跡分析結果顯示，重組的蛋白能夠特異地和抗His抗體反應，出現單一條明顯的結合帶，且分子量(27KDa)與誘導的蛋白一致(圖1，其中泳道l是蛋白分子量標準；泳道2是rVWFA3純品；泳道3和4是大腸桿菌包涵體)。編碼表達人VWF-A3區cDNA序列全長594bp，見SEQIDNO.3所述的堿基序列具體序列如下所示GCTCTGGATTTGTTAGG。實施例2:特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體的制備我們應用常規免疫學方法和雜交瘤技術(K5hlerandMilstein,Nature,215:495-497,1975)制備本發明的單克隆抗體。首先，以純化的rVWF-A3區蛋白質免疫8周齡雌性Balb/c小鼠(上海科學院實驗動物中心)，共免疫三次，每次間隔四周。前兩次為背部皮下多點注射加腹腔注射，第三次為經小鼠尾靜脈注射加腹腔注射。待被免疫小鼠的血清抗體滴度達到足夠髙后，處死動物并分離脾臟細胞。應用標準的單克隆抗體細胞融合技術，將被免疫Balb/c小鼠的脾臟細胞與小鼠的SP2/0骨髓瘤細胞(法國巴黎輸血中心雜交瘤實驗室引進)進行細胞融合。在HAT培養基中選擇培養融合細胞，培養后取上清以ELISA法篩選出髙水平分泌抗體的細胞株。用于進一步的擴大培養或凍存。應用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學技術篩選和鑒定后，獲得兩株特異性抗血管性血友病因子A3區的單克隆抗體，分別命名為SZ-123和SZ-125(圖2)。為了大量制備單克隆抗體，我們選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中(5乂105/小鼠)。大約在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集510ml腹水。實施例3:本發明單克隆抗體的化學性質(1)應用免疫雙擴散方法測定證實，本發明的單抗SZ-123和SZ-125均屬于IgGl亞類。(2)將單克隆抗體SZ-123和SZ-125接種于Balb/c小鼠腹腔產生腹水，用G-Sepharose-4B(Pharmacia公司產品)柱純化，測知每lmL腹水可純化得到IgG3-6mgo(3)ELISA實驗測定SZ-123和SZ-125特異性將重組的VWFAl、A2、A3(均為本實驗室表達和純化)和人VWF純品(從安徽綠十字生物制品有限公司提供的FVIII濃縮物，通過Sepharose4B凝膠層析柱純化)(2jig/ml)分別包被于96孔板上。4"過夜并經PBS-0.05。/。-吐溫20洗滌后，用2%BSA-PBS封閉過夜。每孔分別加入純化的單抗(500ng/ml)，37'C反應1小時。洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體(Beckman-Immunotech公司產品)，37'C反應1小時后，然后加OPD顯色。酶聯免疫分析法測定顯示，SZ-123和SZ-125與人VWF高特異性結合，而與重組的rVWF-Al區和rVWF-A2區無交叉反應(圖2，橫坐標是包被檢測板的各種抗原，縱坐標為以490nm處吸光度表示的抗體與包被抗原的結合量。實驗重復3次)。(4)免疫印跡技術(Western-blot)確定本發明的單克隆抗體識別的抗原分子純化的rVWFA3、rVWFAl和VWF分別經12%和5。/。SDS-PAGE分離，并電轉移到硝酸薄膜上。硝酸薄膜與單抗(5pg/ml)37'C反應1小時后，再使結合的單抗與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體37'C反應1小時，然后用電化學發光法(ECL)進行底物顯色。Western-blot印跡實驗證實，SZ-123和SZ-125可與還原性的VWF結合，并在分子量為250KDa和170KDa分別出現結合帶(圖3，其中A顯示rVWFA3或VWF分別經還原性的12%或5%SDS-PAGE電泳分離后，分別與單抗SZ-123或SZ-125或辣根過氧化物酶標記的兔抗人VWF抗體(VWFpAb)結合。B顯示rVWFAl經還原性的12%SDS-PAGE電泳分離并免疫轉移后，與單抗SZ-123或SZ-125反應)。此結果進一步證明SZ-123和SZ-125與人VWFA3區髙特異性結合，而與重組的rVWF-Al區無交叉反應。(5)Scatchard分析單抗的親和常數Ka和解離常數Kd:應用1251標記單抗，然后進行Scatchard分析，測得SZ-123和SZ-125與血管性血友病因子結合的親和常數Ka和解離常數Kd(表1)。此結果說明，SZ-123和SZ-125與VWF有髙度親和力。表l:SZ-123和SZ-125親和常數Ka和解離常數Kd值mAbsKa(X10"L/Mo1)Kd(X10-12Mol/L)SZ-1236.5±3.91.5±0.9SZ-1252.1±1.34.7±2.4實施例4:本發明單克隆抗體阻斷血管性血友病因子A3區與膠原的結合將乙酸酸化的人胎盤或牛皮膚III型膠原(Sigma公司產品)分別包被于96孔板上(2jig/孔)，4匸過夜。經2%BSA封閉和PBS-0.05。/。-吐溫20洗滌后，同時向各膠原包被的孔中加入lOOpl純化的人VWF和單抗(0.03-8pg/ml)，37'C保溫2小時。洗滌后，用辣根過氧化物酶標記的兔抗人VWF抗體(DakoCytomation公司)測定結合的VWF。結果顯示，抗VWFA3區單克隆抗體SZ-123和SZ-125以劑量依賴方式抑制純化的人VWF與人或牛的III型膠原結合。因此可進一步證明本發明的單克隆抗體SZ-123和SZ-125能夠抑制VWF與III型膠原間的相互作用。其中SZ-123和SZ-125分別抑制VWF與人胎盤III型膠原(IC50=0.07±0.01和0.15±0.03ng/ml)和牛皮膚III型膠原(IC5。=0.48±0.06和0.51±0.07pg/ml)的結合作用(圖4,其中A顯示人胎盤III型膠原；B顯示牛皮膚III型膠原。橫坐標以抗體的濃度對數表示的抗體濃度，縱坐標表示抗體對VWF與膠原結合的抑制率。實驗重復3次)。實施例5:本發明單克隆抗體阻斷血管性血友病因子Al區與血小板GPIb的結合A、單克隆抗體SZ-123和SZ-125對人血小板聚集試驗的影響采集正常健康人全血(3.8%檸檬酸鈉1/9抗凝)100Xg離心10分鐘，取上層富含血小板血漿(PRP)。將各種濃度的單抗(3.5-lOOfig/ml)分別與PRP預先室溫保溫10分鐘，然后再分別用瑞斯托霉素(Ristocetin,Sigma公司產品)(1.25mg/ml)、博托酶素(Botrocetin,比利時KatholiekeUniversityLeuvenCampus,DeckmynH教授提供)(0.5jig/ml)，牛血漿(10%，Sigma公司產品)，膠原(2ug/ml，Chrono-Log公司產品)或二磷酸腺苷(ADP)(2nmol/ml，Sigma公司產品)誘導血小板聚集。血小板聚集實驗結果表明，抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125分別抑制瑞斯托霉素、博托霉素和牛血漿(Sigma公司)誘導的血小板聚集(圖5,其中SZ-34和82D6A3為陰性對照抗體，實驗重復3次)。其中，SZ-123和SZ-125以劑量依賴方式地抑制瑞斯托1<:50=4.54±0.62和8.21±1.02fig/ml)。B、SZ-123和SZ-125對VWF與固相化的重組血小板GPIba活性片段(rGPIbaH1-V298)結合的影響將非阻斷性的抗血小板GPIba單抗2D4(5^g/ml)(比利時KatholiekeUniversityLeuvenCampus,DeckmynH教授提供)包被于96孑L酶標板上，0.05%-tween-20-PBS洗滌3次后，加入100p1純化的CHO細胞表達的rGPIbaHl-V298(2.5fig/ml)(本實驗室表達純化)，37"保溫1小時。洗滌后，同時加入VWF(0.6]ug/ml)-瑞斯托霉素(0.5mg/ml)-SZ-123或SZ-125(3.125-5Hg/ml)100pl，37'C繼續保溫1小時。洗滌后，結合的VWF用辣根過氧化物酶標記的兔抗人VWF抗體測定。實驗結果表明，SZ-123和SZ-125抑制Ristocetin誘導的VWF與固相化的重組rGPIb(Hl-V289)活性片段和血小板結合(圖6,其中SZ-34為陰性對照抗體，實驗重復3次)。另外，我們還證實，單克隆抗體SZ-123和SZ-125也抑制瑞斯托霉素誘導的VWF與固相化血小板結合，因此抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125不僅抑制VWF和III型膠原相互作用，也抑制VWF和血小板GPIbci相互作用，是兩株雙功能抑制型單克隆抗體。該兩項實驗說明抗VWFA3區單抗可與VWFA3區結合，影響Al區構型，從而破壞原來能與血小板GPIba結合的Al區構型，達到阻斷VWFAl-GPIbct相互作用的目的。實施例6:本發明單克隆抗體的應用A:本發明單克隆抗體抑制人全血中血小板在m型膠原分子上的黏附在體外模擬髙剪切力狀態下，應用剪切力為1000S1的Flowchamber試驗(使用的蠕動泵(PerfusorcompactS87"8")為德國B-BraunMesurgenAGC公司產品)。整個灌注過程均在37T進行。經肝素抗凝(40U/ml)的人全血，首先分別與單抗SZ-123或SZ-125或SZ-34(1-50jig/ml)在37'C孵育15分鐘。然后全血分別在已包被人胎盤或牛皮膚III型膠原(100pg/ml)的細胞培養皿表面小室中灌注5分鐘(2ml/分)。將經血小板粘附過的細胞培養皿表面用PBS輕輕地漂洗2次后，用2%多聚甲醛固定15分鐘，最后在LEICADC300顯微鏡(德國LEICADMIRB公司產品)下觀察和拍攝粘附的血小板。結果顯示，抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125分別以劑量依賴方式抑制人血小板在人胎盤和牛皮膚III型膠原上的黏附(圖7,其中A顯示灌注5分鐘后，在顯微鏡下拍攝粘附的血小板。所用抗體濃度均為10fig/ml,其中SZ-34為陰性對照抗體。B(人胎盤膠原)和C(牛皮膚膠原)分別顯示不同濃度(0-50pg/ml)的定量分析單抗對血小板在III型膠原表面上粘附百分數的影響。實驗重復3次)。單抗SZ-123和SZ-125抑制血小板粘附于人胎盤III型膠原的50%抑制抗體濃度(ICso)分別是3.6±0.5pg/ml和10.3±4.8ng/ml,而SZ-123和SZ-125抑制血小板粘附于牛皮膚III型膠原的50。/。抑制抗體濃度(ICso)分別是3.1±0.6pg/ml和11.3±3.6fig/ml(圖7)。本實驗證實，本發明的單克隆抗體足以抑制全血中血小板在m型膠原分子上的黏附。B:本發明單克隆抗體抑制人、獼猴或Begle犬血漿VWF與膠原的結合反應將乙酸酸化的人胎盤或牛皮膚III型膠原(Sigma公司產品)分別包被于96孔板上(2pg/孔)，4"過夜。經2%BSA封閉和PBS-0.05。/n-吐溫20洗滌后，同時加入已IOOnl人或獼猴或Begle犬血漿(彌猴和Beagle犬血由蘇州西山實驗動物中心提供)與單抗(0.03-8^g/ml),37C保溫2小時。洗滌后，用辣根過氧化物酶標記的兔抗人VWF抗體(DakoCytomation公司)測定結合的VWF。結果顯示，抗VWFA3區單克隆抗體SZ-123和SZ-125劑量依賴性地抑制人、獼猴或Begle犬血漿VWF與人胎盤或牛皮膚III型膠原的結合(表2和3)。表2.SZ-123和SZ-125抑制人、獼猴和Beagle犬物血槳VWF與牛皮膚III型膠原的結合<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3.SZ-123和SZ-125抑制人、獼猴和Beagle犬物血漿VWF與人胎盤III型膠原的結合<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>C:本發明單克隆抗體抑制瑞斯托霉素誘導的獼猴血小板聚集采集正常健康獼猴全血(3.8%檸檬酸鈉1/9抗凝)100Xg離心10分鐘，取上層富含血小板血漿(PRP)。將各種濃度的單抗(3.5-100fig/ml)分別與PRP預先室溫保溫10分鐘，然后再分別用瑞斯托霉素(Ristocetin,Sigma公司產品)(1.25mg/ml)誘導血小板聚集。血小板聚集實驗結果表明，抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125分別抑制瑞斯托霉素(Sigma公司)誘導的獼猴血小板聚集血小板聚集。D:本發明單克隆抗體抑制人全血中血小板在人胎盤層粘蛋白的黏附在體外模擬高剪切力狀態下，分別應用剪切力為1000S",2000S"的Flowchamber試驗(使用的蠕動泵(PerfusorcompactS8714843)為德國B.BraunMesiirgenAGC公司產品)。整個灌注過程均在37T進行。經肝素抗凝(40U/ml)的人全血，首先分別與單抗SZ-123或SZ-125或SZ-34(50ng/ml)在37^C孵育15分鐘。然后全血分別在已包被人胎盤層粘蛋白(50pg/ml)的細胞培養皿表面小室中灌注5分鐘(剪切力分別為1000S1，2000S")。將經血小板粘附過的細胞培養皿表面用PBS輕輕地漂洗2次后，用2%多聚甲醛固定15分鐘，最后在LEICADC300顯微鏡(德國LEICADMIRB公司產品)下觀察和拍攝粘附的血小板。結果顯示，抗VWFA3區單抗SZ-123和SZ-125分別抑制人血小板在人胎盤層粘蛋白的黏附(圖8，其中上面3張圖顯示剪切力為1000S"灌注5分鐘后，在顯微鏡下拍攝粘附的血小板。所用抗體濃度均為50ng/ml，其中SZ-34為陰性對照抗體；下面3張圖顯示剪切力為2000S"灌注5分鐘后，在顯微鏡下拍攝粘附的血小板，所用抗體濃度均為50ng/ml,其中SZ-34為陰性對照抗體。結果為3次重復實驗中一次)。本實驗證實，本發明的單克隆抗體足以抑制全血中血小板在人胎盤層粘蛋白的黏附。SEQUENCELISTING<110>蘇州大學<120>抗人血管性血友病因子A3區的雙功能性單克隆抗體<160>3<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>1ataagctttcccctgcacctgactgc26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>2tgctcgagcctaacaaatccagagca26<210>3<211>594<212>DNA<213>智人種(Homosapiens)<400>3tcccctgcacctgactgcagccagcccctggacgtgatccttctcctggatggctcctcc60agtttcccagcttcttattttgatgaaatgaagagtttcgccaaggctttcatttcaaaa120gccaatataagggcctcgtctcactcaggtgtcagtgctgcagtatggaagcatcaccac180cattgacgtgccatggaacgtggtcccggagaaagcccatttgctgagccttgtggacgt240catgcagcgggagggaggccccagccaaatcggggatgccttgggctttgctgtgcgata300cttgacttcagaaatgcatggtgccaggccgggagcctcaaaggcggtggtcatcctggt360cacggacgtctctgtggattcagtggatgcagcagctgatgccgccaggtccaacagagt420gacagtgttcccaattggaattggagatcgctacgatgcagccgacctacggatcttggc480aggcccaagcaggcgactccaacgtggggaaagctccagcgaatcgaagacctccctacc540atggtcaccttgggcaattccttcctccacaaactgtgctctggat"gttagg59權利要求1.一種雜交瘤細胞株，其特征在于所述雜交瘤細胞株為由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的，保藏編號為CGMCCNO.2501的雜交瘤細胞株SZ-125(3D2)。2.—種抗人血管性血友病因子A3區的雙功能性單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體為由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。3.權利要求2所述的單克隆抗體在制備具有抗血小板粘附活性的抗動脈血栓藥物中的應用，所述抗動脈血栓藥物既能阻斷血小板在III型膠原分子上的黏附，又能阻斷血小板在層粘蛋白分子上的黏附。全文摘要本發明一種保藏編號為CGMCCNO.2501的雜交瘤細胞株SZ-125(3D2)以及由上述雜交瘤細胞株分泌的抗人血管性血友病因子A3區的雙功能性單克隆抗體，所述單克隆抗體與VWFA3區結合后阻斷血管性血友病因子A3區與膠原的結合，同時影響A1區構型，從而破壞原來能與血小板GPIbα結合的A1區構型，達到阻斷VWFA1-GPIbα相互作用的目的，因此既可以阻斷血管性血友病因子A3區與膠原的結合，又能阻斷血管性血友病因子A1區與血小板糖蛋白Ib的結合，因此該單克隆抗體可用于制備具有抗血小板粘附活性的抗動脈血栓藥物。文檔編號A61K39/395GK101597595SQ200910027568公開日2009年12月9日申請日期2009年5月12日優先權日2009年5月12日發明者趙益明,阮長耿申請人:蘇州大學