專利名稱：一種含三葉苷的活性提取物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從殼斗科等植物中提取得到的主要含有三葉苷的高含量的活性 提取物及其制備方法，以及用于制備治療糖尿病、糖尿病腎病和肝水腫的藥物組合物中的應用。
背景技術：
糖尿病腎病(diabetic n印hropathy，DN)，糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病常見而 難治的微血管并發癥，為糖尿病的主要死因。在西方，DN已成為終末期腎病的首要原因；在 美國約1/3的I型糖尿病和1/5的II型糖尿病患者最終會發展為糖尿病腎病(宋春光，中 藥研究與信息，2005，7 (10) 19-20，26)。糖尿病患者腎臟功能和結構病變的演變可分為以下五期1期以高腎小球濾過 率(GFR越位150ml/min)和腎臟增大為特征。II期無臨床癥狀腎損害期，但出現腎小球 基質膜增厚的結構損害。運動后可出現可逆性尿白蛋白排泄量(UAE)升高。III期糖尿 病腎病高危期，UAE持續升高(20-200 u g/min)，GFR可恢復正常(130ml/min)，血壓可升高 但未到高血壓水平，已有腎小球結節型和彌漫型病變以及小動脈玻璃樣變，并已開始出現 腎小球荒廢。IV期顯性蛋白尿腎病期，出現進行性臨床非選擇性蛋白尿(UAE > 200 u g/ ml或尿蛋白> 0. 5g/24h ；GFR逐步下降，臨床上可出現水腫，大量蛋白尿等腎病綜合癥的表 現，高血壓常與蛋白尿水平平行，組織學改變為腎小球硬化，屬臨床DN。V期腎功能衰竭 期，出現尿毒癥的臨床表現和組織學改變，為終末期DN。DN已成為終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)最主要的病因(劉燦輝等，中華醫學全科雜志，2004，3 (11) :35_36 ； 張明霞，河北醫藥，2006,28(11) =1087-1088)。目前DN藥物治療有降血糖藥物如噻唑烷二酮類、磺酰脲類、雙胍類、胰島素類、葡 萄糖苷酶抑制劑等，降壓藥物如血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素II受體拮 抗劑(ARB)、鈣通道阻斷劑、利尿劑等，肝素及內皮素(ET1)受體阻斷劑等單獨或聯合用藥 (國際泌尿系統雜志，2006，26(5) :696-701 ；中國實用內科雜志，2003，23(1) :58_59)。無 論單獨或聯合使用降血糖，降壓藥物，都因其副作用之大而無法長期用藥。(中國醫藥論壇 2005 年 7 月第 3 卷第 7 期(總第 29 期)；CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY INFORMATION No.24Dec2005)。從天然植物中提取安全有效成分來治療糖尿病及糖尿病腎病已成為近年來研究 的熱點。多穗柯甜茶是近年來開發出來的一種天然保健茶，其制作工藝已相當成熟(《一 種甜茶提取物及其制備方法和應用》專利CN1122447C，《一種甜茶及其制作方法》申請號 CN1613339A)，報道了長期飲用該茶對高血壓、高血脂、糖尿病有療效。從該植物中分離到 的三葉苷作為抗氧化劑和食品甜味劑已被廣泛報道，例如專利JP2006056831，JP02292208， US3821417，US3857962，US3087821 ；以及 Evans 等人的 Archives of Biochemistry and Biophysics 199(2) :342_8 (1980)，Zhou Wenhua等人的《食品科學》148 :17_19 (1992)，Yang Daijian 等人的《中草藥》22 (3) :99_101 (1991)。
到目前為止仍然沒有一種工藝簡便、成本低廉且適合于大規模生產的制備高含量 三葉苷的提取方法，也沒有一種高含量的三葉苷活性提取物用于制備治療糖尿病中的應 用。因此，有必要進行進一步的研究。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種高含量三葉苷的活性提取物。本發明的目的之二是提供一種適合于大規模生產的制備高含量三葉苷的方法，該 方法簡便易行、不污染環境，而且成本低廉。本發明的目的之三是提供一種高含量三葉苷的活性提取物的藥物組合物。本發明的目的之四是提供一種三葉苷提取物的新用途，即用于制備治療糖尿病、 糖尿病腎病和肝水腫的藥物。本發明的高含量的三葉苷活性提取物指活性提取物中的三葉苷重量含量高于 20%、30%、50% 以上，優選 30% -99. 9%。因此本發明提供了 一種活性提取物，其中三葉苷的含量占該提取物重量的 30-99. 9%，優選為50-99. 9%，特別優選為70-99. 9%。在本發明的一個特別優選實例中， 本發明方法制備的活性提取物為一晶體，其X-衍射圖譜在衍射角為2 0時，具有下述特征 峰4. 660，d = 18. 947，I/I0 = 86 ；9. 340，d = 9. 461，I/I0 = 52 ；12. 340，d = 7. 167，I/I0 =42 ；16. 180，d = 5. 474，1/1。= 99 ；18. 700，d = 4. 741，1/1。= 67 ；20. 240，d = 4. 384， I/I0 = 92 ；22. 800，d = 3. 897，I/I0 = 99 ；24. 300，d = 3. 660，I/I0 = 96 ；29. 720，d = 3. 004，I/I0 = 46。本發明的高含量三葉苷的活性提取物是用5-95%的乙醇水溶液作為溶劑從殼斗 科植物中提取得到的。所述殼斗科植物包括水青R屬(Fagus)，栗屬(Castanea)，錐屬(Castanopsis)， 柯屬(Lithocarpus),櫟屬(Quercus),青岡亞屬(Cyclobalanopsis),三棱櫟屬 (Trigonobalanus)。本發明所述的殼斗科植物優選Lithocarpus polystachyus， Lithocarpuslitseifolius, Lithocarpus lithoserfolins, Lithocarpus lithoseifolius 禾口 Lithocarpus pachyphyllus 等植物。本發明所述的殼斗科植物特別優選多穗柯甜茶。本發明所述的殼斗科植物主要來源于長江以南地區，包括湖南、江西、重慶、四 川、云南、福建、廣西、安徽、浙江。優選湖南、江西、云南、四川、安徽地區。特別優選湖南、江 西地區的多穗柯甜茶。本發明含高含量三葉苷的活性提取物可以從所述植物的地下部分或地上部分提 取，包括葉、嫩枝、樹皮、樹根。但是優選從新鮮的葉子中分離，新鮮的葉子優選在生長周期 的早期收集。本發明的活性提取物中三葉苷的含量為30-99.9%，除了三葉苷外，提取物中還可 以含有其它的多酚，包括但不限于其中一種或多種成分如茶多酚、咖啡堿、谷氨酸、天門冬 氨酸、亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸、根皮苷、3-羥基根皮苷。本發明的另一方面，是提供了一種適合于大規模生產高含量三葉苷的方法，該方法簡便易行、不污染環境，而且成本低廉。在本發明方法的優選實例中，是將植物原料用5-95%乙醇水溶液提取后，得到的 粗提物再用聚酰胺或大孔吸附樹脂進行進一步的分離純化。本發明方法中所用的聚酰胺或 大孔吸附樹脂的粒徑為10 200目，粗提物與聚酰胺或大孔樹脂的重量比為1 1 50， 層析柱的直徑與高的比為1 2 30。特別優選的是聚酰胺或大孔吸附樹脂的粒徑為 10 100目，三葉苷粗提物與聚酰胺或大孔樹脂的重量比為1 5 40，層析柱的直徑與 高的比為1 5 20。本發明方法中，三葉苷粗提物通過聚酰胺進一步分離后可得到無色或淡黃色的三 葉苷針狀結晶體。該結晶體包括用含0-50%乙醇水溶液重結晶得到的含結晶水的三葉苷結 晶體和用無水有機溶劑重結晶得到的不含結晶水的三葉苷結晶體。本發明還提供了一種藥物組合物，其包括本發明的治療有效量的活性提取物和可 藥用載體。優選本發明的藥物組合物含有三葉苷含量為50-99. 9%的活性提取物，特別優選 本發明的藥物組合物含有三葉苷含量為70-99. 9%的活性提取物。本發明的藥物組合物，制備成各種藥物制劑，該制劑為口服給藥制劑、注射給藥制 劑或局部給藥制劑，其中(1) 口服給藥制劑包括普通片、緩釋片、顆粒劑、硬或軟膠囊、糖漿劑、溶液劑、乳 劑；口服給藥制劑的載體包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑或者其他常 規添加劑，具體包括淀粉、乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯 吡咯烷酮、羥丙甲纖維素、硬脂酸鎂、二氧化硅和聚山梨脂-80、十二烷基硫酸鈉；(2)注射給藥制劑包括無菌注射的水溶液、無菌注射的水包油微乳液、注射用無菌 粉末；注射給藥制劑的載體包括注射用溶劑、注射用附加劑，具體注射溶劑包括注射用水、 注射用油如大豆油，注射用增溶劑如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油，等滲物質如氯化鈉、葡 萄糖；(3)局部給藥制劑是貼劑、栓劑、霜劑、膏劑、凝膠劑、溶液、靶向制劑或混懸液，其 中靶向制劑包括脂質體、微球劑、毫微粒、包含物、單克隆抗體耦聯物；局部給藥制劑的載體 包括藥學上用于局部給藥的常規載體。藥物制劑給藥形式包括靜脈、肌內、腹膜、皮下、口服、直腸栓劑插入法、陰道栓 劑插入法、靶向給藥、吸入式、灌胃式、鼻飼式、舌下給藥、滴藥法、微針式給藥、連續給藥系 統和局部給藥，局部給藥方式如貼皮制劑、或植入式連續給藥釋放系統，其中貼皮制劑載體 包括骨架材料如疏水的聚硅氧烷和親水的聚乙烯醇等，控釋膜材料如聚硅氧烷和乙烯_醋 酸乙烯共聚物等，壓敏膠如聚異丁烯、聚硅氧烷和聚丙烯酸酯，活性成分一般分散在壓敏膠 中；其中植入式連續給藥釋放系統所選用的高分子材料包括聚乳酸一乙醇酸共聚物、聚乙 二醇聚乳酸共聚物、聚乳酸/聚己內酯、聚[碳酸(亞丁酯-co-e-己內酯)酯]、聚丁內 酯戊內酯、聚二氧環己酮(PDS)、聚-3-羥基丁酸酯(PHB)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙醇酸 (PGA)、聚￡ -己內酯(PCL)、聚己內酯/聚乙交酯丙交酯(PCL/PLGA)、甲基丙烯酸羥乙酯 (HEMA)o用于口服給藥的本發明藥物制劑可依據本領域用于制備口服藥物組合物的任何 已知方法制得，并且這樣的組合物，除了含有本發明的活性提取物和可藥用載體外，還可包 含一種或多種選自下列的物質甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供藥學美觀和適口的制劑。片劑含有活性組分以及與其混合的適于制備片劑的無毒的藥學上可接受的賦形 劑。這些賦形劑可以是惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩 解劑例如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、玉米淀粉或藻酸；粘合劑例如淀粉、明膠、聚乙烯吡 咯烷酮或阿拉伯樹膠；和潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。本發明的口服制劑還可以以硬明膠膠囊提供，其中活性組分與惰性固體稀釋劑例 如碳酸鈣、磷酸鈣和高嶺土混合，或以軟明膠膠囊提供，其中活性成分與水溶性載體例如聚 乙二醇或油性介質例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。本發明的分散粉劑和粒劑，適于使用時通過加入水來制備水混懸液。它提供了與 分散劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性組分。本發明的糖漿劑和酏劑可以用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。這 樣的制劑還可包含緩沖劑、防腐劑、矯味劑和著色劑以及抗氧劑。本發明的藥物制劑可以是無菌注射水溶液的形式。可使用的載體或溶劑包括水、 林格溶液、氯化鈉和/或葡萄糖注射液。本發明的活性提取物或藥物組合物在制備治療下列疾病的藥物中的應用增加高密度脂蛋白的水平、增強記憶力、改善學習能力、衰老、代謝類疾病、糖尿 病、糖尿病腎病、糖尿病足病、糖尿病視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病并發癥、延遲傷口 愈合、胰島素抗性、高血糖、高胰島素血癥、脂肪酸或甘油的水平升高、高脂血癥、肥胖癥、高 甘油三酯血癥、動脈粥樣硬化、高血壓、代謝綜合癥(X綜合癥)、貧血(如鐮刀細胞貧血)、 粉刺、腫瘤、風濕性關節炎、關節炎、腸炎、銀屑病、多發性硬化癥、神經變性紊亂、充血性心 力衰竭、中風、主動脈瓣狹窄、腎炎、腎衰竭、痛風、紅斑狼瘡、IgA腎病、闌尾炎、胰腺炎、變態 反應(如鼻炎、鼻竇炎)、纖維癥、骨病、骨質疏松、心血管疾病(如心律失常、心血管休克、 心絞痛)、放療及化療并發癥、肝病(如肝炎)、胃腸道病癥(如胃炎和胃腸炎)、結膜炎、斯 耶格倫(Sjogren' s)綜合癥、肺病、腎病(如多囊腎病)、皮炎、HIV相關病癥、瘧疾(如腦 瘧)、強直性脊椎炎、麻風病、免疫性疾病、抑郁癥、老年癡呆癥、水腫、潰瘍、精神分裂癥、精 神障礙性疾病、過敏性休克、尿崩癥、哮喘、青光眼、線粒體疾病、帕金森、、病理老化的糖基 化終端產物、能量代謝異常、基質金屬蛋白酶病理性疾病。本發明所說的病理老化的糖基化終端產物相關疾病包括但不限于糖尿病、老年癡 呆癥、動脈粥樣硬化、腎病、骨關節炎、骨質疏松、衰老等疾病中的一種或多種。本發明所說的基質金屬蛋白酶病理性疾病包括但不限于動脈粥樣硬化、中樞神經 系統炎癥、阿耳茨海默(氏)病、哮喘、皮膚老化、類風濕性關節炎、骨關節炎、骨質疏松、膿 毒性關節炎、子宮內膜異位癥、角膜潰瘍粘連、骨病、蛋白尿、腹主動脈瘤、退化性軟骨損耗、 多動性硬化癥、髓鞘神經耗損、肝纖維化、nephroglomerular病、胚膜破裂、腸炎、牙周病、 老年黃斑變性、糖尿病視網膜疾病、視網膜玻璃體增生、視網膜發育不良、眼炎、角膜潰瘍、 Sjogren' s并發癥、眼近視瘤、腫瘤轉移中的一種或多種。本發明所說的線粒體疾病包括但不限于眼肌麻痹、肌肉病變、運動失調、癲癇發 作、肌陣攣、中風、視神經病變、感音神經性聾、癡呆、周圍神經病、肌張力障礙、脊髓病變、心 肌病、白內障、色素性視網膜病變、代謝性酸中毒、惡心、嘔吐、肝病、腎病、假性腸梗阻、鐵粒 幼細胞貧血、糖尿病、胰腺外分泌功能障礙和甲狀旁腺功能低下癥中的一種或多種。
本發明所說的能量代謝異常疾病包括但不限于創傷、缺血及再灌注損傷導致的疾 病，如各種急性化學物理因素所致的創傷、中毒、休克、高原病、放射病、塵肺、電擊傷、暈動 病、急慢性心功能不全，心律失常、心臟傳導異常、人工心臟起搏、心血管介入療法、瓣膜病、 動脈粥樣硬化、冠心病、(包括猝死)、先天性心臟病、高血壓、感染性心內膜炎、肺源性心 臟病、心包炎、心肌病、周圍血管疾病(包括多發性大動脈炎、雷諾綜合癥、血栓閉塞性脈管 炎、閉塞性動脈硬化等)、心臟移植手術、神經痛、神經炎、各種周圍神經病、各種脊髓疾病、 急性腦血管疾病(包括腦梗死、腦栓塞、腦出血、蛛網膜下腔出血等)、顱內腫瘤、中樞神經 系統感染(包括病毒和細菌性腦炎、腦膜炎等)、運動障礙性疾病(帕金森病、舞蹈病、肝 豆狀核變性、肌張力障礙、抽搐與振顫)發作性疾病(包括癲癇、偏頭痛、發作性睡病與猝 倒癥等)、脫髓鞘性疾病(包括多發性硬化癥、視神經脊髓炎、腦白質營養不良)、骨骼肌肉 病(包括肌營養不良癥、強直性肌病、重癥肌無力、炎癥性肌病、代謝性肌病、周期性癱瘓)、 自主神經疾病(包括雷諾病、紅斑性肢痛、間腦綜合癥)、彌散性血管內凝血等；胰島素抵 抗及內分泌等因素引起的疾病，如肥胖癥、各種原因所致低血糖、胰島素抵抗綜合癥、代謝 綜合癥、營養不良(營養不良性干瘦、惡性營養不良、繼發性蛋白質能量營養不良)、腸內 營養、腸外營養、水電解質代謝紊亂、酸堿平衡紊亂、糖尿病、糖尿病心血管疾病、糖尿病周 圍神經病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足、妊娠與糖尿病、糖尿病并發感染、 糖尿病急性代謝并發癥、乳酸性酸中毒、各型糖原累積病、血脂蛋白紊亂、高氨基酸尿癥、黃 瘤、粘多糖病、果糖不耐受癥、半乳糖血癥、其他嘌呤和嘧啶代謝疾病、營養與代謝障礙性皮 膚病(維生素缺乏、腸病性肢端皮炎、原發性皮膚淀粉樣變、皮膚卟啉病、黃瘤病)、糖尿病 視網膜并發癥、生長激素缺乏性侏儒癥、成年人腺垂體功能減退癥、腎上腺病、甲狀腺病、 甲狀旁腺病、卵巢病、性早熟、胰島內分泌腫瘤、多發性內分泌腺病等疾病；腫瘤等疾病，如 各種腫瘤、癌癥、肉瘤、血癌、急慢性白細胞及粒細胞性白血病、各種原因所致的貧血(包括 骨髓性貧血、再生障礙性貧血、鐮狀紅細胞性貧血)、淋巴組織細胞病、自身免疫性疾病、原 發性和繼發性免疫缺陷病、肺部腫瘤、肺肉瘤、消化性潰瘍、食道癌、胃癌、胃腫瘤、大腸癌、 腎臟腫瘤、口腔腫瘤、原發性和繼發性肝癌、膽管腫瘤、艾滋病、各種皮膚癌、骨髓腫瘤等疾 病；炎癥、嚴重感染和免疫反應導致的疾病，如感染性休克、多臟器功能衰竭、高溫、低溫綜 合癥、感染性疾病(呼吸道感染、哮喘、嚴重急性呼吸綜合癥、病毒性肝炎、流行性腮腺炎、 流行性乙型腦炎、狂犬病、脊髓灰質炎、麻疹、風疹、天花、水痘、單純皰疹、帶狀皰疹、流行性 出血熱、黃熱病、腸道病毒所致的各系統感染、傳染性單核細胞增多癥、巨細胞病毒感染、艾 滋病、立克次體病、衣原體感染、支原體感染、細菌性疾病(包括結核性疾病厭氧菌感染、敗 血癥、破傷風等)、真菌性疾病、螺旋體病、寄生蟲病、各種原因引起的感染性腹瀉、急性出血 壞死性小腸炎、潰瘍性結腸炎、腸梗阻、胃動力性和功能性疾病、急性腹膜炎、急性胰腺炎、 各種原因引起肝硬化、脂肪肝、黃疸、腹瀉、消化道出血、反流性食管炎、爆發性肝功能衰竭、 肝性腦病、膽石病、膽囊炎、急慢性腎功能衰竭、血液凈化療法、急慢性呼吸功能不全、慢性 阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴張、各種原因引起的肺炎、肺膿腫、肺水腫、肺栓塞、肺 靜脈瘺、肺結核、先天性肺發育不全、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫 綜合征、急慢性腎炎、腎病綜合癥、微小病變性腎病、膜性腎病、局灶性腎小球硬化癥、系膜 增殖性腎小球腎炎、系膜毛細血管增生性腎炎、繼發性腎小球疾病、遺傳性腎炎、泌尿道感 染、間質性腎炎、腎小管疾病、腎石病、牙周膿腫、病毒性皮膚疾病、細菌性皮膚疾病、真菌性皮膚病、蕁麻疹類皮膚病、失聰、美尼爾氏綜合癥、急慢性中耳炎、結膜病、角膜病、白內障、 青光眼、葡萄膜病、視網膜病、視神經病、急慢性扁桃體炎、扁桃體膿腫、骨關節炎、代謝性骨 病、骨質疏松癥、痛風和高尿酸血癥、結節病、淀粉樣變性、大骨節病、色素性皮膚病(白癜 風、黃褐斑、雀斑、黑變病、遺傳性大皰性表皮松解癥、魚鱗病、毛周角化病、家族性良性天皰 瘡、日光性皮膚病、凍瘡、放射性皮膚病、痤瘡、脂溢性皮炎、斑禿、雄激素源性脫發、風濕熱、 系統性紅斑囊瘡、類風濕性關節炎、脊柱關節病、多發性肌炎和皮肌炎、硬皮病和系統性硬 化癥、過敏性疾病等；各種原因所致線粒體功能障礙導致的退行性病變以及神經精神性疾 病，如衰老、阿爾茲海默病、各種原因導致的線粒體疾病，如亨廷頓氏疾病、帕金森病(PD)、 肌萎縮性側索硬化、線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風樣發作綜合征(MELAS)、肌陣攣性癲癇 伴破碎紅纖維病(MERRF)、Leber遺傳性視神經病(LH0N)、線粒體心肌病、肌病、癡呆、突發 的不能控制的肌肉收縮(肌陣攣性的癲癇)、精神疾病包括器質性精神障礙(癡呆綜合癥、 譫妄綜合癥、遺忘綜合癥、艾滋病所致精神障礙)、精神活性物質所致精神障礙(酒精中毒 和酒精依賴、藥物依賴)、精神分裂癥、情感障礙、神經癥性障礙(恐怖癥、焦慮癥、強迫癥、 神經衰弱、癔癥、疑病癥)、進食障礙、睡眠障礙、廣泛性發育障礙、精神發育遲滯、多動障礙、 抽動障礙、男性性功能障礙等疾病急慢性缺血、創傷、嚴重感染、糖尿病和腫瘤等。本發明所說的糖尿病并發癥包括但不限于糖尿病腎病、糖尿病足病、糖尿病視網 膜病、糖尿病性神經病等與糖尿病相關的微血管疾病。統稱為“X綜合癥”(也稱做代謝綜合癥)的病癥、疾病和疾患是以中心性肥胖為核 心，合并血壓、血糖、甘油三酯升高和/或HDL-C降低，是胰島素抵抗所致的糖，脂代謝紊亂， 以合并出現多種代謝性疾病為臨床特點的一組嚴重影響健康的癥候群。詳述于Joharmsson J. Clin. Endocrinol. Metab.，82，727-34(1997)中。當把本發明的藥物組合物和藥物制劑對人體給藥時，日劑量通常由處方醫師決 定，并且劑量一般隨個體患者的年齡、體重、性別和反應以及患者癥狀的嚴重程度而變。通 常，成人每天給藥劑量為l_500mg活性提取物/kg體重，優選為每天5-300mg活性提取物/ kg體重。本發明的研究表明三葉苷提取物具有保護腎臟和肝細胞的作用，對體重也有一 定程度的減輕作用。因此，本發明的再一方面是提供了一種三葉苷活性提取物的新用途，即用于制備 預防和治療治療糖尿病腎病、肝水腫，尤其是藥物性肝水腫的藥物。
圖1三葉苷單體X衍射圖
具體實施例方式本發明將結合實施例作進一步的說明。通過實施例來幫助進一步理解本發明。所用的具體材料、物種和條件都是為了舉 例說明本發明，而不是限制本發明的合理范圍。本發明的分子結構有的存在立體異構體，它 們通過手性試劑定向合成或分子拆分或經純化柱制得單純的立體異構體，這些立體異構體 在本實施例中未全部說明但不限制本發明。
下面的實施例僅僅用于進一步解釋本發明，而不是對本發明范圍的限制。實施例1大孔樹脂精制三葉苷 將多穗柯嫩葉加入8倍量濃度為70 %的乙醇水溶液中，浸泡2小時后，加熱至回流 狀態，并回流1小時，過濾；濾渣加入6倍量的70%乙醇水溶液加熱至回流狀態并回流1小 時，過濾；重復此過程1次。合并過濾液，減壓濃縮回收乙醇，得到三葉苷浸膏。將30g三葉苷干浸膏放于100ml蒸餾水中，加熱至80°C并不斷攪拌使三葉苷完全 溶解，趁熱抽濾得到棕褐色澄清溶液，靜置冷卻至20 40°C，將該溶液加到中等極性大孔 吸附樹脂(DM-301)首端，用蒸餾水洗脫除去部分水溶性雜質及色素后，用20% -50%的乙 醇水溶液進行洗脫，薄層檢測，收集末端洗脫液，濃縮過濾，濾液放置析晶，對析出的粗結晶 用適量蒸餾水重結晶，得到10. 0g純度在99%以上的三葉苷精品。m. p. 168. 0 169. 0°C ；X-衍射圖譜見附圖 1。ESI-MS (m/z) 435 [ (M—1) +]及 ESI—MS (m/z) 437 [ (M+H) +]，459 [ (M+Na) +]。IR cnT1 :3414，1596，1515，1076，980，825iH-WlUDMSO-de) 8 :2. 79 (2H，t，J = 7. 4Hz)，3. 16-3. 71 (8H，m)，4. 88 (1H，d，J =
7.7Hz)，4. 52-5. 30 (4H, m)，6. 05 (2H, s)，6. 66 (2H, dt, J = 2. 8,8. 4Hz)，7. 04 (2H, d, J =
8.4Hz)，9. 10 (1H, s)，12. 25 (2H, s)。13C-NMR(DMS0-d6) 8 :29. 3,45. 6,60. 5,69. 4,73. 0,76. 4,77. 1,95. 1 (X2) ,99. 6, 105. 3，115. 0(X2)，129. 2(X2)，131. 5，155. 4，163. 4，163. 7 (X 2)，205. 1。實施例2聚酰胺精制三葉苷將多穗柯嫩葉加入10倍量的80%乙醇水溶液，浸泡30分鐘后，加熱至回流狀態， 并回流1小時，過濾；濾渣加入5倍量濃度為80%的乙醇水溶液加熱至回流狀態并回流1小 時，過濾；此過程重復1次。合并過濾液，常壓回收乙醇，濃縮得到三葉苷浸膏。將30g三葉苷干浸膏放于100ml蒸餾水中，加熱至80°C并不斷攪拌使三葉苷完全 溶解，趁熱抽濾得到棕褐色澄清溶液，靜置冷卻至20 40°C，將該溶液加到聚酰胺首端，用 蒸餾水洗脫除去部分水溶性雜質及色素后，用20% -40%的乙醇水溶液進行洗脫，薄層檢 測，收集末端洗脫液，濃縮過濾，濾液放置析晶，對析出的粗結晶用適量蒸餾水重結晶，得到 13. 2g純度在99. 2%以上的三葉苷精品。實施例3按下列配方制得本發明的片劑(所用含量均為重量百分含量)含70%三葉苷的活性提取物54.5%微晶纖維素42.0%PVP-k301. 0%硬脂酸鎂0.5%羧甲基淀粉鈉2.0%將三葉苷提取物、微晶纖維素、部分羧甲基淀粉鈉混勻，加入PVP_k30的乙醇溶液 制軟材，經20目篩制粒，60°C鼓風干燥后整粒，加入羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂后混勻壓片， 即得。實施例4按下列配方制得本發明的膠囊劑(所用含量均為重量百分含量)
含80%三葉苷的活性提取物淀粉羧甲基淀粉鈉硬脂酸鎂
50. 0% 47. 5% 2. 0% 0. 5%將三葉苷苷提取物與淀粉混合均勻，加入8%淀粉漿制軟材，經20目篩制粒，于 60°C鼓風干燥后整粒，加入羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂后填充到空膠囊即得。實施例5按下列配方制得本發明的片劑(所用含量均為重量百分含量)將三葉苷結晶體、微晶纖維素、部分羧甲基淀粉鈉混勻，加入PVP_k30的乙醇溶液 制軟材，經20目篩制粒，60°C鼓風干燥后整粒，加入羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂后混勻壓片， 即得。實施例6三葉苷提取物治療糖尿病腎病、肝水腫的藥效學研究。(一)動物模型的建立本藥物用在經左腎切除+高脂高糖飼料誘導+STZ選擇性破壞胰腺細胞造成糖尿 病及單側腎臟失代償導致的大鼠糖尿病腎病模型經灌胃給藥一個月。給藥觀察期間，每周 稱體重并計進食量。在結束試驗前每只動物均上代謝籠收集24h尿液，測24h尿蛋白總量; 并取血測相關血生化指標，包括血糖，尿素氮，總膽紅素，谷丙轉胺酶；并且處死動物后取腎 臟，肝臟，心臟，測其重量，計算臟器/體重指數；制作石蠟切片。( 二)藥效學實驗及其結果1.三葉苷對DN大鼠血生化及大體病理的影響實驗發現，在服用三葉苷的兩組動物模型中其谷丙轉胺酶、總膽紅素、血糖量均較 對照組有降低，并有顯著性差異。2.肝細胞病理切片肝細胞HE染色400x顯微鏡下顯示，模型對照組肝細胞形態較正常細胞有腫脹界 限不清，而大劑量組卻見較為清晰的細胞界限。肝細胞核見有2-3個核仁/細胞，可能與細 胞代謝旺盛有關。給藥組較陰性對照組動物轉氨酶顯著降低的結果與病理切片結果吻合。(三)藥效學結果分析及初步結論結果顯示三葉苷可降低尿素氮，使腎重量縮小；降低血谷丙轉氨酶值，減輕肝細胞 水腫現象。給藥組動物的血糖，血脂及24小時尿蛋白也有不同程度下降。因此，三葉苷有 保護腎臟，肝細胞的作用；和降血糖，血脂及蛋白尿作用。三葉苷結晶體微晶纖維素PVP-k30
30. 0% 66. 5% 1. 0%硬脂酸鎂羧甲基淀粉鈉
0. 5% 2. 0%
權利要求
一種高含量三葉苷活性提取物，其特征在于其中三葉苷的含量為該活性提取物重量的30-99.9％。
2.權利要求1的高含量三葉苷活性提取物，其特征在于其中三葉苷的含量為該活性提 取物重量的50-99. 9%。
3.權利要求1的高含量三葉苷活性提取物，其特征在于其中三葉苷的含量為該活性提 取物重量的70-99. 9%。
4.權利要求1的活性提取物，其是一種結晶體。
5.權利要求4的活性提取物，其特征在于所述晶體的X-衍射圖譜在衍射角為20時， 具有下述特征峰16. 180，d = 5. 474，I/I0 = 99 ；20. 240，d = 4. 384，I/I0 = 92 ；22. 800， d = 3. 897，I/I0 = 99 ；24. 300，d = 3. 660，I/I0 = 96。
6.權利要求1所述的活性提取物，其特征在于是用5-95%的乙醇水溶液作為溶劑 從杜鵑花科植物Rhododendron molle和/或蛇菰科Balanophoratobiracola和/或 山石A禾斗Symplocaceae禾口 /或薔薇禾斗Rosaceae禾口 /或葡萄禾斗Vitis piasezkii, Vitis sacchariferBo
7.權利要求1的活性提取物，其特征在于是用5-95%的乙醇水溶液作為溶劑從殼斗科 植物中提取得到的。
8.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述的溶劑是30-90%的乙醇水溶液。
9.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述殼斗科植物選自Lithocarpus polystachyus, Lithocarpus litseifolius， Lithocarpuslithoserfolins, Lithocarpus lithoseifolius 禾口 Lithocarpus pachyphyllus。
10.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述殼斗科植物選自多穗柯甜茶。
11.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述殼斗科植物來源于長江以南地區 包括湖南、江西、重慶、四川、云南、福建、廣西、安徽、浙江。
12.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述殼斗科植物來源于長江以南地區 包括湖南、江西。
13.權利要求7的活性提取物，其特征在于其中所述的植物是該植物的根、莖、葉。
14.一種藥物組合物，其特征在于其含有權利要求1-13任一項的活性提取物和可藥用 載體。
15.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是一種口服給藥制劑、注射給藥制劑或 局部給藥制劑，其中(1)口服給藥制劑包括普通片、緩釋片、顆粒劑、硬或軟膠囊、糖漿劑、溶液劑、乳劑；口 服給藥制劑的載體包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑或者其他常規添加 劑，具體包括淀粉、乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷 酮、羥丙甲纖維素、硬脂酸鎂、二氧化硅和聚山梨脂-80、十二烷基硫酸鈉；(2)注射給藥制劑包括無菌注射的水溶液、無菌注射的水包油微乳液、注射用無菌粉 末；注射給藥制劑的載體包括注射用溶劑、注射用附加劑，具體注射溶劑包括注射用水、注 射用油如大豆油，注射用增溶劑如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油，等滲物質如氯化鈉、葡萄 糖；(3)局部給藥制劑是貼劑、栓劑、霜劑、膏劑、凝膠劑、溶液、混懸液或靶向制劑，其中靶向制劑包括脂質體、微球劑、毫微粒、包含物、單克隆抗體耦聯物；局部給藥制劑的載體包括 藥學上用于局部給藥的常規載體。
16.權利要求14的藥物組合物，其特征在于其中所述的藥物組合物的給藥形式包括 靜脈、肌內、腹膜、皮下、口服、直腸栓劑插入法、陰道栓劑插入法、靶向給藥、吸入式、灌胃 式、鼻飼式、舌下給藥、滴藥法、微針式給藥、連續給藥系統和局部給藥，局部給藥方式如貼 皮制劑、或植入式連續給藥釋放系統，其中貼皮制劑載體包括骨架材料如疏水的聚硅氧烷 和親水的聚乙烯醇等，控釋膜材料如聚硅氧烷和乙烯-醋酸乙烯共聚物等，壓敏膠如聚異 丁烯、聚硅氧烷和聚丙烯酸酯，活性成分一般分散在壓敏膠中；其中植入式連續給藥釋放系 統所選用的高分子材料包括聚乳酸一乙醇酸共聚物、聚乙二醇聚乳酸共聚物、聚乳酸/聚 己內酯、聚[碳酸(亞丁酯-co-e-己內酯)酯]、聚丁內酯戊內酯、聚二氧環己酮(PDS)、 聚-3-羥基丁酸酯(PHB)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚￡ -己內酯(PCL)、聚己 內酯/聚乙交酯丙交酯(PCL/PLGA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)。
17.權利要求14-16中任一項的藥物組合物，其特征在于其中所述的活性提取物中三 葉苷的含量為該活性提取物重量的50-99. 9%。
18.權利要求14-16中任一項的藥物組合物，其特征在于其中所述的活性提取物中三 葉苷的含量為該活性提取物重量的70-99. 9%。
19.權利要求14的藥物組合物，其特征在于其中所述的活性提取物是一種晶體。
20.權利要求1-13任一項的活性提取物或權利要求14的藥物組合物在制備用于治療 下列疾病的藥物中的用途增加高密度脂蛋白的水平、增強記憶力、改善學習能力、衰老、代謝類疾病、糖尿病、糖 尿病腎病、糖尿病足病、糖尿病視網膜病、糖尿病性神經病、糖尿病并發癥、延遲傷口愈合、 胰島素抗性、高血糖、高胰島素血癥、脂肪酸或甘油的水平升高、高脂血癥、肥胖癥、高甘油 三酯血癥、動脈粥樣硬化、高血壓、代謝綜合癥(X綜合癥)、貧血(如鐮刀細胞貧血)、粉刺、 腫瘤、風濕性關節炎、關節炎、腸炎、銀屑病、多發性硬化癥、神經變性紊亂、充血性心力衰 竭、中風、主動脈瓣狹窄、腎炎、腎衰竭、痛風、紅斑狼瘡、IgA腎病、闌尾炎、胰腺炎、變態反應 (如鼻炎、鼻竇炎)、纖維癥、骨病、骨質疏松、心血管疾病(如心律失常、心血管休克、心絞 痛)、放療及化療并發癥、肝病(如肝炎)、胃腸道病癥(如胃炎和胃腸炎)、結膜炎、斯耶格 倫(Sjogren' s)綜合癥、肺病、腎病(如多囊腎病)、皮炎、HIV相關病癥、瘧疾(如腦瘧)、 強直性脊椎炎、麻風病、免疫性疾病、抑郁癥、老年癡呆癥、水腫、潰瘍、精神分裂癥、精神障 礙性疾病、過敏性休克、尿崩癥、哮喘、青光眼、線粒體疾病、帕金森、病理老化的糖基化終端 產物、能量代謝異常、基質金屬蛋白酶病理性疾病。
21.權利要求1-13任一項的活性提取物或權利要求14的藥物組合物在制備用于治療 糖尿病、糖尿病腎病和肝水腫的藥物中的用途。
22.權利要求19的用途，其特征在于其中所述的活性提取物中三葉苷的含量為該活性 提取物重量的50-99.9%。
23.權利要求19的用途，其特征在于其中所述的活性提取物中三葉苷的含量為該活性 提取物重量的70-99.9%。
24.權利要求19的用途，其特征在于其中所述的藥物的給藥劑量為成人每天l_500mg 活性提取物/kg體重。
25.權利要求20的用途，其特征在于其中所述的藥物的給藥劑量為成人每天5-300mg 活性提取物/kg體重。
全文摘要
本發明公開了一種活性提取物，所述活性提取物是用5-95％的乙醇水溶液作為溶劑從殼斗科等植物中提取得到的，所述活性提取物中三葉苷的含量為30-99.9％；本發明還公開所述活性提取物的制備方法和其在制備治療糖尿病、糖尿病腎病和肝水腫的藥物中的用途。
文檔編號A61P29/00GK101874824SQ20091002742
公開日2010年11月3日 申請日期2009年5月1日 優先權日2009年5月1日
發明者孫偉新, 蔣華良, 趙維民, 顧書華 申請人:常州高新技術產業開發區三維工業技術研究所有限公司