脫細胞結膜基質的制備方法和應用的制作方法

專利名稱：脫細胞結膜基質的制備方法和應用的制作方法
脫細胞結膜基質的制備方法和應用
獄領域
本發明涉及一種作為組會im魏厳架材料的腳鵬膜基質的帝恪施和細。 背景獄
角m^是我國的第二^C盲腳艮病，角，植是復明唯一有效的治療手段，但角膜f^!W才料的ES
嚴 響角 植的開展。3fi^來，隨^ia織a:禾iS術的，，組織o^呈角鵬各為角,的治療開辟新 的齒5。組織oa的三大要素包摘中子細胞、支架材料和微環趟。支架材料鄉^^存和行使功能的場 所，同時能引導細ifi^長，決定著所構彰且織的脇。只有選擇了良好的^^材料，種子細財能在其 上數子地生長、增殖。a^想的^:架材料應當滿足以下^f牛(i)生物相容斷，離隹持3隹空間和艦 正常細ia^長和分化而不干擾其他的生ffl:程(2)無不良組織鵬；(3)材料制作簡單，并能按不
同的^t和大小翻；(4)禾fiA體內后，材料可被^lf或吸收。由于角ma織沐身的微性，纟imil呈
角膜支架材料同時鵬具有一定的透明性和抗牽拉能力。迄今為腿沒有發現一種支架材料完全具備上
已有的組織a^呈角M^架材料如天然高w材料中的膠原、明膠等，生物相容i40，但者隋力學性 能欠佳、,過瞎缺點；Ai合成的高^ 材料如聚f強乙酸、聚乳^^乙麟，酸性,^/則
易堆積在局部，不利于細胞生長；生頓行生材料如"去上皮，羊膜或生物羊膜等，在體內P if^、決，也不
倉織股且織o:程角膜的需要。理想的支架材料一:i^ta織a^呈角膜的研究熱點，也是制約組織sif呈角膜
賺的并砂頁問題，故尋找一種逸想的支架材料是非常必要的。

發明內容
本發明的目的^f共一種JM胞結膜基質的制備方法，及其作為組纟尸o:禾呈角05:架材料i^于構建 組織a3呈角mi:戯內皮，以彌補現有組織o:禾魏M^架材料的不足。
本發明以動物(主要是屠宰場的豬)的球結膜或目脾中人的球結膜為材料， :#^只分數為0.2%戊
二醛溶蔽聯、術只分數為l%tritonX-100、質量柳分數為0.25%月鱖口 0.02%EDTA鵬胞、紫外線
消毒等過程制備ra胞結膜基質，并以自胞結膜基質為組織o:程角M^架材料i歸人角JRh皮或內皮
細胞，人角月EJ:戯內鄉胞^I魏胞結膜基質上形忠緊密雜的細胞單層，構建出組織vT^呈角MJ:皮 或內皮，并可^i力用于人角膜緣干細胞^2^膜內皮細胞功能失代^^角li^的治療。 本發明M胞結膜基質的制備方法
1. TO宰場的親賴羊鄉艮球，用PBS反復沖^^，剪去球周組織，再ITf^結膜，置^"妥布霉素 1000UM的PBS中浸泡30併中；若是TO目脾中人的球結膜，直接置^^妥布霉素1000U/ml的PBS 中浸泡30艦
2. ;^g凈臺內于光學^mM微鏡下將J^結膜的Tenon囊盡:M除干凈，并用PBS沖洗，浸泡 于#^只分數為0.2%戊二醛溶液中5^中，以進行交耳對，；3. 再用PBS沖冼，以去除殘留的戊二醛溶瓶
4. 然后對球結J^i4行MMfcS,在37'C恒SI港床掘^f只分數為1。/。的tritonX-100艦24小時， 然后在37'C， C02濃度為5%的:1§^|中，質量fl^只，為0.25%的^ 和0.02%的EDTA作用2小時， 用PBS震蕩沖洗10併中，MS凈臺內a^干燥，球結膜WE紫外消豁30^I中，艮時穀UMJJS^膜 基質。
本發明的M鵬膜基質作為組織a^呈角膜支架材料而細于構彰且織of魏ah頗內皮。 ,鵬膜基質作為組簡魏敝架材料的鵬方法-
1. 靴為組製魏殿架材料的W鵬膜基鵬鵬前用PBS沖洗，然后放于24子版中， 在無菌超凈臺內晾干，ffi^固貼在24孑Lfeb
2. 再榭乍為種子細胞的人角Rh^或內MB胞榮,胞懸液，使用含10%FBS的DMEM/F12培
!^種^j^貼有鵬鵬膜基質的24孔板中，3燕ii^，待形戯密雜的角ai^內M
胞單層，即構^HL織a^呈角MJ^內皮；
3. 驗teJ^i且織a^角Rh戯內皮分別移艇u角^^干細胞^^膜內卿胞功能失代償 本發明首次將i^ffl,膜基質作為一種實用的組mi程角^:架材料，其帝恪方法簡單，生辦目容
'附子，透明并具有一定的屈光力和一定的彈性和抗牽拉能九種子細胞容易4W鵬膜基質上生糊
增殖；i)tm性很低；^S慢，有利于種子細胞增殖和^SI力能在培f^i程中和移t軀始^f其 透明度；且球結11*源廣泛，具有廣闊的細開發前景。
本發明以動物(主要魏宰場的豬)的球結膜，或H脾中人的球結膜為原材料，制備出鵬鵬膜 基質，并以Mffi^膜基質作為組織Tl呈角Mi架材料，構建出可用于移植的組織vH呈角J^i:皮或內皮。 鵬鵬膜基質的制備方法
1. Wf宰場的辦羊鄉艮球，用PBS反復州5fe/g，剪去球周組織，再剪T^結膜，置于含妥布霉素 1000U/ml的PBS中浸泡30併中；
2. SS凈臺內于光學^E^微鏡下將J^結膜的Tenon囊盡 除干凈，并用PBS沖洗'放于 術只分數為0.2%戊二醛溶液中5併喊行交KW;
3. 再用PBS沖〗先，以去除殘留的戊二醛溶液；
4. 然后劉球結J^fi行raMtH，在37。C恒i^岳床iffl^f只微為l%tritonX-100作用24小時., 然后在37'C， C02濃度為5%的*|#箱中，質量ft!R分數為0.25°/。月繊口 0.02。/。EDTA作用2小時，用 PBS震蕩沖洗10規方MiS凈臺內鵬千燥，球結膜顧紫外消豁30恤得到鵬胞結膜翻。
本發明方馳可用屠宰場中其它動物的球結膜制備，方法同上。
若是鵬目脾中人的球結膜，在步驟1中直接置雅妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30併中，
其后步驟相同。
在AM織vEg角J^l:皮或內鵬用于臨i^前，做了媳的動物實驗，證明其完全^^應用于l臨床。Mm膜基質作為組織vifM^^:架材料構建出的Affl^a^M^ahM內^^于i1^，移植
到AH讓，具體頓施如下
(1) 鵬^3a^膜基劂柳前用PBS沖洗，然后放于24孑版中，在無菌超凈臺內晾干，ffiK^固貼 在24孑USJ:;
(2) S^^外i歸的人角RhjM內卿胞制鵬脫懸液，艦含10%FBS的DMEM/F12 接種在貼有M鵬膜基質的24孔板中，3^^ig#^， 7鄉忠緊密連接的角ah^內細m^層， 即構建出組織vll魏mi^內皮；
(3) fch^且織Ol魏RJb鵬內皮分別移豐鼓桷膜緣干細胞^2^膜內皮細胞功能失代償的人 目吐，結艦示AB鵬且會ra魏mhJ^內頗免翻訴鵬，組織vEf呈角ahi^內鵬移齢30 天仍未,，m角I^T細胞^^ft膜內Mii胞功能失代H^有顯著的fim。
為了保跟; 構建的AlilPa^呈角mi:iM內皮能^^的l頓，通常翻取其進fi^下檢測 細臺盼藍-歸紅鵬，結縣 鵬界清晰，與正常人角Rh^或內鵬胞的^^相同，
有極 驗SM胞結膜基質生長的人角ai:頗內飾胞有活性；
，細WfeS熒光方法能檢測至i認角mi:JSIffl胞的新己物K3/12或內^ffl胞的牛斜己物NSE， M^在
月細鵬膜基質生長的人角Rh皮或內鄉胞有功能。
鵬鵬膜基質可細以下;u中方鄉存
(1) 方燭含10r。FBS的DMEM7F12培鎌中，4。C密封保^^用；
(2) 直^^封于無菌塑料包裝袋中，常溫保存j頓前置矜10T。FBS的DMEM/F12JtM中浸 泡12小時以上備用；
G)置于純甘油中一20。C保存；4柳前用PBS反復沖洗后，再放于含10%FBS的DMEM/F12培養 液中浸泡12小時以上備用；
(4) 置于DMEM與純甘油^KR混合液中一2(TC保存i^fl^"法同(3)
(5) 置于FBS與純甘油^f只混合液中一20。C保存j挑前用PBS反復沖洗。 以下列多個實施例，詳細說明本發明。
鄉例l
以鄉艮球結膜為材料制備月細鵬膜基質
屠宰廠取回§ #豬眼球，用PBS反復沖洗后，剪去球周組織，再剪下球結膜，置矜妥布霉素
1000U/ml的PBS中浸泡30併巾；，凈臺內于光學^IES微鏡下將i^結膜的Tenon囊盡量剪除千 凈，并用PBS沖洗，放于fti口、分數為0.2。/o戊二醛溶液巾5粥+it行交駒跟；再用PBS沖洗，以去除 殘留的戊二醛溶液；然后對球結膜I行M胞處理，在37。C恒溫搖床J^I^只分數為l%tritonX-100作 用24小時.,然后在37°C ， CO2濃度為5°/。的±辯箱中，質量^^口、分數為0.25%月繊口 0.02%EDTA作用2 小時，用PBS震蕩沖洗10倂中，方jfffi0凈臺內SM千燥，球結膜麗紫外消豁30併中'得到鵬胞 結膜基質。方爐含10%PBS的DMEM/F12 itf^中，4"密封保#^用^1^魏封于無菌塑料^^^中， 在常溫下保存。鄉例2
以人的球結勵材料W,鵬膜驗
聊脾中人的球結膜，置^^妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30併中；S^凈臺內于^^^見 顯微鏡下將Jd^結膜的T畫囊盡翻除干凈'并用PBS沖洗，放于鵬分數為0.2%戊二醛溶液中5 ^H中進行交TO^再用PBS沖洗，以去除殘留的戊二醛溶液；然后對球結鵬行MMfcS,在37。C 恒溫搖床J^^i^只^m為l%titonX-100作用24小時.,然Jg在37。C， 濃度為5%的@^|中，質量體 積分數為0.25o/cJRRf口0.02。/。EDTA作用2小時，用PBS震蕩沖冼IO倂中， ^凈臺內3^千燥，球 結膜Mffi紫外消豁30併中，《躬IJM鵬膜基質。置預甘油中，在—20'C保存，體于DMEM與 純甘油^KR混合液中，在一20。C保存，驢于FBS與純甘油^^只混合液中，在一2(TC保存。 鄉例3
以MM^膜基質為雜/口a^呈角厳架材料構^M織a^ai^內皮
取出^M例i制備的作為組織a^魏E5:架材料的鵬^^膜基質，pbs沖^/g伸顧于24孑版中，
在無菌超凈臺內晾干，使雜固貼附于24孑L板的地面。將體外歸的兔角mi:喊內鄉胞消^^細 胞懸液，{頓含15%FBS的DMEM/F12 土"§#^接種于貼有 6^膜基質的24孑版中，3殘i"g^， 5天角^]:]^內自胞可在 胞結膜基質上形 密 的細胞單層，即構W^且織v0呈角mi: 皮或內皮。 鵷例4
以ME^膜基質為組mif呈角^:架材料構^Affl織a:程角ai:鵬內皮 取出實lfi例2制備的作為組織a:程角^:架材料的raa^膜基質，PBs沖船伸繊于24孑版中，
在無菌超凈臺內B京干，使僻固貼附于24孑版的地面。將體外i鎌的人角Rh皮或內鄉胞消化鵬細 胞懸液， <姚含10°/。FBS的DMEM/F12 i^t接種于貼有月胸胞結膜基質的24 版中，3 ^^i^M， 7天角 皮或內自胞可在 ^^膜基 形忠緊密連接的細胞單層，即構^UM織vT^角ai:
鄉例5
制作角月徵干細胞敗(如鵬先)的兔動辦難，取實施例3構建的勉織03魏 皮移翻 兔動物M目讓。結果顯示剣歐il組纟尸a:程角ai:皮無免翻訴反應，且移植后組織vX程角JU三皮25
天仍未降解，并能^4、角膨新tt管及角膜白斑的形成，證明其^r嫩。
鄉例6
制作角膜內皮細胞功能失代償(如撕除角月軀彈力層)的兔動jtM，取實施例3構建的勉且纟io:
程角膜內皮移l趕晚動4辦莫型眼t。結果顯，歐寸組織03呈角膜內皮無免翻訴反應，且移凈軀組織
Xg角膜內皮25天仍未降解，并微灰復角膜的透明14M免角膜大泡的形成，其療5劃子。 實施例7
取鄉例4構建的旭虹程角數皮移翻患有角膜緣干細胞阪的Aflai:。結^M示細寸組 虹程角fc皮無免翻訴鵬，且移職且虹程角IIi:皮30天仍未糊牟，并能齡角職她管及 角膜白斑的形成，其療效好。魏例8
取^s例4構建的Aia織a^魏膜內皮移豐鼓隨有角膜內^igmr力能失代償的As吐。結魏示人 目g)啦且織aB角膜內^fe^訴反應，且移s/g組織o:程角膜內皮3o天仍未降解，并能咴魏膜的透 明14M免角馱泡的形成，其,子。
例9
律怖角Ri:皮斷員(如lflM刮除)的^t^M，分別將^M例2制備的M胞結膜基質和已有的
組織a^M^材料"去上皮，羊鵬鄉植拽動辦翻目吐。結殿示，雖然娜纖鵬質和
"去嫂'羊膜均無免翻訴鵬，但'去嫂，羊^&移蹄10天,，而MMg膜S^移f軀25 天仍未,。
制作角膜緣干細胞敗(如 1方)的兔動槲翻，將以"去上皮，羊膜為組織o:禾魏JlS^材料構
建的爐虹程角恥皮移挺晚動榭趣社，觀察其療效。結*^，雖然剣,會)m呈角JEi:
^Efe^訴鵬，但'去嫂'羊^s移f軀io天,，而不倉離i鵬桷膨新tt管和角膜白a^成
的作用。
鄉例ll
制作角膜內鵬胞功能失代償(如 角11^彈力層)的兔^tf題，將以"去J^'羊，纟1IRX
程角膜支架材料構建的^^形iin魏膜內皮移植到兔動tra目吐，觀察其^st結m^，雖然剣艮
對組織o:程角膜內皮無免翻訴ffi，但'去上皮，羊驗移卞軀io天,軍，麻會鵬,魏膜的透明
性和抑制角膜力包形成的作用。
權利要求
1、脫細胞結膜基質的制備方法(1)取屠宰場的新鮮豬眼球，用PBS反復沖洗后，剪去球周組織，再剪下球結膜；或眼庫中人的球結膜，置于含妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30分鐘；(2)在超凈臺內于光學體視顯微鏡下將上述球結膜的Tenon囊盡量剪除干凈，并用PBS沖洗，放于體積分數為0.2％戊二醛溶液中5分鐘以進行交聯保護；(3)再用PBS沖洗，以去除殘留的戊二醛溶液；(4)然后對球結膜進行脫細胞處理，在37℃恒溫搖床上用體積分數為1％tritonX-100作用24小時，在37℃，co2濃度為5％的培養箱中，質量體積分數為0.25％胰酶和0.02％EDTA作用2小時，用PBS震蕩沖洗10分鐘，放在超凈臺內通風干燥，兩面紫外消毒各30分鐘，得到脫細胞結膜基質。
2、 脫細胞結膜基質作為組織工程角膜支架材料應用于構建組織工程 角膜上皮或內皮。
3、 脫細胞結膜基質作為組織工程角膜支架材料的應用方法-(1) 將作為組織工程角膜支架材料的脫細胞結膜基質在使用前用PBS 沖洗，然后放于24孔板中，在無菌超凈臺內晾干，使其牢固貼在24孔板 上；(2) 再將體外培養的人角膜上皮或內皮細胞制成細胞懸液，使用含 10%FBS的DMEM/F12培養液接種在上述貼有脫細胞結膜基質的24孔板 中，3天換培養液，7天形成緊密連接的角膜上皮或內皮細胞單層，即構建 成組織工程角膜上皮或內皮；(3) 最后把上述組織工程角膜上皮或內皮分別移植到角膜緣干細胞缺乏或角膜內皮細胞功能失代償的人眼上。
4、 制備好的脫細胞結膜基質的保存方法(1) 放在含10%FBS的DMEM/F12培養液中，在4。C密封保存；或(2) 直接密封于無菌塑料包裝袋中，在常溫下保存；或(3) 置于純甘油中，在一20。C保存；或(4) 置于DMEM與純甘油等體積混合液中，在一2(TC保存；或(5) 置于FBS與純甘油等體積混合液中，在一2(TC保存。
全文摘要
本發明涉及一種作為組織工程角膜支架材料的脫細胞結膜基質的制備方法和應用。本發明首次將球結膜中的細胞成份除去，制備出脫細胞結膜基質，并以其作為組織工程角膜支架，兔角膜上皮或內皮細胞可在支架上形成良好的細胞單層，構建出組織工程角膜上皮或內皮，并成功移植于兔動物模型眼上。本發明所構建的組織工程角膜降解時間較長，兔眼對其無明顯免疫排斥反應，且對角膜緣干細胞缺乏或角膜內皮細胞功能失代償的治療效果均顯著。本發明制備方法簡單；生物相容性好；抗原性很低；種子細胞容易在其上生長和增殖；降解較慢；在培養過程中和移植后始終保持其透明度；且球結膜來源廣泛，具有廣闊的應用開發前景。
文檔編號A61L27/00GK101590292SQ20091001634
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月11日 優先權日2009年6月11日
發明者史偉云, 周慶軍, 楊玲玲, 趙海峰, 彥 高, 高美麗 申請人:山東省眼科研究所