苦碟子注射液制備工藝及在心腦血管疾病治療中的應用的制作方法

專利名稱：：苦碟子注射液制備工藝及在心腦血管疾病治療中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的中藥的提取工藝及其在藥學上的應用，具體是提供一種苦碟子注射的生產方法和應用，屬于中藥
技術領域：
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背景技術：
：抱莖苦荬菜，俗稱苦碟子、滿天星等，為菊科苦荬菜屬抱莖苦荬菜[Ixerissonchifolia(Bge)Hance]的兩年生干燥地上部分，主產于我國東北、華北等地。《衛生部藥品標準內蒙古分冊》記載，抱莖苦荬菜味苦、辛，銳、涼，具開胃，解毒，接骨，去痞作用，用于不思飲食，解毒，骨折，牙痛。民間主要用于治療闌尾炎、扁桃體炎、無名腫痛等癥。對苦碟子藥材及制劑的研究近幾年有了很大的發展，據文獻報道抱莖苦荬菜含有黃酮、腺苷、內酯等化學成分。藥理研究表明黃酮類成分是其中的主要活性成分類別之一，化學研究表明抱莖苦荬菜黃酮類成分以木犀草素一7-0-(3-D一葡萄糖醛酸苷、木犀草素7-0-(3-D葡萄糖苷、開菜素7-0-(3-D葡萄糖醛酸苷、芹菜素7_0-p-D葡萄糖苷以及其他數種黃酮類成分含量較高。目前研究苦碟子有效成分的方法可歸納為以下幾種1、先用水或醇提取，將回收溶劑后的提取物混懸于水中，分別用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取，劃分成幾個提取部分。再用硅膠柱或高效液相半制備柱層析、分離成單組分物質。上述方法是試驗室研究單一黃酮成分的常用分析方法，不適合醫藥工業化生產抱莖苦荬菜總黃酮提取物。2、申請號200510082836.1的發明專利"木犀草素-7-0-P-D吡喃葡萄糖醛酸苷及其提取方法和用途"，公開了從抱莖苦荬菜藥材中提取分離木犀草素-7-0-P-D吡喃葡萄糖醛酸苷的一種方法，先后采用鈣-硫法得到粗黃酮提取物，再經過硅膠柱層析法和HPLC分離制備，得黃色無定型粉末。該制備方法僅僅適合實驗室分析型工藝，獲得的產品數量為毫微克級，且操作復雜，產品收率低，成本大，不適合工業化生產。3、申請號200610072744.X的發明專利申請"苦碟子總黃酮及其制備方法和含它的凍干粉針與質量控制方法"。.公開了苦碟子提取物的制備方法，采用反復醇液調酸調堿處理法，由于黃酮類化合物在堿性溶液中不穩定，易發生氧化和開環反應，且苦碟子中的大量弱酸性黃酮類化合物在酸性溶液中不易析出，致使收率低，大量活性成分流失。同時，該專利雖然提供了提取物木犀草素7-O-p-D一葡萄糖醛酸苷含量僅為8%左右，這一含量既未達到靜脈注射用二類原料藥的標準，即80%以上。4、申請號200410078168.0的發明專利"一種含有抱莖苦荬菜提取物的制劑及其制備方法"，公開了一種含總黃酮成分不少于80，其中黃酮木犀草素7—0一葡萄糖醛酸不少于24，腺苷不少于O.18的抱莖苦荬菜提取物及制劑，采用的是提取液加絮凝劑或直接進行柱層析，一方面絮凝工藝操作復雜，產品收率低，且易帶入非藥物性雜質，另一方面，簡單的水或醇處理的提取液進行柱層析，雜質含量多，影響分離效果，致使生產負荷大，而且成品含量低。
發明內容本發明的目的是提供一種苦碟子注射液的制備方法。本發明的另一個目的是提供該注射液，用于治療冠心病、心絞痛和腦梗塞的用途。雖然許多文獻報道抱莖苦荬菜用于治療心腦血管疾病的主要化學成分為腺苷和總黃酮類化合物，但是發明人經過提取分離和注射液制劑學實驗證明，抱莖苦荬菜主要用于治療心腦血管疾病的有效部位群為抱莖苦荬菜中總酚酸類化合物，簡稱苦碟子總酚酸，其注射液的穩定性和成品率明顯優于石-硫法工藝產品。藥理試驗和臨床觀察研究結果表明，用苦碟子總酚酸提取物制成的苦碟子注射液(簡稱苦碟子A)與石-硫法工藝制成的苦碟子注射液(簡稱苦碟子B)比較，差異非常顯著，P<0.001。采用的技術方案是一、本發明的苦蝶子注射液的制備方法，包括下述工藝步驟1、切碾制將干燥堅實的抱莖苦荬菜藥材切碾成薄片狀段；2、堿性水提取二次用堿性純化水提取二次，過濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮至0.52.0ml/g藥材；3、冷藏靜置在0—1(TC溫度下冷藏，靜置412小時，分取上清液；4、低溫堿性梯度醇沉低溫堿性梯度醇沉二次，收集上清液，減壓回收乙醇；5、堿性吸附除雜質吸附，過濾，除雜質。6、低溫梯度凍融兩次，-2010°C，低溫濾過；7、酸性條件下煮碳和高溫加熱絮凝110121°C，加熱2060min，即得苦碟子總酚酸提取物。8、將上述制得的苦碟子總酚酸提取物低溫高速離心，得苦碟子離心液，將制得的苦碟子離心液用雙層巻式復合膜過濾系統過濾，濾液用注射用水稀釋至規定量，灌裝，在ll(TC12rC溫度下滅菌1060min，即得苦碟子注射液。上述的堿水提取二次所用的堿為NaHC03，Na2C03,NaOH，NH3OH中的至少一種。上述的低溫堿性梯度醇沉二次是指第一次堿性醇濃度為65%75%，PH值為78;第二次堿性醇濃度75%80%，低溫是指-10l(TC，堿性醇是指乙醇中含NaHCC)3，Na2C03，NaOH，NH3OH中的一種或幾種組合物。上述堿性吸附除雜質中的堿性是指含NaOH的pH值為7.08.0的水溶液，吸附是用顆粒狀大孔樹脂和聚酰胺吸附材料吸附。上述的低溫凍融主要是指-20-5"C冷凍，靜置12小時以上，01(TC融化和過濾。上述的步驟(7)所述的酸性是指含HC1的水溶液。上述的雙層巻式復合膜是指雙層是分子量或型號相同的2層膜材料疊加而成，復合是2組疊加的膜材料構成的過濾膜組件，膜是指纖維素聚砜膜，分子量為1萬和8萬的膜材料。本發明可獲得高純度苦碟子總酚酸提取物，屬于抱莖苦荬菜中新的有效部位群，其中酚酸性黃酮類化合物占總固體量的20%，主要以黃酮的葡萄糖醛酸苷為主，其他酚酸性化合物占總固體量的60%以上，兩者總含量超過總固體量的80%以上，質量穩定，療效確切，安全可控，符合制備中藥注射劑的要求。藥效學和臨床試驗結果表明，苦碟子總酚酸類成分制成的苦碟子注射液有明顯的治療冠心病、心絞痛和腦梗塞的藥理作用。具體實施例方式苦蝶子注射液的制備方法，包括下述步驟1、藥材切碾制將抱莖苦荬菜切碾制成1.010.0cm的片狀段；2、堿性水提取用的堿調節PH值為7.09.0，所加堿性純化水的量為藥材量的1030倍，提取2次，提取溫度70100。C，每次為2040分鐘。提取液濃縮至每lml相當于含生藥0.52.0g的浸膏；3、冷藏靜置上述浸膏，于010。C靜置412小時，濾取上清液；4、低溫堿性梯度醇沉二次醇濃度分別為65%和75%，pH值為78，溫度-1010。C，靜置812小時，濾過，濾液減壓回收乙醇，趁冷過濾；5、堿性吸附除雜質將醇沉后的濾液，用堿調節pH值至78，加入堿性乙醇處理過的大孔樹脂或者聚酰胺，用量為藥液的1%10%，攪拌20-30min，靜置，過濾；6、低溫梯度凍融二次取吸附除雜質后濾液，-20"靜置12小時以上，融化后澄清板濾過，濾液于-l(TC靜置48小時以上，01(TC融化后濾過；7、酸性條件下煮碳和高溫加熱絮凝二次凍融后藥液用鹽酸調節pH值至4.06.0，煮碳，脫碳，于ll(TC12rC，加熱2060min，即得苦碟子總酚酸提取物；8、將制備的苦碟子總酚酸提取物進行低溫高速離心取苦碟子總酚酸提取物，于-1010。C，500015000r/min，離心1030min，分取離心液；將離心液用雙層巻式復合膜過濾系統過濾，濾液調節pH值至中性，灌封。灌封后，優選ll(TC(60min)，115°CGOmin)，116。C(25min)，120。C(10min))中的一種進行高溫滅菌，確保F。》8.0，即得苦碟子注射液。本發明的百分比濃度為質量百分比濃度。本發明的苦碟子注射液的制備方法及其應用其優點在于(1)傳統抱莖苦荬菜提取及苦碟子注射液生產為石-硫法取抱莖苦荬菜，加水煎煮，濃縮，加氧化鈣乳調節pH值至10，離心，沉淀物懸浮于乙醇中，加硫酸溶液調節pH值至34，離心，離心液加40。/。氫氧化鈉溶液中和pH值至7.0，濾過，濾液回收乙醇，置-5-C以下放置，濾過，濾液置-5"C以下放置，濾過，稀釋，用微孔濾膜濾過，灌封，在105-C滅菌45分鐘，即得。(2)新的抱莖苦荬菜提取及苦碟子注射液生產工藝包括藥材切碾制，堿性水提取二次，濃縮，冷藏，低溫堿性梯度醇沉，堿性吸附除雜質，低溫梯度凍融，酸性條件下煮碳和高溫加熱絮凝，低溫高速離心，雙層巻式復合膜過濾系統過濾，稀釋，灌封，高溫滅菌。改進后的方法與傳統方法相比較1、中間體中苦碟子酚酸性成分研究取同一批抱莖苦荬菜藥材，切碾成段，混勻，測定藥材的阿魏酸、蒲公英素-B和總酚酸的含量，再分成12等份，每份500g，分別按石-硫法(簡稱苦碟子B法)和苦碟子總酚酸制備方法(簡稱苦碟子A法)方法工藝操作，制成中間體，濾過，濾液進行含量測定，結果見表l-l。表1-1不同工藝提取物的含測結果工藝阿魏酸(mg/ml)蒲公英素-B(mg/ml)總酚酸(mg/ml)苦碟子B法苦碟子A法提高倍數(倍)1.55.72.81.47.64.47.334.43,72、中間體質量檢査分別取兩種工藝制備的苦碟子注射液中間體，加注射用水稀釋至相同濃度，相當于lml/g藥材，分別按照中國藥典2005年版一部附錄中藥注射劑要求檢測，結果見表2.表2-l不同工藝中間體的檢測結果工藝鈣鹽硫酸鹽鞣質蛋白質樹脂熾灼殘渣(％)石-硫法不合格合格不合格合格合格3.8g/ml總酚酸法合格合格合格合格合格1.1g/ml3、苦碟子注射液成品質量檢測取同一批抱莖苦荬菜藥材，分別按照石-硫法和總酚酸法工藝操作，經提取，精制，稀釋，灌封和滅菌，制成苦碟子注射液成品，按照中國藥典2005年版一部附錄中藥注射劑要求檢測，結果見表3-l。表3-1不同工藝成品的檢測結果(3批統計結果)工藝燈檢溶血與凝聚異常毒性過敏試驗熾灼殘渣合格率(％)合格率(％)合格率(％)合格率(％)(%)石-硫法75.81001001003.2mg/10ml總酚酸法96,41001001000.8mg/10ml4、藥理及臨床對比試驗本制劑與類似藥物在功效上有以下不同點:(1)犬心肌缺血試驗研究主要藥效學試驗是比較總酚酸法苦碟子注射液與石-硫法苦碟子注射液產品在治療冠心病、心絞痛和腦梗塞的作用，為深入研究抱莖苦荬菜的活性部位群總酚酸和藥理作用，臨床用藥提供實驗依據，為苦碟子注射液工藝創新，為持續提高苦碟子注射液的有效性和安全性提供實驗依據。見表4-l-l4-l-2。(2)犬心臟血流動力試驗研究觀察苦碟子總酚酸靜脈滴注給藥后對麻醉犬心臟血流動力學的作用。見表4-2-l4-2陽4)。8(3)對麻醉犬腦血流量的影響見表4-3-1。(4)臨床試驗采用隨機雙盲法分組、分階段對照，進行臨床觀察，結果見表4-4-14-4-3。[實驗例1犬心肌缺血試驗實驗目的通過主要藥效學試驗，比較總酚酸法和石-硫法生產的苦碟子注射液的藥理作用，苦碟子注射液工藝研究提供實驗依據。1、實驗材料1.1藥品與試劑總酚酸法苦碟子注射液(簡稱苦碟子A)為淺黃棕色液體，規格為10ml/支，靜脈滴注，生藥含量為lg/ml，成人日用量為20ml/60kg，批號:080712。臨用前用0.9%的氯化鈉注射液配成所需濃度。石-硫法苦碟子注射液(簡稱苦碟子B)為黃棕色液體，規格為10ml/支，靜脈滴注，生藥含量為lg/ml，成人日用量為2040ml/60kg，批號:080518。臨用前用0.9%的氯化鈉注射液配成所需濃度。1.2動物試驗用犬25只，由沈陽藥科大學試驗動物中心提供，體重7.5-10.0kg，雌雄兼用。1.3儀器SLY-808智能化八道生理記錄儀上海科科醫學模型有限公司752型紫外可見分光光度計，上海分析儀器廠2、實驗方法與結果對麻醉犬冠脈結扎所致心肌梗塞的影響取試驗用犬25只，$3兼用，體重7.5-10kg。隨機均分為五組。(l)偽手術組:生理鹽水1.0ml/kg;(2)模型組:生理鹽水1.0ml/kg;(3)石硫法組:苦碟子注射液1.0ml/kg;(4)總酚酸法組小劑量組:0.5ml/kg;(5)苦碟子總酚酸大劑量組:1.0ml/kg。由前肢隱小靜脈用3%戊巴比妥鈉lml/kg麻醉后，固定于手術臺上。于左側第四、五肋間開胸，暴露心臟，并接人工呼吸機。分離右側股動脈、股靜脈，股動脈插管測量動脈壓(BP)和心率(HR)，股靜脈插管以備靜脈滴注藥物.打開心包膜，縫于胸壁，做成荷包搖籃。用0號絲線結扎左冠狀動脈前降支上中1/3處，偽手術組只穿線不結扎。選擇梗塞區附近位置10個標測點縫置心外膜電圖電極，并在遠離梗塞區選一對照點，用八道生理記錄儀胸導聯標測心外膜電圖(EECG)。結扎15min后給藥。記錄缺血前、缺血15min和給藥后15、30、60、120、180min的EECG、血壓(SAP、DAP、MAP)、心率(HR)。統計各標測點EECG的ST段偏移S-ST，以及ST段抬高^2mv以上的N-ST。各組給藥180min后，股靜脈取血，測定血清CPK、LDH、MDA、SOD值。取血后立即取出心臟，用生理鹽水洗去血液后，稱取心室重量，并把心室橫切成5片，置于37°C0.25%NBT溶液中染色15min，剪去各心肌片被染色的非梗塞區，把未染色的梗塞區心肌稱重，除以全心重或心室重分別得到梗塞范圍占全心重或占心室重的％。結果見表4-1-1一表4-1-2。表4-1-1對麻醉犬冠脈結扎所致心肌梗塞CPK、LDH、MDA、SOD的影響(x±s)組別劑量(ml/kg)CPK(U/L)LDH(U/L)MDA(腿ol/L)SOD(nU/L)偽手術組-1051.8±173.7353.0±77.01.40±0.51167.0±16.5模型組-2744.1±554.3##764.8±56.0糾4,44±0.54##131.4±15.4#苦碟子B1.02042.5±313.3，628.8±92.8*##1.86±0.30**146.6±11.5苦碟子A0.51852.6±238.8，617.6土100.0，1.48±0.52**154.0土12.4*苦碟子A1.01320.7±261.0"##416.8士88.4"1.44±0.66**161.6±16.5*注n=5，Student-t檢驗;各組與模型組相比*p<0.05，**p<0.01;各組與偽手術組相比#p<0.05，##p<0.01。表4-1-2苦碟子總酚酸對麻醉犬冠脈結扎所致心肌梗塞范圍的形響(X士S)組別劑量(ml/kg)心臟重(g)心室重(g)梗塞心肌重(g)梗塞區/心臟(％)梗塞區/心室(％)偽手術組-95.2±4.459.3±5.7000模型組-93.6±5.060.3±4.88.76±2.4##9.3±2.1##14.4±2.9##苦碟子B1.090.9±5.857.5±4.46.2±1.5##6.7±1丫##10.7士1.7'##苦碟子A0.595.8±6.461.1±4.95.2±1.1##5.4±0.9，8.5±1.4，苦碟子A1.097.9±3.862.2±4.53.5±1.2##3.6±1.3，5.7士2.2，注n=5，Student-t檢驗，各組與模型組相比，p0.05，**p<0.01;各組與偽手術組相比#p<0.05,##p<0.01。3、實驗結果表明苦碟子A二個劑量組及苦碟子B組靜脈給藥均明顯減輕心肌缺血程度；能減少血清中CPK、LDH、MDA釋放，增強SOD活性，與模型組比較差異顯著(P0.05、0.01);并能縮小心肌梗塞范圍(P匄.05、0.01)，減慢因缺血而致的心率加快(P0.05、0.01)。提示苦碟子A對冠脈結扎所致狗心肌缺血有明顯的改善作用，且作用優于苦碟子B。試驗例2]犬心臟血流動力學研究實驗目的觀察苦碟子總酚酸靜脈滴注給藥后對麻醉犬心臟血流動力學的作用。1實驗材料l.l苦碟子A:含生藥材lg/ml，pH=6.55;苦碟子B:含生藥材lg/ml，pH=7.10;1.2雜種家犬健康，共20只，3$兼有，體重610kg，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供。1.30.9%氯化鈉注射液250ml/瓶，批號080416。沈陽志鷹制藥廠生產；SLY-808智能化八道生理記錄儀上海科科醫學模型有限公司1.6MFV—3200型電磁血流量計，日本光電公司生產。2實驗方法取健康雜種家犬20只，隨機分為4組，每組5只，($兼有，分別為生理鹽水(NS)對照組、苦碟子B對照組及苦碟子總酚酸大、小劑量組。犬稱重后，腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg進行麻醉，并仰位固定于犬手術臺上。剪去頸、胸部及右后肢內側的毛，并用碘酒和75%酒精消毒剪毛區。切開頸部皮膚，分離氣管，進行氣管插管，并接動物人工呼吸機。分離頸總動脈，并插入動脈插管，用充滿含肝素鈉25u/ml生理鹽水(NS)的導管液導接通TP—400T型壓力換能器，由AP—641G型血壓放大器記錄血壓(收縮壓SAP、舒張壓DAP、平均動脈壓MAP)，定標靈敏度為13.33kPa(100mmHg汞柱)/cm。分離右側股靜脈，以備輸液和給藥。在左側第四肋間橫向切開皮膚，分離肋間肌。用開胸器撐開胸腔切口，暴露心臟，切開心包膜，做心包搖籃。開動人工呼吸機(20-25次/min)，分離于升主動脈根部，放置適宜直徑的電磁血流量計的探頭，由電磁血流量計記錄心輸出量(CO)。左心室心尖部插入導管至左心室腔內測量心室內壓(換能器為TP—400型，放犬器為AP—601型)，定標靈敏度為13.33kPa/cm。并將信號輸入AD—601G型放大器放大后記錄左心室舒張末期壓(LVEDP)，輸入即一601G型微分器記錄左心室內壓最大上升速率。于冠脈第一、第二分支間分離冠狀動脈，放置適宜探頭測量冠脈流量(CAF)，并于犬四肢皮下插入針狀電極，記錄II導聯心電圖，測量心率(HR)。上述測量信號均輸入RM-6000型八道生理記錄儀記錄、描記，同時將心輸出量、心電、血壓及心室內壓的電信號同步輸入微機的生物醫學生理信號處理系統進行記錄、處理，并由微機處理后讀出心室內壓峰值(LVSP)、舒張末期壓(LVEDP)、心室內壓最大上升速率及一個周期心室內壓曲線下積分的面積。最后，按文獻[1]的公式和方法計算心臟指數(CI)、每搏輸出量(SV)、心搏指數(SI)、左室作功指數(LVWI)、血管總外周阻力(TPVR)及反應心臟耗氧情況的TTI等參數。手術完成后穩定20min左右，待所記錄的各指標穩定后，記錄上述指標作為給藥前的正常值，然后于股靜脈滴注給藥，大劑量組的劑量為3g生藥/Kg，中劑量組為2g生藥/Kg,小劑量組為lg生藥/Kg，均將藥物混入100ml的NS輸液中，約在15min內滴完。空白對照組僅滴入100ml的NS輸液陽性藥組給予葛根素注射液50mg/Kg，給藥方法同苦碟子給藥組。記錄并計算給藥后5、10、20、30、60、120、180min的上述各血流動力學指標，結果進行給藥前、后的配對t一檢驗統計學處理。3.實驗結果(詳見表4-2-l4-2-4)表4-2-1空白對照組犬的心臟血流動力學指標變化情況(X士Sn=5)指標給藥前給藥后(min)510203060120180SAP(kpa)14.0±0.8514.45±0.6714.37±0.6214.69±0.5414.64±0.7214.93±0.7514.40±0.41]3.33±2.02DAP(kpa)8,67±1.228.61±1.118.45±1.349.07±1.299.33±1.519.33±1.568.29±1.286.93±1.21MAP(kpa)10.44±1.0010.56±0.7410.43±0.9810.94±0.8811.10±1.1711.20±1.1910.33±0.S49.07±1.25CO(L/min)0.89±0.210.88±0.230.86±0.180.8S±0.240.89±0.230.85±0.150.72±0.060.67土0.1C)HR(beats/min)181.6±37.2185.6±25.9194.4±3.43*199.8±33.6"199.0土34.5"2。7.3±27.3**208.4土34.9'"209.8±41.9*LVSP(kpa)21.65±3.8622.22±3.4621.79±3.2221.01±3.5520.94±3.6721.86±4.1420.07士2.7S18.98±2.06LVEDP(kpa)0.56±0.380.47±0.370.62±0.390.60爆60.81±0.780.82±0.680.50±0.340.41±0.27+dp/dtmax(kpa)613,3±195.3600.4±179.4584.1±172.0572.6±214.0577.7±1狄1596.9±158.1550.4±160.2442.5±141.1*CI(L/min/m2)2.12±0.672.11±0.712.06±0.602.11±0.742.11±0.732.02±0.511,69±0.161.57±0.20SV(10-3L/beat)4.93±0.854.76±0.714.47±0.734.41±0.784.41±0.734.09±0.503.54±0.80*3.33±1.04SI(10—3L/beat/m211.57±2.2611.3±2.1010.60±2.0010.47±2.3710.49±2.259.70±1.578.29±1.56*7.77±2.12*TPVR(kpa's/L)729.7±140.1742.3±125.0744.3±134.3778肚169.1794.2±198.4813.8±168.9874.2±126.5827.0±138.1LVWI(kg.M/m2)0.20±0.120.30±0.130.20±0.100.31±0.120.32±0.120.31±0.090.23±0.020.19±0.04TTl(kpa'beats)7.49±1.937.65±1.917.86±2.708.07±1.718.06±1.688.04±1.337.20±1.287.調.96CAF(10-3L/min)42肚8.142.4±11.641.6±9.838.8±11.841.2±6.438.4±6.938.0±3.535.0±7.8注與給藥前比較.女:P0.05。表4-2-2苦碟子B組犬的心臟血流動力學指標變化情況(X士Sn=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注與給藥前比較。*:PO.05表4-2-3苦碟子A組(0.5ml/kg)犬的臟血流動力學指標變化情況(X士Sn=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>SV(xl。-'L/b)3.54±0.944.00±0.933.80±0.883.67±0.783.47±0.813.25±0.783.06±0.922.91±0.87SI(xlO-3L/b)8.27±2.809.35±0.898.87±2.728.56±2.468.07±2.437.59±2.377.14±2.616.79±2.48rPVR(kpa's/L)042±185.2979.5±174.41007±156.6977.8±136.3977.8±56.31093±92.51174±118.71105±281.8LVWI(kg.M/)0.25±0.010.31±0.22*'0息0.03'0.26±.030.24±0.040.25±0.040.24i0.070.21±0.09TTI(kpa-b)9.56±2.4210息1.859.99±1.<529.67±2.028.61±2.158.59±2.468.54±1.788.98±1.43二AF(xl。-3L/m)31.6±4.245.0±5.8'49.4±12.9'49.2±13.5*45.肚7.9'43.8士5.3"'40.0±5.6"38.2±13.2注與給藥前比較，*:P<0.05，**:P<0.01。***:P<0.001。表4-2-4苦碟子A組(l.Oml/kg)犬的心臟血流動力學指標變化情況(X士Sn=5)指標給藥前給藥后時間(min;)510203060120180SAP(kpa)15.84±1.2517.12±2.2317.38±2.2715.97±1.7615.45±1.3216.16±1.7415.97±2.6415.65±3.17DAP(kpa)11.15±1.0910.83±1.8311.12±1.7610.11±2.2610.51±1.9910.35±1.17歸5±1.658.67±3.52MAP(kpa)12.70±1.0512.92±1.紀13.20±1.7812.06±2.0412.49±1.7512.28±1.3012.03±1.9311.00±3.14CO(L/min)0.65±0.060.73士0,11'0.74±0.11'0.70±0.07"0.70士0.04'0.67±0.030.67±0.030.63±0.03HR(beats/min)188.2±24.9187.4±29.6190.4±29.1189.4±29.2192.4±27響7196.2±27.5195.6±28.3200.2±21.8LVSP(kpa)23.53±3.4525.13±6.3025.05±6.5623.51±5.8122.79±5.3022.78±5.1422.96±4.2522.14±5.01LVEDP(kpa)0.46±0,)50.45±0.130.51±0.080.41±0.110.47±0.120.3S±0.160.32±0-150.44±0.20+dp/dtmax(kps)819.5±187.7709.5±342.9749.2±325.2705.8±317.7698.4±282.8661.0±293.8612.6±177.9636.5±161.0CI(L/min/m2)1.56±0.211.75±0.19'1.78±0.24'1.70±0.22*'1.69±0.22"1.63±0.221.62±0.251.52±0.18SV(10-3L/beat)3.48±0.543.93士0.50"3.92±0.56"'3.77±0.50"3.67±0.473.48±0.483.46±0.493.15±0.34SI(I(T3L/beat/m28.51±2.079.57±1.929.56±2.169.22±2.178.99±2.158.52±2.128.46±2.067.68±1.52TPVR(kpa.s/L)1183±99.11065±80.3'"1077土89.7"'讓±92.2'1073±102.4099±126.2ios肚m.i1055±295.1LVWI(kg德min0.27±0.040.31±0.070.32±0.070.28±0.070.29±0.060.27±0.030.26±0.07'0.22±0.07TTI(kpa.beats)7.61±1.788.27±2.948.63±2.268.11±2.927.88±2.017.73±1.607.03±2.126.54±2.50CAF(10-3L/min)28.4±7.536.0±4.1.39.0i5.5"'38.4±5.9'"35.0±6.6'32.8±5.131.2±6.330.2±5.3注與給藥前比較，氣:P<0.05，"sPO.Ol，,P<0.001.由表4-2-1可知，對照組麻醉犬手術后10min即引起持續性心率增加(與滴注NS前比較，PO.050.001);心臟每搏輸出量、心搏指數和心室內壓最大上升速率隨時間呈下降趨勢，在23h時則有明顯下降(PO.05)其余的血流動力學指標則無顯著性改變。14由表4-2-2表4-2-4可知，苦碟子A靜脈滴注給藥后，麻醉犬的心率無顯著性增加(與給藥前比較，P>0.05)，表明苦碟子A可抑制因手術引起的犬心率增加，且給藥后5min，即引起麻醉犬的CAF明顯增加，并呈一定的劑量依賴性，大劑量組在給藥后120min內均有明顯增加(P0.050.001)，3h時亦有增高，但無統計學差異。中劑量組在30min內CAF顯著升高(P〈0.050.001)，而苦碟子B組的作用僅維持了約20min。大、中劑量組給藥后有短時間的心輸出量明顯增加(P〈0.050.01)，作用僅維持了1060min。另夕卜，大劑量組的LVSP、CI和LTWI在給藥后10min內明顯升高(PO.050.01);中劑量組的CI、SV在給藥后的2030min內明顯增高，TPVR則有明顯的下降(P0.050.001)。苦碟子B靜脈滴注給藥后，lh內麻醉犬的CAF顯著上升(P0.050.001),CO、LVSP、土dp/dtmax、LVWI在給藥后1020min內也有明顯上升(P0.05)，但犬的心率有增加，在給藥后12h時有顯著增加(P0.05)。綜上所述證明，苦碟子A給藥后能抑制麻醉犬手術后心率增快，顯著增加冠脈流量和心輸出量，心臟指數、每搏心輸出量和左室作功指數也有明顯增加，而血管外周阻力則明顯下降，表明能擴張外周血管，增強心功能。這樣，能調整缺血心肌的供一需平衡，使心臟血流供應得到改善，有利于保護缺血心肌，減輕心臟缺血癥狀，且其作用優于苦碟子B。xlOOX。統計學處理所有數據以均數士標準差(X士S)表示，采用t檢驗處理數據。表4-3-1對麻醉犬腦血流量的影響(X士Sn=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與溶媒對照組比較，*:PO.05,**:PO.Ol，PO.001;與苦碟子注射液B組比較，#p<0.05，弁弁pO.Ol，弁弁弁pO.OOl.表4-3-l結果顯示，在給藥后30—180min時，苦碟子注射液A(1.0ml/kg)和苦碟子注射液B組犬腦血流量與溶媒對照組相比，有顯著性差異；腦血流量在給藥后3H80min與溶媒對照組相比有顯著性差異，PO.Ol或PO.OOl。苦碟子A組與苦碟子B組比較，差異非常顯著，P<0.001，即苦碟子A組能明顯增加麻醉犬腦血流量，且明顯優于苦碟子B。試驗例4雙盲雙模擬臨床療效試驗我們在2008年912月期間，采用隨機雙盲法分組、分階段對照，進行臨床觀察，現總結如下。1、病例選擇與分組l.l病例選擇男性40歲以上，女性45歲以上，65歲以下，符合以下條件之一而疼痛發作每周至少3次以上者。1.2分組將選擇的112例，隨機分為甲、乙兩組，進行雙盲法治療。揭盲后，對苦碟子A和苦碟子B心絞痛病情程度進行了比較。兩組心絞痛類型與輕重分級見表4-4-1。表明其心絞痛程度大致相同，有可比性。2、納入病歷標準2.1心絞痛典型，平時或疼痛發作時心電圖呈心肌缺血改變或運動試驗陽性者。2.2心絞痛癥狀雖不典型，但心電圖診斷明確者。3、治療與觀察方法3.1兩組患者均經門診或住院觀察，并詳細填寫觀察病歷。_表4-4-1心絞痛類型與輕重分級(例)_例輕度_中度_重度數苦碟子A苦碟子B苦碟子A苦碟子B苦碟子A苦碟子B心絞痛典一1542225484766型心絞痛不701815171811典型經統計學分析表明，兩組病例在心絞痛類型與輕重分級方面沒有差異，P>0.05。3.2將苦碟子注射液A(主要含有苦碟子總酚酸類成分)和苦碟子注射液B(傳統的石-硫法制備，主要含有黃酮類似物)。兩者外包裝與劑量完全相同，用法均為每次20ml，一日1次，14天為一療程。用藥期間停用其他抗心絞痛藥物，只允許心絞痛發作時含硝酸甘油片。用藥前，兩組均作心電圖(如休息心電圖正常，必要時作運動試驗)、肝功能、血、尿常規檢查。療程結束時，分別復查上述項目，療程全部結束后，先評定療效、最后揭盲，進行匯總，對號分析和總結o3.3療效評定與心絞痛分級按冠心病普査預防座談會修訂的"心絞痛癥狀療效評定標準"進行。4、臨床療效4.1心絞痛療效心絞痛分級與心絞痛療效，結果見表4-4-2。_表4-4-2心絞痛輕重與療效(例)_心絞痛分級~~SS~~~SS苦碟子A苦碟子B4.2心電圖變化心電圖治療前后變化，結果見表4-4-3。表4-4-3不同療程心電圖變化<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>心電圖不正常的93例，用苦碟子A與苦碟子B治療后心電圖總有效率分別為64.5%與34.4%，兩者相比，差異非常顯著(P<0.001)。5、結論5.1以上臨床試驗證明，苦碟子A的臨床療效明顯由于苦碟子B，且苦碟子A對冠心病患者的心電圖療效顯著，尤其對中重度患者療效更優。5.2苦碟子A在臨床觀察過程中未見任何不良反應，臨床前后肝、腎、心電圖、血壓、血、尿常規檢查未見異常，且在臨床觀察期間未見過敏反應。權利要求1、苦蝶子注射液的制備方法，包括苦碟子總酚酸的制備和苦碟子注射液的配制，即將干燥堅實的抱莖苦荬菜藥材切碾成1-10cm的薄片狀段、堿性水提取、冷藏、濾過、堿性低溫醇沉、堿性吸附除雜質、低溫梯度凍融兩次、酸性條件下煮碳、高溫加熱絮凝、低溫高速離心和雙層卷式復合膜過濾工藝步驟，其特征在于所述的堿性水提取工藝步驟是將切碾成1-10cm的藥材放入容器內；將水用堿調節pH值為7.0-9.0后加入到容器內，加入量為藥材量的10-30倍，提取兩次，提取溫度為70-100℃，每次為2040分鐘，提取液濃縮至每1ml相當于含生藥0.5-2.0g的浸膏；所述冷藏工藝步驟，是將制得的浸膏在0-10℃下靜置4-12小時，濾取上清液；所述的堿性低溫醇沉工藝步驟，是將制得的浸膏經冷藏工藝步驟制得的上清液進行低溫堿性梯度醇沉二次，第一次堿性醇濃度為65-75％，pH值為7-8，溫度為-10-10℃，靜置8-12小時過濾；第二次堿性醇濃度為75-80％，溫度為-10-10℃，靜置8-12小時，過濾，合并濾液，濾液減壓回收乙醇，趁冷過濾；所述堿性吸附除雜質工藝步驟，是將醇沉后的濾液，回收乙醇后，用堿調節pH值至7-8，加入堿性乙醇處理過的大孔樹脂或聚酰胺，用量為藥液的1-10％，攪拌20-30min，靜置，過濾；所述低溫梯度冷融工藝步驟，是將上述經大孔樹脂或聚酰胺吸附除去雜質后的濾液，在-20--5℃溫度下冷凍，靜置12小時以上，再在0-10℃溫度下融化后過濾，得苦碟子濾液；所述酸性條件下煮碳和高溫加熱絮凝工藝步驟，是將兩次冷融后藥液用鹽酸調節pH值至4-6，煮碳，脫碳，于110-121℃加熱20-60min，即得苦碟子總酚酸提取物；所述低溫高速離心和雙層卷式復合膜過濾工藝步驟，是將制得的苦碟子總酚酸提取物在-10～10℃溫度下，以5000-15000r/min高速離心10-30min，得苦碟子離心液，苦碟子離心液用注射用水稀釋至規定量后，用雙層卷式復合膜過濾，濾液調節pH值至中性，灌裝，在110-121℃下滅菌，即得苦碟子注射液。2、根據權利要求1所述的苦蝶子注射液的制備方法，其特征在于所述堿性水提取中所用的堿為NaHC03，Na2C03，NaOH，NH3OH中至少一種。3、根據權利要求1所述的苦蝶子注射液的制備方法，其特征在于所述的堿性醇，是指乙醇中含NaHC03，Na2C03，NaOH，NH3OH中至少一種。4、根據權利要求1所述的苦蝶子注射液的制備方法，其特征在于所述低溫堿性梯度冷融，是在-20。C溫度下，靜置12小時以上，融化后澄清板過濾，濾液于-10。C溫度下靜置48小時以上，0—10。C融化后過濾。5、采用權利要求1所述的苦蝶子注射液的制備方法，其特征在于所述的雙層巻式復合濾膜的濾膜是用分子量1萬一8萬的超濾膜;所述滅菌溫度為115°C，滅菌時間為30min;滅菌溫度為120°C，滅菌時間為10min。6、根據權利要求1所述的苦碟子注射液，其特征是經藥理和臨床研究證明，可用于冠心病、心絞痛和腦梗塞的治療。全文摘要苦碟子注射液制備工藝及在心腦血管疾病治療中的應用，是將抱莖苦荬菜堿水提取，提取液濃縮至生藥量0.5-2.0g的浸膏，冷藏，濾取上清液，低溫堿性醇沉二次，第一次堿性醇濃度為65-75％，pH值為7-8，溫度為-10-10℃，第二次堿性醇濃度為75-80％，溫度為-10-10℃，回收乙醇后過濾，濾液用堿調pH值至7-8后加入大孔樹脂，用量為藥液的1-10％，過濾，濾液經低溫梯度凍融，制得苦碟子總酚酸提取物，再經低溫速離心和雙層卷式復合膜過濾后調pH值至中性，即得苦碟子注射液。本發明制得的苦碟子注射液純度高、質量穩定，對冠心病、心絞痛和腦梗塞，療效確切，安全可控。文檔編號A61P9/00GK101524387SQ200910011220公開日2009年9月9日申請日期2009年4月21日優先權日2009年4月21日發明者丁百蓮,呂志會,王學東,王淞林,馬占芝申請人:沈陽雙鼎制藥有限公司