專(zhuān)利名稱(chēng)：殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，具體地說(shuō)是殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬 化形成的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)一步說(shuō)是殼寡糖在制備治療細(xì)菌性感染及炎癥因子所致動(dòng)脈粥 樣硬化的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化系指由脂質(zhì)、碳水化合物、血液成份的灶狀沉積、結(jié)締組織和鈣沉積 所致，并伴有動(dòng)脈中膜改變的聯(lián)合病變。訖今，動(dòng)脈粥樣硬化已成為威脅西方發(fā)達(dá)國(guó)家人體 生命安全的主要疾病。隨著我國(guó)生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，動(dòng)脈粥樣硬化亦成為 影響國(guó)人機(jī)體健康的重要原因。據(jù)衛(wèi)生部公布的生命統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)每年的總死亡人 數(shù)中約有1/3為心腦血管疾病患者，而幾乎所有的心腦血管疾病均因動(dòng)脈粥樣硬化所致或 與之有關(guān)。因此，有效預(yù)防、治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，將是改善人類(lèi)生活 質(zhì)量所面臨的迫切任務(wù)之一。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素參與的復(fù)雜疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。大量人 及動(dòng)物的病理生理觀察多支持炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化病變始于血管內(nèi)皮細(xì)胞受 損和/或由此引起的免疫細(xì)胞趨化，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不良。體外研究及動(dòng)物學(xué)實(shí) 驗(yàn)表明，外源性刺激致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，后者將表達(dá)多種粘附分子(VCAM-1、ICAM-1、 MCP-1等)，介導(dǎo)單核細(xì)胞和T細(xì)胞的滾動(dòng)、粘附、遷移和積聚，最終通過(guò)發(fā)生局部的炎癥 反應(yīng)以作為代償性保護(hù)；另一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞及趨化的免疫細(xì)胞將分泌致炎因子如 TNF-a、IL-6、IL_8等，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，最終演變?yōu)槁匝装Y，并導(dǎo)致病理性斑 塊的形成。此外，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者的病檢亦發(fā)現(xiàn)，其血管粥樣斑中多沉積有大量免疫細(xì) 胞(主要為單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞)及相關(guān)炎性因子，此結(jié)果進(jìn)一步提示，免疫系統(tǒng)及炎癥 因子是動(dòng)脈粥樣硬化形成的主導(dǎo)因素?；谏鲜鲅芯靠芍獌?nèi)皮功能障礙、免疫細(xì)胞趨化、 炎癥反應(yīng)發(fā)生及其相互之間形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起主導(dǎo)作 用。由上可見(jiàn)，炎癥因子既是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件，又是動(dòng)脈粥硬化形成的必然結(jié)^ o目前，抗動(dòng)脈粥樣硬化新藥的研究進(jìn)展迅速，臨床一線的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的 作用機(jī)制主要包括消除、控制誘發(fā)因素；防治動(dòng)脈粥樣硬化的并發(fā)癥；防止炎癥的形成等 方面。常用的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物主要包括調(diào)血脂類(lèi)、抗氧化劑、降血壓類(lèi)等。研究證實(shí)， 殼寡糖具有抗氧化、降血脂、降低血糖、調(diào)節(jié)血壓、改善消化機(jī)能等諸多功能，而針對(duì)殼寡糖 抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均無(wú)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)一步 提供殼寡糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用；殼寡糖能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形 成通過(guò)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，抑制脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-6及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)；抑制TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1、ICAM-1及相關(guān)粘附 分子家族成員的表達(dá)；抑制TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞的粘附，從而抑 制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物中的應(yīng)用。所述殼寡糖可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-6、VCAM_1及ICAM-1等炎癥介質(zhì) 的表達(dá)而抑制炎癥因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，即殼寡糖可進(jìn)一步用于制備治療動(dòng)脈粥樣 硬化的藥物中；所述治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物為治療細(xì)菌性感染及炎癥因子所致動(dòng)脈粥樣 硬化的藥物。所述殼寡糖的糖鏈聚合度在1-10之間，其中以聚合度為2-6的寡糖效果最佳；各 寡糖脫脫乙酰度在0-95%之間，其中以脫乙酰度為85-95%的寡糖效果最佳；所述殼寡糖 于患處體液中的有效作用濃度為10-400 y g/ml。所述殼寡糖與藥物學(xué)上可接受的藥物輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑、粉劑、 針劑或水劑。在使用時(shí)可采取口服、皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以任意選用生 理鹽水、葡萄糖、穩(wěn)定劑、防腐劑、懸浮劑或乳化劑等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為1、所述殼寡糖具有促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖(Jiangli Dou, Chengyu Tan, Yuguang Du, Xuefang Bai, Keyi Wang, Xiaojun Ma. Effects of chitooligosaccharides on rabbit neutrophils in vitro. Carbohydrate Polymers 2007 ;69 :209_213.)、{呆護(hù)內(nèi)皮 細(xì)胞的氧化性損傷(Hong-Tao Liu, Wen-Ming Li, Gang Xu, Xiu-Ying Li, Xue-Fang Bai, Pengffei, Chao Yu, Yu—Guang Dua. Chitosan oligosaccharides attenuate hydrogen peroxide-induced stress injury in human umbilical vein endothelial cells. Pharmacological Research 2009 ；59 :167-175.)、抑制腫瘤血管的生成、保護(hù)肝臟細(xì)胞免 受異源性刺激的損傷等功能。與現(xiàn)有抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物相比，殼寡糖可長(zhǎng)期服用，且在藥 用劑量范圍內(nèi)無(wú)明顯毒副作用，同時(shí)兼有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、降低血壓、提高機(jī)體免疫力 等多種功效。2、根據(jù)實(shí)施例2 實(shí)驗(yàn)證明，殼寡糖能夠顯著抑制由脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的轉(zhuǎn)錄。殼寡糖有效作用濃度在10-400 u g/ml，其中對(duì)IL-8的最大抑 制率為75. 3%，對(duì)IL-6的最大抑制率為74. 6%。3、根據(jù)實(shí)施例3 實(shí)驗(yàn)證明，殼寡糖能夠顯著抑制由脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的蛋白表達(dá)。殼寡糖有效作用濃度在10-400 y g/ml，其中對(duì)IL-8的最 大抑制率為43. 8%，對(duì)IL-6的最大抑制率為48. 2%。因此，殼寡糖具有抑制細(xì)菌性感染所 致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛在作用，有望開(kāi)發(fā)成抗動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的藥物及與抗動(dòng)脈粥樣 硬化有關(guān)的保健食品和/或食品添加劑等。4、根據(jù)實(shí)施例4 實(shí)驗(yàn)證明，殼寡糖能夠顯著抑制由TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄。殼寡糖有效作用濃度在10-400 u g/ml，其中對(duì)VCAM-1的 最大抑制率為35. 4%，對(duì)ICAM-1的最大抑制率為53. 8%。5、根據(jù)實(shí)施例5 實(shí)驗(yàn)證明，殼寡糖能夠顯著抑制由TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)
4皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)。殼寡糖有效作用濃度在10-400 y g/ml，其中對(duì) VCAM-1的最大抑制率為44. 8%，對(duì)ICAM-1的最大抑制率為54. 1%。根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)論， 殼寡糖可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)而減輕炎癥因子對(duì)血管內(nèi)皮的 損傷，有望研制開(kāi)發(fā)成為更高效的抗動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物。6、根據(jù)實(shí)施例6 實(shí)驗(yàn)證明，殼寡糖可顯著抑制經(jīng)TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞與單核細(xì)胞的粘附。由本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知，殼寡糖能抑制免疫細(xì)胞向受損血管內(nèi)皮細(xì) 胞的粘附、趨化，從而抑制了炎癥反應(yīng)的過(guò)度發(fā)生，有望開(kāi)發(fā)成與抗動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的免 疫調(diào)節(jié)劑。
圖1.殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的轉(zhuǎn)錄抑制作用。Control 正 常對(duì)照組；LPS 脂多糖模型組；殼寡糖-1 殼寡糖預(yù)保護(hù)組1 (50 u g/ml)；殼寡糖-2 殼寡 糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)；殼寡糖-3 殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。具體實(shí)驗(yàn)方案詳見(jiàn) 實(shí)施例2。圖2.殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的蛋白表達(dá)抑制作用。Control 正常對(duì)照組；LPS 脂多糖模型組；殼寡糖-1 殼寡糖預(yù)保護(hù)組1 (50 u g/ml)；殼寡糖-2 殼 寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)；殼寡糖-3 殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。具體實(shí)驗(yàn)方案詳 見(jiàn)實(shí)施例3。圖3.殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄抑制作用。Control 正常對(duì)照組；TNF-a :TNF-a模型組；殼寡糖-1 殼寡糖預(yù)保護(hù)組1 (50g/ml)；殼寡糖_2 殼寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)；殼寡糖-3 殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。具體實(shí)驗(yàn)方案 詳見(jiàn)實(shí)施例4。圖4.殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)抑制作用。 Control 正常對(duì)照組；TNF-a :TNF-a模型組；殼寡糖-1 殼寡糖預(yù)保護(hù)組1 (50 y g/ml)； 殼寡糖_2 殼寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)；殼寡糖-3 殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。具 體實(shí)驗(yàn)方案詳見(jiàn)實(shí)施例5。圖5.殼寡糖對(duì)TNF- a (20ng/ml)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF_ k B表達(dá)抑制的 免疫熒光分析。(A)空白對(duì)照組(Blank組)的免疫熒光譜圖；(B)正常對(duì)照組(Control組) 的免疫熒光譜圖；(C)TNF-a模型組的免疫熒光譜圖；(D)殼寡糖預(yù)保護(hù)組(100 y g/ml)的 免疫熒光譜圖。具體實(shí)驗(yàn)方案詳見(jiàn)實(shí)施例6。
具體實(shí)施例方式動(dòng)脈粥樣硬化疾病的形成是由病理、生理、生化等多因素綜合作用的結(jié)果，而炎性 因子刺激所致的血管內(nèi)皮損傷則是其發(fā)生、發(fā)展的前奏。研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)時(shí)，單核細(xì)胞 等免疫細(xì)胞首先通過(guò)胞膜上的粘附分子配體與受損血管內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子結(jié)合，并進(jìn) 一步分泌TNF-a、IL-8、IL-6, IL_1 0等多種因子，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成。因此， 如何通過(guò)抑制單核細(xì)胞的粘附及炎癥因子的表達(dá)以達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的目，已成為當(dāng)前 心血管疾病防治中的熱點(diǎn)問(wèn)題。殼寡糖具有良好的生物相容性及可降解性，有望被開(kāi)發(fā)成 一種有效、安全的抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥物、保健食品或食品添加劑。
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本發(fā)明采用脫乙酰度> 95的殼寡糖，經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可明顯 抑制脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的表達(dá)，亦可明顯抑制TNF-a誘導(dǎo) 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)，并能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞 的粘附。說(shuō)明殼寡能夠通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形 成。參照 文獻(xiàn)(Alison R. Hunter and Anthony J. Turner. Expression and localization of endothelin-converting enzyme-1 isoforms in human endothelial cells, inhibitors. Exp Biol Med, 2006 ；231 :718_722.)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件 為在完全培養(yǎng)基DMEM-F 12(Gibco，Grand Island, USA)培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清、 30 u g/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子添加劑、100U/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素；于37°C，5% C02條件 下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前先以含胎牛血清的培養(yǎng)基預(yù)孵育24h。實(shí)施例1殼寡糖以水劑形式給藥，藥液配制的具體操作如下①準(zhǔn)確稱(chēng)取5mg殼寡糖，溶 于5ml含胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，形成終濃度為lmg/ml的殼寡糖藥液；②用 0. 22 yM孔徑的針式濾器對(duì)前述藥液進(jìn)行抽濾處理，即為無(wú)菌的殼寡糖貯存液；③將上述 貯存液分裝后，于_80°C保存，以用于下述實(shí)施例中。實(shí)施例2殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的轉(zhuǎn)錄抑制分析。主要操作如下 ①實(shí)驗(yàn)共分5組(圖1)，即正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)、脂多糖模型組、殼寡糖預(yù)保護(hù)組 1 (50 u g/ml)、殼寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)及殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。②用質(zhì)量 濃度0. 125%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并按2X 106/瓶接種于25ml 培養(yǎng)瓶中，每瓶加入細(xì)胞懸液的總體積為4ml。③將培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，5% C02, 37°C，培養(yǎng)24h。④取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組及脂多糖組分別加入3ml新鮮的 DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco, Grand Island, USA)；各殼寡糖預(yù)保護(hù)組分別加入含50、100及 200 u g/ml殼寡糖的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑤取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組 加入3ml新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基，其余各組分別加入含脂多糖(lOOng/ml)的DMEM-F12培 養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。⑥取出培養(yǎng)瓶，進(jìn)行RNA抽提處理，并使用商業(yè)化試劑盒(杭州博日技 術(shù)有限公司，浙江)對(duì)抽提得到的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增分析，以檢測(cè)IL-8及IL-6 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。圖1結(jié)果表明，脂多糖可顯著上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6在轉(zhuǎn)錄水平 的表達(dá)，而殼寡糖在50-200 y g范圍內(nèi)對(duì)IL-8及IL-6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有明顯的抑制作用，且 殼寡糖在100 y g/ml時(shí)的預(yù)保護(hù)效果最佳。實(shí)施例3殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8及IL-6的蛋白表達(dá)抑制分析。主要操作如 下①實(shí)驗(yàn)共分5組(圖2)，即正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)、脂多糖模型組、殼寡糖預(yù)保護(hù) 組1 (50 u g/ml)、殼寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)及殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。②用質(zhì) 量濃度0. 125%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并按5X 103/孔的密度將細(xì) 胞接種于96孔中，每組重復(fù)5孔，每孔加入細(xì)胞懸液的體積為150 yl。③將培養(yǎng)板放入細(xì) 胞培養(yǎng)箱中，5% C02，37°C，培養(yǎng)24h。④取出培養(yǎng)板，棄上清后，Control組及脂多糖組分別加入150 u 1新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基；各殼寡糖預(yù)保護(hù)組分別加入150 yl含50、100及 200 u g/ml殼寡糖的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑤取出培養(yǎng)板，棄上清后，Control 組加入100 ill新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基，其余各組分別加入100 yl含脂多糖(lOOng/ml) 的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。⑥取出培養(yǎng)板，收集各孔中的上清液，采用商業(yè)化試劑盒 (R&D Systems Inc,Minneapolis,USA)檢測(cè)各樣品中的 IL-8 及 IL-6 濃度，以分析 IL-8 及 IL-6的蛋白表達(dá)變化。圖2的結(jié)果表明，脂多糖可顯著上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中IL-8及IL-6的分泌，而 殼寡糖在50-200 y g范圍內(nèi)對(duì)IL-8及IL-6的蛋白分泌具有明顯的抑制作用，且殼寡糖在 100 u g/ml時(shí)的抑制作用最佳。實(shí)施例4殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄抑制分析。主要操作如 下①實(shí)驗(yàn)共分5組(圖3)，即正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)、TNF-a模型組、殼寡糖預(yù)保護(hù) 組1(50 y g/ml)、殼寡糖預(yù)保護(hù)組2(100 y g/ml)及殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 y g/ml)。②用 質(zhì)量濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并按2X106/瓶接種 于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶加入細(xì)胞懸液的總體積為4ml。③將培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，5% C02，37°C，培養(yǎng)24h。④取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組及TNF- a組分別加入3ml新鮮的 DMEM-F12培養(yǎng)基；各殼寡糖預(yù)保護(hù)組分別加入含50、100及200 u g/ml殼寡糖的DMEM-F12 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑤取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組加入3ml新鮮的DMEM-F12培 養(yǎng)基，其余各組分別加入3ml含TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。⑥取 出培養(yǎng)瓶，進(jìn)行RNA抽提處理，并使用商業(yè)化試劑盒(杭州博日技術(shù)有限公司，浙江)對(duì)抽 提得到的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增分析，以檢測(cè)VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。圖3結(jié)果表明，TNF-a可顯著上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄； 殼寡糖在50-200 y g范圍內(nèi)對(duì)VCAM-1及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄具有明顯的抑制作用，且殼寡糖在 100 u g/ml時(shí)的抑制作用最佳。實(shí)施例5殼寡糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)抑制分析。主要操作 如下①實(shí)驗(yàn)共分5組(圖4)，即正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)、TNF-a模型組、殼寡糖預(yù)保 護(hù)組1 (50 u g/ml)、殼寡糖預(yù)保護(hù)組2 (100 u g/ml)及殼寡糖預(yù)保護(hù)組3 (200 u g/ml)。②用 質(zhì)量濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并按2X106/瓶接種 于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶加入細(xì)胞懸液的總體積為4ml。③將培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，5% C02，37°C，培養(yǎng)24h。④取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組及TNF- a組分別加入3ml新鮮的 DMEM-F12培養(yǎng)基；各殼寡糖預(yù)保護(hù)組分別加入含50、100及200 u g/ml殼寡糖的DMEM-F12 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑤取出培養(yǎng)瓶，棄上清后，Control組加入3ml新鮮的DMEM-F12培 養(yǎng)基，其余各組分別加入3ml含TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。⑥ 取出培養(yǎng)瓶，進(jìn)行蛋白抽提處理，并對(duì)抽提得到的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析(抗 VCAM-1 及 ICAM-1 人源化抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology, CA, USA。顯影方式為 ECL 化學(xué)發(fā)光法)，以檢測(cè)VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)變化。圖4結(jié)果表明，TNF-a可顯著上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1及ICAM-1的蛋白 表達(dá)；殼寡糖在50-200 ii g范圍內(nèi)對(duì)VCAM-1及ICAM-1的蛋白表達(dá)具有明顯的抑制作用，且殼寡糖在lOOy g/ml時(shí)的抑制作用最佳。實(shí)施例6人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞(U937)的粘附實(shí)驗(yàn)。主要操作如下①實(shí)驗(yàn)共 分4組(圖5)，即空白對(duì)照組(Blank)、正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)、TNF-a模型組及殼寡 糖預(yù)保護(hù)組(100y g/ml)。②用質(zhì)量濃度為0. 125%的胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的人臍脈內(nèi) 皮細(xì)胞細(xì)胞，并按5 X 103/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔暗培養(yǎng)板中，每組重復(fù)5孔，每孔加 入細(xì)胞懸液的體積為150 iU (空白對(duì)照組加入150 u 1培養(yǎng)基)。③將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培 養(yǎng)箱，5% 0)2，37°0，培養(yǎng)2411。④取出培養(yǎng)板，棄上清后，Blank組、Control組及TNF-a 組分別加入150 u 1新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基；殼寡糖預(yù)保護(hù)組加入150 yl含100 u g/ml 藥物的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑤取出培養(yǎng)板，棄上清后，Blank組及Control組 各加入100 u 1新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基，TNF- a組及殼寡糖預(yù)保護(hù)組分別加入100 yl含 TNF- a (20ng/ml)的DMEM-F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6h。⑥取出培養(yǎng)板，吸棄上清，每孔加入 4X104個(gè)熒光標(biāo)記的單核細(xì)胞，培養(yǎng)lh后，于熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照。由圖5可知空白對(duì)照組未檢測(cè)到熒光；正常對(duì)照組可檢測(cè)到較低的熒光；TNF- a 模型組的熒光顯著增強(qiáng)；殼寡糖預(yù)保護(hù)組的熒光強(qiáng)度介于正常對(duì)照組與TNF-a模型組之 間。上述結(jié)果表明，TNF-a可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞的粘附，而殼寡糖可逆 轉(zhuǎn)TNF-a的誘導(dǎo)作用?？傊?，本發(fā)明將殼寡糖用于制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物中；殼寡糖可通過(guò) 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)白介素_8 (IL-8)、白介素-6 (IL-6)、血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)、細(xì) 胞間粘附分子(ICAM-1)及其它相關(guān)炎癥因子的表達(dá)而抑制炎癥因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損 傷，即殼寡糖可進(jìn)一步用于制備治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中。本發(fā)明以脂多糖(脂多糖) 及人源化基因重組腫瘤壞死因子-a (TNF-a)為誘導(dǎo)因子，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究 對(duì)象，結(jié)果表明①殼寡糖能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-6及相 關(guān)炎癥因子的表達(dá)；②殼寡糖能顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的膜表面分子 VCAM-1、ICAM-1及相關(guān)粘附分子家族成員的表達(dá)。③殼寡糖能顯著抑制TNE-a誘導(dǎo)的人 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞的粘附。
8
權(quán)利要求
殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于殼寡糖可進(jìn)一步用于在制備治療動(dòng)脈粥 樣硬化的藥物中。
3.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物為治療細(xì) 菌性感染及炎癥因子所致動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于殼寡糖可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi) IL-8、IL-6、VCAM-1、ICAM-I等相關(guān)炎性因子的表達(dá)，并能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞 的粘附，從而抑制炎癥因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖的糖鏈聚合度在1-10之 間，各寡糖脫乙酰度為0-95%。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖的糖鏈聚合度為2-6，各 寡糖脫乙酰度為85-95%。
7.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中的殼寡糖于患處體液中 的有效作用濃度為10-400 μ g/ml。
8.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述殼寡糖與藥物學(xué)上可接受的藥 物輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑或水劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，具體地說(shuō)是殼寡糖在制備預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明以脂多糖(脂多糖)及人源化基因重組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為誘導(dǎo)因子，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果表明①殼寡糖能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8、IL-6及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)；②殼寡糖能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的膜表面分子VCAM-1、ICAM-1及相關(guān)粘附分子家族成員的表達(dá)。③殼寡糖能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞的粘附。
文檔編號(hào)A61K31/722GK101849958SQ200910010979
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者劉啟順, 劉洪濤, 杜昱光, 白雪芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所