調節血管生成和癌細胞增殖的方法

專利名稱：調節血管生成和癌細胞增殖的方法
調節血管生成和癌細胞增殖的方法
技術領域：
本發明專利申請是國際申請號為PCT/US2004/037754，國際申請日為 2004年11月12日，進入中國國家階段的申請號為"200480033521. 1"， 發明名稱為"調節血管生成和癌細胞增殖的方法"的發明專利申請的分案申請。
相關申請的交叉引用 本申請要求2003年11月14日提交的美國臨時申請60/520,172的權益， 在此完整引入以供參考。
關于聯邦資助的研究或開發的聲明 本發明在美國政府通過以下代理機構授予的基金NIH EY014385和 HL036279的支持下完成。美國政府對本發明享有特定的權利。
背景技術：
得自花生四烯酸代謝作用的產物參與調節血管和細胞生長。當花生四烯酸 的代謝由細胞色素P450催化時，主要的產物是區域和立體特異性的環氧二十 碳三烯酸(EET)、它們相應的二羥基二十碳三烯酸(DHET)和20-羥基二十碳三 烯酸(20-HETE)。細胞色素P450也可將花生四烯酸代謝為16-、 17-、 18-和 19-HETE。在CYP450的所有同種型中，參與花生四烯酸co-羥化為20-HETE 的主要的酶是CYP450 4A (CYP4A)和CYP450 4F (CYP4F)家族(Roman RJ.， 尸/z戸o/.細82:131-185， 2002)。
生理血管生成是涉及細胞、胞外基質分子與細胞遷移、增殖和內皮細胞的 管分化中積累的可溶性因子之間相互作用的復雜過程。血管生成的過程與已經 存在的血管有關，它長出毛細管枝芽以產生新血管(HanahanD等，Sc〖wce 277:48-50， 1997)。幾種細胞因子和生長因子，例如內皮細胞生長因子(VEGF)、 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)已公認可在體外和 體內調節血管生成，在這些因子中，VEGF認為是最有效的血管生成誘導 物(FerraraN， J尸/z"/。/Ce〃尸/zyw'o/ 280: C1358-C1366， 2001)。近來的 研究進一步支持了 VEGF在骨骼肌中作為重要的血管生成調節物的作用， 因為用VEGF-中和抗體處理阻斷了針對電刺激和鍛煉的血管生成應答 (Amaral SL等，M/cro"ycw/a"o" 8: 57-67， 2001;和Amaral SL等，爿w J P/z"/o/i/eflWC7rc尸/ywW281: H1163-H1169， 2001)。
花生四烯酸的環氧合酶(Epoxygenase)代謝物參與培養細胞中的內皮細胞 遷移和管形成(Natarajan R等，爿m J P/z;w'o/ i/eaW Oc尸/z"zW 273: H2224-H2231， 1997; Natarajan R等，/Voc淑"ca"c/園90: 4947-4951， 1993;和RiederMJ等，M/③麗c Ae"9: 180-189， 1995)。近來的一項研究 提供了大鼠提睪肌中細胞色素P450A(CYP450)(o-羥化酶在骨骼肌細胞和小動 脈中表達的證據(Kunert MP等，J尸/ jw'o/ T/eaW Oc尸/yw'o/ 280: H1840-H1845， 2001)。 20-HETE顯示在大腦和腎循環的小動脈的生肌活化中 起作用(Harder DR等，J ^wc 34: 237-243， 1997; Harder DR等，爿cto 尸/z"〖。/ Scam/ 168: 543-549， 2000;禾卩Ma YH等，爿m J尸/z"/。/ i egw/ /"&gr Cowp P/2"/0/ 267: R579陽R589， 1994)。 Frisbee等04m /尸/z;^W T/eaW Oc 尸—'o/ 280: H1066-H1074， 2001)禾口 Kunert等(M.c畫,簡/a"o" 8: 435-443， 2001)證實20-HETE導致針對骨骼肌抵抗小動脈中透壁壓力升高和P02的血管 收縮應答。
近來的研究也表明去甲腎上腺素和血管緊張素II(ANG II)刺激20-HETE 在血管平滑肌細胞中合成與釋放(Muthalif MM等， / 5/o/ C/zew 271: 30149-30157， 1996)，并且細胞色素P-450抑制劑阻斷MAPK系統活化與去 甲腎上腺素和ANG II對培養的血管平滑肌(對M)細胞的促有絲分裂作用。有 證據表明20-HETE作為ANG II的血管收縮作用的二級信使(Alonso-Garcia M 等，爿m J尸/z"/。/ i egw/ /"&gr Cow; 尸&wW 283: R60-R68, 2002)并且局部 腎素—血管緊張素系統在電刺激誘導的血管生成中起重要作用(Amaral SL等，M/c腦.腦/fl"o" 8: 57-67， 2001)。然而，20-HETE在肌肉的電刺激后 介導Ang II的血管生成作用中的角色尚不清楚。
20-HETE也涉及在促進培養的各種類型正常細胞生長中起作用。例如， 20-HETE增加VSM細胞(Muthalif等，外—畫'ow 36: 604-609， 2000;和 Uddin等，Z/，eWe"w'o" 31: 242-247， 1998)和近端小管腎上皮細胞(Lin等，
尸tyWo/. 269: F806-F816， 1995)中的胸苷摻入。體外這兩種細胞類型中， EGF的促有絲分裂作用與20-HETE生產增加有關(Muthalif MM等，尸roc. iVa" 爿cw/. 1998， 95:12701-12706;禾PLinF等，」m //^"/o/ 1995，
269:F806-16)。阻斷20-HETE的形成降低了對血清、去甲腎上腺素和EGF的 生長應答(LinF等，JmJ尸/^w'o/ 1995， 269:F806-16; Roman RJ，i ev 2002， 82:131-85; SacerdotiD等，尸簡一Wz7w 。
一WMWw 2003， 72:51-71; Zhao X和Imig JD， C^r Z>wg Tl^eto6 2003 ， 4:73-84)。在各種細 胞類型中，幾種信號轉導途徑可能與20-HETE對細胞生長的刺激有關(Muthalif MM等，iV"". Jcat/. L^4 1998， 95:12701-12706; UddinMR等， //，W國.o" 31: 242-247， 1998; Harder DR等，JJ^wc i ^ 34: 237-243， 1997; Lange等，C/zew 272: 27345-27352， 1997; Lin等，J尸/^w'o/i e"a/ 尸—W269: F806-F816， 1995;禾口 Sun等，//，W函ow 33: 414-418， 1999)。 Muthalif等報道了血管平滑肌中通過NE和血管緊張素II活化MAPK取決 于20-HETE的形成，它是在經鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II刺激cPLA2 后產生的。Ras/MAPK途徑經20-HETE的活化，放大了 cPLA2活性并通過 正反饋機理額外釋放花生四烯酸。Muthalif等提出該機理可能在調控其它參 與細胞增殖和生長的細胞信號傳遞分子中起作用(Muthalif MM等， 淑/.園1998， 95:12701-12706)。
雖然花生四烯酸代謝物的生產由剌激血管生成的生長因子改變并且有證 據表明20-HETE在體外促進一些類型的正常細胞生長中起作用，但在本申請 所述工作之前沒有證據表明20-HETE直接參與體內血管生成，也沒有證據表 明20-HETE在癌細胞增殖和癌性腫瘤生長中起作用。
6發明概述
本發明一方面涉及將足夠降低組織中血管生成的量的20-HETE合成抑制 劑或20-HETE拮抗劑給予人或非人哺乳動物，來減少人或非人哺乳動物組織 中血管生成的方法。
本發明的另一方面涉及通過充分增加組織中20-HETE活性從而誘導和促 進組織中血管生成，來誘導和促進人或非人哺乳動物組織中血管生成的方法。
本發明還有另一方面涉及使癌癥或腫瘤細胞與選自20-HETE合成抑制劑 或20-HETE拮抗劑的藥物接觸來抑制癌癥或腫瘤細胞增殖的方法，該藥物的 量足夠抑制癌癥或腫瘤細胞增殖。
附圖的幾種視角的簡述


圖1顯示了代表性反向HPLC色譜，說明脛骨前(TA)肌樣品中熒光標記的 20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)的分離。WIT-002, 20-5(Z),14(Z)-羥基二十 碳二烯酸用作內標。
圖2顯示用選擇性細胞色素尸-450A (CYP4A)抑制劑[,羥基-;V'-(4-丁基 -2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)]處理對大鼠尿中20-HETE水平的作用。數值 是用載體(卵磷脂)處理的5只大鼠和用HET0016處理的5只大鼠的平均值± SE。 *尸<0.05對卵磷脂。
圖3顯示7天刺激方案后用選擇性CYP4A抑制劑(HET0016)處理對大鼠 肌肉中20-HETE形成的作用。PBS，磷酸緩沖鹽。數值是用卵磷脂處理的5只 大鼠和用HET0016處理的5只大鼠的平均值±SE。 *尸< 0.05對未刺激側。
圖4顯示7天電刺激方案后對照大鼠(11 = 4)、用選擇性CYP4A抑制劑(卵 磷脂配制的HET0016， 2mgkg"天—1， w = 4)處理的和用非選擇性CYP4A抑 制劑[PBS配制的1-氨基苯并三唑(ABT)， 50mgkg—'天—1， " = 4]處理的大 鼠的指長伸肌(EDL)和TA肌肉的血管密度變化。數值是平均值± SE。顯著性 <0.05對未刺激側。
圖5顯示7天電刺激方案后，用卵磷脂、HET0016 (卵磷脂配制，2 mg kg" 天—"和ABT(PBS配制，50mgkg"天"，"=4)處理大鼠的未刺激(U)或電刺激(S)的TA肌肉中血管VEGF的表達。每份樣品加樣為50(ig總蛋白。由于大 量表達VEGF，用C6腫瘤細胞作為陽性對照。顯示了 7天電刺激方案后在對 照組(n = 5)和用選擇性CYP4A抑制劑HET0016 (" = 7)處理組中VEGF蛋白 質的定量密度顯像測定。數值是平均值iSE。 *尸<0.05對未刺激側。
圖6顯示7天刺激方案后，用VEGF-中和抗體(PBS配制的VEGF Ab; 0.6 mg/100g體重，腹膜內(ip))處理對大鼠肌肉中20-HETE形成的作用。數 值是用PBS(對照)處理的5只大鼠和用VEGF Ab處理的4只大鼠的平均值± SE。數值表達為在C6腫瘤細胞標準中觀察到的VEGF表達的百分比。*尸< 0.05對未刺激側。
圖7顯示HET0016對培養的人血管內皮細胞(HUVEC)中VEGF的增殖性 應答的作用。HUVEC單獨與250 ng/ml VEGF或在存在10 (iM HET0016時 孵育，24小時后測定細胞增殖。HET0016消除了對VEGF的增殖性應答(n =3，每次實驗一式三份)，但未改變HUVEC的基礎增殖率(未顯示)。*/7< 0.05，對照對VEGF; ; <0.05， VEGF對VEGF + HET0016。
圖8A和8B顯示HET0016對體內VEGF引發的血管生成應答的作用。用 大鼠角膜袋(cornea pocket)血管生成試驗檢測新血管形成的改變。將單獨含有 VEGF(250 ng/小球)或含有VEGF和HET0016 (20 (ig)的小球植入大鼠角膜的 基質。7天后處死大鼠并使用India墨水使新血管形成顯現。通過追蹤血管并 使用圖像分析軟件以獲得視野中所有血管長度的數值來定量估計血管生成應 答。圖8A顯示了小球植入物區域中代表性的角膜載玻片(flatmount)。圖8B顯 示了以平均值土SEM表示的所有實驗的總血管長度。(p<0.001， VEGF對 VEGF + HET0016)。
圖9A和9B顯示HET0016對體內bFGF引發的血管生成應答的作用。單 獨含有bFGF(250 ng/小球)或含有bFGF和HET0016 (20 (ig)的小球植入大鼠 角膜的基質。圖9A顯示了代表性的角膜載玻片。圖9B顯示了圖8所示血管 生成應答的變化。("=6; / < 0.001， bFGF對bFGF + HET0016)。
圖10A和10B顯示HET0016對體內EGF引發的血管生成應答的作用。 單獨含有EGF(250 ng/小球)或含有EGF和HET0016 (20 pg)的小球植入大鼠
8角膜的基質。圖IOA顯示了代表性的角膜載玻片，圖10B顯示了血管生成應
答的變化。("=7; p< 0.001， EGF對EGF + HET0016)。
圖11A和11B顯示了化學性質和機理不同的20-HETE形成抑制劑，二溴 十二碳烯基甲磺酰亞胺(DDMS，也稱為7V-甲基磺酰基-12, 12-二溴十二垸基 -ll-烯酰胺)對體內VEGF的血管生成應答的作用。單獨含有VEGF(250 ng/小 球)或含有VEGF和DDMS(IO (ig)的小球植入大鼠角膜的基質。圖11A顯示 了代表性的例子，圖IIB顯示了血管生成應答的變化。("=6; ; < 0.001， VEGF對VEGF + DDMS)。
圖12顯示20-羥基二十碳-6(Z)， 15(Z)-二烯酸(WIT003)， 一種具有有效 激動活性的20-HETE的更穩定類似物對培養的HUVEC增殖的作用。HUVEC 單獨與40 pM棕櫚酸(無活性脂肪酸對照)或乙醇(載體對照)孵育。二者無 差別，因此合并該兩組的對照數據。在實驗組中，細胞與1 )iM WIT003孵 育48小時并測定增殖。WIT003提高HUVEC的增殖("=3，每次實驗一式 三份；*; <0.05禾[]#p<0.01，對照對WIT003)。
圖13A和13B顯示20-HETE類似物WIT003在體內大鼠角膜袋中的血管 生成作用。含有20 pg WIT003的小球植入大鼠角膜的基質。7天后處死大 鼠并檢測新血管形成。圖13A顯示了代表性的載玻片。圖13B顯示對 WIT003的血管生成應答("=6; /7<0.01，對照對WIT003)。
圖14A和14B顯示HET0016在體內對U251癌細胞的血管生成應答的作 用。通過以低密度將單細胞懸浮液接種于0.8%瓊脂層上產生人成膠質細胞瘤 癌細胞系U251的球狀體。總共5-8個球狀體(每個約200 pm)插入刻入雙眼的 角膜袋中。含有20pgHET0016或載體(乙醇)的小球置于球狀體附近。植入 癌細胞2周后處死大鼠并檢測新血管形成應答。圖14A顯示了在連續實驗 中所有大鼠的球狀體/小球植入物區域的角膜。圖14B顯示了血管生成應答 的變化("=8; p<0.01，對照球狀體對球狀體+HET0016)。
圖15顯示了 20-HETE合成抑制劑，HET0016對體外生長的人U251成膠 質細胞瘤癌細胞的生長模式和細胞周期特性的作用。A幅涂布相同數量的
U251細胞(0.75 X 10,鋪板并在接觸各種濃度的HET0016之前血清禁食1天，每24小時進行細胞計數；B幅在對照培養物和用10 pM HET0016 處理的培養物中評估摻入DNA的[3司胸苷。[3司胸苷摻入數據計算為 d.p.m./l(^個細胞并相對于EtOH對照定標；C幅U251細胞鋪板，并用 EtOH配制的10 )iMHET0016或單用EtOH(對照)處理。用碘化丙錠(細胞增 殖標記)染色細胞并通過FACS分析染色細胞的總DNA含量來確定它們的 細胞周期分布。處于細胞周期的各種階段的細胞百分比示于每幅圖中。每 幅圖顯示了一式三份進行的3到4個獨立實驗的平均值±SD。 C幅顯示了 3個獨立實驗的代表性實驗。箭頭表示當HET0016加入培養物使的時間0 點。
圖16顯示HET0016抑制EGF刺激培養物中U251癌細胞增殖和生長的作 用。血清禁食U251細胞，然后用200 ng/ml EGF、 10 jiM HET0016或二者處 理。48小時后評估細胞增殖。
圖17比較了 HET0016對HUVEC、初級角化細胞和U251生長的作用。 HUVEC、初級人角化細胞和人U251成膠質細胞瘤癌細胞接種于96-孔板并用 HET0016處理48小時。HET0016對正常的HUVEC或角化細胞無作用，而抑 制約50%U251癌細胞增殖。(圖中)給出了一式三份進行的3個獨立實驗的平均 值士SD。 ***表示各自對照值的；？<0.001。
圖18顯示DDMS對生長于培養物中的人U251成膠質細胞瘤細胞增殖的 作用。用DDMS(化學性質和機理與HET0016極為不同的第二種CYP4A和 20-HETE合成抑制劑)處理U251細胞。DDMS以濃度依賴性方式抑制U251 細胞的增殖。(圖中)給出了一式三份進行的3個獨立實驗的平均值±SD。
圖19顯示WIT003， 一種具有促效劑性能的20-HETE的穩定類似物對 人U251成膠質細胞瘤癌細胞體外增殖的作用。在加入0.1 和1 faM的 WIT003或已知對這些用于比較的細胞的增殖產生接近最大刺激的不同濃 度EGF之前U251培養物血清禁食1天。結果顯示1 pM WIT003促進U251 的生長與200 ng/ml EGF的相當。48小時后進行細胞計數并依照在單用載 體(EtOH)處理的對照培養物中觀察到的數值定標。(圖中)給出了一式三份進 行的3個獨立實驗的平均值± SD。 *; <0.05; **; <0.01; ***p<0.001。
10圖20顯示加入20-HETE促效劑(agonist)WIT003可從20-HETE合成抑 制劑HET0016的抗增殖作用中拯救U251細胞。培養物血清禁食并單用10 pM HET0016或與聯用1 ^MWIT003處理。處理48小時后通過細胞計數來評估 細胞增殖。(圖中)給出了一式三份進行的3個獨立實驗的平均值±SD。
圖21顯示HET0016對9L膠質肉瘤細胞體外增殖的作用。A幅相同數 量的9L細胞(0.75 X 104)鋪板，并在接觸各種濃度的HET0016之前血清禁 食1天，每24小時進行細胞計數；B幅在用10 ^MHET0016處理的培養 物中評估摻入DNA的[3司胸苷。[3閉胸苷摻入數據計算為d.p.m./l(^個細胞 并對EtOH對照定標。A-B幅圖中的數據是一式三份進行的3個獨立實驗的 平均值± SD。
圖22顯示DDMS對9L膠質肉瘤細胞體外增殖的作用。相同數量的9L 細胞(0.75 X 104)鋪板并在接觸各種濃度的DDMS或載體之前血清禁食1 天，24和48小時后進行細胞計數。(圖中)給出了一式三份進行的3個獨立實 驗的平均值±SD。
圖23顯示了 HET0016對EGF-剌激9L增殖的作用。9L培養物經血清禁 食，然后單用200 ng/ml EGF或用EGF和10 |uM HET0016處理。。24和48 小時后評估細胞增殖。
圖24顯示20-HETE促效劑WIT003對HET0019對體外生長9L膠質肉瘤 細胞的抗增殖作用的作用。A幅培養物血清禁食并用0.1 ^M或1 pM WIT003 處理。48小時后評估細胞數目。數據表示為對照。/。。B幅單用10 HET0016 或聯用1 WIT003處理9L細胞。處理24小時和48小時后通過計數細 胞來評估細胞增殖。數據表示為抑制％。給出了一式三份進行的3個獨立實 驗的平均值士SD。
圖25顯示HET0016在體內對9L膠質肉瘤腫瘤生長的作用。9L細胞 (1 X 104)注射入大鼠的大腦。經過2天確定有腫瘤后，用卵磷脂(載體)或 HET0016 (10 mg/kg/天)處理大鼠15天。A幅顯示了注射卵磷脂(載體)的 對照大鼠的大腦組織。B幅顯示了 15天后用HET0016處理的大鼠的大 腦組織。顯示的圖片是在5只對照動物和5只HET0016處理的動物中觀察到的代表性圖像。
圖26顯示HET0016慢性處理在體內對9L腫瘤生長的作用。A幅給出了 用載體或HET0016處理的大鼠中沿著腫瘤中點的HE切片。B幅比較了在連續 切片中用AIS圖像分析系統軟件檢測的對照和HET1006大鼠的腫瘤體積。(圖 中)給出了每組5只大鼠的平均值±SE。
發明詳述
本文公開了可通過調節20-HETE的活性來調控血管生成。本文還公開了 可通過20-HETE及其促效劑來刺激以及通過20-HETE合成抑制劑和拮抗劑來 抑制癌癥和腫瘤細胞增殖。
本發明使用大鼠骨骼肌和大鼠角膜作為例子證實了用至少3種化學性質 和機理不同的20-HETE合成抑制劑阻斷20-HETE合成可降低各種生長因子誘 導的血管生長。與該觀察結果一致的是，本發明人也證實給予20-HETE促效 劑可模擬生長因子誘導新血管生長的作用。這些發現提供了新的策略，從而通 過阻斷血管生成來治療或預防異常或過度的血管生長相關疾病和病癥，以及通 過誘導和促進血管生成來治療或預防與血管生長不足或血管衰退相關的疾病 或病癥。
本發明人使用人膠質瘤和大鼠膠質肉瘤癌細胞作為例子，顯示了不同類型 的化學性質和機理的20-HETE合成抑制劑在體外和體內均抑制癌細胞增殖并 且該抑制作用可為20-HETE促效劑逆轉。本發明人還發現20-HETE抑制劑不 影響正常細胞的基礎增殖。然而，用各種生長因子(EGF、 bFGF和VEGF)異 常刺激正常的人血管內皮細胞生長后，20-HETE抑制劑阻斷這些細胞的異常增 殖。這些發現為癌癥治療(包括輔助治療)和預防提供新的策略。
20-HETE的活性與合成在哺乳動物中十分保守。例如，迄今為止研究的 所有哺乳動物物種均表達CYP4A和CYP4F家族的酶并且20-HETE由白血球 產生，存在于血管中(Roman RJ.，尸/z;^W. i ev. 82:131-85， 2002)。因此，下 文實施例使用大鼠、大鼠細胞和人細胞所示的觀察結果可應用于所有哺乳動 物，例如人、犬、大鼠、小鼠和家兔。本發明一方面涉及通過充分抑制組織中20-HETE活性從而減少人或非人 哺乳動物組織中血管生成的方法。
在一個實施方案中，本發明的方法用于減少生長因子誘導的血管生成。技 術人員熟悉這種生長因子。例子包括，但不限于酪氨酸激酶依賴性生長因子， 例如VEGF、 bFGF、 EGF;胰島素、胰島素樣生長因子(IGF-1)和PDGF; 與G蛋白偶聯的受體，例如腎上腺素能(受體)、膽堿能(受體)、催產素、內 皮肽、血管緊張素、血管舒緩激肽、組胺、凝血酶和許多其它受體。
在另一個實施方案中，本發明方法用于減少腫瘤或癌細胞分泌的生長因子 誘導的血管生成。在還有另一個實施方案中，本發明方法用于減少非肌肉組織 (例如眼睛的非肌肉組織)中的血管生成(例如，新生兒與高濃度的氧接觸后， 受傷和炎癥后以及在糖尿病(患者)中)。在還有另一個實施方案中，本發明方 法用于減少處于炎癥，例如哮喘、類風濕性關節炎、骨關節炎、皮膚感染和損 傷、以及肺纖維化中的非肌肉組織的血管生成。
抑制人或非人哺乳動物的組織中20-HETE活性的一種合適的方法是給予 人或非人哺乳動物以足夠降低該組織中血管生成的量的20-HETE合成抑制劑。 術語"20-HETE合成抑制劑"指參與將花生四烯酸轉化為20-HETE的酶的抑 制劑。這種酶是已知的并且包括CYP4A和CYP4F家族的酶，例如CYP4A11、 CYP4F2禾卩CYP4F3 (Christmas P等，《/.腸/. C/z醫，276: 38166-38172,2001)。
本領域已知許多類型的20-HETE合成抑制劑，它們均可用于本發明的方 法。這些抑制劑包括以下文獻公開的U.S. 20040110830; WO0236108; WO0132164; Nakamum T等，A.oorg Med C7zew. 12:6209-6219; 2004; Nakamura T等，5z》org MW C7zew 14:5305-5308， 2004; Nakamura T 等，Med C/zem14:333-336， 2004; Nakamura T等，JMedC/zem. 46:5416-5427， 2003; SatoM等，5z'oorg Mec/CTzew11:2993-2995， 2001; MiyataN等，J尸Aamwco/. 133:325-329， 2001; XuF等，/尸/zflrwaco/五x; T7ze廣308:887-895， 2004; XuF等，J尸/z"/。/i eg"〃Wegr Com/ 尸/z;^'o/ 28:R710-720, 2002; RomanRJ.，尸/z;^Wi ev. 82:131-185， 2002，所有這些 文獻全文納入本文作為參考。這些抑制劑的例子包括N-羥基-N-(4- 丁基-2-甲基苯酚)-甲脒 (HET0016)、 N-(3-氯-4-嗎啉-4-基)苯基-N'-羥基亞氨甲酰胺(TS-0U)、 二溴十 二碳烯基甲磺酰亞胺(DDMS)、 l-氨基苯并三唑(ABT，得自Sigma Chemical Corp., St. Louis， MO)、 17-十八炔酸(17-ODYA)、咪康唑(得自Sigma Chemical Corp,， St. Louis, MO)、酮康唑、氟康唑和硫酸10十一炔酯(IO-SUYS)。 HET0016、TS陽011和DDMS是20-HETE的特異性抑制劑，17陽ODYA、 l-ABT 和咪康唑是特異性較低的抑制齊IJ(W00236108)。 HET0016、 l-ABT和 17-ODYA顯示能在體內降低20-HETE水平(WO0236108; Dos Santos EA等， 」w J尸/zjwo/ i egw/ /Wegr Com; 287:R58-68， 2004; Hoagland KM等， 外戸/師'cw 42:669-673， 2003; Cambj-Sap麗r L等，34:1269-1275， 2003;禾H Hoagland KM等，//"eWe""ow 41:697-702， 2003)。 WOO 132164 公開了一種合成HET0016的方法。還描述了合成具有抑制20-HETE合成的 類似性能的大量HET0016類似物的方法(Nakamura T等，Me" CTzem. 12:6209-6219， 2004; NakamuraT等，M^/C/zem Ze". 14:5305-5308， 2004; NakamuraT等，歷離gMedCAem丄機14:333-336， 2004; Nakamura T等，JMec/C/zem. 46:5416-5427， 2003;和Sato M等，歷oc^gMed C/ em Z^". 11:2993-2995， 2001)。 17-ODYA、 ABT和咪康唑得自Sigma Chemical Corp., St. Louis， MO。用于本發明目的的優選抑制劑包括HET0016、 TS-011和 D函S。
U.S. 20040110830公開了能抑制從花生四烯酸合成20-HETE的羥基甲 脒，所有這些衍生物可用于本發明。
由于當抗體施用入動物身體后一般能阻斷靶蛋白的功能，抗20-HETE合 成酶的抗體(單克隆或多克隆)也可用作20-HETE合成抑制劑(Dahly， A丄， /^S￡SJ. 14:A133， 2000; Dahly， A丄，乂 Jw. Soc. A^7A卬/0gy 11:332A， 2000)。CYP4A和CYP4F家族的所有已知成員的DNA和蛋白質氨基酸序列 均得到公布并且可用。因此，技術人員可制造包括20-HETE合成酶的人源 化抗體的抗體。例如，已制造了抗CYP4A1和CYP4A10的抗體，并且這些 抗體顯示能抑制CYP4A1和CYP4A10的酶活性(Amet， Y,等，腸c/zem
14尸/zflrmaco/. 54(8): 947-952， 1997; Amet， Y.等，尸/zarmaco/. 53(6): 765-771， 1997; Amet， Y.等，J/co/zo/CY,".22(2): 455-462， 1998)。 某些這種抗體也可購得(例如，抗-CYP4Al得自Gentest Corp.， Woburn， Massachusetts) o
抑制人或非人哺乳動物組織中20-HETE活性的另一種合適的方法是給予 人或非人哺乳動物以足夠降低組織中血管生成的量的20-HETE拮抗劑。可用 所有已知的20-HETE拮抗劑。這些拮抗劑包括公開于以下文獻的美國專利 號6,395,781; YuM等，￡wr J泡畫co/. 486:297-306， 2004; YuM等，
Med C/ 麼11:2803-2821 ， 2003;和Alonso-Galicia M等，」w J尸/z戸W. 277:F790-796， 1999;所有這些文獻全文納入作為參考。例子包括19羥基 十九烷酸、20羥基二十碳-5(Z),14(Z), 二烯酸和N-甲磺酰基-20-羥基二十 碳-5(Z)，14(Z)-二烯酰胺。
可通過本發明的方法治療或預防異常和過度的血管生長相關疾病和病癥。 "治療疾病"指某種疾病發生后降低其嚴重性或使得某疾病的癥狀消失。"預 防疾病"指防止疾病發展或在疾病開始時降低其嚴重性。可治療或預防的疾病 和病癥的例子包括，但不限于癌癥(例如，腦癌和其它實體組織腫瘤)、置于高 氧孵育箱中新生兒的角膜血管化與受傷或感染后眼睛、皮膚或其它器官的血管 化。除了作為受傷或感染的結果的血管化以外，也可治療或預防其它眼病，例 如不受控制的血管生成導致的新血管眼病。在該例子中，應該注意的是視網膜 和脈絡膜循環的病理性血管生成是許多眼病的嚴重后果。視網膜新血管化發生 于糖尿病性視網膜病變、鐮狀紅細胞性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞和早熟 性視網膜病變(ROP)。中樞視網膜靜脈或其一條支脈的阻塞可導致視力迅速 降低并伴有視網膜新血管生成的后遺癥。在前缺血性視神經病中衍生于脈 絡膜系統，供應視神經的血管可被阻斷。產生自脈絡膜毛細管的新血管導 致在年齡相關的黃斑變性和基質黃斑疾病中脈絡膜新血管化的發生。
不適當的血管生成還涉及動脈粥樣硬化癥和再狹窄、先天肺纖維化、急性 成人呼吸窘迫綜合征和哮喘中的有害重塑。此外，血管生成與關節炎癥，例如 類風濕性關節炎相關。所有這些疾病可用本發明的方法治療或預防。除了上述疾病和病癥之外，其它可治療或預防的疾病和病癥包括(但不限于)表1所列的
(Ca薩liet P，淑匿MeW"力e 9:653-660，2003;禾卩Carmeliet P，J /"^tz. Md 255:538-561， 2004， 二者均全文納入作為參考)。有關這些疾病的其它信息 見Storgard CM等，103:47-54 (1999)與Greene AS和Amaral SL， //，e"e似4:56-62 (2002)，所有這些文獻全文納入本文作為參考。
表l-以異常或過度的血管生成為特征或由其導致的疾病
器官 小鼠或人的疾病
許多器官 癌癥(癌基因的激活；腫瘤抑制基因的喪失)；感染
性疾病(病原體表達血管生成基因，誘導血管生成 進程或轉化EC);自身免疫疾病(肥大細胞和其它白 細胞的激活)
血管 血管畸形(Tie-2突變)；迪喬治綜合征(低VEGF和
神經氈蛋白-1表達)；HHT(內皮糖蛋白或ALK-1突 變)；海綿狀血管瘤(Cx37和Cx40喪失)；動脈粥樣 硬化癥；移植動脈病
脂肪組織 肥胖癥(脂肪飲食誘導的血管生成；血管生成抑制
劑導致的體重降低)
皮膚 銀屑病、疣、過敏性皮炎、傷疤瘢痕瘤、化膿性肉
芽腫、起泡性疾病(blistering disease)、 AIDS患者中
的卡波西肉瘤
眼 持續增生性玻璃體綜合征(Ang-2或VEGF喪失)；
糖尿病性視網膜病變；早熟性視網膜病變；脈絡膜 新血管化(TIMP-3突變)
肺 原發性肺動脈高壓種系BMPR-2突變；體細胞EC突變)；哮喘；鼻息肉
腸 炎性腸病和牙周病、腹水、腹膜粘連
生殖系統 子宮內膜異位癥、子宮出血、卵巢囊腫、卵巢刺激
過度
骨骼，關節 關節炎、滑膜炎、骨髓炎、骨贅形成_
本發明的另一方面涉及將足夠降低組織中血管生成的量的HET0016或 DDMS給予哺乳動物來減少人或非人哺乳動物組織中血管生成的方法。
本發明的另一方面涉及將足夠降低組織中血管生成的量的TS-011給予哺 乳動物來降低人或非人哺乳動物組織中血管生成的方法。
本發明的另一方面涉及通過充分增加組織中20-HETE活性從而誘導和促 進血管生成來誘導和促進人或非人哺乳動物組織中血管生成的方法。在一個實 施方案中，該方法用于誘導和促進非肌肉組織中的血管生成。
增加人或非人哺乳動物組織中20-HETE活性的一種合適的方法是給予人 或非人哺乳動物以足夠誘導和促進組織中血管生成的量的20-HETE或其促效 劑之一。可用所有己知的20-HETE促效劑。這些促效劑包括公開于以下文獻 的美國專利號6,395,781; YuM等，￡w J泡畫co/. 486:297-306， 2004; 和Alonso-GaliciaM等，J尸/^wW. 277:F790-796， 1999。例子包括20羥 基二十烷酸、20羥基二十碳-6(2),150二烯酸( 1丁003)和^甲磺酰基-20-羥基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酰胺。
可由本文提供的方法預防或治療血管生成不足或血管退化相關的疾病或 病癥。例如，可預防或治療與糖尿病和缺血性心臟病相關的周圍血管疾病。治 療性血管生成有助于降低患周圍血管疾病患者對截肢的需要，在心臟血管成形 術的情況中，該療法可提高心臟病發作后的存活率并可提高或者甚至替代旁路 手術。類似地，給予20-HETE或其促效劑來增加血管生成可減輕缺血性中風 后和大腦區域血管化降低相關病癥(例如，阿爾茨海默病)中的細胞死亡和神經 缺陷。其它可預防或治療的疾病和病癥包括(但不限于)下表2所列的(Carmeliet
17P， 《/ M /. 255:538-561， 2004)。
表2-血管生成不足或血管退化為特征或導致的疾病
器官 小鼠或人的疾病 血管生成機理
神經系統 阿爾茨海默病 通過淀粉樣-卩的EC毒性導致血管
收縮、微血管退化和大腦血管病
肌萎縮性側索硬化癥；VEGF生產不足導致灌流和神經保糖尿病性神經病變護受損，從而造成運動神經元或軸
突退化
中風
存活率與大腦血管生成相關；動脈病導致的中風(Notch-3突變)
血管
動脈粥樣硬化癥 特征為側血管生長受損
高血壓
由于血管舒張或血管生成受損導致微血管稀疏化
糖尿病
特征為局部缺血肢的側面生長和血管生成受損，但隨周細胞減少視網膜新血管化提高
再狹窄
老年人動脈受傷后再內皮化受損
胃或口腔潰瘍 由于病原體產生血管生成抑制劑
導致愈合滯后
克羅恩病
特征為粘膜局部缺血
皮膚
脫發
血管生成抑制劑導致頭發生長遲皮膚紫癜、毛細管擴張
和靜脈湖(venous lake)
形成
由于EC端粒變短造成血管數量和成熟(SMC減少)的年齡依賴性降低
生殖系統
先兆子癇
由于通過可溶性Flt-1除去VEGF
造成EC功能障礙從而導致器官衰竭、血栓形成和高血壓
肺
月經過多(子宮出血)
新生兒呼吸窘迫
由于Ang-1產量低造成SMC-不良血管易碎
由于HIF-2a和VEGF產量降低導
致早熟小鼠的肺成熟不完全且表
面活性劑生產不足
肺部纖維化、肺氣腫基于VEGF抑制的蜂窩狀EC凋亡
冃
腎病
由于TSP-1產生導致年齡血管的血管喪失
骨骼 骨質疏松癥、骨折愈合受影響
VEGF驅動血管生成的年齡依賴性減少導致骨形成受損；血管生成抑制劑阻止骨折愈合
本發明的另一方面涉及通過給予哺乳動物以足夠誘導或促進組織中血管生成的量的20羥基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸來誘導和促進人或非人哺乳動物組織中血管生成的方法。
本發明另一方面涉及通過使腫瘤或癌細胞與選自20-HETE合成抑制劑或20-HETE拮抗劑的藥物接觸來抑制腫瘤或癌細胞增殖的方法，所述藥物的量足夠抑制腫瘤或癌細胞增殖。在一個實施方案中，該藥物給予患癌癥或腫瘤的人或非人哺乳動物以治療癌癥或腫瘤。在另一個實施方案中，給予該藥物以預防癌癥或腫瘤發生。
19已知癌細胞能產生造成它們異常生長的自分泌生長因子。在以下實施例
中，本發明人證實20-HETE在介導響應生長因子的細胞促有絲分裂應答中起作用。不想受限于任何理論，本發明人相信20-HETE合成抑制劑和20-HETE拮抗劑通過抑制生長因子的信號轉導途徑來抑制癌癥或腫瘤細胞增殖。此外，以上癌癥或腫瘤細胞生長也取決于生長因子的分泌來剌激血管生成并向腫瘤供血。本公開內容證實20-HETE的合成與作用抑制劑在至少兩種不同的體內模型系統中阻止生長因子誘導的血管生成。因此，可進一步推理通過20-HETE合成抑制劑和拮抗劑對腫瘤誘導的血管生成的這種抑制作用也有助于它們的體內抗癌癥活性。在一優選的實施方案中，20-HETE合成抑制劑和20-HETE拮抗劑用于預防或治療神經膠質細胞來源(神經膠質瘤)和星形細胞來源(星形細胞瘤)的腦癌以及上皮組織(惡性腫瘤)的癌癥，例如某些類型的腸癌、乳腺癌(例如，導管乳腺癌)、皮膚癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、結腸癌和卵巢癌。在一更優選的實施方案中，預防或治療乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、皮膚癌和胰腺癌的膠質瘤和惡性腫瘤。合適且優選的20-HETE合成抑制劑和20-HETE拮抗劑如上所述。
本發明的另一方面涉及通過使腫瘤或癌細胞與HET0016或DDMS接觸來抑制腫瘤或癌細胞增殖的方法，其中HET0016或DDMS的量足夠抑制腫瘤或癌細胞增殖。在一個實施方案中，HET0016或DDMS給予患癌癥或腫瘤的人或非人哺乳動物以治療癌癥或腫瘤。在另一個實施方案中，給予HET0016或DDMS以預防癌癥或腫瘤發生。
本發明的另一方面涉及通過使腫瘤或癌細胞與TS-011接觸來抑制腫瘤或癌細胞增殖的方法，其中TS-011的量足夠抑制腫瘤或癌細胞增殖。在一個實施方案中，TS-011給予患癌癥或腫瘤的人或非人哺乳動物以治療癌癥或腫瘤。在另一個實施方案中，給予TS-011S以預防癌癥或腫瘤發生。
就本發明的具體應用而言，例如預防或治療具體的疾病或病癥，技術人員易于確定特定給藥途徑的某種20-HETE合成抑制劑或20-HETE促效劑或拮抗劑的最優劑量。本發明不受限于特定的給藥途徑。合適的給藥途徑包括(但不限于)口服、靜脈內、皮下、肌肉內和注射入特定的器官或組織。基于以下非限制性實施例可更完全地理解本發明。
實施例1
通過20-HETE調節骨骼肌血管生成本實施例證實20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)對骨骼肌中電刺激誘導的血管生成是重要的。刺激大鼠的脛骨前肌肉和指長伸肌7天。電刺激顯著增加了肌肉中20-HETE形成和血管生成，它被N-羥基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)或l-氨基苯并三唑(ABT)的慢性處理阻斷。用HET0016或AB丁慢性處理未阻斷VEGF蛋白質在兩種肌肉中表達的增加。為分析VEGF對20-HETE形成的作用，用VEGF中和抗體(VEGF Ab)處理其它大鼠。VEGF Ab阻斷刺激誘導的20-HETE形成。這些結果證明20-HETE與血管生成的下游信號傳遞途徑(VEGF的下游)有關。材料與方法
動激》/辨手術所有方案得到Wisconsin醫學院的動物實驗管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of the Medical College ofWisconsin)的批準。大鼠安置于Wisconsin醫學院的動物研究中心(AnimalResource Center of the Medical College of Wisconsin)并隨意給予食物和水。通過肌肉內注射開他敏(100 mg/kg)和乙酰丙嗪(2 mg/kg)的混合物麻醉7-8周齡的32只雄性Sprague-Dawley大鼠。在胸腰部以上進行皮下切割并植入以前設計并證實對慢性研究有效的小型電池驅動的刺激器(Linderman JR等，M/cm">cw/a//(^ 7: 119-128， 2000)，適當固定。在覆蓋右后肢膝關節(在腓總神經的區域之上)側面的皮膚與筋膜中切另一個開口。 一對電極在皮膚下從刺激器引出并固定于接近腓總神經的包圍膝蓋的肌肉上(Ma YH等J/wJ尸/y^0/CompP/z>^/o/267: R579-R589, 1994)。用生物相容的丙烯酸粘固劑(Loctite; Rocky Hill， CT)局部固定而遠端用細縫合線(規格5-0， Ethicon;Somerville， NJ)固定電極。縫合兩處切口的皮膚，并且第二天允許大鼠在刺激時期開始之前恢復。
實發方,與教織劍備24小時恢復期后，使用小的手提式磁鐵瞬間閉合
21磁性彈簧開關來激活植入的刺激器。刺激器通過以0.3-ms持續時間的方波脈 沖、10-Hz頻率和3-V電位刺激腓總神經從而在小腿肌肉中產生電誘導的肌肉 收縮(Linderman JR等，M/c腦.簡/Wo" 7: 119-128， 2000)。指長伸肌(EDL) 和脛前(TA)肌肉于每天早上9點自動收縮并持續8h/天，連續7天。在刺激期 結束時，以過量的戊巴比妥鈉(IOO mg/kg ip)無痛處死大鼠，收集EDL和TA 肌肉以進行前述分析(Greene AS等，//，W腦'o" 15: 779-783， 1990;和 Parmentier JH等，Z/，eWe肌'cw 37: 623-629， 2001)。
大鼠分為4組。為評價20-HETE在VEGF蛋白表達和骨骼肌血管生成中 的作用，組1的9只大鼠在電刺激期間每天接受腹膜內注射有效和選擇性的 CYP4A酶抑制齊!j[N-羥基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)， Taisho Pharmaceutical (Miyata N等，￡r/尸/u^maco/ 133: 925-929， 2001)]兩次，每 次注射的劑量為1 mg/kg。該劑量是基于以前研究結果選擇的(KehlF等，
CVc尸/z"/o/ 282: H1556-H1565， 2002)。在該項研究中，10 mg/kg靜脈內的劑量在多個小時期間產生的血漿濃度遠超過(高10 倍)HET0016在血漿中的有效抑制濃度。
為比較HET0016與更常用，但特異性較低的抑制劑的作用，在電刺激期 間用l-氨基苯并三唑(ABT;組2)以50mg'kg十天-'腹膜內(ip)的劑量處理4 只大鼠。
為確定VEGF對電刺激誘導的血管生成的作用，組3的6只大鼠在電刺激 期間以3 mg/kg ip注射單克隆VEGF-中和抗體(Texas Biotechnology; Houston, TX)來處理。VEGF-中和抗體的給藥方案是Zheng W等，(C/rc 85: 192-198， 1999)的改進方案，該劑量是基于我們以前研究的結果(Amaral SL 等，M/croc/rcw/a"o" 8: 57-67， 2001)。刺激時期開始后，大鼠在第3、 5和7 天接受腹膜內注射(0.6 mg/100 g)。
組4的大鼠用HET0016的載體卵磷脂(n = 9)或用用于VEGF抗體的鹽 水，PBS (n = 4)處理。由于在用每種載體處理的大鼠中獲得的結果無明顯差異， 合并這些組的結果。
M-iffi7E ^^,1#^/激在電刺激的最后一天，大鼠置于有效分開尿液和食物的代謝籠中。就在開始收集尿液之前取走食物以免污染尿樣，并將24-小時對照和處理的尿液樣品收集入包裹有冰的玻璃瓶中。使用前述的熒光
HPLC測定(Maier KG等，J尸—'o/ Oc尸—'o/ 279: H863-H871 ，
2000)來檢測尿液樣品中20-HETE的濃度。加入25 ng內標[20-5(Z)，14(Z)-羥 基二十碳二烯酸(WIT-002)， Taisho Pharmaceutical; Saitama， Japan]后，用 甲酸將樣品酸化至pH 4，用1 ml乙酸乙酯提取并用氬氣干燥有機相。樣品重 新溶解于1 ml的20%乙腈并上樣于Sep-Pak Vac柱(Waters; Milford， MA)。 用1 ml的30%乙腈洗滌柱兩次，用400 pi的90%乙腈洗脫含有HETE和 EET的部分。樣品稀釋于水中，上Sep-Pak Vac柱，用500 pi乙酸乙酯洗 脫然后干燥。脂質部分用含有36.4mM三氟甲磺酸2-(2,3-萘亞氨基)乙酯的 20 ^乙腈標記。加入N,N-二異丙基乙胺(IO M!)以催化反應。使用Sep-Pak Vac提取(Maier KG等，爿m J尸/z"/。/ 尸/z"/oZ 279: H863-H871 ，
2000)除去過量的染料，在氬氣環境中干燥樣品，懸浮于lOOpl甲醇并通過 使用熒光檢測器(型號L-7480; Hitachi, Naperville, IL)的反向HPLC(Waters) 分析。通過比較20-HETE峰面積與內標的峰面積確定樣品中20-HETE的量。
教織汰桌浙i,麥度游,漆,分橋取下經刺激的和對側的肌肉，稱 重并在生理鹽溶液中清洗。從TA肌肉向頭的部分取300-mg樣品并冷凍于 液氮用于Western印跡(IOO mg)和HPLC (200 mg)分析，分別檢測VEGF蛋 白表達和20-HETE形成。剩余的TA和EDL肌肉輕輕地固定于0.25%福爾 馬林溶液過夜。用手動切片機通過固定肌腱并平行于肌肉纖維的縱向切片 將肌肉切為約100 pm厚。每只動物制備兩個EDL肌肉切片和3個TA肌 肉切片。這些切片浸于25 pg/ml羅丹明標記的Griffonia simplicifolia I (GS-I) 卵磷脂(Sigma; St. Louis， MO (Greene AS等，//>^eWe"w'o" 15: 779-783， 1990))溶液中2小時。接觸GS-I卵磷脂2小時后立即在生理溶液中漂洗肌 肉。15和30分鐘后重復該清洗過程，并將肌肉在生理鹽水溶液中漂洗12 小時(過夜，4°C)。第二天，切片用含有甲苯和丙烯酸樹脂的水溶性封固培 養基(SP ACCU-MOUNT 280， Baxter Scientific)封固于顯微鏡載玻片上。
如前所述，標記的切片使用反射照明的影像熒光顯微鏡系統(Olympus，1.6 cm工作距離和0.4數值的口徑)目測 (Parmentier JH等，i/，eWera/o" 37: 623-629， 2001)。在本項研究中，分別 選擇10-15和20-25個代表性視野來研究每個EDL和TA肌肉切片。每個 視野轉化為數字化圖像(DT2801 Data Translation; Marlboro, MA)并以分辨 率為512 X 512像素的8-位/像素圖像文件保存。掃描的組織化學切片的 形態計量分析如前所述進行(Parmentier JH等，37: 623-629， 2001)。以前已證實血管-網格交叉(Vessel-grid intersection)可精確且定量地 估計血管密度(Parmentier JH等，/fy; eWe"w'ow 37: 623-629， 2001)。
W^Wem伊_^分,"檢,/ 蚤^游存玄勻漿100-mg TA肌肉樣
品，蛋白質懸浮于鉀緩沖液中(lOmM)。在12%變性的聚丙烯酰胺凝膠上從 TA和己知高水平表達VEGF的腫瘤細胞系(C6，美國模式培養物保藏所， 107-CCL)分離5微克蛋白質(由蛋白質測定試劑盒測定，Bio-Rad; Hercules, CA)。將凝膠轉移至在稀釋于Tris-緩沖鹽水(50 mM Tris和750 mM NaCl， pH 8)的5%脫脂奶粉和0.08%吐溫20(Bio-Rad)中封閉過夜的硝酸纖維素膜 上。印跡然后與來源于人VEGF序列的肽的多克隆抗體(1:1，000稀釋，克隆 G143-850， Pharmingen)于室溫孵育2小時。洗滌印跡，然后以1:1,000稀釋 度與山羊抗-小鼠二抗于室溫孵育1小時，再經SuperSignal West Dura化學 熒光底物(Pierce; Rockford， IL)檢測系統(檢測)。膜對X-射線膠巻(Fuji Medical; Stamford, CT)曝光15-30秒并用Kodak M35 X-Omat處理器顯影。 為定量分析VEGF，薄膜總是曝光一段時間以保證所有信號在膜檢測的線 性范圍內。使用形態計量成像系統(Metamorph， Universal Imaging; West Chester, PA)定量VEGF區帶強度并將數值表示為(36腫瘤細胞標準物的百 分比。
^f檢,/20-//五7E游巡^劍吝欽100-200 mg冷凍的TA肌肉在含有1 ml 酸化水和由Taisho Pharmaceutical合成并惠贈的50 )til內標，WIT-002的溶 液中勻漿。向混合物中加入乙酸乙酯(3 ml， Fisher Scientific; Pittsburgh, PA)
并小心攪拌。勻漿的組織然后以3,000轉/分鐘離心2分鐘。使用玻璃巴斯德 移液管移去上層并轉移至無菌的玻璃小瓶，樣品在氮氣環境中干燥并保存于
24-8(TC。
#^標記浙20-//￡7^游資^檢簾如前所述檢測20-HETE(Ma YH等， Jm J尸/z",'o/ i egw/ /Wegr Comp 267: R579-R589， 1994)。提取樣品
并在氬氣環境中干燥，將其重懸于含有36.4 mM 2-(2,3-萘亞氨基)乙基三氟 甲磺酸酯的20 pl乙腈中，并加入N,N-二異丙基乙胺(10)Ld)作為催化劑。樣 品于室溫反應30分鐘，在氬氣環境中干燥，重懸于1 ml的40。/。乙腈-水， 上Sep-Pak Vac柱。用6ml的50%乙腈-水溶液洗滌柱以除去未反應的染料， 500 fil乙酸乙酯洗脫，氬氣環境中干燥并重懸于100 pl的HPLC流動相中[甲 醇-水-乙酸，82:18:0.1 (體積/體積)]。25卞1等份衍生的樣品在4.6 X 250-mm Symmetry C18反向HPLC柱(Waters)上使用甲醇-水-乙酸，82:18:0.1 (體積/ 體積)作為流動相以1.3 ml/分鐘的流速等度分離。使用串聯的熒光檢測器(型 號L-7480， Hitachi; Naperville， IL)以中等增益靈敏度檢測熒光強度。通過 比較20-HETE峰面積和內標(WIT-002)的峰面積確定樣品中20-HETE的量。
^^為^^^統^:就每份肌肉而言，所有選擇的視野(每份EDL肌肉是 10-15次掃描X 2片；每份TA肌肉是20-25次掃描X 3片)的血管計數 取單個血管密度的平均值。血管密度表示為每個顯微鏡視野(0.224 mm"的血管 -網格交叉的平均數。就每個實驗組而言，將受刺激肌肉的檢測到的血管密度 和20-HETE形成與其未刺激的對應部分以及年齡匹配的對照相比較。所有數 值表示為平均值± SE。使用具有一個因子(刺激)的重復測量值的雙因子 ANOVA(藥物X刺激)評估同一動物中檢測值差異的顯著性。使用事后測 試(post hoc test)(Tukey's)進一步調查顯著的差異。
結果
為評估阻斷CYP4A酶的作用，我們檢測了用HET0016處理7天的大鼠中 的尿液20-HETE排泄。圖1給出了闡述20-HETE分離的代表性HPLC色譜。 如圖1所示，在非常接近20-HETE處有其它峰。基于標準品的共遷移，我們 鑒定了色譜圖中前一個峰是19-HETE， 20-HETE后一個峰是18-HETE。下一 個峰是16-HETE，其后是15-HETE。如材料與方法所述，為分析每個峰的面積， 我們通過去褶合方法(Hitachi軟件)扣除了肩峰。如圖2所示，與用卵磷脂處理的對照組相比，用HET0016慢性處理顯著 降低了(36%)24-小時的尿液20-HETE排泄(尸< 0.05)。
如圖3所示，7天的電刺激顯著增加骨骼肌中20-HETE形成(未刺激和刺 激的肌肉分別是從69.52 ± 31.3到177.58 ± 54.4 ng/g肌肉，P < 0.05)。用 HET0016處理7天未改變骨骼肌中20-HETE的基礎形成量(處理和對照的分別 是110.26 ± 28.36和69.52 ± 31.3 ng/g肌肉，尸> 0.05;圖3);然而，用HET0016 慢性處理完全阻斷了由電刺激誘導的骨骼肌中20-HETE形成的增加(未刺激和 刺激側分別是從110.26 ±28.3到102.1 ±22.3 ng/g肌肉；圖3)。
如前所示，電刺激導致用卵磷脂處理的對照組中血管密度增加(EDL和TA 的血管交叉數量分別是從107.0 ± 1.6到121.0 ± 4.5和從100.4 ± 8.4到132.0 士9.9，尸<0.05)。如圖4所示，用HET0016慢性處理完全阻斷了 7天電刺 激誘導的骨骼肌中血管密度的增加(EDL和TA的血管交叉數量分別是從 116.0 ± 1.0到118.0 ± 10.1和從105.7 ± 4.9到110.5 ± 1.1)。使用ABT慢性 抑制20-HETE形成也減緩了電刺激誘導的骨骼肌中血管密度的增加(EDL 和TA的血管交叉數量分別是從111 ± 7.4到121 ± 4.35和從99.7 ± 4.72到 119.5 ±4.51)。
由于VEGF顯示在骨骼肌血管生成中起重要作用，我們進行了 Western 印跡分析以確認HE丁0016或ABT對VEGF蛋白表達的作用。圖5顯示了 Western印跡分析的定量光密度測定，用于比較7天刺激后所有用HET0016 處理的動物或對照組中VEGF蛋白表達響應。如圖5所示，在對照組中，電刺 激顯著增加了 VEGF蛋白水平(尸< 0.05)。為比較HET0016和另一種CYP4A 抑制劑的作用，我們在電刺激期間用ABT處理動物組7天，結果示于圖5。 HET0016或ABT對基線VEGF表達均無任何作用。HET0016或ABT未阻斷 電刺激誘導VEGF蛋白表達的增加。
在一個補充實驗中，用VEGF-中和抗體或PBS(對照)處理大鼠來分析 VEGF對20-HETE形成的作用。如圖6所示，用VEGF抗體處理完全阻斷了 由于7天電刺激誘導的20-HETE形成的增加。實施例2
通過20-HETE調節大鼠角膜中生長因子誘導的血管生成 CYP4A酶將花生四烯酸代謝為20-HETE。在該實施例中，我們證實 20-HETE在體外的內皮細胞中體外是促有絲分裂的，體內是血管生成性的。我 們還證實高選擇性的CYP4A酶抑制劑HET0016阻斷VEGF在內皮細胞中的促 有絲分裂活性。DDMS是CYP4A的另一種選擇性抑制劑。我們證實HET0016 和DDMS抑制體內VEGF的血管生成響應。我們還證實HET0016阻斷bFGF 和EGF的血管生成響應。我們也證實HET0016降低U251， 一種人成膠質細 胞瘤細胞系誘導的血管生成。 材料與方法 微
如MiyataN等，(Br J Pharmacol 2001 ， 133:325-9)禾口 SatoM等，(Bioorg Med Chem Lett 2001， 1 l:2993-5)所述(全文納入作為參考)合成HET0016 [N-羥基-N'-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]，并由Taisho Pharmaceuticals Corp (Satiama， Japan)提供。CYP4A抑制劑DDMS和穩定的20-HETE促效劑， WIT003[20-羥基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸]由德克薩斯大學西南醫學中心 (University of Texas Southwestern Medical Center)的JR Falck博士合成 (Capdevila JH禾口 Falck JR， Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002， 68-69:325-44)并且在以前使用過(Alonso-Galicia M等，Am J Physiol 1999， 277:F790-6; WangMH等，J Pharmacol Exp Ther 1998， 284:966-73;禾口 Yu M等，Eur J Pharmacol 2004， 486:297-306)。 VEGF、 bFGF禾口 EGF購自R&D Systems (Minneapolis, MN)，NCC型Hydron得自Interferon(New Brunswick, NJ)。 PCR引物由Qiagen (Valencia, CA)合成。人血管內皮細胞(HUVEC)和 相關的培養試劑購自Cambrex (Walkerville， MD)。所有其它的培養試劑購 自Invitrogen (Carlsbad, CA)。棕櫚酸和所有其它的試劑購自Sigma Chemical Corp (St. Louis, MO)。
動激
使用體重200-225 g、 7-8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA)進行實驗。大鼠安置于12小時/12小時白天 /夜晚循環環境中，供給食物并隨意飲水。所有方法符合在眼科和視覺研究 中使用動物的ARVO聲明。使用動物得到亨利福特健康系統(Henry Ford Health System)的動物實驗管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)， Detroit, MI的批準。
冊rac潸遊始
HUVEC以1 X 104細胞/孔接種于96-孔板。培養物生長過夜，然后 單獨接觸10 fiM HET0016、 1 |iM WIT003或250 ng/ml VEGF或聯合 HET0016或WIT003共同接觸。HET0016和WIT003均溶解于乙醇。有機 溶劑濃度切勿超過總培養物體積的0.1%。 24小時后，使用CellTiter96 AQueous One試劑(Promega， Madison, WI)， 一種用于測定增殖的存活細 胞數量的可靠比色方法來檢測細胞增殖。20 pi Aqueous One試劑加入每孔 的100pl培養基中。板在增濕孵育箱中于37r孵育2小時。使用96- L Bio Kinetics Reader EL340(Bio-TEK， Winooski， VT)記錄490 nm的吸光度。數 據表示受處理的培養物與對照細胞相比吸光度變化百分數。進行了 3個不 同的實驗，并且每點均進行一式三份的測定。
雄資逾散劇定
(i)制備緩釋聚合物通過制備1:1的120/。聚合物(Hydron聚羥基乙基甲 基丙烯酸酯)乙醇溶液和含有生長因子的鹽水的混合物來制備緩釋聚合物小 球。生長因子bFGF、 VEGF禾n EGF以濃度125 ng l溶解。HET0016和 WIT003(YuM等，Eur J Pharmacol 2004， 486:297-306)以濃度為10 ng/pl溶 解于乙醇，DDMS以濃度為5 Mg l溶解于乙醇。向每個小球加入2pl的這 些溶液。因此，含有250 ng單一生長因子的小球隨機植入右眼或左眼。另 一只眼睛中植入同一劑量的含有生長因子+11￡丁0016的小球。在一些大鼠 中，小球含有單一的VEGF和VEGF + DDMS。在一只眼睛內植入20 jig 穩定的20-HETE促效劑類似物WIT003以確定它是否誘導血管生成。由于 乙醇是HET0016、 DDMS和WIT003的載體，加入乙醇作為所有其它小球 的對照。9 ^的1:1 Hydron/處理混合物置于1.5-cm桿的末端。每個小球含有250 ng其各自的生長因子。就bFGF而言，我們使用硫糖鋁來穩定并維 持該生長因子緩釋(VolkinDB等，Biochim Biophys Acta 1993， 1203:18-26)。 小球干燥l小時后，可立即用于植入大鼠的角膜。
(ii) 小球植入用開他敏(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)經IM麻醉大鼠。 眼睛用0.5。/。丙氧苯卡因(Ophthetic， Alcon， TX)局部麻醉并用珠寶鑷子使眼 球突出。使用手術顯微鏡在平行于插入側向直肌的方向用手術刀 (Bard-Parker # 11; Becton Dickinson, Franklin Lake, NY)進行約1.5mm長 的中心基質內線形角膜切開術。約1.5 mm寬、5 mm長的彎曲虹膜刮刀(No. 10093-13， Fine Science Tools, Belmont, CA)插入切口的邊緣下并將其朝眼 睛的顳颥角膜緣(temporal limbus)小心地推過基質。角膜緣和袋之間的距離 維持于1.0 ± 0.1 mm。小球伸到袋的顳颥(temporal)末端。抗生素軟膏(紅霉 素)涂在眼睛的前表面。
(iii) U251人膠質瘤細胞球狀體U251人膠質瘤細胞由Stephen Brown博 士(輻射腫瘤學部門，Henry Ford Health System, Detroit, MI)饋贈。細胞維 持于補加了 10%熱滅活的胎牛血清、青霉素(10 IU/ml)、鏈霉素(IO (ig/ml) 和10。/。非必需氨基酸的DMEM (Invitrogen)中并于37。C生長在含有5。/。 C02. 的增濕孵育箱中。按照Carlsson和Yuhas(Carlsson J禾口 Yuhas JM， Recent Results Cancer Res 1984， 95:1-23)的改進方法獲得U251球狀體。簡言之，通 過在一層0.8%Noble瓊脂(Difco， Livonia, MI)上接種單細胞懸浮液(5 X 106 個細胞)來制備腫瘤細胞球狀體。細胞生長2-3天直至球狀體形成。選擇直徑 相似的球狀體，然后轉移到細胞培養皿上并用PBS洗滌以除去痕量的血清。使 用安裝了標尺的解剖顯微鏡測量球狀體直徑。5-8個直徑約200 |im的球狀體吸 入裝有鈍頭27規格針頭的注射器并插入角膜袋。在該實驗中， 一只眼睛含有 球狀體和含有乙醇(HET0016溶劑)的小球，而另一只眼睛接受球狀體和含有 20 (ig HET0016的小球。
(iv) 定量角膜新血管化小球植入7天后，大鼠如前述用開他敏和甲苯噻 嗪深度麻醉殺死。左心室插入導管并用20-25 ml鹽水經作心室灌注動物，然后 用20-25 ml India墨水(防水的繪圖墨水，Sanford， Bellwood， IL)灌注。目艮
29睛作朝向標記、摘下并置于4%福爾馬林中24小時。將角膜與周圍的眼球 和其下的虹膜切開，對切并松散地安放于兩塊玻璃載玻片之間從而輕柔地
鋪平角膜。使用裝了 CCD影像照相機的Nikon Diaphot Epi-fluor 2顯微鏡顯 微檢查這些平坦的固定物，使用計算機數字化圖像并保存。
通過比較對照和實驗眼睛中總的血管長度測定新血管化。通過追蹤角膜緣 到小球的每根血管來確定血管長度。總長度是以像素計的這些值的和，并使用 常規圖像分析軟件(SigmaScanPro， SPSS, Chicago, IL)確定。
教
在所有情況中，兩只眼睛均植入小球。 一只眼睛作為對照，另一只是實驗 組。研究了下列組。 組l.對照
僅含有2pl乙醇的小球植入大鼠角膜。在一些實驗中，我們測試了小球中 僅存在脂肪酸所導致的非特異性作用。在這些實驗中，小球含有40pg棕櫚酸 ("=4)。在僅用乙醇處理和用含有棕櫚酸的乙醇處理的眼睛之間VEGF的血管 生成響應沒有差異。
組2.CYP4A抑制劑HET0016的作用
對照對20嗎HET0016或10 |ug DDMS.基于下述的劑量-應答研究選 擇這些劑量("=6)。包括該組是為確定抑制劑是否具有任何明顯的毒性或促 血管生成作用。在一些大鼠中也測試了 DDMS(10 pg/小球)的作用。
組3. HET0016抑制VEGF血管生成應答的劑量應答
a. VEGF對VEGF + 5嗎HET0016 (n = 4)
b VEGF對VEGF + 20 ngHET0016(n = 4)
c. VEGF X寸VEGF + 40(igHET0016(n = 4)
組4.HET0016的抗血管生成作用.
在這些大鼠中，我們測試了 HET0016在VEGF、 bFGF和EGF的新血管 化應答中的作用。
a. VEGF對VEGF + 20 HET0016 (n = 6)
b. bFGF對bFGF + 20 pgHET0016 (n = 6)c. EGF對EGF + 20 fig HET0016 (n = 8)。 組5.第二種CYP4A抑制劑的抗血管生成作用.
在這些大鼠中，我們測試了 DDMS對VEGF的新血管化應答的作用。 VEGF對VEGF+10 pgDDMS (n-7)。該劑量在導向性實驗后選擇， 表明20 |ag HET0016是有效的。
組6.20-HETE的促血管生成作用.
在這些大鼠中，我們測試了穩定的20-HETE類似物WIT003是否是血管 生成性的。
對照對20 pg WIT003 (n = 7) 組7.HET0016的抗血管生成作用
在這些大鼠中，我們研究了 HET0016對癌癥誘導的血管生成應答的作用。 就這些實驗而言，我們使用已知為血管生成性的人成膠質細胞瘤癌細胞系 U251(HsuSC等，Cancer Res 1996， 56:5684-91)。球狀體和含有HET0016的 小球一起植入同一角膜袋。植入球狀體14天后評估血管生成應答。
U251細胞球狀體對U251球狀體+20 pgHET0016 0 = 8)。
扇贗C1T"/威眉表逸
(i) mRNA提取和cDNA合成使用RT-PCR檢測新血管化期間角膜中 CYP4A1 mRNA的表達。快速取下角膜并在液氮中快速冷凍。稍后融化角膜 并在TRIzol中勻漿。按照生產商的方案(Invitrogen)從TRIzo1中提取總RNA。 使用260/280 nm吸光度之比評價RNA的質量。只有1.8-2.0范圍內的樣品 可用。使用FirstStrand synthesis kit (Invitrogen)逆轉錄總共1-3 pg mRNA。 Uig cDNA通過PCR擴增。
(ii) PCR分析我們使用以下特異性CYP4A1 mRNA弓l物擴增CYP4A1 mRNA:有義TTCCAGGTTTGCACCAGACTCT (SEQ ID NO:l)和反義 TTCCTCGCTCCTCCTGAGAAG (SEQ ID NO:2)。擴增的卩-肌動蛋白用作內 標。使用Applied Biosystems (Foster City， CA)的引物表達軟件設計引物。 CYP4A1的mRNA序列得自GeneBank(登錄號NM—175837),大鼠(3-肌動蛋 白的登錄號是NM—031144。用于擴增CYP4A1和(3-肌動蛋白的PCR條件包括預循環95°C3分鐘， 其后是由95°C 45秒，57°C1分鐘和72°C1分鐘組成的35輪循環，然后是 72。C10分鐘的最終延伸。PCR產物經10%丙烯酰胺凝膠電泳并通過溴化乙 錠顯像。使用合適的對照來保證擴增的樣品不含基因組DNA。
統z^學分添
通過配對t-測試確定大鼠中對照和實驗眼睛的差異的統計學意義。通過 ANOVA，然后事后測試確定各組之間應答的差異。；？<0.05認為是顯著的。
結果
VEGF對HUVEC生長的作用示于圖7。 VEGF刺激這些細胞增殖，而該 應答在同時用HET0016處理的培養物中被消除。HET0016未改變HUVEC的 基礎增殖速率(未顯示)。
我們接著使用大鼠角膜袋血管生成測定研究了 HET0016在體內對VEGF 的血管生成應答的作用。單用HET0016或DDMS都不能引發異于使用鹽水的 應答(圖8B和IIB)。為確定HET0016的最佳劑量，我們進行了劑量-應答硏究， 其中將同時含有不同劑量的HET0016和VEGF的小球植入角膜。劑量為20 jug 和40 ^g/小球的HET0016幾乎完全消除了 VEGF的血管生成應答。5 pg HET0016使VEGF的血管生成應答降低約50%。由于所有化合物具有相當 的分子量和溶解性，我們選擇每個小球20 pg的HET0016或其它相關化合 物。在一些實驗中我們使用棕櫚酸作為脂肪酸非特異性作用的對照。棕櫚 酸本身無作用并且顯示不能影響VEGF或其它所研究的血管生成因子的血 管生成應答(未顯示)。
小球中含有VEGF導致顯著的新血管化應答，該應答可被HET0016消除。 圖8A顯示單用VEGF和用VEGF + HET0016處理的代表性角膜顯微照片， 而圖8B是以圖示形式顯示的結果。在其它實驗中，我們檢查了阻斷CYP4A 活性對其它生長因子的血管生成應答的作用。我們研究了 HET0016的抗血管 生成作用是否僅限于VEGF或也可抑制bFGF禾P EGF的應答。小球中含有 HET0016極大降低了 bFGF (圖9A和9B)和EGF(圖10A和IOB)的血管生成 應答。
32這些數據提示CYP4A活性是血管生成生長因子引發血管生成應答所需
的。為鞏固該觀點，我們測試了 CYP4A的化學性質相異的抑制劑，DDMS在 大鼠角膜袋血管生成試驗中是否也抑制VEGF的血管生成應答。這些實驗的結 果示于圖IIA和IIB，并且表明DDMS也完全抑制VEGF的血管生成應答。
由于CYP4A是從花生四烯酸合成20-HETE的co-羥化酶，HET0016可 能通過抑制20-HETE合成來起作用。為確定20-HETE是否有助于CYP4A 抑制劑的抗血管生成活性，我們測試了穩定的20-HETE類似物WIT003在 體外對HUVEC增殖和在體內對新血管生長的作用。WIT003增加 HUVEC(圖12)的增殖速率并且在大鼠角膜袋血管生成測定中誘導血管生成 應答(圖13A和13B)。
我們也研究了 HET0016是否抑制腫瘤細胞誘導的血管生成。植入角膜 袋的人成膠質細胞瘤細胞系U251的三維球狀體在兩周后導致顯著的血管 生成。在存在HET0016時，角膜的新血管化顯著受抑制(p < 0.01)(圖14A 和14B)。
評價CYP4A mRNA在大鼠角膜中表達的實驗的結果顯示在對照角膜 中檢測到預期大小的區帶。在VEGF-處理的角膜中無可檢測的變化。
總之，本項研究檢驗了 CYP4A抑制劑對HUVEC的VEGF的促有絲分 裂應答和在體內對角膜中的生長因子誘導血管生成的作用。結果表明用 HET0016阻斷CYP4A活性阻斷了 HUVEC中VEGF的已知增殖性應答 (Kurzen H等，"通過非毒性劑量的替莫唑胺抑制血管生成"(Inhibition of angiogenesis by non-toxic doses of temozolomide)， Anticancer Drugs 2003， 14:515-22)。使用穩定的20-HETE類似物WIT003的實驗提示了花生四烯酸 代謝物在VEGF誘導的增殖中可能有作用的其它證據。用WIT003處理 HUVEC以與用VEGF處理內皮細胞后發生的變化類似的方式增加細胞增 殖。
體內血管生成應答涉及遠不止內皮細胞增殖的增加一種，因為它還涉 及包括細胞遷移、基質降解、內皮細胞分化和perimural細胞募集的其它過 程。考慮血管生成過程的復雜性，必需要證實的是血管生成的任何可能的抑制劑能影響體內完全成形血管的形成。由于我們假定對CYP4A的抑制可 改變體內血管生成應答，我們在大鼠角膜袋血管生成試驗， 一種體內血管 生成模型中測試了該假設。該測定涉及將含有血管生成誘導物(在我們的實 驗中是血管生成生長因子或癌細胞)的小球置于刻入角膜基質的袋中。小球 ;緩慢而持續地釋放血管生成因子，進而刺激周圍脈管系統緣依濃度梯度向
小球生長。由于角膜最初是無血管且透明的(Kenyon BM等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996， 37:1625-1632)，與其它體內測定相比，僅檢測 新血管更有利。
當VEGF、 bFGF或EGF植入大鼠角膜時觀察到強有力的血管生成應 '答。HET0016的存在消除了所有這些生長因子的血管生成應答。由于存在 有效的CYP4A抑制劑時血管生成應答實際上被消除，這表明CYP4A是血 管生成的關鍵調控物。已報道烯烴化合物DDMS是有效和高度選擇性的 CYP4A抑制劑，其結構和作用機理與HET0016無關(Wang MH等，J Pharmacol Exp Ther 1998， 284:966-73)。 DDMS也消除了 VEGF對角膜新血 管化的作用。因此，兩種不同的CYP4A抑制劑消除了 VEGF誘導的血管生 成應答，從而加強了這些抑制劑影響血管生成過程中的主要步驟的觀點。 由于抑制CYP4A明顯是HET0016和DDMS之間的共同點，我們得出結論 CYP4A酶活性的一種產物是血管生成過程進行的介體或所需組分，缺少其 血管生成過程就無法進行。
血管生成是生理狀況，例如傷口愈合與女性生殖周期中的關鍵現象， 并且也是病理情況，例如糖尿病性視網膜病變、黃斑變性和慢性炎癥中的 關鍵現象。特別是，腫瘤擴張依賴于血管生成，這對于超過l-2mm以上的 腫瘤生長是至關重要的。因此，抑制腫瘤生成新血管的能力是有吸引力的 治療目標。
因此，我們研究了 HET0016是否可影響腫瘤誘導的血管生成。為此目 的，我們選擇了已知是高度血管生成的惡性成膠質細胞瘤細胞模型，成膠 質細胞瘤細胞系U251。由于成膠質細胞瘤的多種形態由強烈的血管生成所 區分(HsuSC等，Cancer Res 1996， 56:5684-91)，這是臨床相關的。我們將U251球狀體連同含有HET0016或對照(棕櫚酸或鹽水)的小球一起植入大鼠 角膜基質。所有的對照眼睛顯示顯著的角膜新血管化；然而，HET0016顯 著降低約70%的血管生成應答。
實施例3
HET0016抑制人膠質瘤癌細胞中的細胞增殖 該實施例顯示20-HETE對人癌細胞生長重要。1 fim的20-羥基二十碳 -5(Z),14(Z)-二烯酸， 一種穩定的20-HETE促效劑使人膠質瘤U251細胞增 殖增加約20%。劑量-應答研究表明用10 HET0016處理48小時抑制約 60%的U251細胞增殖，同時[3司胸苷攝取降低65%。 二溴十二碳烯基甲磺 酰亞胺(DDMS，也稱為iV-甲磺酰基-12, 12-二溴十二烷基-11-烯酰胺)， 一種 結構不同的CYP4A抑制劑也阻斷約60%的細胞增殖。DDMS和HET0016 均對正常人血管內皮細胞或角化細胞的基礎生長無作用。流式細胞計數研 究證實HET0016通過使細胞周期停滯于Go/G,來特異性抑制人U251癌細 胞的增殖。加入20-HETE促效劑(l pM)逆轉HET0016對細胞增殖的阻斷約 70%。 Western印跡實驗表明HET0016改變U251癌細胞的酪氨酸磷酸化從 而導致在HET0016處理24和48小時后觀察到的抑制作用。進一步研究顯 示加入HET0016特異性抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。 材料與方法
潘應系與試^/: U251人膠質瘤細胞得自Stephen L. Brown博士(輻射腫 瘤學部門，Henry Ford Health System, Detroit, MI)。人血管內皮細胞(HUVEC) 購自Cambrex (East Rutherford, NJ)。原代人角化細胞得自George Murakawa 博士(皮膚病學系，Wayne State University, Detroit, MI)。 HET0016 [N-羥 基—N'-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]由Taisho Pharmaceuticals(Japan)饋贈。 DDMS、棕櫚酸和EGF購自Sigma (St. Louis， MO)。 WIT003[20-羥基二十 碳-6(Z),15(Z)-二烯酸]， 一種20-HETE促效劑由德克薩斯大學西南醫學中心 生物化學系(Dallas， Texas)的John R Falck博士合成。所有其它細胞培養試 劑購自Invitrogen (Carlsbad, CA)。4^蕎條伴細胞常規維持于補充有10。/。熱滅活的胎牛血清(FBS)、青霉
素(IO IU/ml)、鏈霉素(IO pg/ml)和10%非必需氨基酸的DMEM中(均購自 Invitrogen)。細胞于37'C維持在含有5% C02.的增濕孵育箱中。細胞生長在含 有10%FBS的培養基中，然后用使U251細胞對數生長的無血清培養基替換 FBS。除去血清一天后開始處理。
潘應潛遭漱定用以至少保證對數生長5天的密度涂布的培養物進行 增殖研究。涂布24小時后，用無血清培養基替換生長培養基。如方法中所 述，用各種濃度的給定化合物處理細胞24或48小時。HET0016、 DDMS 和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀釋。有機溶劑切勿超過總培養物體積 的0.1%。通過與0.05。/。胰蛋白酶/EDTA接觸來收集細胞并用血球計數器計 數。
/"3/// 滲乂^^充:使用生長于35-mm培養皿中的細胞進行胸苷摻入研 究。用HET0016處理1小時后，培養物在各時間用[甲基-311]胸苷(1 |uCi/ml 培養基)脈沖。棕櫚酸和EtOH分別用作脂肪酸和載體對照。脈沖結束時， 吸去培養基并用冷的1 X磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗細胞兩次。清洗的培養 物通過在4。C與冷的5%三氯乙酸接觸過夜固定，然后按照前述提取固定的 細胞(Scholler等，Mo/.尸/^rmoco/. 45: 944-954， 1994)。第二組未固定的培 養皿用0.05%胰蛋白酶/EDTA處理來估計細胞數目。通過閃爍計數檢測卩H] 胸苷并表示為dpm/103細胞。
嚴式潘應^教細胞以能保證在收集時為對數生長的密度培養于 100-mm培養皿中。先前描述過通過使用碘化丙錠(PI)的流式細胞計數檢測 DNA的收集和加工方案(Reiners等，Carc/"ogenew^ 20: 1561-1566， 1999)。 在Wayne State University Flow Cytometry Core Facility, Detroit, MI用 Becton Dickinson FACScan分析細胞。用DNA直方圖擬合程序(MODFIT; Verity Software, Topsham， ME)確定處于細胞周期Go/G,、 S和G2/M期的 細胞百分比。至少收集104種情況/樣品。
DA^ TI/A^丄實驗HET0016-處理的培養物用1 X PBS洗
滌兩次并與裂解緩沖液[20 mM Tris-HCl、 10 mM EDTA、 0.3% Triton X-100]一起孵育。提取基因組DNA并在2M瓊脂糖凝膠上分離。通過用溴化乙錠 (EtBr)染色凝膠來使分離的DNA顯像。同時將U251培養物接種于蓋玻片 上并用HET0016處理來進行TUNEL測定。蓋玻片用3 X PBS洗滌，風 干。然后用新鮮配制的固定溶液(4。/。PBS配制的低聚甲醛，pH7.4)于室溫固 定樣品1小時，接著在新鮮的滲透化溶液(0.1。/。檸檬酸鈉配制的0.1% Triton X-100)中于冰上孵育2分鐘。最后根據生產商的建議使用原位細胞死亡檢 觀!Ji式齊U盒，AP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)力卩工樣品。
i M4 iA庸浙逆存^-,^糜鏈《及應(7 r-PC7 力培養物分別用10 |aM HET0016或100 pM DDMS處理24和48小時。乙醇處理的培養物用作溶 劑對照。簡言之，用Trizol試劑(Invitrogen)分離總RNA并使用首鏈合成試 劑盒(Invitrogen)用1-2叫RNA來合成cDNA。我們使用特異識別CYP4A 的PCR引物和P-肌動蛋白-特異性引物。向Platinum PCR Supermix (Invitrogen)中加入1 (iCi "P/樣品。用于擴增CYP4A和(5-肌動蛋白的PCR 條件包括95。C、 3分鐘的預循環；然后是95。C、 45秒'52°C、 30秒和72 °C、 2分鐘的35輪循環；和72'C、 10分鐘的最終延伸。所用的引物是(3-肌動蛋白正向引物，5，- TGC GTG ACA TTA AGG AGA AG -3， (SEQ ID NO:3);卩-肌動蛋白反向引物，5，-GCTCGTAGC TCT TCT CCA -3， (SEQ ID NO:4); CYP4A11正向引物，5，-CCA CCT GGA CCA GAG GCC CTA CAC CAC C-3， (SEQ ID NO:5); CYP4A11反向引物，5，-AGG ATA TGG GCA GAC AGG AA -3，(SEQ ID NO:6)。 PCR產物經5%雙-丙烯酰胺凝膠電泳并 通過放射自顯影顯像。
煮y備凝遂欲激浙『ew""伊遂用10 |aM HET0016處理細胞不同時間 并用冰冷卻的l X PBS洗滌兩次。然后于4。C以1,000 g離心細胞5分鐘 得到沉淀。加入RIPA緩沖液[20 mM HEPES (pH 7.4)， 100 mM NaCl， 1% Nonidet P-40， 0.1% SDS， 1%脫氧膽酸，10%甘油，1 mM EDTA， 1 mM NaV03， 50 mM NaF和蛋白酶抑制劑Set 1 (Calbiochem， La Jolla， CA)]裂 解細胞。然后刮板并將細胞收集在1.5-ml離心管中，再于冰上孵育30分鐘。 細胞懸浮液的勻漿液于4。C以14,000 g離心10分鐘，棄去沉淀并通過二辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)蛋白質實驗確定上清液中的蛋白質濃度。
20 pg蛋白質一般在14。/。三甘氨酸凝膠(Irwitrogen)上分離并電印跡至 PVDF膜(Biotrace，Bothell， WA)。膜在與封閉緩沖液[1 X PBS配制的0.2% I-封閉試劑(Tropix， Bedford, MA)， 0.P/o吐溫-20]配制的一抗孵育(4。C過 夜)前，用封閉緩沖液于室溫封閉1小時。磷酸-酪氨酸(Y102)、磷酸-絲氨 酸/蘇氨酸-Pro MPM2、磷酸-p42/p44 MAPK (T202/Y204)(20G1 l)和磷酸 -SAPK/JNK(T183/Y185)(98F2)單克隆抗體購自Upstate, Waltham， MA。此 夕卜，CYP4A多克隆抗體購自Research Diagnostics (Flanders, NJ)和Chemicon (Temecula， CA)來檢測CYP4A蛋白。使用1:2000稀釋的對應抗體檢測磷 酸-酪氨酸(Y102)和磷酸-絲氨酸/蘇氨酸-Pro MPM2，使用1:1000稀釋的抗 體檢測磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。 CYP4A抗體以1:100稀釋 度使用。膜在洗滌緩沖液(l X TBS和0.1%吐溫-20)中洗滌3次后，于室 溫和過氧化物酶偶聯的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗體(Upstate， Waltham， MA) (在封閉緩沖液中以1:4000稀釋)孵育1小時。然后在洗滌緩沖液中洗滌膜3 次，并根據生產商的方案用改善的化學發光試劑盒(Upstate)進行化學發光檢
測。肌動蛋白用作加樣對照。
統7^學分析數據通過Tukey HSD測試分析。用Statistica 5.0軟件包 (StaSoft， Tulsa, OK)進行這些計算。p < 0.05處的差異認為是統計學顯著的。
結果
C1T" #劍對潘應潛遭游/^^:為評價20-HETE在調節U251細胞生 長中的作用，我們研究了 CYP4A抑制劑HET0016在體外對人U251膠質瘤 癌細胞增殖和生長的作用。我們用各種濃度的HET0016處理細胞2天，然 后計數細胞。HET0016以濃度依賴性的方式抑制U251細胞的基礎增殖(圖 15A)。由于臺盼藍排除顯示細胞的存活率未受HET0016影響，這認為是細 胞抑制作用。此外，HET0016也抑制EGF誘導的增殖(圖16)。劑量-應答 研究顯示10 jliM HET0016抑制約60%的U251細胞增殖，該濃度用作我們 所有隨后研究的工作濃度。進行DNA片斷化和TUNEL實驗來檢測 HET0016是否在U251細胞中誘導凋亡。由于兩種結果均是陰性(數據未顯示)，我們的結論是HET0016未在這些細胞中誘導凋亡。為確定HET0016 對正常細胞是否有對U251癌細胞相同的作用，我們用10 ^MHET0016處 理HUVEC和人基礎角化細胞。HET0016對兩種正常類型人細胞的生長或 增殖均無作用(圖17)。胸苷摻入的分析顯示向培養基中加入HET0016約24和48小時后， 50%和60%的DNA合成受到抑帝D(圖15B)。與HET0016相同的是，DDMS， 一種結構不同的20-HETE合成抑制劑也以劑量依賴性方式抑制U251癌細 胞增殖(圖18)。
魔式浙應術進行細胞DNA含量的流式細胞術來確定HET0016的抗 增殖作用是否反映了細胞周期停滯在某一特定位置(圖15C)。含有G"G, DNA的細胞在HET0016處理的24和48小時處積累，伴有S和G2/M期細
胞的喪失。
CT尸W ,mi A^浙歪^屑^:乎游表達:我們進行了 RT-PCR和Western 印跡實驗來確定CYP4A是否在U251細胞中表達。DNA測序證實CYP4A11 mRNA在對照U251培養物中表達。用10 ^MHET0016處理細胞24小時后 轉錄水平下降，而在用100 pM DDMS處理的培養物中未受影響。因此， CYP4A基因得到轉錄并在U251培養物中表達信息。此外，使用得自兩種 商業來源的兩種不同CYP4A多克隆抗體的Western印跡實驗顯示兩種抗體 檢測到與CYP4A的預期分子量一致的約55 kDa的免疫活性蛋白質。因此， 人U251癌細胞在mRNA和蛋白質水平表達CYP4A。
^#炬資^/好絲游77￡7^類^激W t/25/虜潘應譜遭游 :我們 測試了具有促效劑特征的穩定的20-HETE類似物WIT003對生長于培養基 中的U251癌細胞增殖的作用。用0.1和1.0 fiM的20-HETE促效劑處理血 清禁食培養物48小時，然后計數細胞。由于已知EGF能導致U251細胞最 大增殖，它用作陽性對照。濃度為O.l [iM的WIT003對U251細胞增殖的 刺激作用不比50 ng/ml EGF強，但1.0 WIT003剌激約20%U251癌細 胞增殖。作用的強度與200 ng/mlEGF誘導的生長刺激作用相當(圖19)。
20-//￡r￡炬效^/逆^i^r卯/6游貧潛潛H:我們檢測了外源性添加
3920-HETE促效劑WIT003是否可逆轉用HET0016阻斷內源性20-HETE合成 所誘導的U251細胞增殖抑制。在該實驗中，用1 iliM WTT003、 10 (iM HET0016或同時用兩種化合物處理U251培養物。處理2天后計數細胞。 在存在WIT003和HET0016時，U251增殖增加至70%，超過了在單用 HET0016處理的培養物中觀察到的(圖20)。這些結果說明加入穩定的 20-HETE促效劑WIT003逆轉了 HET0016抑制U251癌細胞增殖的作用。
CJ7M^ #觀矽惑7應^#號存導歪^游;^發眾游 :為闡明與 HET0016在U251細胞中對20-HETE形成抑制相關的下游信號傳遞作用， 從用HET0016處理不同時間的U251培養物中分離蛋白質提取物。為檢測 HET0016在U251細胞的蛋白質的酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化狀態 中誘導的變化，使用磷酸-酪氨酸(Y102)抗體和磷酸-Ser/Thr-Pro MPM2抗體 進行Western印跡。我們發現HET0016在U251細胞中改變了酪氨酸磷酸 化，導致其在加入HET0016后24和48小時顯著降低。然而，用HET0016 處理的U251細胞中蛋白質的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化未見有明顯變化。其它 兩種抗體用于檢測HET0016如何如何影響p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷 酸化。HET0016在24和48小時抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷酸化。 因此，MAPK和SAPK/JNK途徑可在CYP4A抑制導致的信號轉導中起作 用。
實施例4
20-HETE抑制劑在體外和體內抑制大鼠膠質肉瘤細胞增殖 該實施例顯示CYP4A的選擇性抑制劑HET0016在體外對9L生長和體 內在大鼠的9L誘導大腦腫瘤中的作用。RT-PCR確定C YP4A基因在9L細 胞中高度表達。用高度選擇性的抑制劑，HET0016抑制CYP4A活性以劑 量相關的方式降低9L細胞增殖。加入10 pM HET0016 48小時后使9L細 胞增殖降低60%。 1 ^M的穩定的20-HETE促效劑WIT003拯救HET0016 抑制的細胞增殖約70%。 EGF (200 ng/ml)使生長于體外的9L細胞增殖增加 約30%。用1 nM WIT003獲得類似的刺激程度。HET0016幾乎消除了 EGF-誘導的9L細胞生長。Western印跡分析顯示HET0016降低p42/p44 MAPK 和SAPK/JNK的磷酸化。在大鼠中，通過將9L細胞直接注射入前腦誘導體 內大腦腫瘤。用HET0016 (1 mg/Kg/天，的處理大鼠約2周使大腦腫瘤體積 降低80%。這是因為注射的9L細胞的有絲分裂降低一級凋亡增加。 材料和方法
潛孝條伴9L大鼠膠質肉瘤細胞購自ATC(Gaithersburg， MD)并維持 于DMEM(Invitrogen)中，其中DMEM補加了 10。/。熱滅活的胎牛血清(FBS)、 青霉素(IO IU/ml)、鏈霉素(IO嗎/ml)和10%非必需氨基酸(均購自 Invitrogen)。細胞于37'C維持在含有5% (302.的增濕孵育箱中。細胞生長在含 有10%FBS的培養基中，然后用使9L細胞對數生長的無血清培養基(給出類型 和來源)替換FBS。
潘應潛;^實驗用以至少保證對數生長5天的密度涂布的培養物進行 增殖研究。涂布24小時后， 一般用無血清培養基替換生長培養基。用 HET0016 (Taisho Pharmaceuticals, Japan)、 DDMS、棕櫚酸(非特異性脂肪 酸對照)、EGF(Sigma， St. Louis， MO)或WIT003 (20-HETE促效劑)處理細 胞24或48小時。HET0016、 DDMS和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀 釋。加入培養基的乙醇濃度切勿超過0.1%。通過與0.05。/。胰蛋白酶/EDTA 溶液接觸來收集細胞并用血球計數器計數。
,///廯,滲乂,究:使用生長于35-mm培養皿中的細胞進行胸苷摻入研 究。用HET0016處理1小時后，培養物在各時間用[甲基-3司胸苷(1 pCi/ml 培養基)脈沖。棕櫚酸和EtOH分別用作非特異性脂肪酸和載體對照。脈沖 結束時，吸去培養基并用冷的1 X磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗細胞兩次。清 洗的培養物通過在4X:與冷的5%三氯乙酸接觸過夜固定，然后按照前述提 取固定的細胞(Scholler等，Mo/.尸/zwmaco/. 45: 944-954， 1994)。第二組未 固定的培養皿用0.05%胰蛋白酶/EDTA處理來估計細胞數目。通過閃爍計 數檢測[力]胸苷并表示為dpm/103細胞。
戶銜眾^7rWVE丄實-澄HET0016-處理的9L培養物用1 X PBS 洗滌兩次并與裂解緩沖液[20 mM Tris-HCl、 10 mM EDTA、 0.3% Triton
41X-100]—起孵育。提取基因組DNA并在2。/。瓊脂糖凝膠上分離。分離的DNA 通過用溴化乙錠(EtBr)染色凝膠來目測。同時將9L培養物接種于蓋玻片上 并用HET0016處理來進行TUNEL實驗。蓋玻片用3 X PBS洗滌，風干。 然后用新鮮配制的固定溶液(4。/。PBS配制的低聚甲醛，pH7.4)于室溫固定樣 品1小時，接著在新鮮的滲透化溶液(0.1%檸檬酸鈉配制的0.1% Triton X-100)中于冰上孵育2分鐘。最后根據生產商的建議使用原位細胞死亡檢 測試劑盒，AP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)加工樣品。
^V^分,/〃逆存f-,^朦楚《f座(^r-尸C7 "培養物分別用10 MM HET0016或100 (iM DDMS處理48小時。EtOH處理的培養物用作溶劑對 照。然后用Trizol試劑(Invitrogen)分離總RNA并使用首鏈合成試劑盒 (Invitrogen)用1-2 |ag RNA來合成cDNA。我們使用特異識別CYP4A的PCR 引物和P-肌動蛋白-特異性引物。Platinum PCR Supermix (Invitrogen)用作反 應混合物。用于擴增CYP4A1/2/3和P-肌動蛋白的PCR條件包括95°C、 3 分鐘的預循環；然后是95。C、 45秒，52°C、 30秒和72。C、 2分鐘的35輪 循環；和72'C、 10分鐘的最終延伸。所用的引物是(3-肌動蛋白正向引物， 5，-TTC AAC ACC CCA GCC ATG T-3， (SEQIDNO:3); (3-肌動蛋白反向引 物，5，- GTG GTA CGA CCA GAG GCA TAC A -3' (SEQ ID NO:4); CYP4A1/2/3正向引物，5，- TTC CAG GTT TGC ACC AGA CTC T -3， (SEQ IDNO:5); CYP4A1/2/3反向引物，5，國TTC CTC GCT CCT CCT GAG AAG -3， (SEQ ID NO:6)。 PCR產物經5%雙-丙烯酰胺凝膠電泳并通過放射自顯 影顯像。
劍備樣楚欲激蘿『ew""伊遂用10 pM HET0016處理9L細胞各種 時間并用冰冷卻的PBS洗滌兩次。然后于4°C以1,000 g離心細胞5分鐘得 到沉淀。加入RIPA緩沖液[20 mM HEPES (pH 7.4)， 100 mM NaCl， 1% Nonidet P-40， 0.1% SDS， 1%脫氧膽酸，10%甘油，1 mM EDTA， 1 mM NaV03， 50 mM NaF和蛋白酶抑制劑Set 1 (Calbiochem， La Jolla， CA)]裂 解細胞。然后刮板并將細胞收集在1.5-ml離心管中，再于冰上孵育30分鐘。 細胞懸浮液的勻漿液于4t:以14,000 g離心10分鐘，棄去沉淀并通過二辛可寧酸(BCA)蛋白質實驗確定上清液中的蛋白質濃度。
得自細胞勻漿液的20 iag蛋白質一般在14。/。三甘氨酸凝膠(Irwitrogen) 上分離并轉移至PVDF膜(Biotrace， Bothell， WA)。膜用封閉緩沖液[l X PBS配制的0.2% I-Block試劑(Tropix， Bedford, MA)， 0.1%吐溫-20]于室 溫封閉1小時，然后于4。C與封閉緩沖液配制的一抗孵育過夜。磷酸-p42/p44 MAPK (T202/Y204)(20G1 l)和磷酸-SAPK/JNK(Tl83/Y185)(98F2)單克隆抗 體購自Upstate(Waltham， MA)。此夕卜，購自Research Diagnostics (Flanders， NJ)和Chemicon (Ternecula， CA)的CYP4A多克隆抗體用于檢測CYP4A蛋 白。使用1:1000稀釋的抗體檢測磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。 CYP4A抗體以1:100稀釋度使用。膜在洗滌緩沖液(l X TBS和0.1%吐溫 -20)中洗滌3次后，于室溫和過氧化物酶偶聯的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗體 (Upstate)(在封閉緩沖液中以1:4000稀釋)孵育1小時。然后洗滌膜3次， 并使用改善的化學發光試劑盒(Upstate)顯影。然后剝下膜并用作為加樣對照
的(3肌動蛋白一抗再次探查。
,i腔A:植入前，90%匯合的9L細胞經胰蛋白酶化并離心。細胞沉 淀重懸于DMEM+ 10。/。FBS并用血球計數器計數。9L細胞的濃度調整為1 X 104細胞/5 W培養基。
按照下述通過將9L細胞懸浮液注射入購自Charles River Laboratories (Wilmington, MA)的Fisher 344大鼠的前腦皮層來接種大腦腫瘤。用開他 敏(80 mg/Kg, im)和甲苯噻嗪(13 mg/Kg)麻醉大鼠，將頭部固定于立體定向 框架(David Kopf Instruments, Tujunga， CA)并暴露顱骨。在顱骨中前囪的 側面2 mm和前部2.5 mm處鉆一小孔，使用裝有26規格針頭的10 Hamilton (#2701 )注射器在5分鐘期間將5 ^ 9L膠質肉瘤細胞懸浮液注射入 大腦皮層內3.5mm處。用骨蠟封閉該孔并閉合切口 。讓腫瘤生長2天并形 成后，大鼠每天以10mg/kg/天的劑量皮下(sc)注射HET0016或載體卵磷脂 兩次。用HET0016或載體處理15天后，用80 mg/Kg(開他敏)麻醉殺死大 鼠并用250 ml無菌的0.9。/。鹽水溶液經心臟穿刺沖洗，然后用生理鹽溶液配 制的10%福爾馬林灌注固定。取出大腦并保存于10%福爾馬林中。頁
伊份/W蘑沐茨福爾馬林固定的大腦置于Coronal大鼠大腦基質中并 切為3毫米小塊。然后將這些塊包埋于石蠟中并制備6pM厚的切片。制備 用于H&E染色的切片放于無涂層的載玻片上。用于免疫組織化學分析的切 片放于帶正電的超磨砂載玻片上。該系列切片用H&E染色來評價腫瘤大小 并通過Ki-67抗原的免疫組織化學方法來評價增殖程度。
使用2X物鏡的SONY CCD照相機拍下含有腫瘤的H&E染色切片的 圖像。使用AIS圖像分析系統(Imaging Research, St. Catherine, ON， Canada) 軟件手工繪出每個切片中腫瘤的面積并以mmh則量。然后面積乘以切片的 厚度來計算切片體積。然后將所有切片的體積取和得到每只大鼠的總腫瘤 體積。
制備用于免疫組織化學分析的切片通過于加熱板上在檸檬酸緩沖液 (pH6.0)煮沸IO分鐘來除去石蠟。切片冷至室溫，置于封閉緩沖液[PBS配 制的2。/。常規血清、1。/。BSA]中1小時，在洗滌緩沖液中[PBS配制的0.05吐 溫-20]洗滌兩次，用過氧化氫封閉10分鐘并在洗滌緩沖液中漂洗。然后將 切片與家兔多克隆抗-ki67抗體(AbcamInc.， Cambridge, MA;在PBS配制 的1.0%BSA中以1:200稀釋)孵育30分鐘。切片在洗滌緩沖液中洗滌，與 生物素化的山羊抗-家兔IgG(Vector Laboratories, Inc., Burlingame， CA; PBS配制為l:500)孵育30分鐘并再次洗滌。切片然后與HRP-鏈霉抗生物 素蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; PBS 配制為l:500)孵育30分鐘并洗漆。DAB底物(Vector Laboratories, Inc.， Burlingame, CA; 2滴底物緩沖液，4滴DAB， 2滴用5 ml蒸餾水配制的 過氧化物)涂布于切片8分鐘。然后洗滌切片，在Meyer蘇木精中復染5秒， 在氨水中染藍，在水中漂洗，千燥，清潔并固定。
嚴泣源亡分橋其它切片如上述除去石蠟并用ApopTag過氧化物酶檢 測試劑盒(Chemicon International Inc., Temecula， CA)分析凋亡情況。簡言 之，用蛋白酶(20 (ig/ml)于室溫消化復水的切片15分鐘，然后在3.0%11202 中猝滅5分鐘并洗滌。然后于37"C用TdT酶在增濕室中標記1小時并于室 溫施用抗-洋地黃毒苷偶聯物30分鐘。洗滌切片、在過氧化物酶底物中顯
44影、在5%甲基綠中復染IO分鐘，干燥并固定用于光顯微鏡檢測。
!^/"學分,使用ANOVA，再用Tukeys測試分析數據。p < 0.05處
的差異認為是統計學顯著的。 結果
CJT"游/ r-尸CR:由于據報道HET0016是CYP4A禾卩4F酶催化的 20-HETE合成的高度選擇性抑制劑，我們首先通過RT-PCR檢測CYP4A mRNA是否在9L膠質肉瘤細胞中表達。我們觀察到CYP4A的mRNA在體 外生長的9L細胞中表達。
,虔y C1TW ^沐,/^ 9丄it資應發潘應潛遭游/，屑各種濃度的 HET016對9L膠質肉瘤細胞生長的作用示于圖21。根據細胞計數直接評估， HET0016對生長在培養物中的9L細胞產生劑量依賴性抑制(圖21A)。即使 在非常低的10 nM濃度(接近該化合物抑制CYP4A —些同種型的報道 IC50)，雖然與對照的差異不顯著(p-0.056)，對細胞生長一定程度的抑制也 是明顯的。1和10 pM濃度的HET0016在24和48小時明顯使細胞數量降 低30-40%。
在其它實驗中，我們測試了高濃度(IOO )aM)的HET0016對9L細胞生 長的作用。這導致細胞數量顯著降低。然而，我們也觀察到細胞實質性的 解離和培養基中漂浮有死細胞，這提示此濃度的HET0016可能具有直接的 細胞毒性作用。因此，我們決定在以后所有的實驗中使用10 濃度的 HET0016。如圖21B所示，HET0016 (10 iiM)在9L膠質肉瘤細胞的培養物 中使胸苷摻入降低60%。圖21B所示生長曲線的檢測表明HET0016改變該 特性曲線的斜率，這表明其是對細胞增殖起作用而非殺死一群細胞進而導 致特性曲線中預期的基線偏移。
DDMS在體外對9L細胞增殖的作用DDMS是CYP4A的一種高度選 擇性的自殺底物抑制劑，但其化學結構和作用機理與HET0016極為不同。 各種濃度的DDMS在體外對9L細胞的生長速率的作用示于圖22。這些結 果與用HET0016觀察到的相當。在接近抑制CYP4A酶的IC50的10 pM濃 度時，DDMS明顯降低細胞數量。在較高濃度(IOO ^M)， DDMS降低這些細胞增殖的作用和HET0016(10 nM)的相似。
//五r卯M ^沐,/對五GF W激游處潘應全長游伊^: 9L細胞與EGF (200 ng/ml)接觸在24和48小時增加細胞數量(圖23)。加入HET0016 (10 |uM) 防止EGF在24小時對細胞生長的作用并在48小時降低細胞數量(圖23)。 比較生長曲線的斜率提示HET0016的抑制作用在24-48小時間變弱。
20-//￡7^類奴欽#//五7^"游生長肅^伊賴游/，^:為確定HET0016 對9L膠質肉瘤細胞生長的抗增殖作用是否與抑制20-HETE合成相關，我 們檢測了外源性加入WIT003， 一種穩定的20-HETE促效劑是否可阻止 HET0016的抗增殖作用。示于圖24的結果表明向培養基中加入WIT003 (1 ^M)部分拯救了 9L細胞免遭HET0016的抑制作用。將單用HET0016誘導 的抑制視為100%，用HET0016 + WIT003處理的細胞顯示僅使增殖有60% 的提高。
/7￡7^)/6 W M4尸《蘿游激賓發艨發眾游/fl:為進一步理解 HET0016可抑制9L細胞生長的機理，我們檢測了 HET0016對有絲分裂原 激活的蛋白質激酶(MAPK)的磷酸化和激活的作用，該激酶已知在9L細胞 的細胞生長和增殖中起作用。用HET0016 (10 pM)處理9L細胞4小時明顯 降低了 p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。p42/p44 MAPK磷酸化的降 低甚至高于接觸HET001624小時后的。JNK的磷酸化也觀察到相同的趨勢， 雖然抑制在48小時達到最高而非在接觸HET0016的24小時時。
浙W漸劍^/,丈廣沐片jy犬嵐處^^^應^^7t^,i^生長游, y^: 9L細胞植入正常、免疫活性大鼠的前腦后，它們形成具有明確邊界的 快速生長的腫瘤。在現有實驗條件下，如果不處理動物通常在2-3周后死 亡。在本項研究中，植入腫瘤17天后，我們發現用HET0016處理的大鼠 看起來更健康并且在尸檢時顯示比在未處理對照大鼠中所觀察到的小得多 的腫瘤(圖25)。對照和HET0016處理大鼠通過腫瘤中面的代表性切片連同 對腫瘤體積的比較示于圖26。與對照動物中觀察到的相比，HET0016處理 大鼠的腫瘤體積降低了 80%(圖26)。
嚴泣源亡分,游/^菜9L腫瘤的切片用抗體免疫染色來確定細胞增殖和凋亡的面積。用HET0016慢性處理的大鼠9L腫瘤中用Ki67抗體陽性染 色的有絲分裂細胞數量極大降低。相反，用載體或HET0016處理的大鼠9L 腫瘤中陽性染色的凋亡細胞數量上無明顯差異。這些結果表明用HET0016 抑制20-HETE的合成通過使細胞增殖停滯來抑制腫瘤生長而非刺激癌細胞 的凋亡和程序性死亡。
本發明不受上述實施例的限制，但包括附加的權利要求范圍內的所有 改進和變化形式。序列表
〈110〉 R. J.羅曼(Roman, Richard J.) A.格林(Greene, Andrew) S.阿馬拉爾(Amaral， Sandra L.) G.希^利(Scicli' Alfonso Guillermo) S. L布朗(Brown, Stephen) P.陳(Chen, Ping) M.享R (Guo， Meng)
<120>調節血管生成和癌細胞增殖的方法
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<160〉 6
<170〉 Patentln version 3. 3
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〈212〉 DNA <213>人工的
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<223〉 合成的PCR引物 〈400〉 1
ttccaggttt gcaccagact ct
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〈213>人工的
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<213〉 人工的
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<213> 人工的
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〈223〉 合成的PCR引物
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權利要求
1. 20-HETE或20-HETE促效劑在制備用于誘導和促進人或非人哺乳動物組織中血管生成的藥物中的用途。
2. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，制備中使用的是20-HETE促效劑。
3. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，用于制備用于促進非肌肉 組織中的血管生成的藥物。
4. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，用于制備用于治療或預防 與人或非人哺乳動物中血管生長不足或血管退化有關的疾病或病癥的藥 物。
5.20羥基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸在制備用于誘導和促進人或非人哺 乳動物組織中血管生成的藥物中的用途。
6. 20-HETE合成抑制劑或20-HETE拮抗劑在制備通過抑制癌細胞增殖 來治療人或非人動物中癌癥的藥物中的用途。
7. 如權利要求6所述的用途，其特征在于，制備中使用的是20-HETE 合成抑制劑。
8. 如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述20-HETE合成抑制劑 選自N-羥基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)、 二溴十二碳烯基甲 磺酰亞胺(DDMS)、 N-(3-氯-4-嗎啉-4-基)苯基-N'-羥基亞氨甲酰胺(TS-011)、 l-氨基苯并三唑(ABT)、 17-十八炔酸(17-ODYA)、酮康唑、氟康唑或10十 一炔基硫酸酯(10-SUYS)。
9. 如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述20-HETE合成抑制劑 是HET0016、 TS-011或DDMS。
10. 如權利要求6所述的用途，其特征在于，制備中使用的是20-HETE 拮抗劑。
11. 如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌癥選自膠質瘤、 星形細胞瘤、腸癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、結腸癌或卵巢癌。
12. 如權利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌癥選自膠質瘤、 乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、胰腺癌或結腸癌。
13. 如權利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌癥是人或大鼠膠
全文摘要
公開了通過調節20-HETE活性來調控血管生成的方法。還公開了通過使癌癥和腫瘤細胞接觸20-HETE抑制劑來抑制癌癥和腫瘤細胞生長的方法。
文檔編號A61K31/335GK101507720SQ20091000986
公開日2009年8月19日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月14日
發明者A·格林, G·希克利, R·J·羅曼, S·L·布朗, S·阿馬拉爾 申請人:Mcw研究基金會股份有限公司;亨利福特健康系統