專利名稱：2,3-吲哚二酮-3-肟的制備和在癌癥防治方面的用途的制作方法
技術領域：
本發明公布了一種2，3-吲哚二酮-3-肟、或稱靛紅-3-肟的制備方法，以及按該方法獲得的2，3-吲哚二酮-3-肟在制備癌癥預防或治療藥物方面的用途。
背景技術：
基因組不穩定性是惡性腫瘤細胞最具本質性的特征[1]，表現在高基因突變率和染色體組異常兩大方面。一個腫瘤細胞基因組中的突變總數高達1萬至10萬次。腫瘤細胞群體固有的高變異率有助于惡性度更高的新變異出現，后者經克隆選擇又可以遺傳給更多的子代細胞克隆，使其基因組更趨異常，形成不斷演進的惡性循環。因此，基因組不穩定性既是癌癥發生的前提，也是惡性腫瘤復發和轉移的驅動力。導致基因組不穩定性的根本原因是細胞周期和有絲分裂調控途徑中的某些核心分子的基因突變或表觀遺傳學變異。這些核心分子的失控不僅引發癌細胞的增殖失控和永生化，而且同時導致基因組不穩定性，包括多倍體核型和染色體畸變，使得腫瘤細胞與正常細胞之間出現不可逆轉的本質差異[1-2]。
目前大量的分子生物學實驗、臨床檢驗數據和流行病學證據表明，細胞周期蛋白cyclin E和細胞周期抑制因子p21基因表達水平的正常調控，對于維護基因組穩定性和防止癌癥發生具有關鍵作用，二者正是上述導致癌癥發生和發展的核心分子。例如，在多種癌細胞中檢測到cyclin E的過度表達，因而cyclin E屬于癌基因；相反，多種癌細胞中p21明顯下調，因而表現為抑癌基因。Cyclin E和p21的上述變化使得細胞周期檢驗點失效，細胞不能滯留在G1期或靜止期，而是不斷進行DNA復制和有絲分裂，并形成多倍體和非整倍體核型[3-4]。其他兩種周期蛋白即cyclin B和cyclin A的過度表達也與癌細胞的增殖失控密切相關[5]。
所以，如果找到一種化合物，能夠同時下調細胞內cyclin E、cyclin B和cyclinA的表達，卻又能提高p21的表達水平，就能夠防止癌前病變細胞的過度增殖和基因組穩定性的進一步破壞，并誘導癌前病變細胞或癌細胞進入G1期阻斷狀態；處于G1期阻斷狀態下的癌前病變細胞或癌細胞將啟動細胞分化程序，從而失去原有的異常或惡性表型。這樣的化合物將具有G1期阻斷和分化誘導作用，從而產生顯著的防癌和抗癌效果。本發明公布的內容首次表明，2，3-吲哚二酮-3-肟(2，3-indoledione-3-oxime)具有上述特征，可用于制備防止癌癥發生的預防性藥物、或針對已診斷癌癥的治療性藥物或輔助治療性藥物。
本發明所涉及的物質2，3-吲哚二酮-3-肟(2，3-indoledione-3-oxime)又稱靛紅-3-肟(isatin-3-oxime)或β-靛紅肟(isatin-β-oxime)。本發明的合成原料之一是2，3-吲哚二酮(2，3-indoledione)，該物質又稱吲哚-2，3-二酮(indole-2，3-dione or 2，3-dioxoindole)、吲哚醌或靛紅(isatin)，是一種重要的人體內源性生物活性物質，具有神經-內分泌活性，因而具有良好的人體兼容性。以靛紅作為2，3-吲哚二酮-3-肟的合成原料具有成本低廉、無毒性、無污染的優點。將靛紅與羥胺反應合成2，3-吲哚二酮-3-肟或靛紅-3-肟的方法已有文獻報道[6]。然而，靛紅的羰基具有反芳香性，非常活潑，事實上靛紅的2-位和3-位羰基均可能成肟，并可形成數種異構體；而且在反應體系過酸或過堿、反應溫度過高的條件下，會出現多種副反應，使得產品的質量不穩定、產率低、后續純化步驟繁瑣、能耗和成本過大。例如，文獻報道的方法通常是將鹽酸羥胺、碳酸鈉和靛紅溶解在含乙醇和水的反應體系中加熱回流，然而當pH值為7.6時，可導致副產品靛紅-2-肟的生成[6]。又如，另有一篇近期文獻報道了在離子液體作用下由Isonitrosoacetanilide環化生成靛紅-3-肟的方法，但離子液體成本很高，且反應需要135℃的高溫[7]。本發明公布的一種2，3-吲哚二酮-3-肟合成和純化方法解決了上述問題。
參考文獻 [1]Klausner R.D.，The fabric of cancer cell biology-weaving together the strands.Cancer Cell.2002，1，3-10 [2]Olaharski A.J.Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervicalcarcinogenesis.Carcinogenesis.2006，27，337-343 [3]Minella A.C.p53 and SCFFbw7cooperatively restrain cyclin E-associated genome instability.Oncogene.2007，26，6948-6953 [4]Benjamin D.Rowland and Daniel S.Peeper.KLF4，p21 and context-dependent opposing forcesin cancer.Nature Reviews Cancer.2006，6，11-23 [5]Whitfield M.L.et al.Common markers of proliferation.Nature Reviews Cancer.2006.6，99-106 [6]Abele E.et al.Indole and isatin oximessynthesis，reactions，and biological activity.Chemistryof Heterocyclic Compounds.2003，39(1)，3-35 [7]Pinto A.C.et al.Pronounced ionic liquid effect in the synthesis of biologically activeisatin-3-oxime derivatives under acid catalysis.Tetrahedron Letters.2008，49，5639-5641
發明內容
本發明公布了一種具有簡便、經濟、環保特點的2，3-吲哚二酮-3-肟制備方法，用本方法制備的2，3-吲哚二酮-3-肟滿足以下結構
本發明中關于2，3-吲哚二酮-3-肟制備方法的主要技術特征是使用一種無水有機溶劑，該溶劑的特征是能夠保證2，3-吲哚二酮(即靛紅)在該溶劑中的室溫溶解量≥0.5mol/L；用該溶劑溶解鹽酸羥胺和靛紅，并加入一種無機或有機堿；在所選無水有機溶劑中，鹽酸羥胺、靛紅、堿的溶解或加入可按任何順序進行；通過調節所加堿的摩爾比，保證反應體系的pH值為中性或弱酸性；在機械攪拌中于溫度范圍為0℃至50℃的任何一種溫度下反應生成2，3-吲哚二酮-3-肟；反應達終點后，向反應體系中加入2至5倍體積的水，致使鮮黃色的2，3-吲哚二酮-3-肟沉淀析出；再通過反復水洗、或反復水洗后有機溶劑內的重結晶，獲得2，3-吲哚二酮-3-肟純品。上述技術特征有三項要素 第一個要素是選取一種無水有機溶劑，并保證靛紅和鹽酸羥胺在該溶劑中有足夠大的溶解量。以往的制備方法通常使用甲醇、乙醇、乙腈，或前述三種溶劑與水的混合物進行反應。經測試，靛紅在甲醇、乙醇、乙腈中的溶解量在室溫時分別小于或等于0.25mol/L、0.15mol/L、0.0625mol/L；當這三種溶劑中含水時，靛紅的溶解量大大降低。但是以往的制備方法為了保證鹽酸羥胺或硫酸羥胺也能溶解在上述三種溶劑中，不得不加入水，并且通常需要加熱回流，以便加快反應速度。經我們驗證，在上述舊有條件下反應，靛紅會部分分解，影響產物的純度和產率，并且由于產物在反應體系中的濃度低，不能通過直接結晶或加水沉淀等簡便方法回收產物，而是需要先經過減壓蒸發等濃縮步驟才能提高產率。這就不可避免地導致能耗和成本的增高，并且不利于環保。本發明通過選擇合適的溶劑，解決了上述問題。為了同時保證靛紅和鹽酸羥胺在該溶劑中均有足夠大的溶解量，本發明選擇了以下溶劑二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基吡硌烷酮、吡啶、二甲基亞砜(DMSO)；2，3-吲哚二酮或靛紅在上述溶劑中的溶解量依次為2.5mol/L、0.5mol/L、2mol/L、1mol/L、2mol/L。鹽酸羥胺在上述溶液中的溶解量均超過靛紅。在上述溶劑中，以DMF中的溶解量最大，且DMF在上述溶劑中是最為經濟環保的一種溶劑，因此本發明優選DMF，并且優選在DMF中接近飽和的靛紅濃度，如2至2.5mol/L。
上述制備方法技術特征中的第二個要素是通過選擇一種無機或有機堿，保證反應體系的pH值處于合適的范圍。以往的2，3-吲哚二酮-3-肟合成方法常常在堿性或酸性條件下反應，這將導致副反應的增多和反應不徹底、并形成多種肟類異構體或物種，為后續的純化帶來困難。本發明將整個反應體系的最終pH值控制在弱酸性到中性之間，即pH值在4至7.5之間，其中優選pH值范圍為5至6.5，這樣可以在大大加快反應進程的同時，減少副反應的發生。檢測pH值的方法是取1份體積的反應體系混合液，加10份體積的水混勻，用pH試紙或pH計檢測。本發明所用的堿可以是以下任何一種氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、四硼酸鋰、四硼酸鈉、四硼酸鉀、三乙胺、吡啶、羥胺。在這些堿中，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、四硼酸鋰、四硼酸鈉、四硼酸鉀在反應體系中的溶解度很低，需要事先研磨成細粉，且在室溫反應時需要長時間(12小時)劇烈機械攪拌，才能保證反應終點的實現。三乙胺和吡啶不利于環保、且后續純化時的產率不高。本發明優選氫氧化鋰，因其在反應體系中溶解量大，可提高反應速度。氫氧化鋰可以是一水合氫氧化鋰，也可以是無水氫氧化鋰。氫氧化鋰分子量小，按重量計算用量少，比某些其他堿成本更經濟。
上述制備方法技術特征中的第三個要素是在節省鹽酸羥胺用量的條件下，保證反應依然能快速達到終點。本發明所述反應終點特指靛紅在反應中全部消耗完畢。某些舊有方法為保證靛紅完全轉化、從而有利于后續純化步驟，常常加入摩爾比大大過量的羥胺，但羥胺有一定毒性，不利于環保。本發明通過提高反應物的濃度、選用非質子溶劑、優化反應體系的酸堿度等措施，降低了鹽酸羥胺的用量，即選擇鹽酸羥胺與靛紅的摩爾比為1至1.5∶1，其中優選1.2∶1。本發明所述反應終點除了使用常規TLC技術檢測以外，還可按本發明公布的簡便鑒定方法進行取1份體積的2mol/L氫氧化鋰水溶液與9份體積的DMF混合，作為檢測液；取1份體積的反應體系混合液，用上述檢測液稀釋50倍，觀察溶液的顏色；如果呈紫色，表示有殘存靛紅；如果呈淺黃色，表示靛紅全部消耗，即已達反應終點。按本發明所述優化的條件進行反應，室溫30min即可確保達到反應終點。
本發明公布的能夠滿足上述技術特征中三項要素的優選方案是反應體系中鹽酸羥胺、靛紅、一水合氫氧化鋰的摩爾比按1.2∶1∶1設定；以DMF為溶劑，使上述三種成分的摩爾濃度分別為2.4mol/L、2mol/L和2mol/L。
當反應達終點后，本發明的后續純化過程均按常規操作進行。具體地說，向反應體系中加入2至5倍體積的水，以低溫預冷的水為佳，以便促進2，3-吲哚二酮-3-肟結晶析出和提高產率；用濾膜或濾紙抽濾、或用離心沉降法收集沉淀物即2，3-吲哚二酮-3-肟；再反復水洗2至4次、或進行連續淋洗，干燥后可獲純度95％以上的產物。進一步純化采用重結晶法，即將上述初步純化產物溶解于預熱的揮發性有機溶劑如甲醇、乙醇或異丙醇內，待溶劑冷卻后析出晶體，可獲純度99％以上的產物。
本發明進一步公布了2，3-吲哚二酮-3-肟在制備癌癥預防或治療藥物方面的用途。如在前文的“背景技術”部分所述，基因組不穩定性既是癌癥發生的前提，也是惡性腫瘤復發和轉移的驅動力。而導致基因組不穩定性的核心分子機制涉及癌基因產物cyclin E、cyclin B和cyclinA的過度表達，以及抑癌基因p21的表達下調；上述癌基因與抑癌基因的表達失控同時還造成癌細胞的過度增殖和細胞周期的不斷運行。本發明首次證明了2，3-吲哚二酮-3-肟對癌細胞、惡性神經膠質瘤細胞、具有癌前病變細胞特征的轉化細胞即人胎肝L02細胞均有顯著的增殖抑制作用，能夠將這些細胞阻斷在G1期，并誘導細胞分化。本發明還首次闡明了2，3-吲哚二酮-3-肟發揮上述作用的分子機制，即2，3-吲哚二酮-3-肟能夠顯著下調癌基因產物cyclin E、cyclin B和cyclin A的表達，并能大幅度提高抑癌基因p21的表達水平。2，3-吲哚二酮-3-肟對上述關鍵癌癥相關靶分子的特異性作用，提供了將2，3-吲哚二酮-3-肟用作防癌和抗癌藥物的科學依據。
目前臨床上許多常用抗癌藥的作用機制是誘導DNA雙鏈斷裂，進而由DNA雙鏈斷裂激活細胞周期檢驗點，誘發癌細胞凋亡。這類已知抗癌藥的作用特點使其不可避免地產生兩大弊端第一、這類抗癌藥具有基因毒性，對患者身體造成的損害極大，并常常誘發新的基因突變，引起癌細胞耐藥，甚至誘發二次腫瘤發生。第二、癌細胞的細胞周期檢驗點經常失靈，其失靈的原因恰恰與癌基因產物cyclin E、cyclin B和cyclin A的過度表達和抑癌基因p21的表達阻遏密切相關，故此癌細胞易于對這類抗癌藥產生耐藥性。本發明一方面證明了2，3-吲哚二酮-3-肟不具有上述已知抗癌藥的第一項弊端用DNA雙鏈斷裂的特異性探針、即γH2AX抗體檢測表明，2，3-吲哚二酮-3-肟并不導致DNA雙鏈斷裂，即不具有基因毒性；相反，臨床常用基因毒類抗癌藥表柔比星則引起γH2AX表達量明顯增加，即產生了DNA雙鏈斷裂。本發明在小鼠毒性實驗中也證實，2，3-吲哚二酮-3-肟的體內毒性極低。本發明另一方面證明了2，3-吲哚二酮-3-肟能夠對抗已知抗癌藥的上述第二項弊端選取有代表性的臨床常用基因毒類抗癌藥表柔比星進行單獨或聯合給藥實驗，證實2，3-吲哚二酮-3-肟能夠增加癌細胞對表柔比星的敏感性，表明2，3-吲哚二酮-3-肟具有和傳統化療藥聯合用藥以便增加療效的價值。
圖1，2，3-吲哚二酮-3-肟對人鼻咽癌CNE細胞具有顯著的G1期阻斷作用。A.DMSO處理細胞24h的對照；B.4.2μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟處理細胞24h。圖中顯示流式細胞分析儀測得的細胞周期各個時相的分布。
圖2，2，3-吲哚二酮-3-肟對人鼻咽癌CNE細胞中周期蛋白和周期抑制因子表達的影響。各實驗組在藥物作用24h后，收集細胞，進行Western blotting。圖中每條區帶均分為三個泳道左側為DMSO溶劑對照(Ctr)，中間為4μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟(IO)，右側為4μg/ml靛紅(IS)。與對照(Ctr)和靛紅給藥組(IS)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟(IO)在顯著下調癌基因產物cyclin E、cyclin B和cyclinA表達的同時，對抑癌基因產物p21有明顯上調作用。
圖3，2，3-吲哚二酮-3-肟對人鼻咽癌CNE細胞的分化誘導作用。癌細胞經4μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟作用24h后，經鬼筆環肽-TRITIC標記微絲和Hoechst33258染色顯示細胞核之后，用激光共聚焦顯微鏡檢測。左側為DMSO對照，右側為2，3-吲哚二酮-3-肟給藥后的結果。
圖4，按本發明所述方法制備的2，3-吲哚二酮-3-肟的500MHz1H NMR表征圖譜。
具體實施例方式 實施例1按本發明的優化條件制備2，3-吲哚二酮-3-肟。
反應體系中鹽酸羥胺、靛紅、一水合氫氧化鋰的摩爾比按1.2∶1∶1設定。稱取鹽酸羥胺8.33g，溶于50ml DMF中，配成濃度為2.4mol/L的溶液，并置于一個有磁力攪拌裝置的容器中；向容器中加入一水合氫氧化鋰4.2g，并進行磁力攪拌；加入靛紅14.7g，在室溫下和磁力攪拌中進行反應。在數分鐘內，溶液由初始反應時的橙紅色轉變為淺橙黃色。在反應進行了30分鐘之后，溶液顏色不再變淺，按本發明所述方法檢測反應終點，證實全部靛紅均已經消耗完畢。在攪拌中加入150ml于4℃預冷的蒸餾水，溶液內出現大量鮮黃色沉淀；于4℃靜置30分鐘。棄去上部溶液，將沉淀物轉移到一個有濾紙的抽濾裝置中，抽濾除去殘留液體；用200ml預冷的蒸餾水淋洗沉淀物；最后用95％乙醇淋洗沉淀物，并抽濾去除殘余液體；于室溫下避光處晾干。所得2，3-吲哚二酮-3-肟產率為92.2％。2，3-吲哚二酮-3-肟的重結晶純化如下取上述產物3g，加入甲醇100ml，加熱至產物溶解；溶液于室溫冷卻后于4℃靜置過夜。收集析出的結晶；溶液經減壓旋轉蒸發儀濃縮1倍后，繼續于4℃靜置，收集結晶。合并所得2，3-吲哚二酮-3-肟純品，產率為70.4％，純度經HPLC檢測大于99％。上述溶液中殘余2，3-吲哚二酮-3-肟可通過進一步的濃縮和結晶回收。
按上述方法所獲2，3-吲哚二酮-3-肟的表征以DMSO d6為溶劑，對2，3-吲哚二酮-3-肟進行1H譜500MHz的核磁共振分析，所得圖譜見圖4。
實施例22，3-吲哚二酮-3-肟對癌細胞、惡性腫瘤細胞和轉化細胞的生長抑制作用和化療增敏作用。
將2，3-吲哚二酮-3-肟溶解于DMSO中，配成100mg/ml濃度的溶液，于-20℃冰箱凍存待用。以含10％新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基培養細胞，即在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養多種癌細胞、惡性神經膠質瘤細胞和人胎肝L02轉化細胞，常規消化傳代。取對數生長期細胞，消化后制成細胞懸液，按每孔5×103細胞的密度接種于96孔板。培養24h，實驗組加入上述先用二甲基亞砜(DMSO)溶解、再經RPMI-1640培養液稀釋至終濃度為1至20μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟；空白對照組加入RPMI-1640培養液；溶劑對照組加入0.1％DMSO；實驗中每個濃度設5個平行孔。各組繼續培養48h后用酸性磷酸酶法(acid phosphatase assay，APA)檢測給藥后細胞相對于對照組細胞的存活率(參見文獻馬朋，曹同濤，顧國峰，趙翔，杜宇國，張頁合成紫花茄皂甙誘導人肝癌細胞株Bel-7402凋亡的作用機制，癌癥，2006，25(4)438-442)。所得結果經Prism 4軟件繪圖并求出半數存活濃度。
結果如下2，3-吲哚二酮-3-肟對人小細胞肺癌NCI-H446細胞、人鼻咽癌CNE細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、大鼠C6神經膠質瘤細胞、人肝細胞癌BEL-7402細胞、和人胎肝L02細胞的半數生長抑制濃度分別為1.1μg/ml、2.1μg/ml、2.3μg/ml、5.0μg/ml、6.4μg/ml和7.8μg/ml。以上結果表明2，3-吲哚二酮-3-肟對癌細胞、惡性神經膠質瘤細胞和轉化細胞的增殖均有顯著抑制作用。
將不同濃度的2，3-吲哚二酮-3-肟與不同濃度的臨床常用抗癌藥表柔比星分別或聯合給藥，按上述方法檢測大鼠C6神經膠質瘤細胞的存活率。結果表明，當表柔比星的給藥濃度在0.0625μg/ml至1μg/ml之間時，同時給予5μg/ml或10μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟均可明顯增強各個不同濃度下的表柔比星對大鼠C6神經膠質瘤的殺傷作用，例如，在1μg/ml表柔比星作用下，仍有11％的C6神經膠質瘤存活；而當1μg/ml表柔比星與5μg/ml 2，3-吲哚二酮-3-肟聯合給藥時，僅有2％的細胞存活。表明2，3-吲哚二酮-3-肟有化療增敏作用。
實施例32，3-吲哚二酮-3-肟對癌細胞的細胞周期G1期阻斷和增殖抑制作用。
以濃度為4.2μg/ml的2，3-吲哚二酮-3-肟DMSO溶液處理人鼻咽癌CNE細胞，作用24h后收集細胞并制備細胞懸液，用PBS清洗2次，用200目不銹鋼網過濾細胞，獲得單細胞懸液。用-20℃預冷的70％乙醇固定細胞。4℃固定30分鐘以上后，將細胞離心，棄乙醇，PBS離心清洗兩次。調整細胞濃度為1×106/ml，加入RNase(終濃度為20μg/ml)，室溫放置30分鐘。離心，棄上清，將細胞用PBS重新懸浮。樣品中加入20μg/ml碘化丙錠(Propidium iodide，PI)后，用流式細胞儀檢測細胞周期各時相的比率，并進行統計學處理。
結果如圖1所示，與DMSO對照(圖1A)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟能夠特異性地將癌細胞阻斷于G1期(圖1B)。對細胞周期各時相的統計分析見表1。表1中可見與DMSO溶劑對照組相比，2，3-吲哚二酮-3-肟作用于人鼻咽癌CNE細胞24小時后，G1期所占比率顯著增高(P＜0.01)，S期即DNA復制期比率極顯著降低(P≤0.001)，表明2，3-吲哚二酮-3-肟能夠顯著抑制癌細胞進入DNA復制階段，即抑制癌細胞增殖。
表12，3-吲哚二酮-3-肟作用24h對CNE細胞周期的影響。各組數據均為三 次獨立實驗的平均值±標準誤。與對照組相比*P＜0.01，**P≤0.001。
實施例42，3-吲哚二酮-3-肟對癌基因產物cyclin E、cyclin B、cyclin A的表達量有顯著抑制作用，而對抑癌基因表達產物p21表達量有顯著促進作用。
用4μg/ml濃度的2，3-吲哚二酮-3-肟處理癌細胞24h。對照組包括等體積DMSO溶劑對照和4μg/ml濃度的合成前體靛紅對照。收集各組細胞，3000r/min離心15min。沉淀用預冷PBS洗滌2次后，加入2倍體積細胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1％NP 40，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin)，冰上裂解30～60min。于4℃、12000rpm離心10min。取上清。用Bradford法進行蛋白質定量。取含等量蛋白質的樣品進行12％凝膠濃度的SDS-PAGE電泳，然后將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，以含5％脫脂奶粉的TBST(含Tween 20的TBS)緩沖液于室溫封閉2h。分別用抗cyclin E、cyclin B、cyclin A和p21的單克隆抗體和抗Actin多克隆抗體雜交，以及HRP標記的二抗雜交后，應用SuperSignal West Pico Chemi-luminescent Substrate試劑盒(Pierce公司產品)進行化學發光檢測。
結果如圖2所示，與DMSO溶劑對照泳道(Ctr)和靛紅給藥泳道(IS)相比，2，3-吲哚二酮-3-肟(圖中IO泳道)作用于人鼻咽癌CNE細胞后，能夠顯著下調癌基因產物cyclin E、cyclin B和cyclinA表達，同時又對癌基因產物p21的表達有明顯上調作用。對人小細胞肺癌NCI-H446細胞、人鼻咽癌CNE細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、大鼠C6神經膠質瘤進行的實驗均顯示出同樣的結果，即顯著下調cyclin E、cyclin B和cyclin A表達，同時又明顯上調p21的表達。該實施例通過2，3-吲哚二酮-3-肟與其合成前體2，3-吲哚二酮即靛紅的對比實驗，證實2，3-吲哚二酮-3-肟對癌基因和抑癌基因的上述作用是高度特異的，而2，3-吲哚二酮或靛紅則不具備上述作用。
實施例52，3-吲哚二酮-3-肟對癌細胞和癌前轉化細胞的分化誘導作用。
以人鼻咽癌CNE細胞和人胎肝L02細胞為實驗對象。人胎肝L02細胞是一種永生化的轉化細胞，具有非整倍體核型等基因組不穩定性特征，不同于正常細胞；但接種到裸鼠體內不能成瘤，因而可作為癌前病變細胞的代表。用4μg/ml濃度的2，3-吲哚二酮-3-肟處理人鼻咽癌CNE細胞24h后，癌細胞的形態有明顯改變，由原先的多邊形變成不對稱的梭形，鋪展面積明顯減少，并出現大量絲狀突起即微棘。癌細胞的形態變長和趨于不對稱是細胞極性和細胞分化狀態趨于正常的表現。進一步用鬼筆環肽-TRITIC標記微絲和Hoechst33258染色顯示細胞核之后，再經激光共聚焦顯微鏡觀測和記錄。結果顯示，除了上述形態變化以外，與對照細胞(圖3左側)相比，經2，3-吲哚二酮-3-肟處理后，細胞內的微絲大量富集于質膜下即細胞皮質處，并突起形成毛刺狀(圖3右側)。微絲的這種變化與細胞分化和增殖抑制有關。對人胎肝L02細胞進行的上述檢測顯示出同樣的結果。進一步按實施例4所述方法檢測了鼻咽癌CNE細胞和人胎肝L02細胞內β-catenin和galectin-3蛋白的表達水平，結果表明2，3-吲哚二酮-3-肟顯著下調兩種細胞內β-catenin和galectin-3蛋白的表達。β-catenin和galectin-3的表達增加與癌細胞和癌前病變細胞的過度增殖和分化受阻密切相關，也與癌細胞的侵襲轉移能力呈正相關，因而是兩個重要的癌基因產物(參見張頁、張麗君“第十八章、細胞表面、細胞連接和細胞極性”；張頁“第二十一章、細胞社會性”，《醫學細胞生物學》周柔麗主編，普通高等教育“十五”國家級規劃教材，北京大學醫學出版社，2006年，第2版。)。因此，2，3-吲哚二酮-3-肟能夠通過下調癌基因β-catenin和galectin-3的表達，誘導癌細胞和癌前病變細胞的分化。
實施例62，3-吲哚二酮-3-肟不具有基因毒性 按上述實施例4所述方法給藥和進行Western blotting，但不同之處是用DNA雙鏈斷裂的特異性探針、即γH2AX單克隆抗體作為一抗進行免疫雜交。結果表明，溶劑對照組和2，3-吲哚二酮-3-肟給藥組均無γH2AX區帶，即無DNA雙鏈斷裂；然而表柔比星陽性對照組則出現明顯的γH2AX區帶，表明表柔比星導致DNA斷裂，具有基因毒性。
實施例72，3-吲哚二酮-3-肟的體內毒性低，可安全使用。
將2，3-吲哚二酮-3-肟溶解在DMSO中，配成2mol/L濃度，并分別以DMSO和同等濃度靛紅的DMSO溶液為對照，對昆明小鼠共36只進行腹腔注射。實驗包括一次給予最大劑量0.31ml的注射，和每天一次0.125ml、連續7天的腹腔注射。當對各組動物一次注射0.31ml被測樣品后，各組小鼠均在當天死亡；由于DMSO組同樣死亡，表明該實驗反映的是溶劑的毒性。當各組按每天一次0.125ml、連續7天進行腹腔注射時，各組均無一例動物死亡。經計算2，3-吲哚二酮-3-肟對小鼠的腹腔注射致死劑量大于0.9g/kg體重。靛紅是一種無毒的人體內源性生理物質，本實施例表明2，3-吲哚二酮-3-肟與靛紅對照無顯著性區別，可見2，3-吲哚二酮-3-肟同樣具有體內毒性低的優點。
權利要求
1.2，3-吲哚二酮-3-肟(或稱靛紅-3-肟)在制備預防或治療癌癥等惡性腫瘤的藥物中的應用，其特征是利用2，3-吲哚二酮-3-肟對細胞增殖周期特異性的G1期阻斷作用和阻止腫瘤細胞DNA復制的作用，或對周期蛋白cyclin E、cyclin B和cyclin A的表達下調作用、或對細胞周期抑制因子p21的表達上調作用，或對細胞的分化誘導作用，阻止非典型增生等癌前病變發展為癌癥，或者抑制癌細胞或惡性腫瘤細胞的增殖，或者輔助其他化療藥或放射療法殺滅癌細胞或惡性腫瘤細胞。
2.如權利要求1所述2，3-吲哚二酮-3-肟的制備方法，其特征是使用一種無水有機溶劑，該溶劑的特征是能夠保證2，3-吲哚二酮(即靛紅)在該溶劑中的室溫溶解量≥0.5mol/L；用該溶劑溶解鹽酸羥胺和2，3-吲哚二酮，并加入一種無機或有機堿；通過調節所加堿與鹽酸羥胺的當量比，保證反應體系的pH值為中性或弱酸性；在機械攪拌中于溫度范圍為0℃至50℃的任何一種溫度下反應生成2，3-吲哚二酮-3-肟；反應達終點后，向反應體系中加入2至5倍體積的水，致使鮮黃色的2，3-吲哚二酮-3-肟沉淀析出；再通過反復水洗、或反復水洗后有機溶劑內的重結晶，獲得2，3-吲哚二酮-3-肟純品；用本方法制備的2，3-吲哚二酮-3-肟滿足以下結構
3.如權利要求2所述的2，3-吲哚二酮-3-肟制備方法，所用無水有機溶劑為以下溶劑之中的任何一種二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基吡硌烷酮、吡啶、二甲基亞砜(DMSO)；其中優選二甲基甲酰胺。
4.如權利要求2所述的2，3-吲哚二酮-3-肟制備方法，鹽酸羥胺與靛紅的摩爾比為1至1.5∶1；所用的一種堿是以下任何一種氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、四硼酸鋰、四硼酸鈉、四硼酸鉀、三乙胺、吡啶、羥胺，其中優選氫氧化鋰；在所用反應溶劑中，鹽酸羥胺、靛紅、堿的溶解或加入可按任何順序進行；堿的加入量以保證反應體系的pH值為中性或弱酸性為準，即取1份體積的反應體系混合液，加10份體積的水混勻，測得的溶液pH值在4至7.5之間，其中優選pH值范圍為5至6.5。
全文摘要
本發明公布了一種2，3-吲哚二酮-3-肟、或稱靛紅-3-肟的制備方法，并公布了2，3-吲哚二酮-3-肟在制備癌癥預防或治療藥物方面的用途。2，3-吲哚二酮-3-肟在癌癥或其他惡性腫瘤防治方面的用途基于以下特征該物質對多種腫瘤細胞具有明顯的生長抑制作用；對細胞增殖周期具有特異性的G1期阻斷作用，即能夠阻止腫瘤細胞進行DNA復制；對周期蛋白cyclin E、cyclin B和cyclin A的表達有明顯下調作用；對細胞周期抑制因子p21的表達有明顯上調作用；對癌細胞或癌前病變細胞具有分化誘導作用；對基因毒類化療藥有增敏作用。
文檔編號A61K31/404GK101816649SQ200910009279
公開日2010年9月1日 申請日期2009年2月27日 優先權日2009年2月27日
發明者張頁, 林維佳, 張麗君, 趙翔, 張瑤, 薛非凡 申請人:北京大學