專利名稱：：一種雙特異性寡肽-力達霉素強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新型抗腫瘤靶向藥物及其制備方法和應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是威脅人類健康的多發病和常見病，已經位居人類疾病中三大主要死亡原因之首。傳統的腫瘤化學治療，由于靶向性不明確、選擇性不強、特異性不高和極易產生耐藥等，導致其存在殺傷腫瘤細胞的同時損害正常組織細胞，影n^^說壬n/上左甘B楚4;l11^Sliir^處、te;i^rnilTTT古日B接鉢仆&的^,B.t縣宮坫肺癇始;T^'t:j/J/v<-'J"—ij/yj、j，vri_jutu1.ji丄iH/J7、j'j夕u"i^i、-"乂uiu/jnji/-j_'i—j■/山,h"的效果。在靶向性治療中，單克隆抗體發揮了重要的作用，然而單抗存在對實體腫瘤滲透能力差的缺點。因此，采用小分子寡肽配體取代單抗的作用，已成為靶向藥物的一個發展方向。表皮生長因子受體EGFR(或稱HER1)、HER2、HER3和HER4都是跨膜受體酪氨酸激酶家族(ErbB)的成員。該家族成員有著相似的結構，均由胞外配體結合結構域、胞內激酶結構域和跨膜結構域組成。當配體與受體結合后，可導致受體發生同二聚化或異二聚化，從而激活受體的酪氨酸激酶活性，進而活化一系列的胞內信號通路，最終促進細胞的生長、增值、分化和遷移。EGF是EGFR的天然配體，以EGF或抗EGFR的單克隆抗體為導向分子構成的融合蛋白，能夠通過EGFR介導的內吞作用而進入EGFR表達的腫瘤細胞，從而發揮特異性殺傷作用。EGF由53個氨基酸組成，與受體結合的區段位于其C環。HER2目前還未發現其天然配體，但在發生二聚化時，它是其他受體優先選擇的對象。ErbB受體家族與人類癌癥的關系非常密切，尤其是EGFR和HER2。ErbB受體發生改變的腫瘤通常更具有侵襲性，而且病人往往也預后不良。例如在25-30%的乳腺癌中HER2基因呈高表達，在非小細胞肺癌和頭頸部腫瘤中EGFR大量表達或發生突變等，這就使得EGFR和HER2成為很有前景的腫瘤治療靶點。目甜臨床使用的靶向ErbB受體的藥物主要可分為兩類一類是單克隆抗體，用于結合受體的胞外結構域；另一類是小分子的酪氨酸激酶抑制劑，其機制是競爭性地結合酪氨酸激酶結構域的ATP結合位點。這些藥物單獨使用或者與其他化4療藥物聯合應用均獲得了較好的療效，但耐藥性問題仍然比較突出。研究顯示，EGFR和HER2是協同發揮作用的，共同導致NIH3T3細胞的癌變，而單獨的任何一個受體都不足以引起細胞的轉化。另一些研究也表明，在其他受體配基存在的情況下，靶向于某一ErbB受體的抗腫瘤藥物的效果會被抵消。此外，一些臨床甜的體內外研究也顯示，對ErbB受體的雙重抑制要比單獨靶向一個受體的抗腫瘤效果好。力達霉素(Lidamycin，LDM)也稱C-1027，是從我國湖北省潛江縣土壤中分離得到的一株鏈霉菌(5^eptomycesg/o^s;on^，菌種保藏號CGMCCNo.0704)產生的烯二炔類抗生素，是迄今報道過的對腫瘤細胞殺傷作用最強的大分子肽類抗腫瘤抗生素。體內動物試驗表明，LDM對小鼠結腸癌26有非常顯著的療效，對人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種人移植瘤均有較好療效[中國抗生素雜志1994，19(2):164-168]。LDM由輔基蛋白(LDP)和烯二炔結構的發色團(AE)兩部分組成，發色團是力達霉素分子的活性部分，輔基蛋白對發色團起穩定保護作用。LDM的發色團和輔基蛋白系通過非共價鍵結合，因而可在體外將其拆分與重建。LDM以其獨特的分子結構，成為構建新型導向藥物的理想"彈頭"[中國醫學科學院報2001，23(6):563-567]。小型化和高效化，是解決當前單抗治療劑所遇難點的重要途徑。本發明的目的，是以靶向EGFR和HER2的兩個寡肽Ec、Hr為導向分子，以LDM為"彈頭"，制備雙特異性強化融合蛋白。該強化融合蛋白在體外對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，體內試驗對人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤療效顯著。本發明所說的雙靶點強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，迄今為止尚未見有相關報道。
發明內容:本發明提供的雙靶點強化融合蛋白，是由分別靶向EGFR和HER2的兩個寡肽分子、力達霉素輔基蛋白以及力達霉素活性發色團組成，其中兩個導向寡肽分別位于力達霉素輔基蛋白的兩側。為了避免各分子之間空間結構的相互干擾，在導向分子和力達霉素輔基蛋白之間設計了(G4S)2的柔性連接肽；為了使融合蛋白在大腸桿菌中分泌表達，在其N水端還加入了pelB信號肽。靶向EGFR的導向短肽采用了EGFC環(22個氨基酸殘基，GenBank序列號AAS83395)，靶向HER2的導向短肽選擇了經過分子進化的抗HER2抗體C6.5重鏈的CDR3區(20個氨基酸殘基)[SchierR.等J.Mol.Biol.1996,263(4):551-567]。本發明構建的融合蛋白編碼基因全長為612bp，編碼204個氨基酸，融合蛋白分子量為19.3kD，其基因編碼序列和氨基酸序列如序列表所示。本發明的技術方案包括以下歩驟1.重組表達質粒pET-五c-丄D尸-Z/r的構建含有力達霉素輔基蛋白的重組質粒pEFL由本實驗室構建(菌種保藏號CGMCCNo.0960)，pMD18-T載體購于大連i生物公司，大腸桿菌菌株DH5a購自北京博大泰克公司，pET30a表達載體以及大腸桿菌菌株BL2kto/M(DE3)均購自Novagen公司。靶向EGFR和HER2的寡肽Ec和Hr(分別是EGFC環的22個氨基酸殘基、抗HER2抗體C6.5重鏈CDR3區的20個氨基酸殘基)、柔性連接肽(G4S)2以及pelB信號肽[RathoreD.等，FEBSLetters,1996，392(3):259-262]均根據其氨基酸序列反推出DNA序列，并參考了大腸桿菌偏愛密碼子，人工合成了上述寡肽的基因片段，作為PCR的引物，PCR引物由上海生工公司合成。采用PCR技術分別克隆得到基因片段和份基因片段，并在基因的N末端引入pelB信號肽序列；將基因與i^尸-Z/r基因進行重疊拼接PCR，得到五c-丄D尸-份基因，將此基因片段插入到pET30a表達載體中，得到重組表達載體pET-5c-LD尸-Z^。2.融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌中的誘導表達將表達載體pET-￡c-ZXP-//r轉化到大腸桿菌宿主菌BL2btor(DE3)中，得到轉化菌株，命名為pET-Ec-LDP-Hr，于2008年12月31R提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號CGMCCNo.2846。加入異丙基-^D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導8小時后，按pET系統操作手冊(Novagen公司)分別制備全細胞組分、培養液上清組分、周質腔組分、細胞質可溶性組分、包涵體組分，然后進行SDS-PAGE電泳分析融合蛋白的定位情況。結果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr主要以可溶性形式存在于周質腔中。3.融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化采用滲透壓震驚法提取大腸桿菌周質腔中的蛋白。由于pET載體帶有六聚組氨酸標簽，融合蛋白的純化采用親和層析方法，使用GE公司的HisTrapN產柱，按照GE公司的說明書進行操作。4.融合蛋白Ec-LDP-Hr的生物學活性測定主要采用ELISA法、流式細胞技術6和免疫熒光技術，分析融合蛋白Ec-LDP-Hr對腫瘤細胞的親和活性。5.強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備融合蛋白Ec-LDP-Hr與力達霉素活性發色團AE以1:3的比例，在體外進行分子組裝，得到強化融合蛋白Ec-LDP-Hr匿AE6.強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的生物學活性分析主要采用MTT法，檢測強化融合蛋白對不同腫瘤細胞的殺傷活性以及在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型中，觀察強化融合蛋白的體內抗腫瘤活性。發明效果本發明的優點和積極效果在于，所說強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE穩定性好，可以使用基因工程手段進行大規模發酵制備。該強化融合蛋白以兩個寡肽作為導向分子，分子量小(僅為19.3KDa)、免疫原性小、穿透性強。體外實驗結果顯示，其對腫瘤細胞的殺傷能力明顯優于LDM以及單特異性的強化融合蛋白Ec-LDP-AE和LDP-Hr-AE;體內試驗也顯示了良好的抗腫瘤療效，是一種新型、高效、小型抗腫瘤靶向藥物，具有良好的應用甜景。圖1:重組質粒pMD-fc-丄P/5-//r的構建示意圖圖2:重組質粒pET-Ec-丄D尸-份的限制性內切酶分析其中l.DNAMarkerDL15000;2.pET30a質粒；3.pET-￡c-Hr質粒；4.pET30a/AWel+loI;5.pET匿五c層mP-份/MM+勘I;6.DNAMarkerDL2000。圖3:融合蛋白Ec-LDP-Hr表達產物的SDS-PAGE分析其中l.分子量標準(kDa);2.IPTG誘導后五.co"總蛋白；3.IPTG誘導前五.co/Z總蛋白；4.誘導后培養液上清組分；5.誘導前培養液上清組分；6.誘導后五.co"周質腔組分；7.誘導前E.co/Z周質腔組分；8.誘導后Eco/Z細胞質可溶組分；9.誘導前KCO"細胞質可溶組分；10.誘導后五.CO"細胞質包涵體組分;11.誘導前細胞質包涵體組分。圖4:融合蛋白Ec-LDP-Hr經N卩+親和層析純化的SDS-PAGE分析其中1.分子量標準(kDa);2.未上柱的周質腔總蛋白；73.樣品上柱后未與N產柱結合的雜蛋白；4.用結合緩沖液洗脫下的雜蛋白；5.用洗滌緩沖液洗脫下的雜蛋白；6-13.用洗脫緩沖液洗脫下的目的蛋白。圖5:經N嚴親和層析純化的融合蛋白Ec-LDP-Hr的HPLC純度分析圖6:融合蛋白Ec-LDP-Hr對不同腫瘤細胞的免疫結合活性分析其中*—SK-OV-3;余一A431;*—SK-BR陽3;楊一MCF-7;&—NIH3T3。圖7:融合蛋白Ec-LDP-Hr對SK-BR-3乳腺癌細胞的免疫熒光化學分析圖8a:融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3細胞EGFR受體結合特異性分析其中l.PBS對照；2.融合蛋白與抗EGFR抗體混合物；3.抗EGFR抗體。圖8b:融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3細胞HER2受體結合特異性分析其中l.PBS對照；2.融合蛋白與抗HER2抗體混合物；3.抗HER2抗體。圖9:強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE體外組裝的HPLC分析圖10a:強化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE對SK-0V-3細胞的體外細胞毒作用其中LDM;*—Ec-LDP-iir-AE;—Ec-LDP-AE;一LDP-Hr-AE。圖10b:強化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE對SK-BR-3細胞的體外細胞毒作用其中*一LDM;*—Ec-LDP-HKAE;Ec-LDP-AE;—LDP-Hr-AE。圖10c:強化融合蛋白對A431細胞的體外細胞毒作用其中*一LDM;*—Ec-LDP-Hr-AE;o—Ec墨LDP-AE;—LDP-Hr-AE。圖10d:強化融合蛋白對MCF-7細胞的體外細胞毒作用其中*一LDM;蕃一Ec-LDP畫Hr-AE;—Ec-LDP-AE;—LDP-Hr-AE。。圖10e:強化融合蛋白對NIH3T3細胞的體外細胞毒作用其中*一LDM;尋一Ec-LDP陽Hr-AE;—Ec-LDP-AE;*—LDP-Hr-AE。8圖11:強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用其中4一Control;—Ec-LDP-Hrlmg/kg;LDM0.05mg/kg;*一Ec-LDP-Hr-AE0.3mg/kg;Ec-LDP-Hr-AE0.4mg/kg;a—Ec-LDP-Hr-AE0.5mg/kg。具體實施例方式以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。<實施例1〉重組表達質粒pET-Ec-Z"/V/r的構建.-PCR反應引物PI:5'ggtggaggcggtteaggtggaggtteagcgcccgccttctecgtcagt3'(l-27bp為(G4S)2連接肽序列，28-48bp與力達霉素輔基蛋白l-21bp配對)P2:5'tgaaccgcctecacctgaaccgcctecaccgccgaaggtcagagecacgtg3'(l-30bp為(G4S)2連接肽序列，31-51bp與力達霉素輔基蛋白639-660bp配對)P3:5'aactgtgtggtgggctatattggcgaacgctgtcagtatcgcgatctgaaatggtgggaactgcgcggtggaggcggtteaggt3，(l-66bp為寡肽Ec片段序列，67-84bp%(G4S)2連接肽l-18bp配對)P4:5'gcetcgagcacgcccagccattceggccatttcgcacagetgcgateggtacaatagcccacateatgtgaaccgcctecacctga3'(下劃線部分為A7wl酶切位點，9-60bp為寡肽Hr序列，61-86bp與(G4S)2連接肽1-18配對)P5:5'gccatatgaaatacctgctgccgaccgetgetggtctgctgetcetcgetgcccagccggcgatggccatggccaactgtgtggtgggctatatt3'(下劃線部分為Mfel酶切位點，9-66bp為pelB信號肽序列，67-95bp與寡肽Ec的1-21bp配對)P6:5'gc￡§L§tg_aaatacctgctgccgacc3'(下劃線部分為Mfel酶切位點，與pdB信號肽序列l-18bp配對)P7:5'gcetcgagcacgcccagccattcegg3，(下劃線部分為屈ol酶切位點，與寡肽Hr序列42-60bp配對)Rl:5'gccgaaggtcagagecacgtg3，(與力達霉素輔基蛋白639-660bp配對)R2:5'gcgcccgccttctecgtcagtc3'(與力達霉素輔基蛋白l-22bp配對)R3:5'gcetcgaggccgaaggtcagagecacgtg3'(下劃線部分為oI酶切位點，與力達霉素輔基蛋白639-660bp配對)(1)以質粒pEFL(含有力達霉素輔基蛋白基因)為模板，弓l物1和引物Rl以及引物4和引物R2分別進行第一輪常規PCR反應，產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收360bp的片段，克隆至pMD18-T載體，分別命名為pMDl和pMD2，挑選出陽性克隆進行測序。序列正確的質粒作為下一輪PCR反應的模板；(2)以質粒pMDl和pMD2為模板，弓l物2和引物Rl以及引物5和引物R2進行第二輪PCR反應，產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳回收426bp以及420bp的片段，克隆至pMD18-T載體，分別命名為pMD3和pMD4，挑選出陽性克隆進行測序。序列正確的質粒作為下一輪PCR反應的模板；(3)以質粒pMD3為模板，弓1物3和引物R3進行第三輪PCR反應，產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收500bp的片段，克隆至pMD18-T載體，命名為pMD5，轉化大腸桿菌DH5a，挑選出陽性克隆進行測序。序列正確的質粒作為下一輪PCR反應的模板；(4)以質粒pMD5為模板，弓I物6與引物R1進行第四輪PCR反應；同時以質粒pMD4為模板，引物5和引物R2進行PCR反應，產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，回收500bp以及420bp的片段；(5)以回收的兩個片段混合作為模板，引物6和引物7進行第五輪重疊拼接PCR反應，產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收600bp的片段，克隆至pMD18-T載體，命名為pMD-五c-丄DP-i^。重組質粒pMD-五c-丄i^-Z^的構建見(圖1)，挑選出陽性克隆進行測序；(6)測序驗證正確的質粒用Mfel和^oI雙酶切，酶切得到的小片段與經過相同雙酶切的pET30a載體連接，得到重組表達載體pET-五c-丄D/5-/^(圖2)。經過五輪PCR構建的融合蛋白基因全長612bp，編碼204個氨基酸，其中pe舊信號肽長72bp,編碼24個氨基酸，融合蛋白分泌至周質腔中時信號肽被周質腔中的信號肽酶切除，只留下兩個氨基酸甲硫氨酸和丙氨酸；EGFC環長66bp，編碼22個氨基酸，之后依次是(G4S)2連接肽(IO個氨基酸)、力達霉素輔基蛋白(110個氨基酸)、(G4S)2連接肽(IO個氨基酸)、抗HER2抗體重鏈CDR3區(20個氨基酸)、A7^I酶切位點(2個氨基酸)以及組氨酸標簽(6個氨基酸)，因此，最后得到的融合蛋白含有182個氨基酸殘基，測序結果和預期一致，表明載體構建成功。其基因序列和氨基酸序列見序列表。<實施例2>融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌中的誘導表達將表達載體pET-Ec-丄Z)尸-份轉化大腸桿菌BL21sto/M(DE3)感受態細胞。從平板上挑取一個單克隆接種至10mlLB培養基(含有卡那霉素50/xg/ml)中，37'C搖床振蕩培養過夜。次日將10ml菌液轉接至lLLB培養基(含有卡那霉素50/xg/ml)中，37'C搖床繼續振蕩培養至OD60(^2。菌液在無菌條件下于4°C、5,000g離心10分鐘，菌體沉淀用1L新鮮的LB培養基(含有卡那霉素50Mg/ml)重懸，加入IPTG至終濃度為O.lmM，37'C搖床振蕩培養8小時。按照pET系統操作手冊中的步驟，分別制備全細胞組分、培養液上清組分、周質腔組分、細胞質可溶性組分和包涵體組分，15%SDS-PAGE分析結果表明，在周質腔中經誘導的菌體在18kD處有目的條帶表達，而未經誘導的菌體則無此帶(圖3)。對影響表達產量的各個條件溫度、菌體起始密度、IPTG濃度和誘導時間分別進行了優化，最終確定表達條件為溫度37°C、菌體起始密度OD600=2、IPTG濃度為O.lmM、誘導時間8小時。<實施例3>融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化(1)將誘導好的菌液于4'C、10,000g離心10分鐘，收集菌體，融合蛋白主要定位于大腸桿菌的周質腔，周質腔蛋白的提取采用滲透壓震驚法；(2)將菌體重懸于100ml高滲溶液(30mMTris-Cl,lmMEDTA,20。/。蔗糖，pH8.0)中，用磁力攪拌器于室溫緩慢攪拌10分鐘；'(3)于4。C、10,000g離心IO分鐘，收集菌體，棄去上清液；(4)用90ml預冷的蒸餾水(低滲溶液)重懸菌體，用磁力攪拌器于4。C緩慢攪拌10分鐘；(5)于(C、10，000g離心IO分鐘，收集上清液；11(6)上清液中加入10mlIOX結合緩沖液(200mM磷酸緩沖液，5MNaCl,200mM詠唑)，使磷酸緩沖液、NaCl、咪啤的終濃度分別為20mM、0.5M和20mM;(7)由于融合蛋白帶有六聚組氨酸標簽，因此其純化方法主要采用Ni2+親和層析技術，親和層析柱HisTrapHP購于GE公司；(8)msTrap親和層析柱先用蒸餾水沖洗5個柱體積，再用1X結合緩沖液(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl,20mM咪唑)平衡5個柱體積；(9)將上述提取的周質腔蛋白溶液上柱，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(10)洗滌緩沖液I(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCi,50mM咪唑)沖洗柱子5體積，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(11)洗滌緩沖液II(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl,70mM咪唑)沖洗柱子5體積，控制流速為lml/min，收集流出液以備分析；(12)洗脫緩沖液(20mM磷酸緩沖液，0.5MNaCl，500mM咪唑)洗脫蛋白，洗5-8個柱體積，流速控制為lml/min，分管收集流出液以備分析；(13)將各部分的流出液各取50u1進行SDS-PAGE電泳(圖4)分析，收集含目的蛋白的洗脫液；(14)將含目的蛋白的洗脫液用IOK的超濾管(Millipore公司)濃縮至所需濃度，蛋白溶液于-8(TC保存備用。純化的融合蛋白產量為每升發酵液9mg活性蛋白，經HPLC檢測純度為95.3。/。。(圖5)。<實施例4〉融合蛋白Ec-LDP-Hr對腫瘤細胞的免疫活性分析1.ELISA法分析融合蛋白對各種腫瘤細胞的免疫反應性(1)人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、人卵巢癌細胞SK-OV-3，人表皮癌細胞A431、小鼠成纖維細胞NIH3T3以1X104個細胞/井的密度接種于96孔板(不同細胞的大小以及生長速度有差異，本數量是以MCF-7細胞為例，其他的細胞以24小時長滿96孔板為準)，37'C培養24小時后用PBS洗3次(3分鐘/次)，加入4'C預冷的0.05%戊二醛50U1/井，于4"C固定細胞15分鐘；(2)固定好的細胞用PBS洗3次后，用1%BSA/PBS溶液以200/xl/井于4'C封閉過夜；(3)用PBST緩沖液(PBS中含有0.05%的Tween-20)洗3次；(4)將融合蛋白倍比稀釋加入到96孔板中，50m1/井，每個濃度設3個平行井，37'C溫育2小時；(5)用pbst洗3次后，加入抗His-tag單抗(1:2000)稀釋，50m1/井，37°C溫育2小時；(6)用PBST洗板3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(]:2500)稀釋，50/^1/井，37'C溫—存2小時；(7)用PBST洗板5次，加入辣根過氧化物的底物反應液(鄰苯二胺0.1M檸檬酸H202=4mg:10ml:15mU，100]Ul/井，室溫避光反應10分鐘。以2M的硫酸100Ml/井終止反應，立即在酶標儀上測定492nm的吸光值。結果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr對高表達EGFR和HER2的腫瘤細胞，如SK-0V-3、A431、SK-BR-3和MCF-7都有較強的免疫結合活性，而對不表達EGFR和HER2的小鼠成纖維細胞NIH3T3則沒有免疫結合活性，且結合活性的強弱與EGFR和HER2的表達水平存在一定的相關性，如SK-OV-3細胞EGFR和HER2表達水平均較高，因此，融合蛋白與該細胞的親和活性最強(圖6)。2.細胞免疫熒光法分析融合蛋白Ec-LDP-Hr與SK-BR-3乳腺癌細胞結合活性將SK-BR-3細胞(EGFR和HER2均表達)以4X104的密度接種到放有蓋玻片的六孔板中，37'C培養24小時后用PBS洗3次，加入甲醇于室溫固定10分鐘，吸棄甲醇，再次加入甲醇置于-20'C固定IO分鐘，PBS洗3次；加入融合蛋白Ec-LDP-HR(50|Ug/ml)，于室溫孵育2小時或于4"過夜，然后PBS洗3次；加入1:500稀釋的抗His-tag抗體，室溫反應2小時，PBS洗3次；加入l:IOO稀釋的FITC(中文？)標記羊抗鼠IgG，室溫避光反應1小時，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察并照相。結果表明，融合蛋白Ec-LDP-Hr可與SK-BR-3乳腺癌細胞發生特異性結合(圖7)。3.競爭性免疫熒光試驗，分析融合蛋白Ec-LDP-HR與EGFR和HER2結合的特異性取對數生長期的SK-BR-3細胞，用胰酶消化后計數，取5個離心管，每管中加入5x1()S個細胞，PBS洗3次后用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，13PBS洗3次；在5個離心管中分別加入PBS、Ec-LDP-Hr蛋白(100/xM)和抗EGFR抗體(5/xg)混合物、抗EGFR抗體(5/ag)、Ec-LDP-Hr(100/xM)蛋白和抗HER2抗體(5將)混合物、抗HER2抗體(5/ig)，反應體積均為100/J，4。C反應過夜；離心去上清，PBS洗3次后加入FITC標記羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(l:100稀釋)，室溫反應l小時；離心去上清，PBS洗3次后重懸于lmlPBS中，流式細胞儀測定熒光強度。結果表明，融合蛋白可以競爭性地抑制抗EGFR抗體和抗HER2抗體與SK-BR-3細胞的結合(圖8a和8b)。<實施例5>強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備取高活性的力達霉素純品(專利號00121527.2)，經C4柱分離活性發色團，流動相為水乙腈三氟乙酸(78%:22%:0.05%)，檢測350nm處的吸光值，收集發色團。將融合蛋白與發色團按照l:3的分子比混合，置于搖床上緩慢晃動，室溫避光反應12-16小時，將二者的混合液經SephadexG-75柱除去未包裝上的發色團。經HPLC檢測發現，融合蛋白與發色團已成功組裝，得到了強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE(圖9)。<實施例6>MTT法檢測強化融合蛋白對腫瘤細胞的殺傷活性取對數生長期的MCF-7、SK-BR-3、SK-0V-3、A431、NIH3T3細胞，用胰酶消化后計數，以4000個細胞/孔接種于96孔板中(本數量是以MCF-7細胞為例，不同細胞的生長速度不同，接種量也不相同，以未加藥的細胞72小時長滿96孔板為原則)，37'C培養24小時后吸棄培養液，加入以培養液稀釋的不同濃度的力達霉素或強化融合蛋白200/Al/L，每個藥物濃度設三個平行孔，繼續培養72小時后，每孔加入以PBS溶解的MTT(5mg/ml)20/xl，37。C繼續培養4小時后，吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜，室溫搖床振蕩10分鐘，酶標儀上測定570nm處的吸光值。每次實驗均設無藥對照孔和無細胞對照孔各3孔，按下面公式計算細胞的存活率及強化融合蛋白的IC5o值細胞存活率=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)X100%結果表明，強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對SK-OV-3、SK-BR-3、A431和MCF-7等腫瘤細胞均有強烈的殺傷作用(圖10a、10b、10c、10d、10e)，其14IC5o值低于LDM和單特異性的強化融合蛋白，而對不表達EGFR和HER2的小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞，其ICso值則與LDM相當(表1)。由此可以看出，強化融合蛋白與LDM和單特異性的強化融合蛋白相比，其對高表達EGFR和HER2的腫瘤細胞具有更強的殺傷能力，而對正常細胞的毒性則略有下降，這表明強化融合蛋白的作用具有特異性。表1.LDM和強化融合蛋白對各種細胞的ICm)但<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><實施例7>強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的治療作用'取體重為18-22g的雌性BALB/c裸鼠2只，將人卵巢癌細胞SK-OV-3接種于裸鼠腋窩皮下，每只接種1X1(^個細胞。待瘤塊長至足夠大小時，將其在無菌生理鹽水中剪成2X2X2mm3的小塊，用套管針將腫瘤分別移植到36只體重為18-22g的雌性BALB/c裸鼠右腋窩皮下，用火膠棉將切口粘住。待瘤塊長至100mr^大小時，將裸鼠按照瘤塊大小、體重分6組，使每組瘤塊大小平均值為100mm3，且各組體重平均值接近，每組6只裸鼠。瘤塊接種后第12天和第19天尾靜脈注射給藥。LDM劑量為0.05mg/kg，；融合蛋白Ec-LDP-Hr劑量為lmg/kg，強化融合蛋白3個劑量組，分別為0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，均為尾靜脈注射給藥。實驗期間每3天測量一次腫瘤直徑和體重，根據公式V=ab2/2計算腫瘤體積(a:腫瘤長徑，b:腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線(圖11)，計算抑瘤率，觀察體重變化(表2)。實驗第30天處死動物，分離腫瘤并稱重。實驗結果表明，強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對人卵巢癌移植瘤有顯著療效，其中強化融合蛋白0.5mg/kg、0.4mg/kg和0.3mg/kg劑量組第30天的抑瘤率分別為80.3%、70.3%、65.8%,0.5mg/kg和0.4mg/kg劑量組明顯優于LDM治療組(抑瘤率為65%)。表2.強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE對人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>序列表<110>中國醫學科學院醫藥生物技術研究所〈120〉一種雙特異性寡肽-力達霉素強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE<160>2〈210〉丄<211〉612<212〉腿〈213>人工序列<220><221〉sig—peptide〈222〉(1)…(72)<223〉〈400〉1tgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcg60atggccatggcgaactgtgtggtgggctatattggcgaacgctgtcagtatcgcgatctg120aaatggtgggaactgcgcggtggaggtggttcaggtggaggcggttcagcgcccgccttcISOtccgtcagtcccgcctcgggtctgagtgacggacagagcgtgtcggtgtcggtcagcggt240gccgccgccgCt3C3tCgCCcagtgcgctccggtcggtggccaggacgcg300tgcaacccggcgaccgcgacgtccttraccacggacgcgtccggagcggcgtcgttcagc360ttcgtcgtgcgcaagtcgtacacgggctcc3CgCCCg33ggcacgccggtcggcagcgtc420gactgcgccacggccgcctgteacctcggcgccggcaactccgggctcgaCCtCggCC2lC480gtggctctgaccttcggcggtggaggcggttcaggtggaggc幽tcacatgatgtgggc540tattgtaccgatcgcagctgtgcgaaatggccggaatggc'tg能Cgtgctcgagcaccac600C3CCaCC3CC3C612<210>2<211>182<212>PRT〈213〉人工序列17<220>《223〉<400>2MetAlaAsnCysValValGlyTyrlieGlyGluArgCysGinTyr11015ArgGluLeuLysTrp20TrpGluLeuArgGly25GlyGlyGlySerGly30GlyGlyGlySerAla35ProAlaPheSerVal40SerProAlaSerGly45LeuSerAspGlyGin50SerValSerValSer55ValSerGlyAlaAla60AlaGlyGluThrTyr65TyrlieAlaGinCys70AlaProValGlyGly75GinAspAlaCysAsn80ProAlaThrAlaThr85SerPheThrThrAsp90AlaSerGlyAlaAla95SerPheSerPheVal100ValArgLysSerTyr105ThrGlySerThrPro110GluGlyThrProVal115GlySerValAspCys120AlaThrAlaAlaCys125AsnLeuGlyAlaGly130AsnSerGlyLeuAsp135LeuGlyHisValAla140LeuThrPheGlyGly145GlyGlyGlySerGly150GlyGlyGlySerHis155AspValGlyTyrCys160ThrAspArgSerCys165AlasTrpProGlu170TrpLeuGlyValLeu175GluHisHisHisHis180HisHis18218權利要求1.一種雙特異性寡肽-力達霉素強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，其特征是所說融合蛋白由靶向EGFR的寡肽、力達霉素輔基蛋白、靶向HER2的寡肽以及力達霉素活性發色團四部分組成，其分子量為19.3kD，基因全長612bp，編碼204個氨基酸。2.權利要求1所述的強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，其特征是靶向EGFR的寡肽Ec基因為66bp，編碼EGFC環的22個氨基酸殘基；力達霉素輔基蛋白LDP基因330bp，編碼110個氨基酸；靶向HER2的寡肽Hr基因長60bp，編碼抗HER2抗體C6.5重鏈CDR3區的20個氨基酸。3.制備權利要求1所述強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的方法，其特征是所說方法包括以下歩驟(1)重組表達質粒pET-五c-丄"/5-/^的構建；(2)融合蛋白Ec-LDP-Hr在大腸桿菌(菌種保藏號CGMCCNo.2846)中的誘導表達；(3)融合蛋白Ec-LDP-Hr的分離純化；(4)融合蛋白Ec-LDP-Hr的生物學活性測定；(5)強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制備。4.權利要求3所述的制備方法，其特征是運用基因工程技術，分別克隆得到五c-丄D尸基因片段和丄AP-份基因片段，并在丄"戶基因的N水端引入pelB信號肽序列；將丄D尸基因與基因進行重疊拼接PCR，得到￡0丄1)尸-/^基因，將此基因片段插入到pET30a表達載體中，得到重組表達載體pET-￡c-i"尸-7/r。5.權利要求3所述的制備方法，其特征是將表達載體pET-Ec-丄Z)/3-//r轉化到大腸桿菌宿主菌BL21加"tm(DE3)中，經IPTG誘導得到融合蛋白Ec-LDP-Hr。6.權利要求3所述的制備方法，其特征是釆用親和層析方法，從大腸桿菌周質腔中純化融合蛋白Ec-LDP-Hr。7.權利要求3所述的制備方法，其特征是采用ELISA法、流式細胞技術和免疫熒光技術，分析融合蛋白Ec-LDP-Hr對腫瘤細胞的免疫反應性。8.權利要求3所述的制備方法，其特征是將融合蛋白Ec-LDP-Hr與力達霉素活性發色團AE在體外進行分子組裝，得到強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE。9.權利要求1所述強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE在制備抗腫瘤導向藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種雙特異性寡肽-力達霉素強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE，該融合蛋白由靶向表皮生長因子受體EGFR和HER2的兩個寡肽、力達霉素輔基蛋白以及力達霉素活性發色團四部分組成，研究證明，其在體外能與表達表皮生長因子受體EGFR和HER2的腫瘤細胞特異性結合，對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，體內試驗對人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤療效顯著，顯示了靶向藥物的小型化與高效化的特點，具有良好的應用前景。文檔編號A61P35/00GK101497666SQ200910000090公開日2009年8月5日申請日期2009年1月7日優先權日2009年1月7日發明者悅商,甄永蘇,郭曉芳,金蓮舫申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所