改進的基于纖連蛋白的結合分子及其用途的制作方法

專利名稱：改進的基于纖連蛋白的結合分子及其用途的制作方法
改進的基于纖連蛋白的結合分子及其用途相關信息本申請要求2007年12月27日遞交的美國臨時申請號61/009，361的優選權。本 說明書通篇引述的任何專利、專利申請和參考文獻的內容在此全文并入作為參考。
背景技術：
能夠與期望的靶表位特異性結合的分子作為治療劑和醫學診斷工具均具有極大 意義。此類分子的實例是單克隆抗體。對于幾乎任何結構表位，都可以選擇出特異性地并 以高親和力與之結合的抗體。所以，抗體常規地用作為研究工具和FDA批準的治療劑，從而 治療性和診斷性單克隆抗體的全球市場目前價值約$300億。然而，單克隆抗體具有許多缺點。例如，經典抗體是大而復雜的分子。它們具有雜 四聚體結構，含有通過分子間二硫鍵和分子內二硫鍵連接在一起的兩條輕鏈和兩條重鏈。 這種結構復雜性使得不能容易地表達抗體或多特異性抗體，例如含有對兩個不同分子治療 靶標的結合特異性的分子。大分子抗體也限制了其治療效力，因為它們往往不能夠有效穿 透某些組織間隙。另外，治療性抗體因為擁有Fc區，偶爾會觸發不期望的效應子細胞功能 和/或凝血級聯反應。從而本領域需要能夠以高親和力和特異性與期望靶標特異性結合的可選結合分 子。發明概述本發明通過提供基于纖連蛋白的結合分子以及將供體CDR引入到基于纖連蛋白 的結合支架尤其是FN3中的方法，而解決了前述問題。本發明基于纖連蛋白的結合分子可 以進一步工程化或綴合其他部分例如PEG、Fe、HSA、抗HSA，以提高半衰期和穩定性。本發 明還提供了篩選與靶抗原結合的此類分子以及制備和純化候選結合劑的方法。此外，本發 明首次證實，Fn3基結合分子可以成功地體內表達，尤其是在哺乳動物細胞，例如大鼠、小 鼠、倉鼠、人細胞或源于其的細胞系中表達。再者，本發明證實，工程化或綴合其它部分例如 PEG、Fc、HSA、抗HSA的Fn3基結合分子也可以成功地在哺乳動物細胞中表達并顯示出增加 該分子的半衰期的期望生理學效應。從而本發明具有多個優點，包括但不限于如下-提供了基于纖連蛋白的結合分子，例如修飾的基于纖連蛋白的結合分子，所述結 合分子由于分子小而且沒有免疫原性而適于作為治療劑；-提供了基于纖連蛋白的結合分子，所述結合分子具有延長的半衰期；-提供了基于纖連蛋白的結合分子，同時還提供了用于與期望的功能部分例如阻 斷部分、可檢測部分、診斷部分或治療部分相連的位點；和-以基于纖連蛋白的結合分子處理有需要的受試者用于診斷或治療的方法。一方面，本發明提供了基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，包含至少兩個 Fn3i3鏈結構域序列以及連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中環區序列 包含與特異性靶標結合的非Fn3結合序列(即外源結合序列)。一般與野生型III型纖連 蛋白(Fn3)分子(SEQ ID NO!)相比，所述結合分子還包含至少一個修飾的氨基酸殘基用于連接功能部分。在特別的實施方案中，在基于Fn3的結合分子中該非Fn3結合序列包含互補決定 區(CDR)的全部或部分，例如抗體、特別是單鏈抗體、單域抗體或駝類(camelid)納米抗體 的⑶R。⑶R可選自⑶R1、⑶R2、⑶R3區及其組合。可選擇此類非Fn3結合序列以結合各種 靶標，包括但不限于細胞受體、細胞受體配體、生長因子、白介素、細菌或病毒。基于Fn3的結合分子內的該修飾氨基酸殘基可包括，例如，添加和/或將至少一個 Fn3氨基酸殘基取代為至少一個半胱氨酸殘基或非天然氨基酸殘基。在一個實施方案中， 半胱氨酸或非天然氨基酸殘基位于環區、β鏈區、β樣鏈、C-末端區域、位于C-末端和最 C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區域、和/或N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈 之間。在特別的實施方案中，修飾的氨基酸殘基包括一個或多個如下殘基的取代Ser 17、 Ser 21、Ser 43、Ser 60、Ser 89、Val 11、Leu 19、Thr 58 和 Thr 71。另一方面，本發明提 供了綴合物，其包括與非Fn3多肽相連的基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，其中基于 Fn3的結合分子包含至少兩個Fn3i3鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間 的環區序列，其中環區序列結合特定的靶標。在另一實施方案中，環區包含與特定靶標結合 的外源結合序列。一般而言，非Fn3多肽能夠結合第二靶標，和/或增加基于Fn3的結合分子在體內 給藥時的穩定性(即，半衰期)。適宜的非Fn3多肽包括但不限于抗體Fc區、人血清白蛋 白(HSA)(或其部分)和/或與HSA結合的多肽、或其他具有增加的半衰期的血清蛋白質例 如轉鐵蛋白。非Fn3部分增加綴合物的半衰期，使得綴合物的半衰期大于未綴合的Fn3基結合 分子的半衰期。綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期大至少2-5小時、 5-10 小時、10-15 小時、15-20 小時、20-25 小時、25-30 小時、35-40 小時、45-50 小時、50-55 小時、55-60小時、60-65小時、65-70小時、75-80小時、80-85小時、85-90小時、90-95小 時、95-100 小時、100-150 小時、150-200 小時、200-250 小時、250-300 小時、350-400 小 時、400-450 小時、450-500 小時、500-550 小時、550-600 小時、600-650 小時、650-700 小 時、700-750 小時、750-800 小時、800-850 小時、850-900 小時、900-950 小時、950-1000 小 時、1000-1050 小時、1050-1100 小時、1100-1150 小時、1150-1200 小時、1200-1250 小時、 1250-1300 小時、1300-1350 小時、1350-1400 小時、1400-1450 小時、1450-1500 小時。綴合 物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30 倍、35 倍、40 倍、45 倍、50 倍、55 倍、60 倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。一個實施方案中，非Fn3部分是與Fn3基結合分子融合的抗體Fc區。該綴合物的 半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的大至少5-30倍，且該綴合物的體內半衰期為至少9. 4 小時。另一實施方案中，非Fn3部分是與Fn3基結合分子連接的血清白蛋白或轉鐵蛋白、或 其部分。該綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的大至少20-25倍，且該綴合物的 體內半衰期為至少19. 6小時。另一實施方案中，非Fn3部分是與Fn3基結合分子連接的抗 血清白蛋白或抗轉鐵蛋白、或其部分。該綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的大 至少10-35倍，且該綴合物的體內半衰期為至少7. 7小時。另一實施方案中，非Fn3部分是
8與Fn3基結合分子連接的聚乙二醇(PEG)。該綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子 的大至少5-25倍，且該綴合物的體內半衰期為至少3. 6小時。一個實施方案中，非Fn3部分包含融合在Fn3基結合分子的N末端區或C末端區的 抗體Fc區。抗體Fc區也可以在選自如下的區域與Fn3基結合分子融合環區、β鏈區、β 樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區域、和/或N-末 端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。Fc綴合物的體內半衰期增加至少大約9. 4小時。另一實施方案中，非Fn3部分包含血清白蛋白(SA)，例如人血清白蛋白(HSA)、或 其部分、或結合SA的多肽，例如抗HSA。SA綴合物的體內半衰期為至少大約19.6小時，而 抗SA綴合物的體內半衰期為至少大約7. 7小時。再一實施方案中，非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。PEG部分可以結合至巰基基團 或胺基團。PEG部分可以通過定點PEG化連接到Fn3基結合分子上，例如Cys殘基或非天 然氨基酸殘基上。PEG部分可以連接在Fn3基結合分子中的選自如下的區域上環區、β 鏈區、β樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區域、和 N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。PEG部分具有大約2kDa至大約IOOkDa之間 的分子量。PEG綴合物的體內半衰期增加至少大約3. 6小時。另一實施方案中，本發明涉及具有改善的藥代動力學性質的綴合物，所述綴合物 包含與結合抗體Fc區的多肽連接的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，其中Fn3基 結合分子包含至少兩個Fn3 β鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區 序列，其中綴合物結合特定的靶標，具有至少9. 4小時的血清半衰期。另一實施方案中，本發明涉及具有改善的藥代動力學性質的綴合物，所述綴合物 包含與血清白蛋白(SA)部分連接的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，其中Fn3基 結合分子包含至少兩個Fn3 β鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區 序列，其中綴合物結合特定的靶標，具有至少19. 6小時的血清半衰期。另一實施方案中，本發明涉及具有改善的藥代動力學性質的綴合物，所述綴合物 包含與結合血清白蛋白(SA)部分的多肽連接的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子， 其中Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3i3鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列 之間的環區序列，其中綴合物結合特定的靶標，具有至少7. 7小時的血清半衰期。另一實施方案中，本發明涉及具有改善的藥代動力學性質的綴合物，所述綴合物 包含與PEG部分連接的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，其中Fn3基結合分子包 含至少兩個Fn3i3鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中 綴合物結合特定的靶標，具有至少3. 6小時的血清半衰期。另一實施方案中，本發明涉及具有改善的藥代動力學性質的綴合物，所述綴合物 包含與抗FcRn部分連接的、基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子，其中Fn3基結合分子 包含至少兩個Fn3i3鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其 中綴合物在酸性PH以高親和性而在中性ρΗ以低親和性結合新生兒FcR受體(FcRn)。酸性 PH可以為大約1至大約7，中性ρΗ可以為大約7.0至大約8.0。一個實施方案中，酸性ρΗ 為大約PH 6. 0，中性ρΗ為大約ρΗ 7. 4。Fn3基結合分子或綴合物可以具有源自至少兩個相同或不同纖連蛋白組件的Fn3 結構域，其中所述纖連蛋白組件來自IFn至17-Fn組件之任一，并可以以任何組合方式組合，例如，10Fn3-10Fn3 ； 10Fn3-9Fn3，10Fn3-8Fn3，9Fn3_8Fn3。綴合物，例如 wFnS-wFnS-HSA 或 抗-HSA 或 Fc 或 PEG ； 10Fn3-9Fn3-HSA 或抗 HSA 或 Fc 或 PEG ； 10Fn3-8Fn3-HSA 或抗-HSA 或 Fc 或PEG ；9Fn3-8Fn3-HSA或抗-HSA或Fc或PEG，也考慮落入本發明范圍。Fn3基結合分子或綴合物可以具有源自至少三個或三個以上相同或不同纖連 蛋白組件的Fn3結構域，例如，10Fn3-10Fn3-10Fn3 (-10Fn3)n,其中η是2-10中任意個數 的1QFn3結構域；1QFn3-9Fn3-8Fn3 (-Fn3)n,其中η是2_10中任意個數的Fn3結構域； 9Fn3-8Fn3-7Fn3(-Fn3)n，其中η是2_10中任意個數的Fn3結構域。這些分子的綴合物也在 本發明范圍內。本發明還涉及包含編碼Fn3基結合分子或綴合物的序列的核酸、包含與啟動子可 操作連接的該核酸的表達載體、包含該核酸的細胞、和通過在細胞中，尤其是在體內細胞 中，表達包含編碼Fn基結合分子或綴合物的序列的核酸，生產結合靶標的Fn3基結合分子 或綴合物的方法。在一個特定實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，例如大鼠、小鼠、倉鼠、人 細胞或源自其的細胞系。本發明基于Fn3的結合分子可以基于(例如人)野生型Fn3序列，以及該序列的 修飾形式，如本文所討論的那樣。例如，基于Fn3的結合分子可以是嵌合體，其具有來自至 少兩個不同纖連蛋白組件的Fn3 β鏈。可能的嵌合體的實例示于圖6。本發明還提供了組合物，包含本發明基于Fn3的結合分子和綴合物，用適宜的載 體配制。本發明基于Fn3的結合分子和綴合物可用在多種治療和診斷應用中，包括但不限 于任何可以使用抗體的應用。例如，此類應用包括治療和診斷疾病或病癥，包括但不限于， 自身免疫病、炎癥、癌癥、感染性疾病、心血管疾病、胃腸道疾病、呼吸道疾病、代謝疾病、肌 肉骨骼疾病、神經變性疾病、精神性疾病、眼科疾病和移植物排斥。本發明的其他特征和優點將會因如下詳細說明和權利要求書而變得顯而易見。發明詳述為了確保清楚地理解說明書和權利要求書，下文便利地提供了如下定義。定義如本文所用，術語“III型纖連蛋白結構域”或“Fn3結構域”是指，來自任何生 物體的野生型Fn3結構域、以及從兩種或兩種以上不同的Fn3結構域的β鏈構建的嵌合 Fn3結構域。本領域已知，天然Fn3結構域具有β夾心結構，該結構由7個稱作A、B、C、 D、Ε、F和G的β鏈組成，其中這7個β鏈通過稱作AB、BC、⑶、DE、EF和TO環的6個環 連接(見例如，Bork 和 Doolittle，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89 :8990，1992 ；Bork 等， Nature Biotech. 15 553,1997 ；Meinke 等，J. Bacteriol. 175 1910,1993 ；Watanabe 等， J. Biol. Chem. 265 :15659，1990 ；Main 等，1992 ；Leahy 等，1992 ；Dickinson 等，1994 ；美國專 利6，673，901 ；專利協作條約公布W0/03104418 ；以及美國專利申請2007/0082365，上述文 獻的所有教導特此并入此處作為參考)。三個環(BC、DE和re環)位于結構域的頂部，而 三個環(AB、CD和EF環)位于結構域的底部(見

圖1)。在一個特定實施方案中，Fn3結構 域來自人纖連蛋白的第10個Fn3結構域(10Fn3) (SEQ IDNO 1)。本文中，術語“Fn3基結合分子”或“基于III型纖連蛋白的結合分子”是指已經經 過改變而包含了一個或多個非Fn3結合序列的Fn3結構域。
術語“非Fn3結合序列”是指不存在于天然(例如，野生型)Fn3結構域中的氨基酸 序列，其與特定靶標結合。非Fn3結合序列典型地可以通過修飾野生型Fn3結構域(例如， 通過替代和/或添加)而引入。這可以例如通過隨機突變或預先確定的突變野生型Fn3結 構域中的氨基酸殘基來實現。此外或者備選地，非Fn3結合序列可以是部分地或者完全地 外源的，即，源自不同遺傳或氨基酸來源。例如，該外源序列可以源自對于已知靶抗原具有 已知結合特異性的抗體的高變區，例如一個或多個CDR區。該CDR可以來自單抗體鏈(例 如，輕鏈或重鏈的可變區)或來自不同抗體鏈的組合。CDR還可以來自兩種不同抗體(例 如，具有不同特異性)。在一個特定實施方案中，CDR來自納米抗體，例如，駝樣重鏈。術語“互補決定區(⑶R)”是指來自抗體可變結構域或T細胞受體的高變環。⑶R 在抗體可變區中的定位已有精確定義(參見Kabat，Ε. A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901_917，1987，其并 入本文作為參考)。術語“單域抗體”是指任何天然存在的單可變結構域抗體或相應的工程化結合片 段，包括如 Domantis (Domantis/GSK (Cambridge, UK)所述(see, e. g. ，Ward et al. ，1989， Nature 341(6242) 484-5 ；W004058820)的人結構域抗體、或如下文所定義的駝類納米抗體。術語“單鏈抗體”是指由(例如利用重組方法)通過合成接頭連接在一起的輕鏈 可變區抗原結合部分和重鏈可變區抗原結合部分組成的抗體，其中所述接頭使得所述鏈形 成單個蛋白質鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(ScFv)；參見例如Bird 等(1988) Science 242:423-426;和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85: 5879-5883)。術語“駝類納米抗體”(camelid nanobody)是指這樣的駝類抗體區域，該區域為 缺乏輕鏈的小單可變結構域，其可以通過遺傳工程化產生對靶標具有高親和力的小蛋白質 而獲得，從而導致小分子量的抗體衍生蛋白質。參見例如W007042289和1998年6月2日 授權的美國專利 No. 5，759，808 ；還請參見 Stijlemans，B.等，2004，J Biol. Chem. 279(2) 1256-61。工程化的駝類抗體及抗體片段文庫可商購獲得，例如來自Ablynx，Ghent,比利 時。同其他非人源抗體一樣，駝類抗體的氨基酸序列可以重組改變，以獲得與人序列更密切 類似的序列，即，該納米抗體可以“人源化”。因而能夠進一步降低駝類抗體施用于人時已經 天然低的抗原性。術語“靶標”是指本發明Fn3基結合分子所識別(即，結合)的抗原或表位。靶標 包括，但不限于，蛋白質、肽、糖和/或脂質上存在的表位。術語“綴合物”是指化學或遺傳連接一個或多個非Fn3部分的Fn3基結合分子。術語“非Fn3部分”是指賦予與之結合的分子額外的功能性的生物或化學實體。在 一個特定實施方案中，非Fn3部分是多肽，例如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或其 變體或突變體、抗HSA或其片段或突變體、抗體Fc或其片段或突變體、或化學實體，例如聚 乙二醇(PEG)，其可以增加Fn3基結合分子的體內半衰期。術語“非天然氨基酸殘基”是指不存在于天然(野生型)Fn3結構域中的氨基酸殘 基，包括例如化學修飾的氨基酸。此類非天然氨基酸殘基可以通過取代天然氨基酸和/或通過插入到天然Fn3氨基酸序列中而引入(見例如，Sakamoto et al.，2002，Nucleic Acids Research, 30 (21) 4692-4699)。還可以摻入非天然氨基酸殘基，以賦予Fn3基結合分子期望 的功能，例如連接功能性部分(例如PEG)的能力。術語“聚乙二醇”或“PEG”指聚亞烷基二醇化合物或其衍生物，有或無偶聯劑、或 以偶聯或活化部分衍生。術語“特異性結合”或“與……特異性地結合”是指，按照表面等離子體共振測量， 在標準生理鹽和pH條件下于室溫，Fn3基結合分子以至少1 X 10-6M的親和力與靶標結合、 和/或以比其對非特異性抗原的親和力高至少2倍、優選至少10倍的親和力與靶標結合的 能力。附圖的簡短說明圖IA顯示野生型纖連蛋白分子III型的第10組件，其中枝權表示絲氨酸殘基；圖 IB于二級結構背景中顯示Fn3的氨基酸序列。β鏈中的殘基以白圈顯示。側鏈形成疏水 核的那些殘基以加粗線圈起來。環殘基以陰影顯示。箭頭標示環中的位置，在所述位置處 Fn3被分開以產生互補片段。圖2顯示了野生型纖連蛋白分子III型的第10組件以及提出的可用來修飾的絲 氨酸殘基(Serl7-Ser 21-Ser 43-Ser 60-Ser 89)。圖3顯示了野生型纖連蛋白分子III型第10組件的三鏈片層(鏈A-B-E)。候選 殘基Ser 17和Ser 60在片層底部。候選殘基Ser 21位于頂部。排除了 Ser 55，因為其靠 近結合表面。顯示了其他潛在的候選殘基，即Val 11、Leu 19和Thr 58。圖4顯示了野生型纖連蛋白分子III型第10組件的四鏈片層(支架的另一側)。 Thr 71靠近Ser 89，也是潛在的修飾候選物。圖5顯示了野生型纖連蛋白分子III型第10組件的re和⑶環。圖6A-B顯示了野生型纖連蛋白分子III型第7、8、9和10組件的β鏈的多種組 合，以產生基于纖連蛋白的結合分子嵌合體(β鏈交換)。圖7A-C提供了關于示例性靶標的信息。圖8顯示野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys (無還原劑 (圖8A))、以及野生型10Fn3 (RGD至RGA) 30kDaPEG (有還原劑(圖8B))的SDS PAGE分析結果。圖9顯示使用大腸桿菌(E. coli)表達系統，野生型10Fn3(RGD至RGA)在Lewis 大鼠中的PK(藥代動力學)。圖10顯示使用大腸桿菌表達系統，野生型10Fn3(RGD至RGA)-PEG在Lewis大鼠 中的PK。圖11顯示使用WinNonLin軟件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -PEG的計算半衰期。圖12顯示野生型10Fn3 (RGD至RGA) -RSA (有還原劑(圖12a))和野生型 10Fn3 (RGD至RGA)-HSA (有還原劑(圖12b))的SDS PAGE分析結果。圖13顯示使用哺乳動物表達系統，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -RSA在Lewis大鼠 中的PK。圖14顯示使用哺乳動物表達系統，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -HSA在Lewis大鼠中的PK。圖15顯示使用WinNonLin軟件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -RSA和HSA的計算半衰期。圖16顯示VEGFR 10Fn3結合劑-RSA(有還原劑(圖16a))和VEGFR10Fn3結合 劑-HSA (有還原劑(圖16b))的SDS PAGE分析結果。圖 17 顯示 VEGFR 10Fn3 結合劑-HSA 和 RSA 的 ELISA 結果。圖18顯示使用哺乳動物表達系統，VEGFR結合性Fn3_HSA在Lewis大鼠中的PK。圖19顯示使用哺乳動物表達系統，VEGFR結合性Fn3_RSA在Lewis大鼠中的PK。
圖20顯示使用WinNonLin軟件分析，VEGFR結合性Fn3_HSA和VEGFR結合性 Fn3-RSA的計算半衰期。圖21顯示有還原劑時野生型10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA的SDSPAGE分析結果。圖22顯示使用大腸桿菌表達系統，野生型10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA在Lewis大 鼠中的PK。圖23顯示使用WinNonLin軟件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA的計算半衰期。圖24顯示有還原劑時野生型10Fn3 (RGD至RGA) -Fc的SDS PAGE分析結果。圖25顯示使用哺乳動物表達系統，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -Fc在Lewis大鼠中 的PK。圖26顯示使用WinNonLin軟件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -Fc的計算半衰期。MM本發明提供了基于纖連蛋白的結合分子，以及將供體CDR引入到基于纖連蛋白的 結合支架，特別是Fn3中的方法。如下文進一步討論的那樣，本發明還提供了向基于纖連蛋 白的結合分子或支架中引入適于與部分綴合的氨基酸殘基的方法。此優點允許本發明基于 纖連蛋白的結合分子進一步與其他此類分子綴合，以構建雙和多特異性結合分子，和/或 允許連接諸如PEG等部分以提高半衰期和穩定性。本發明還提供了篩選與靶標(一般是蛋白質抗原)特異性結合的此類結合分子以 及在例如原核或真核系統中制備所述分子的方法。 另外，本發明提供了純化候選結合分子及其配制的方法。另外，本發明提供了在多種診斷和治療應用中使用此類配制的結合分子的方法， 尤其是用于診斷或治療人類疾病。m^mm&m^^Mmmm一方面，本發明提供了用于制備結合分子的改良的支架。適合于在本發明中使用 的支架包括但不限于錨蛋白重復支架或免疫球蛋白超家族的一個或多個成員，例如抗體 或纖連蛋白結構域。在一個實施方案中，纖連蛋白III型結構域(Fn3)作為支架分子(美國專利 No. 6，673，901，PCT公開W0/03104418以及美國專利申請20070082365)。此結構域在蛋白 質序列數據庫中出現過400次以上，并且據估計存在于迄今測序的2%蛋白質中，包括纖 連蛋白、生腱蛋白、細胞內細胞骨架蛋白以及原核細胞酶(Bork和Doolittle，Proc. Natl.
13Acad. Sci. U. S. A 89 8990,1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 553,1997 ；Meinke 等， J. Bacteriol. 175 :1910，1993 ；Watanabe 等，J. Biol. Chem. 265 :15659，1990)。Fn3 的三維 結構已經通過NMR(Main等，1992)和X射線結晶學(Leahy等，1992 ；Dickinson等，1994) 確定。所述結構描述為類似于抗體VH結構域的β夾心，除了 Fn3具有7個β鏈而不是9 個。每個Fn3結構域的每一端有3個環；BC、DE和TO環的位置分別大致對應于抗體VH結 構域的CDRU2和3的位置(美國專利6，673，901,PCT公開W0/03104418)。來自任何物種 的任何Fn3結構域均適合于在本發明中使用。在另一實施方案中，Fn3支架是人類Fn3的第10組件(kiFI^)，其含有94個氨 基酸殘基。kiFM中對應于IgG重鏈的抗原結合環的3個環，位于如下氨基酸殘基之間 21-31 (BC)、51-56 (DE)和 76-88 (FG)(美國專利申請號 20070082365)。這些 BC、DE 和 FG 環 可以分別直接被抗體可變區的CDR1、2和3環，尤其是單域抗體的CDR，所取代。盡管wFM是用于產生Fn3基結合分子的Fn3支架的一個實施方案，但是在本文描 述的分子中可以用其它分子替代"^113。這些分子包括但不限于，人纖連蛋白組件1FnS-9Fr^ 和11FnS-17Fr^以及來自非人動物和原核生物的相關Fn3組件。此外，來自具有與kiFM同源 的序列的其它蛋白質，例如，生腱蛋白和undulins，的Fn3組件也可以使用。來自不同生物 和親本蛋白的組件可能最適用于不同的應用；例如，在設計抗體模擬物時，可能最期望從治 療性或診斷性分子預期使用的生物所天生的纖連蛋白或纖連蛋白樣分子出發來產生該蛋 白質。在另一實施方案中，Fn3來自非人物種。如果向人類患者給藥非人Fn3，可能會引 起有害的免疫反應。為預防之，非人Fn3可以遺傳工程化，以除去抗原性氨基酸或表位。鑒 定非人Fn3抗原性區域的方法包括但不限于美國專利No. 6，673，580中所述的方法。在另一實施方案中，Fn3支架是從一個或多個Fn3(例如至少兩個不同Fn3，例如 1QFn3和9Fn3)的部分構建的嵌合體。利用Fn3結構域已知的氨基酸序列和三維結構，技術 人員能夠容易地鑒定不同Fn3分子中能夠組合起來以產生功能性嵌合Fn3分子的區域。此 類嵌合Fn3結構域可以以多種方法構建，包括但不限于基于PCR的或酶介導的基因工程 化，從頭開始DNA或RNA合成，或者盒誘變。上述基于纖連蛋白的結合支架可以從頭構建，或者通過應用芯片(insilico)分 子建模而獲得信息。芯片或計算機輔助建模可以包括簡單的核酸或氨基酸序列比對或應用 例如Ras-Mol進行三維建模。就支架的哪些區域或環能夠選擇用來呈遞高變區而言，支架 建模造就一種理性方法。建模還使得可以最好地修飾支架以最佳地呈遞一個或多個高變 區。一方面，本發明描述了將高變區從其他Ig超家族分子上移植到本發明基于纖連 蛋白的結合支架上的改進方法。在一個實施方案中，來自抗體可變區(例如重鏈可變區、輕鏈可變區或兩者)的一 個或多個CDR被移植到一種上述結合支架的一個或多個環中。任何抗體可變區的CDR區或 其抗原結合片段均適合于移植。CDR可從任何動物的抗體譜(repertoire)中獲得，包括但 不限于嚙齒類動物、靈長類動物、駝類動物或鯊魚。在特別的實施方案中，CDR從單域抗體 例如納米抗體的CDR1、CDR2和CDR3獲得。在更具體的實施方案中，單域抗體例如納米抗體的⑶Rl、2和3移植到Fn3結構域的BC、DE和TO環中，由此向基于纖連蛋白的結合分子提供 原納米抗體的靶結合特異性。駝類抗體和抗體片段的工程化文庫可商購獲得，例如Ablynx， Ghent,比利時。抗體譜可來自用一種或多種抗原刺激的動物，或來自未用抗原刺激過的幼 稚動物。另外或者可選地，CDR可從通過體外或體內文庫篩選方法所產生的抗體或其抗原 結合片段獲得，所述方法包括但不限于體外多聚核糖體或核糖體展示、噬菌體展示或酵母 展示技術。這包括非由體外或體內文庫篩選方法最初產生的、而是利用體外或體內篩選方 法隨后經歷了誘變或一個或多個親和力成熟步驟而獲得的抗體。此類體外或體內文庫篩 選方法或親和力成熟方法的實例描述在美國專利No. 7，195，880 ；6, 951，725 ；7, 078，197 ； 7，022，479 ；5，922，545 ；5，830，721 ；5，605，793,5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ； 7，063，943 ；5866344 以及 PCT 公開 W006023144 中鑒定抗體CDR的方法在本領域公知(參見Kabat等，U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest " (1983)； Chothia 等,J. Mol. Biol. 196 901-917 (1987) ；MacCallum 等,J. Mol. Biol. 262 732-745(1996))。可以分離和測序編碼特定抗體的核酸，并通過相對于確立的抗體序列命 名法來檢查所編碼的蛋白質而推出CDR序列。例如，將高變區或CDR移植到本發明基于纖 連蛋白的結合支架中的方法包括基因工程化法、從頭核酸合成或基于PCR的基因組裝(參 見例如美國專利No. 5，225. 539)。鑒定某于鄉千連g白的結合支奧Φ 舌合于{I條tfeP對是高CDR旱遞/結合的殘基的方法上述技術允許鑒定適宜的支架環，用來選擇和呈遞高變區或⑶R。不過，可以調用 其他法則，基于Fn3結構域和供體抗體的結構建模，進一步改進高變區的合身性以及呈遞。一方面，可以突變Fn3支架上任一 β鏈中的特定氨基酸殘基，以允許⑶R環采取 保留或提高抗原結合的構象。這種方法可應用結構建模和序列比較的組合，通過類似于將 CDR移植到異源抗體構架中的方式進行。在一個實施方案中，鄰近CDR的Fn3殘基以類似 于Queen 等(參見美國專利No. 6，180，370 ；5，693，762 ；5，693，761 ；5，585，089 ；7，022，500) 實施的方式進行突變。在另一實施方案中，落在CDR殘基一個范德華半徑范圍內的Fn3殘 基以類似于Winter等(參見美國專利No. 6，548，640 ；6, 982，321)實施的方式進行突變。 在另一實施方案中，不靠近CDR殘基、但根據Fn3結構域和供體抗體的結構建模預測將調 節⑶R殘基構象的Fn3殘基，以類似于Carter等或Adair等(見美國專利No. 6，407，213 ； 6，639，055 ；5, 859，205 ；6, 632，927)實施的方式進行突變。另一方面，對含有一個或多個移植的抗體CDR的Fn3支架進行一個或多個體外或 體內親和力成熟步驟。可采用任何親和力成熟方法，引起Fn3支架或CDR中的氨基酸變化， 提高Fn3/CDR與期望抗原的結合。這些氨基酸變化可以例如，借助于隨機誘變、“巡視式誘 變(walk throughmutagenesis)，，禾口 "瀏覽式誘變(look through mutagenesis)，，而實現。 例如，monobody的此類誘變可利用易錯PCR，利用酵母或細菌“增突”株，在從頭合成所有 或部分monobody期間摻入隨機或確定的核酸變化而實現。實施親和力成熟和/或誘變的 方法描述在例如，美國專利 No. 7，195，880 ；6, 951，725 ；7, 078，197 ；7, 022，479 ；5, 922，545 ； 5，830，721 ；5, 605，793，5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ；7，063，943 ；5866344 和 PCT 公 開TO06023144中。包含最小必需結合決定簇的新CDR序列還可以利用如US20050255552 中所述的Kalobios技術來篩選。
工靴禾口·_攤連屈另一方面，本發明描述了基于纖連蛋白的結合分子，與原始基于纖連蛋白的分子相比，其已經被修飾而具有改變的性能。修飾包括該分子與其他分子綴合或融合、以及化學 修飾該分子或改變分子結構的氨基酸殘基或核苷酸。纖連蛋白融合物本發明基于纖連蛋白的結合分子可以與其他分子融合或綴合。此類綴合物在本文 稱為“Fn融合物”。例如，Fn融合物包括與增加結合分子的穩定性或半衰期的分子融合的 基于纖連蛋白的結合分子(例如，Fc區、HSA或抗HSA結合分子)。例如，可以通過IgG恒定區(Fe)與kiFM組件(優選地通過kiFM的C末端)融 合，而使Fn融合物與人免疫應答結合。在該kiFM-Fc融合分子中Fc激活免疫應答的補體 成分，并增加該抗體模擬物的治療價值。類似地，kiFM與補體蛋白如Clq的融合可以用于 靶向細胞，kiFM與毒素的融合可以用于特異地破壞帶有特定抗原的細胞。此外，任何形式 的kiFM都可以與白蛋白融合以增加在血流中的半衰期和其組織穿透性。這些融合物均可 以通過標準技術產生，例如使用公眾可得的基因序列構建重組融合基因，從該融合基因表 達融合蛋白。Fn融合物還可以使用新生兒Fc受體(FcRn)(也稱作“Brambell受體”)產生，所 述受體參與延長白蛋白在循環中的壽命(見Chaudhury等(2003) J. Exp. Med. 3 :315_322 ； Vaccarao 等，(2005)Nature Biotech. 23 1283-1288)。FcRn 受體是整合膜糖蛋白，由 β 2 微球蛋白可溶性輕鏈與43kDa鏈非共價結合組成，所述α鏈具有三個胞外結構域、一個跨 膜區和一個大約50個氨基酸的胞質尾。胞質尾含有涉及受體內在化的、基于二核苷酸基序 的胞吞信號。該α鏈是非經典MHC I蛋白家族的成員。i32m與α鏈的結合對于FcRn正 確折疊和退出內質網以運送至內體(endosome)和細胞表面是關鍵的。FcRn的整體結構類似于I類分子的整體結構。α-1和α-2區類似于一個平臺， 由8個反平行β鏈組成，這些β鏈形成頂部為兩個反平行α螺旋的單個β折疊，極為類 似于MHC I分子中的肽裂隙。天然地，FcRn結合IgG并跨胎盤合胞體滋養層自母體循環轉 運IgG至胎兒循環并在成體中保護IgG免遭降解。除了體內穩態，FcRn還控制IgG在組織 中的胞轉。FcRn定位在上皮細胞、內皮細胞和肝細胞中。研究顯示，白蛋白結合FcRn，和IgG形成三分子復合物。白蛋白和IgG兩者非協 同地結合在FcRn的不同部位。人FcRn與S印harose_HSA和S印harose-hlgG的結合是pH 依賴性的，在pH5. 0最大，在pH7. 0-pH8為零。觀察到FcRn結合白蛋白與FcRn結合IgG具 有相同的PH依賴方式，這提示白蛋白與FcRn相互作用以及由此受保護而免遭降解的機制 與IgG的相同，由類似地與FcRn的pH敏感性相互作用介導。FcRn和白蛋白通過白蛋白的 D-III結構域在不同于IgG結合位點的位點以pH依賴性方式相互作用。本發明的Fn融合物也包括Fn-FcRn融合蛋白或Fn-抗-FcRn融合分子。一個實 施方案中，Fn融合物是Fn-抗-FcRn融合分子，其中抗FcRn融合分子可以在酸性pH(例如 PH6. 0)以高親和力而在中性pH(例如，ρΗ7·4)以低親和力結合新生兒FcR受體(FcRn)，類 似于IgG與FcRn的結合。Fn-抗-FcRn融合物的體內半衰期增加，由此提供改良的治療應 用。使分子與Fc結構域(例如IgGl的Fc結構域)融合的方法在本領域已知(參見例如U. S. 5，428，130)。此類融合物由于Fc結合FcRn的能力而具有增加的循環半衰期，該 能力在IgG穩態中起著關鍵作用，防止與之結合的分子代謝(參見例如US20070269422)。其他融合物包括與人血清白蛋白(HSA或HA)融合的基于纖連蛋白的結合分子。人 血清白蛋白成熟形式為585個氨基酸的蛋白質，負責重大比例的血清滲透壓，而且也可以 作為內源和外源配體的載體起作用。白蛋白作為載體分子的作用及其惰性性質對于作為體 內多肽載體和轉運蛋白的用途而言是期望的性能。作為白蛋白融合蛋白組分的白蛋白用作 多種蛋白質的載體的用途已經在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413622中提出。此夕卜， 也已經提出(EP 399666)使用HSA的N-末端片段與多肽融合。因此，可以通過將本發明的 分子與白蛋白、或白蛋白的片段(部分)或變體、或能夠結合HSA、足以穩定所述蛋白質和/ 或其活性的分子(“抗HSA結合劑”)基因或化學融合或綴合，使得本發明分子得以穩定以 延長保質期，和/或使得分子的活性在溶液中、在體外、和/或在體內得以保留延長的時間。白蛋白與其他蛋白質的融合可以通過基因操縱實現，將編碼HSA的DNA或其片段 與編碼蛋白質的DNA相連。然后用融合的核苷酸序列轉化或轉染適宜的宿主，其中所述融 合的核苷酸序列在適宜的質粒上的排列使得可以表達融合的多肽。表達可以由例如原核或 真核細胞在體外實現，或由例如轉基因生物在體內實現。與HSA融合相關的其他方法可見 于例如WO 2001077137和WO 200306007，并入本文作為參考。在一個具體實施方案中，融合 蛋白質的表達在哺乳動物細胞系中進行。哺乳動物細胞系的實例包括但不限于，人胚胎腎 細胞(例如HEK Freestyle, HEK293，HEK293T)；中國倉鼠卵巢細胞(例如CH0)；倉鼠腎細 胞(例如BHK)；人胚胎視網膜細胞(例如PERC6)；小鼠骨髓瘤(Sp/20) ；HEK293和人B細 胞系的雜種(例如HKB11)；宮頸癌細胞(例如HeLa)；和猴腎細胞(例如COS).本發明的其他融合物包括使基于纖連蛋白的結合分子與其他功能分子例如其 他肽或蛋白質(例如抗體或受體的配體)相連以生成“雙特異性分子”。雙特異性分子 結合至少兩個不同的結合位點或至少兩個不同的靶分子，例如纖連蛋白分子靶向的結 合位點和抗HSA結合劑，所述抗HSA結合劑來自基于纖連蛋白的分子(如上文所述)或 來自其他非纖連蛋白支架，例如來自單域抗體(參見例如W02004041865 (Ablynx)和 EP1517921 (Domantis) )0本發明基于纖連蛋白的結合分子還可以衍生或連接不止一個其 他功能分子，以生成結合同一靶分子上兩個以上不同的結合位點和/或兩個不同靶分子上 的兩個分開的結合位點、或其各種排列組合的多特異性分子。一個實施方案中，Fn3基多特 異性結合分子可以包含例如連接在一起并綴合了半衰期延長結構部分例如HSA的至少兩 個Fn3結構域，其中每個Fn3結構域分別結合相同治療靶標的不同位點，例如，TNF上的不 同位點。另一實施方案中，Fn3基多特異性結合分子可以包含例如連接在一起并綴合了半 衰期延長結構部分例如HSA的至少兩個Fn3結構域，其中每個Fn3結構域分別結合不同的 治療靶標，例如第一 Fn3結構域結合Her3而第二 Fn3結構域結合Her2。再一實施方案中， Fn3基多特異性結合分子可以包含例如連接在一起并綴合了半衰期延長結構部分例如HSA 的至少兩個Fn3結構域，其中每個Fn3結構域分別結合不同治療靶標上的不同位點，例如， 第一 Fn3結構域結合Her3的位點1，第二 Fn3結構域結合Her3的位點2，第三Fn3結構域 結合Her2的位點1，而第四Fn3結構域結合Her2的位點2，及其各種排列組合。此類多特 異性分子也旨在為如本文所用的術語“雙特異性分子”所涵蓋。本發明的雙特異性分子可利用本領域已知的方法通過綴合組分結合特異性而制
17備。例如，雙特異性分子的每個結合特異性可分開生成，然后彼此綴合。當結合特異性是蛋 白質或肽時，多種偶聯劑或交聯劑可用來進行共價綴合。交聯劑的實例包括蛋白質A、碳化 二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基_3-(2_吡啶二硫代)_丙酸酯(SPDP) 和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC)(參見例如 Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu, MA 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behringlns. Mitt. No. 78，118-132 ；Brennan 等 (1985) Science 229 81-83)和 Glennie 等(1987) J. Immunol. 139 2367-2375)中所述的那 些。優選的綴合劑是SATA和sulfo-SMCC，兩者均可購自Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)。如果結合特異性包括一個以上抗體(例如，在多特異性構建體中)，綴合可以借助 于兩個重鏈C-末端鉸鏈區的巰基鍵合而實現。在尤其優選的實施方案中，在綴合之前修飾 鉸鏈區，以含有奇數個巰基殘基，優選1個。可選地，兩種結合特異性均可在同一載體上編碼并在同一宿主細胞中表 達和組裝。制備雙特異性分子的方法描述在例如美國專利No.5，260，203;美國 專利No. 5，455，030 ；美國專利No. 4，881，175 ；美國專利No. 5，132，405 ；美國專利 No. 5，091，513 ；美國專利 No. 5，476，786 ；美國專利 No. 5，013，653 ；美國專利 No. 5，258，498 和美國專利No. 5，482，858中。雙特異性分子與其特異性靶標的結合可通過多種測定法來確認，例如，可以放射 性標記融合物并用在放射性免疫測定法(RIA)中(參見例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society，March，1986，并入本文作為參考)。放射性同位素可通過諸如應 用Y _計數器或閃爍計數器或者通過放射自顯影法等方法來檢測。本發明的其他融合物包括使基于纖連蛋白的結合分子與標簽(例如生物素)或化 學品(例如免疫毒素或化療劑)相連。此類化學品包括細胞毒性劑，即，任何對細胞有害 (例如殺傷)的物質。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根堿、絲裂霉 素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮、 米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、 普萘洛爾和嘌呤霉素，以及它們的類似物或同源物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如， 氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)，烷化劑(例如， 氮芥、thio印a苯丁酸氮芥、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷酰胺、白消安、 二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C和順二氯二氨鉬(II) (DDP)順鉬)，蒽環類藥物(例 如，柔紅霉素(以前稱作道諾霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放線菌素D (以前稱作放 線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨曲霉素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和 長春堿)。能夠與本發明基于纖連蛋白的結合分子綴合的治療性細胞毒素的其他實例包括 duocarmycins、刺孢霉素、美登素和auristatins，以及它們的衍生物。細胞毒素可以利用本領域可用的接頭技術與本發明基于纖連蛋白的結合分子綴 合。已經用來與細胞毒素綴合的接頭類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含 肽接頭。例如，接頭可以選擇為易被溶酶體區室內的低PH斷裂、或者易被蛋白酶(例如優
18選在腫瘤組織中表達的蛋白酶，例如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、C、D))斷裂的接頭。有關細胞毒素、接頭類型以及治療劑綴合方法的更多討論還參見Saito，G.等 (2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 199-215 ；Trail, P. Α.等(2003)CancerImmunol. Immunother. 52 328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell3 :207_212 ；Allen, Τ. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2 :750_763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman, R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3 1089-1091 ；Senter, P. D.禾口 Springer. C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 247-264。本發明基于纖連蛋白的結合分子還可以與放射性同位素綴合以生成細胞毒性放 射性藥物，也稱為放射性免疫綴合物。能夠與基于纖連蛋白的結合分子綴合用于診斷或治 療用途的放射性同位素的實例包括但不限于碘m、銦釔％和镥177。制備放射性免疫綴 合物的方法在本領域已經確立。基于抗體的放射性免疫綴合物的實例可商購獲得，包括替 伊莫單抗、tiuxetan和托西莫單抗，且類似的方法可用來應用本發明的分子制備放射性免 疫綴合物。本發明的Fn融合物可用來調節給定的生物學反應，且藥物部分不應理解為局限 于經典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是擁有期望生物學活性的蛋白質或多肽。例如， 此類蛋白質可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌 內毒素或白喉毒素；諸如腫瘤壞死因子或干擾素-Y等蛋白質；或生物學反應調節劑，例 如，淋巴因子、白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒細胞巨 噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。綴合此類治療性部分的技術公知，并且可應用于本發明的分子，參見例如Arnon 等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(編輯)，243-56 頁(Alan R. Liss,Inc.1985) ；Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery" ,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson φ ( H車t)，623—53 M (Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review", in Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological And Clinical Applications, Pinchera φ ( 'ΦΜ ) ,475-506 M (1985) ； “ Analysis, Results, And FutureProspective Of Th e Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy" , in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(編 輯)，303-16 頁 (Academic Press 1985),禾口 Thorpe 等，“ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol. Rev. , 62 :119-58(1982)。化學修飾另一方面，本發明提供了通過聚乙二醇化修飾的基于纖連蛋白的結合分子，以例 如增加分子的生物學(例如血清)半衰期。為使分子聚乙二醇化，所述分子或其片段一般 與聚乙二醇(PEG)部分，例如PEG的活性酯或醛衍生物，在一個或多個PEG基團可以與所述 分子連接起來的條件下反應。術語“聚乙二醇化部分”、“聚乙二醇部分”或“PEG部分”包括 聚亞烷基二醇化合物或其衍生物，有或無偶聯劑或以偶聯或活化部分衍生(例如，以硫醇、 三氟甲磺酸(triflate)、tresylate、氮雜環丙烷(azirdine)、環氧乙烷(oxirane)，或優選 以馬來酰亞胺部分衍生，例如PEG-馬來酰亞胺)。其他適當的聚亞烷基二醇化合物包括但不限于馬來酰亞胺基單甲氧基聚乙二醇、活化的聚乙二醇聚丙二醇，而且還包括如下類型 的荷電或中性聚合物葡聚糖、多聚乙酰神經氨酸、或其他基于糖的聚合物、氨基酸聚合物、 和生物素衍生物。選擇適宜官能團用于PEG衍生物可以以該分子上或將與PEG偶聯的分子上可利用 的反應基團的類型為基礎來進行。對于蛋白質而言，典型的反應性氨基酸包括賴氨酸、半胱 氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。還可以利用N-末端氨基 基團和C-末端羧酸。優選，聚乙二醇化借助于與活性PEG分子(或類似的活性水溶性聚合物)的酰 化反應或烷化反應而進行。如本文所用，術語“聚乙二醇”旨在涵蓋已經用來衍生其他蛋 白質的任何形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-馬 來酰亞胺。聚乙二醇化蛋白質的方法在本領域已知，并且可應用于本發明。參見例如WO 2005056764,U. S. 7，045，337,U. S. 7，083，970,U. S. 6，927，042,Nishimura 等的 EP 0154316 和Ishikawa等的EP 0401384。基于纖連蛋白的結合分子可以工程化以納入至少一個半胱 氨酸氨基酸或至少一個非天然氨基酸以促進聚乙二醇化。本發明基于纖連蛋白的結合分子還可以通過羥乙基淀粉化修飾，其利用與藥物相 連的羥乙基淀粉(“HES”)衍生物以修飾藥物特征。HES是可以被機體酶代謝的、衍生自蠟 質玉米淀粉的、修飾的天然聚合物。這種修飾通過增加分子的穩定性以及減小腎臟清除而 使循環半衰期延長，導致增加的生物學活性。此外，HES化潛在地改變免疫原性或變應原性。 通過改變不同的參數，例如HES的分子量，可以定制范圍廣泛的HES藥物綴合物。DE 19628705和DE 10129369描述了在無水二甲基亞砜(DMSO)中借助于羥乙基 淀粉的相應醛糖內酯使羥乙基淀粉分別與血紅蛋白和兩性霉素B的游離氨基偶聯的可行 方法。由于因為溶解度的原因或者是蛋白質變性的原因使用無水非質子溶劑往往是不可行 的(特別是在蛋白質的情況下)，故也可利用HES在水性介質中偶聯的方法。例如，通過水 溶性碳化二亞胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺)的介導，可以偶聯已 在鏈還原端選擇性氧化為醛糖酸的羥乙基淀粉(PCT/EP 02/02928)。可應用于本發明的其 他羥乙基淀粉化方法描述在例如 U. S. 20070134197、U. S. 20060258607、U. S. 20060217293、 U. S. 20060100176 和 U. S. 20060052342 中。本發明基于纖連蛋白的結合分子還可利用糖殘基來修飾。修飾蛋白質的糖殘基或 使蛋白質糖基化的方法在本領域已知(參見例如Borman(2006)Chem. &Eng. News 84(36) 13-22和Borman (2007) Chem. &Eng. News85 19-20)，并且可應用于本發明的分子。此類糖修 飾還可通過例如改變纖連蛋白基結合分子序列內部的一個或多個糖基化位點來實現。例 如，可進行一個或多個氨基酸取代，以消除一個或多個可變區構架糖基化位點，由此消除在 該位點的糖基化。這樣的無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。這樣的方法在Co等的 美國專利No. 5，714，350和6，350，861中有更詳細的說明。另外地或可選地，可制備本發明基于纖連蛋白的結合分子，其具有改變的糖基化 類型，例如巖藻糖殘基量減小的低巖藻糖基化模式，或平分型GlcNac結構增加的基于纖連 蛋白的結合分子。此類糖修飾可通過例如在具有改變的糖基化機器的宿主細胞中表達基 于纖連蛋白的結合分子來實現。具有改變的糖基化機器的細胞在本領域已有描述，并且可 用作為宿主細胞表達本發明重組的基于纖連蛋白的結合分子，由此產生糖基化改變的本發明基于纖連蛋白的結合分子。例如，Hang等的EP 1，176，195描述了編碼巖藻糖基轉移 酶的FUT8基因被功能性破壞了的細胞系，從而在這樣的細胞系中表達的抗體呈現低巖藻 糖基化。Presta的PCT公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其使巖藻 糖與Asn(297)連接的糖相連的能力下降，也導致該宿主細胞中表達的抗體低巖藻糖基化 (還請參見 Shields，R. L.等，2002J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana 等的 PCT 公 開TO 99/54342描述了經工程化表達修飾糖蛋白的糖基轉移酶(例如，β(1，4)_Ν_乙酰 葡糖胺轉移酶III(GnTIII))的細胞系，從而該工程化細胞系中表達的抗體呈現出增加的 平分型GlcNac結構，導致抗體ADCC活性增加(還請參見Umana等，1999Nat. Biotech. 17 176-180)。產生具有人樣糖基化模式的多肽的方法也已經由EP1297172B1以及源于 Glycofi的其他同族專利描述過。氨基酸/核苷酸修飾本發明具有一個或多個氨基酸或核苷酸修飾(例如，改變)的基于纖連蛋白的結 合分子可通過多種已知方法生成。例如，此類修飾分子可通過重組方法產生。而且，由于遺 傳密碼的簡并性，可利用多種核酸序列來編碼每個期望的分子。例示性的本領域公認的制備編碼起始分子的氨基酸序列變體的核酸分子的方法 包括但不限于，通過定點(或寡核苷酸介導的)誘變、PCR誘變以及盒誘變早先制備的編碼 分子的DNA來制備。定點誘變是制備取代變體的優選方法。此技術在本領域公知(參見例如Carter等 Nucleic Acids Res. 13 4431-4443 (1985)和 Kunkel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 488(1987))。簡言之，在進行DNA定點誘變時，親本DNA通過如下方式改變首先使編碼期 望突變的寡核苷酸與此類親本DNA的單鏈雜交。雜交后，利用雜交的寡核苷酸作為引物，而 利用該親本DNA單鏈作為模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二鏈。從而，編碼期望突變的 寡核苷酸被摻入到所得的雙鏈DNA中。PCR誘變也適合于制備起始分子的氨基酸序列變體。參見Higuchi，inPCR Protocols,177-183 頁(Academic Press,1990)；禾口 Vallette 等，Nuc. Acids Res. 17 723-733 (1989)。簡言之，當小量模板DNA在PCR中用作為起始材料時，可利用在序列上與 模板DNA相應區域稍有差異的引物來生成相對大量的特異性DNA片段，其僅在引物有別于 模板的位置上與模板序列存在差異。另一種制備變體的方法，即盒誘變，是以Wells等Gene 34 :315_323 (1985)描述的 技術為基礎的。起始材料是含有待突變的起始多肽DNA的質粒(或其他載體)。鑒定親本 DNA中待突變的密碼子。所鑒定的突變位點的每一側必需有獨特的限制性內切酶位點。如 果不存在這樣的限制性位點，則可以利用上述寡核苷酸介導的誘變方法將其引入在起始多 肽DNA的適當位置上。在這些位點切割質粒DNA以使之線性化。利用標準方法合成編碼兩 限制性位點之間的DNA序列但含有期望突變的雙鏈寡核苷酸，其中兩條寡核苷酸鏈分開合 成，然后利用標準技術雜交在一起。這種雙鏈寡核苷酸稱為盒。此盒設計為具有與線性化 質粒末端適配的5’和3’端，從而能夠直接連接到質粒中。這樣該質粒含有突變的DNA序 列了。可選地，或另外地，可確定編碼分子的多肽變體的期望氨基酸序列，并合成產生編 碼此氨基酸序列變體的核酸序列。
21
本領域普通技術人員將會理解，可以進一步修飾本發明基于纖連蛋白的結合分 子，從而其氨基酸序列改變(例如與野生型不同)，但期望的活性不變。例如，可對蛋白質進 行導致“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸取代的其他核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨 基酸殘基可以替換為相同側鏈家族的其他氨基酸殘基。在另一實施方案中，一段氨基酸鏈 可以替換為結構上類似的、僅在側鏈家族成員的順序和/或組成方面有別的鏈，即可進行 保守取代，其中氨基酸殘基替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族在本領域已經定義，包括堿性側鏈(例如，賴氨 酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側鏈(例如， 蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。除了氨基酸取代，本發明還考慮起始分子氨基酸序列的其他修飾，以生成功能上 等同的分子。例如，可以缺失一個或多個氨基酸殘基。一般而言，根據本發明的此實施方案， 將會缺失不超過1個至約10個殘基。本文包含一個或多個氨基酸缺失的纖連蛋白分子將 優選保留起始多肽分子的至少約80%、優選至少約90%、最優選至少約95%。還可以制備氨基酸插入變體，其保留原始纖連蛋白分子的功能。例如，可以將至少 一個氨基酸殘基(例如，1個至2個氨基酸殘基，一般不超過10個殘基)引入到分子中，在 另一實施方案中，可以在單個纖連蛋白分子中組合種種氨基酸修飾。在一個實施方案中，對3型纖連蛋白結構域進行氨基酸取代，以包括半胱氨酸或 其他非天然氨基酸，從而適合于通過公知的綴合方法使部分與該基于纖連蛋白的結合分子 綴合。尤其是，本發明涉及具Fn3支架的基于纖連蛋白的結合分子的特定氨基酸變體，其中 一個或多個絲氨酸殘基被半胱氨酸或非天然氨基酸取代。能夠取代的絲氨酸殘基包括但不 限于Ser 17, Ser 21, Ser 43, Ser 60，和Ser 89。能夠取代的Fn3支架的其他氨基酸位置 包括但不限于Valll，Leul9，Thr58和Thr71。非天然存在的氨基酸可利用例如Ambrex技 術(參見例如US 7，045，337 ；7, 083，970)取代到Fn3支架中。m^m^mm^^M&m^^mmMmi可采用多種篩選測定法來鑒定本發明改進的基于纖連蛋白的結合分子。在一個實 施方案中，篩選基于纖連蛋白的結合分子對期望抗原提高的結合親和力。可以考慮能夠選 擇對期望抗原的提高結合性的任何體外或體內篩選方法。在另一實施方案中，在細胞、病毒或噬菌體表面展示基于纖連蛋白的結合分 子，并利用固定化抗原對其進行選擇。適宜的篩選方法描述在美國專利No. 7，063，943 ； 6，699，658 ；7, 063，943和5866344中。此類表面展示可能要求創建基于纖連蛋白的結合分 子和正常存在于細胞、病毒或噬菌體外表面上的適宜蛋白質之間的融合蛋白質。適宜制備 此類融合物的蛋白質在本領域公知。在另一實施方案中，利用體外表型-基因型關聯展示例如核糖體或多核糖體展示 來篩選基于纖連蛋白的結合分子。此類“分子進化”方法為本領域公知(參見例如美國專 利 No. 6，194，550 和 7，195，880)。本發明采用的篩選方法可能需要在基于纖連蛋白的結合分子中引入一個或多個 氨基酸突變。可以考慮任何本領域公認的突變方法。在一個實施方案中，創建基于纖連蛋
22白的結合分子的文庫，其中隨機突變Fn3支架或移植CDR中的一個或多個氨基酸。在另一 實施方案中，創建基于纖連蛋白的結合分子的文庫，其中Fn3支架或移植CDR中的一個或多 個氨基酸被突變為一個或多個預定的氨基酸。本發明采用的篩選方法可能還需要增加抗原結合篩選測定法的嚴謹度，以選擇抗 原親和力提高的基于纖連蛋白的結合分子。此處可使用本領域公認的增加蛋白質-蛋白質 相互作用測定法的嚴謹度的方法。在一個實施方案中，改變一種或多種測定條件(例如，測 定緩沖液的鹽濃度)以降低基于纖連蛋白的結合分子對期望抗原的親和力。在另一實施方 案中，縮短允許基于纖連蛋白的結合分子與期望抗原結合的時間長度。在另一實施方案中， 在蛋白質-蛋白質相互作用測定法中增添競爭性結合步驟。例如，首先使基于纖連蛋白的 結合分子與期望的固定化抗原結合。然后添加特定濃度的非固定化抗原，其起與固定化抗 原競爭結合的作用，從而抗原親和力最低的基于纖連蛋白的結合分子從固定化抗原上洗脫 掉，導致選擇出抗原結合親和力提高的基于纖連蛋白的結合分子。測定條件的嚴謹度可進 一步通過增加添加到測定中的非固定化抗原的濃度來增加。本發明的篩選方法還可能需要多輪選擇，以富集抗原結合性提高的一種或多種基 于纖連蛋白的結合分子。在一個實施方案中，在每一輪選擇中，向基于纖連蛋白的結合分子 中引入進一步的氨基酸突變。在另一實施方案中，在每一輪選擇中，增加與期望抗原結合的 嚴謹度，以選擇抗原親和力增加的基于纖連蛋白的結合分子。制備方法本發明基于纖連蛋白的結合分子一般通過重組表達產生。編碼所述分子的核酸插 入到表達載體中。編碼所述分子的DNA區段于表達載體中有效連接確保其表達的控制序 列。表達控制序列包括但不限于啟動子(例如天然相伴或異源的啟動子)、信號序列、增 強子元件和轉錄終止序列。優選表達控制序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的 真核啟動子系統。一旦載體已經摻入到適當的宿主中，則宿主在適合于高水平表達所述核 苷酸序列、以及收集和純化交叉反應的基于纖連蛋白的結合分子的條件下維持。這些表達載體一般可作為游離體或者宿主染色DNA的整合部分而在宿主生物體 中復制。通常表達載體含有選擇標記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環素抗性或 新霉素抗性)，以允許檢測轉化了期望的DNA序列的那些細胞(參見例如Itakura等，美國 專利 4，704，362)。大腸桿菌是一種尤其可用于克隆本發明多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。 其他適合于應用的微生物宿主包括芽孢桿菌屬(bacilli)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),以及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，例如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙 雷氏菌屬(Serratia)和多種假單胞菌屬(Pseudomonas)菌種。其他微生物例如酵母也可用于表達。酵母屬(Saccharomyces)和畢赤氏酵母屬 (Pichia)為例示性的酵母宿主，適宜載體按期望具有表達控制序列(例如啟動子)、復制起 點、終止序列等。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導型酵母啟動 子包括例如來自醇脫氫酶、異細胞色素CGsocytochrome C)以及負責甲醇、麥芽糖和半乳 糖利用的酶的啟動子。除了微生物，哺乳動物組織培養也可以用來表達和生產本發明的多肽(例如 編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見Winnacker，From Genesto Clones, VCHPublishers, N. Y.，N. Y. (1987)。實際上優選真核細胞，因為本領域已經研發了許多能夠 分泌異源蛋白質(例如完整免疫球蛋白)的適宜宿主細胞系，并且包括CHO細胞系、多種 COS細胞系、HeLa細胞、293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞以及雜交瘤。這些細胞的表 達載體可包括表達控制序列，例如復制起點、啟動子和增強子(Queen等，Immunol. Rev. 89 49(1986))，以及必要的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化 位點和轉錄終止子序列。優選的表達控制序列為來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛 乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等的啟動子。參見Co等，J. Immunol. 148 =1149(1992)。
可選地，編碼序列可摻入到轉基因中，以引入到轉基因動物的基因組中，隨后在 轉基因動物乳汁中表達(參見例如Deboer等，U. S. 5，741，957，Rosen, U. S. 5，304，489和 Meade等，U. S. 5，849，992)。適宜的轉基因包括輕鏈和/或重鏈編碼序列，有效連接于來自 乳腺特異性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的啟動子和增強子。含目的多核苷酸序列和表達控制序列的載體可通過公知的方法轉移到宿主細胞 中，所用方法取決于細胞宿主的類型。例如，可以短暫熱擊化學感受態原核細胞，而磷酸鈣 處理、電穿孔、脂轉染(lipofection)、生物轟擊(biolistics)或基于病毒的轉染可用于 其它細胞宿主(一般參見 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。其他用來轉化哺乳動物細胞的方法包括應用 polybrene、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(一般參見Sambrook等，同前)。為 產生轉基因動物，轉基因可顯微注射到受精卵中，或者可摻入到胚胎干細胞的基因組中，并 將此類細胞的細胞核轉移到去核卵細胞中。本發明基于纖連蛋白的結合分子一經表達，則可按照本領域的標準方法純化， 包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等(一般參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag, N. Y.，(1982))。對于制藥用途，優選基本上純的、至少約 90-95%均質的分子，最優選98-99%或更高均質性。組合物本發明基于纖連蛋白的結合分子(及其變體、融合物和綴合物)具有體外和體內 診斷和治療用途。從而，本發明還提供了組合物，例如藥物組合物，含有與可藥用載體配制 在一起的一種或組合的基于纖連蛋白的結合分子(或其變體、融合物和綴合物)。本發明的 藥物組合物還可以在組合治療中給藥，即與其他藥劑組合。例如，組合治療可包括本發明的 組合物連同至少一種或多種其他治療劑，例如抗炎藥、抗癌藥和化療劑。本發明的藥物組合物還可聯合放射治療給藥。與其他基于纖連蛋白的分子共給藥 也涵蓋在本發明中。如本文所用，“可藥用載體”包括任何及所有生理上相容的溶劑、分散介質、衣料、 抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優選載體適合于靜脈內、肌肉內、皮下、胃腸 外、脊髓或表皮給藥(例如，通過注射或輸注)。取決于給藥路徑，活性化合物，即抗體、雙特 異性和多特異性分子，可用保護化合物免受酸及其他可能使化合物失活的天然條件作用的 材料進行包衣。“可藥用鹽”是指保留親本化合物的期望生物學活性而不帶來任何不期望的毒性 效應的鹽(參見例如Berge，S. Μ.，等(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。此類鹽的實例包括 酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等)以及無毒有機酸(例如脂肪族單羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的 鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族磺酸和芳族磺酸等)的那些鹽。堿加成鹽包括衍生自 堿土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣等)以及無毒有機胺(例如N，N’ _ 二芐基乙二胺、N-甲基葡 糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的那些鹽。本發明的組合物可通過多種本領域公知的方法給藥。如技術人員將會理解的那 樣，給藥路徑和/或給藥方式將取決于期望的結果。活性化合物可與防止化合物快速釋 放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統。可利用生物 可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和 聚乳酸。許多制備此類制劑的方法被授予專利或是本領域技術人員普遍已知。參見例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編輯,Marcel Dekker, Inc. , New York,1978。為通過某些給藥路徑給藥本發明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包 衣化合物，或與該材料共給藥化合物。例如，化合物可以在適當的載體例如脂質體或稀釋劑 中施用于受試者。可藥用的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。脂質體包括水包油包水CGF 乳化劑以及常規脂質體(Strejan 等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)。可藥用載體包括無菌水性溶液或分散液以及用于即時制備無菌注射液或分散液 的無菌粉劑。此類介質和試劑用作藥物活性物質的用途在本領域已知。除非與活性化合物 不相容，否則任何常規介質或試劑均可以考慮在本發明藥物組合物中使用。增補活性化合 物也可摻入到組合物中。治療性組合物一般必需是無菌的，并在生產和儲存條件下穩定。組合物可以配制 為溶液、微乳、脂質體或其他適合于高藥物濃度的有序結構。載體可以是溶劑或分散介質， 含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)，及其適宜的混合物。 恰當的流動性可例如通過應用衣料如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大 小，以及通過應用表面活性劑來維持。在許多情況下，優選在組合物中納入等滲劑，例如糖、 多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可注射組合物的延時吸收可通過在組合物中納入延 遲吸收的藥劑來實現，例如單硬脂酸鹽和明膠。無菌可注射溶液可通過按需要將處于適當溶劑中的所需量的活性化合物與一種 或組合的上文列舉的成分摻在一起、接著微濾除菌來制備。一般而言，分散體通過將活性 化合物摻入到含有基本分散介質和上文列舉的那些所需其他成分的無菌媒介物中來制備。 在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥 (凍干)，從之前的無菌過濾溶液得到活性成分外加任何其他期望成分的粉劑。調整劑量方案以提供最佳的期望反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單個大 劑量(bolus)，可以在一段時間給藥幾個分劑量，或者可以按照治療情形的緊急情況所指示 的那樣成比例地降低或增加劑量。例如，本發明基于纖連蛋白的結合分子可以每周一次或 兩次皮下注射給藥，或者每月一次或兩次皮下注射。特別有利的是以劑量單位形式配制胃 腸外組合物，以易于給藥和統一劑量。如本文所用的劑量單位形式是指適于作為單個劑量 用于待治療受試者的、物理上離散的單位；每個單位含有經計算可以產生期望治療效果的 預定量的活性化合物以及所需藥物載體。本發明劑量單位形式的規格受制于并直接取決 于(a)活性化合物的獨特特征和欲實現的特定治療效果，和(b)個體敏感性對配制此類活
25性化合物用于治療造成的本領域固有限制。可藥用抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸 鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、 丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3) 金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。對于治療組合物，本發明的制劑包括適合于口服、鼻腔、局部(包括頰和舌下)、直 腸、陰道和/或胃腸外給藥的那些。制劑可以便利地以單位劑量形式存在，并且可以通過藥 學領域公知的任何方法制備。可與載體材料組合以產生單個劑量形式的活性成分量將取決 于待治療的受試者和具體的給藥方式。可與載體材料組合以產生單個劑量形式的活性成分 量一般是產生治療效果的組合物的量。一般而言，在100%當中，該量范圍將是約0.001% 至約90%的活性成分，優選約0. 005%至約70%，最優選約0. 01%至約30%。本發明適合于陰道給藥的制劑還包括含有本領域已知適當的此類載體的栓劑、棉 塞劑、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑。用于局部或透皮給藥本發明組合物的劑型包括 粉劑、噴霧劑、膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼片和吸入劑。活性化合物可以在無菌 條件下與可藥用的載體、與任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。如本文所用的短語“胃腸外給藥”和“經胃腸外給藥”表示除消化道和局部給藥之 外的給藥方式，通常通過注射，并且包括，但不限于，靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、包膜內、 眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、包膜下、蛛網膜下、脊髓內、硬膜 外和胸骨內注射和輸注。本發明的藥物組合物中可采用的適宜水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多 元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適宜的混合物，植物油，例如橄欖油，和可注射 的有機酯，例如油酸乙酯。恰當的流動性例如，可通過應用衣料如卵磷脂，在分散體的情況 下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應用表面活性劑來維持。這些組合物還可以含有助劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。防止存在微 生物既可以通過同前的滅菌方法、又可以通過納入多種抗細菌劑和抗真菌劑來確保，例如 對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。還可能期望在組合物中納入等滲劑，例如糖、氯 化鈉等。另外，可注射藥物形式的延時吸收可以通過納入延遲吸收的藥劑來實現，例如單硬 脂酸鋁和明膠。當本發明的化合物作為藥物對人和動物給藥時，它們可以單獨地或作為含有例如 0. 001-90% (更優選0. 005-70%，例如0. 01-30% )活性成分連同可藥用載體的藥物組合
物給予。不管選擇的給藥路徑如何，本發明的化合物(其可以以適宜的水合形式應用)和/ 或本發明的藥物組合物均可以通過本領域技術人員已知的常規方法配制成可藥用的劑型。本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得對于具體的患 者、組合物和給藥方式而言能有效實現期望治療反應、而對該患者無毒的活性成分量。選擇 的劑量水平將取決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發明具體組合物或其酯、鹽或 酰胺的活性，給藥路徑，給藥時間，所采用具體化合物的排泄速率，治療的持續時間，與所采 用的具體組合物組合應用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、 病情、總體健康和既往病史，以及醫學領域公知的類似因素。具有本領域普通技術水平的醫師或獸醫能夠容易地確定和開處有效量的所需藥物組合物。例如，醫師或獸醫可以以比為 實現期望治療效果所需低的劑量開始給予用于藥物組合物中的本發明化合物，并逐漸增加 劑量，直至實現期望的效果。一般而言，本發明組合物適宜的日劑量將是有效產生治療效果 的最低劑量的化合物量。這樣的有效劑量一般將取決于上文所述的因素。優選給藥是靜脈 內、肌肉內、腹膜內或皮下，優選在靠近靶部位處給藥。如果期望，治療組合物的有效日劑量 可以在一整天以適當的時間間隔分開為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個分劑量來給 藥，任選以單位劑量的形式。雖說可以單獨給藥本發明的化合物，但是優選以藥物制劑(組 合物)形式給藥所述化合物。治療組合物可用本領域已知的醫療裝置給藥。例如，在優選的實施方案中，本發 明的治療組合物可用無針頭皮下注射裝置給藥，例如美國專利No. 5，399，163,5, 383，851、 5，312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中所述的裝置。公知的可 用于本發明的植入物和器件的實例包括美國專利No. 4，487，603，其公開了以可控速 率分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利No. 4，486，194，其公開了通過皮膚給藥藥物 的治療裝置；美國專利No. 4，447，233，其公開了以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸 注泵；美國專利No. 4，447，224，其公開了用于連續藥物遞送的可變流可植入輸注裝置； 美國專利No. 4，439，196，其公開了具有多腔區室的滲透藥物遞送系統；以及美國專利 No. 4，475，196，其公開了滲透藥物遞送系統。許多其他此類植入物、遞送系統和器件為本領 域技術人員已知。在某些實施方案中，可配制本發明的分子以確保體內恰當的分布。例如，血腦屏障 (BBB)排除許多高度親水的化合物。為確保本發明的治療性化合物穿過BBB (如果期望的 話)，可例如在脂質體中配制之。有關制備脂質體的方法，參見例如U. S.專利4，522，811; 5，374，548和5，399，331。脂質體可以含有選擇性運輸到特定細胞或器官中的一個或多個 部分，從而增強靶向藥物遞送(參見例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 685)。 例示性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如授予Low等的美國專利5，416，016)；甘露 糖苷(Umezawa 等，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗體(P. G. Bloeman 等(1995)FEBS Lett. 357 140 ;Μ· Owais 等(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性劑蛋白 A 受體(Briscoe 等(1995)Am. J. Physiol. 1233 134)，其不同類 型以及所發明分子的組分可以含有在本發明制劑中；pl20 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；還請參見 K. Keinanen ；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 123 ； J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 :273。在本發明的一個實施方案中，本 發明的治療化合物配制在脂質體中；在更優選的實施方案中，脂質體包括靶向部分。在最優 選的實施方案中，脂質體中的治療化合物通過在靠近腫瘤或感染的部位快速濃注來遞送。 組合物必須具有達到易于注射程度的流動性。其在制備和儲存條件下必需穩定，并且必需 防止其遭到微生物如細菌和真菌的污染。在另一實施方案中，可配制本發明的分子以防止或減小跨胎盤運輸。這可通 過本領域已知的方法進行，例如通過聚乙二醇化基于纖連蛋白的結合分子。更多參 考可見 Cunningham-Rundles C， Zhuo Z， Griffith B， Keenan J. (1992)Biological activities of polyethylene-glycolimmunoglobulin conjugates.Resistance to enzymatic degradation. JImmunol Methods. 152 :177_190 ； 以 及 Landor Μ. (1995)
27Maternal-fetaltransfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74 279-283。這在基于纖連蛋白的結合分子用于治療或預防復發性自然流產時尤其相關。化合物抑制癌癥的能力可在能預測人腫瘤中的功效的動物模型系統中進行評價。 可選地，組合物的這種特性可通過利用技術人員已知測定法研究化合物抑制的能力、例如 體外抑制作用來評價。治療有效量的治療化合物能夠降低腫瘤大小，或以其他方式緩解受 試者癥狀。本領域普通技術人員將能夠基于諸如受試者的個頭、受試者癥狀的嚴重程度以 及所選擇的具體組合物或給藥路徑等因素來確定這樣的量。就組合物可通過注射器遞送而言，組合物必需是無菌流動的。除了水，載體可以是 等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適宜的混合 物。例如，可通過應用衣料如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通 過應用表面活性劑來維持恰當的流動性。在許多情況下，優選在組合物中納入等滲劑，例如 糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化鈉。可注射組合物的長期吸收可通過在組合物納入 延遲吸收的藥劑來實現，例如單硬脂酸鋁或明膠。當活性化合物如上文所述進行了適當的保護時，化合物可以口服給藥，例如，用惰 性稀釋劑或可同化可食用的載體。治療和診斷應用可以構建本文所述的基于纖連蛋白的結合分子以結合任何目的抗原，并且可以修 飾之以具有增加的穩定性和半衰期以及其他功能部分。相應地，這些分子可在使用抗體的 所有領域中，包括研究、治療和診斷領域，采用以替代抗體。另外，由于這些分子擁有比抗體 優越的溶解性和穩定性特性，本文所述的抗體模擬物還可以在將破壞或失活抗體分子的條 件下應用。例如，可向培養中(例如體外或離體)或受試者(例如體內)中的細胞施用這些分 子，以治療、預防或診斷多種紊亂。如本文所用的術語“受試者”旨在包括人和非人動物。非 人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長動物、綿羊、狗、貓、 牛、馬、雞、兩棲動物和爬行動物。當纖連蛋白分子與其他藥劑一起給藥時，兩者可以按任何 次序或同時給藥。在一個實施方案中，本發明基于纖連蛋白的結合分子(及其變體、融合物和綴合 物)可用來檢測該分子所結合的靶標和/或雙特異性/多特異性纖連蛋白基結合分子所結 合的靶標的水平。例如，這可通過使樣品(例如體外樣品)和對照樣品與所述分子在允許分 子和靶標之間形成復合物的條件下接觸來實現。檢測分子和靶標之間形成的任何復合物， 并在樣品和對照之間進行比較。例如，可利用本發明的組合物進行本領域公知的標準檢測 方法，如ELISA、FACS和流式細胞計測定法。同樣落在本發明范圍內的是試劑盒，其含有本發明的組合物(例如，基于纖連蛋 白的結合分子、其變體、融合物和綴合物)和使用說明。試劑盒可進一步含有至少一種其他 試劑，或一種或多種本發明的其他纖連蛋白分子(例如，具有互補活性、與區別于第一分子 的靶抗原上的表位結合的抗體)。試劑盒一般包括表明試劑盒內含物的目的用途的標簽。 術語標簽包括試劑盒上或與之附隨提供的、或以其他方式與試劑盒相伴的任何書面或記錄 材料。如上文所述，本發明的分子可以在研究、治療和診斷領域的所有方面采用。可利用
28本發明基于纖連蛋白的結合分子(及其變體、融合物和綴合物)治療的例示性疾病/紊亂 包括，但不限于，自身免疫病、炎癥、癌癥、感染性疾病、心血管疾病、胃腸道疾病、呼吸道疾 病、代謝病、肌肉骨骼疾病、神經變性病、精神性疾病、眼科疾病、增生、糖尿病性視網膜病、 黃斑變性、炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、糖尿病、結節病、哮喘、 水腫、肺高壓、銀屑病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、Osler-Webber氏綜合癥、心肌血 管新生、斑塊內新生血管形成、再狹窄、血管創傷后新內膜形成、毛細血管擴張、血友病性關 節病、血管纖維瘤、纖維化伴慢性炎癥、肺纖維化、淀粉樣變、阿爾茨海默氏病、器官移植排 斥、深靜脈血栓、或創面肉芽(wound granulation)。一個實施方案中，本發明分子可以用于治療自身免疫病，例如，急性特發性血小板 減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜、皮肌炎、Sydenham舞蹈病、重癥肌無力、系統性 紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風濕熱、多腺體綜合征、大皰性類天皰瘡、青少年糖尿病、過敏性紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、鏈球菌感染后腎炎、結節性紅斑、Takayasu關節炎、Addison 氏病、類風濕性關節炎、多發性硬化、結節病、潰瘍性結腸炎、多形紅斑、IgA腎病、結節性多 動脈炎、強直性脊柱炎、Goodpasture氏綜合癥、血栓閉塞性脈管炎、Sjogren氏綜合癥、原 發性膽汁性肝硬化、Hashimoto甲狀腺炎、甲狀腺毒癥(即Graves病)、硬皮病、慢性活動性 肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮性側索 硬化癥、脊髓癆(tabes dorsalis)、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球腎炎、 銀屑病、或致纖維性肺泡炎。另一實施方案中，本發明分子可以用于治療癌癥。可以靶向的示例性癌癥類型包 括急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、膽囊癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血 病、慢性髓性白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、 甲狀腺髓樣癌、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、前 列腺癌、神經膠質和其它腦和脊髓腫瘤、和膀胱癌。另一實施方案中，本發明分子可以用于治療病原性生物例如細菌、病毒、真菌 或單細胞寄生蟲感染。可以治療的示例性真菌包括小孢霉屬(Microsporum)、發蘚菌屬 (Trichophyton)、表皮蘚菌屬(Epidermophyton)、申克抱子絲菌(Sporothrix schenckii)、 新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、莢膜組 織胞菜菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色 念珠菌(Candida albican) 0示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹病毒、巨細胞病 毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、Sendai病毒、貓白血病病 毒、呼腸弧病毒、脊髓灰質炎病毒、人血清細小病毒樣病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、 小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、登革病毒、風疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T細胞 白血病病毒、EB病毒、小鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水皰性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴 細胞性脈絡叢腦膜炎病毒或藍舌病毒。示例性細菌包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis), 無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、月市炎軍團菌(Legionella pneumophilia)、 化膿性鏈球菌(Sti^ptococcus pyogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟 菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌屬 ^J禾中(Pneumococcus spp. )、胃口f H干胃 B (Hemophilis influenzae B) > ^ S WilM # (Treponema pallidum)、！ξ _ _ 旋 # (Lyme diseasespirochetes)、tM M fx Ifi胃(Pseudomonas aeruginosa) > M ^ fe If lif (Mycobacterium leprae)、 ，$ I 氏 菌(Brucella abortus)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原體屬 (Mycoplasma)。示例性寄生蟲包括蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、賈第蟲屬物種(Giardia spp.)、卡氏月市孢子蟲(Pneumocystis carinii)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、隱孢子蟲 屬物種(Cryptospordium spp.)、棘阿米巴屬物種(Acanthamoeba spp.)、耐格里原蟲屬物 種(Naegleria spp.)、利什曼原蟲屬物種(Leishmania spp.)、結腸小袋蟲(Balantidium coli)、伊氏維蟲(Trypanosoma evansi)、維蟲屬物種(Trypanosoma spp.)、脆弱雙核阿 米巴(Dientamoeba fragilis)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、毛滴蟲屬物種 (Trichmonas spp.)、內阿米巴屬物種(Entamoeba spp.)、雙核阿米巴屬物種(Dientamoeba spp.)、巴貝蟲屬物種(Babesia spp.)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、等孢子 球蟲屬(Isospora spp.)、弓形體屬物種(Toxoplasma spp.)、腸上皮細胞微孢子蟲屬 物種(Enterocytozoon spp.)、月市囊蟲屬物種(Pneumocystis spp.)禾口小袋蟲屬物種 (Balantidium spp.)。治療和診斷應用可以構建本文所述的基于纖連蛋白的結合分子，以結合任何目的抗原或靶標。此 類靶標包括但不限于簇結構域、細胞受體、細胞受體配體、生長因子、白介素、蛋白質變應 原、細菌或病毒(參見例如圖7A-C)。還可以修飾本文所述的基于纖連蛋白的結合分子，以 具有增加的穩定性和半衰期，以及其他功能部分。相應地，這些分子可在使用抗體的所有 領域中采用以替代抗體，包括研究、治療和診斷領域。另外，由于這些分子擁有比抗體優越 的溶解性和穩定性特性，本文所述的抗體模擬物還可以在破壞或失活抗體分子的條件下應 用。本發明進一步通過如下實施例舉例說明，其不應闡釋為進一步的限制。本申請通 篇引述的所有附圖和所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容明確并入本文作為參考。
實施例所有實施例中使用如下材料和方法，除非另有說明。材料和方法一般而言，除非另有說明，本發明的實施采用化學、分子生物學、重組DNA技 術、免疫學(特別是例如抗體技術)的常規技術、和多肽制備的標準技術。參見例如 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis，Molecular Cloning ；Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody EngineeringProtocoIs(Methods in Molecular Biology)，510， Paul，S. , Humana Pr (1996) ；Antibody Engineering :A Practical Approach (Practical Approach Series，169)， McCafferty 編 輯，Irl Pr(1996) ；Antibodise :A Laboratory Manual，Harlow 等，C. S. H. L. Press, Pub. (1999)； 禾口 Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel 等編輯，John Wiley&Sons (1992) 0 適合用來實施本發明的 其他方法、技術和序列見 U. S.專利 No. 7，153，661 ；7，119，171 ；7，078，490 ；6，703，199 ； 6，673，901 和 6，462，189。序列
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通篇使用如下序列野牛型Fn3序列VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)野牛型Fn3序列(RGD至RGA)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 2)結合TNF的Fn3序列VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 3)結合TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 4)結合VEGFR 的 Fn3GEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO 76)dsbA信號序列MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQID NO 5)CD33信號序列土結合TNF的Fn3序列MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT (SEQ ID NO 6)CD33 信號序列 + 結合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPffASTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT (SEQ ID NO 7)⑶33信號序列+野生型Fn3MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 8)CD33信號序列+野生型Fn3 (RGD變成RGA)MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 9)CD33信號序列+結合VEGFR的Fn3MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ IDNO 77)結合TNF的納米抗體QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEIN
TNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO: 10)結合TNF的單域抗體DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 11)抗HSA結合劑EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEY匪SWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSS_(SEQ ID NO: 12)抗MSA結合劑DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 13)抗RSA結合劑DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 78)人血清白蛋白(HSA)DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLLAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶KLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO: 14)大鼠血清白蛋白(RSA)EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLF⑶KLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMS QRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAE⑶PPACYGTVL
32
AEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHS DICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA(SEQID NO 79)hlgGlFcKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 15)引物(1)5' gggcggaccgatgctcataaatctgaagtcgc3' (F)(SEQ ID NO 16)(2)5' gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgcaaaccaagtgcggcctgactggc cgc3，(R)(SEQID NO 17)(3)5，cagact agatct gtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F)(SEQ ID NO 18)(4)5' cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagtta atgctgatcgg3，(R)(SEQ ID NO 19)(5)5' cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagtta atgctaatcggtttg3，(R)(SEQ ID NO 20)(6)5，cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (S EQ ID NO 21)(7)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatag ttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 22)(8)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatag ttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 23)(9)5，cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (SEQ ID NO 24)(10)5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcg atagttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 25)(11) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcg atagttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 26)(12)5，cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (SEQ ID NO 27)(13) 5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgata gttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 28)(14)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgata gttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 29)(15)5，cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F)(SEQ ID NO 30)(16) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcg atagttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 31)(17) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcg atagttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 32)
33
(18) 5，gggcggaccggcaaatcttgtgacaaaactcacacatgc3，(F)(SEQ ID NO 33)(19)5' gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgtttacccggagacagggagaggc 3，(R) (SEQ IDNO 34)(20)5， cgtgcgagccagagcattagctcttacctgaactggtatcagcagaaaccg 3， (F)(SEQ ID NO 80)(21)5，cggtttctgctgataccagttcaggtaagagctaatgctctggctcgcacg 3，(R) (SEQ ID NO 81)(22) 5，cgaaactgctgatttatcgcaacagcccgctgcagagcggtgtgcc 3，(F)(SEQ ID NO: 82)(23) 5，ggcacaccgctctgcagcgggctgttgcgataaatcagcagtttcg 3，(R)(SEQ ID NO: 83)(24) 5，cctattattgccagcagacttaccgtgttccgccgacctttggccagggcacc 3，(F) (SEQ ID NO 84)(25) 5，ggtgccctggccaaaggtcggcggaacacggtaagtctgctggcaataatagg 3，(R)(SEQ IDNO 85)(26)5' gggcggaccgaagcacacaagagtgagatcgc 3，(F) (SEQ ID NO 86)(27)5' gggtttaaacgggccctctagatcatcaatgatgatgatgatggtgggctaaggcttctttgc ttctagc 3，(R)(SEQ ID NO 87)(28)5，atggattccaaaacgccgttctggttcgatacacc 3，(F)(SEQ ID NO 88)(29)5，ggtgtatcgaaccagaacggcgttttggaatccat 3，(R) (SEQ ID NO 89)(30)5，accaaattggcaacagacgtcaccaaaatcaacaagg 3，(F) (SEQ ID NO :90)(31)5，ccttgttgattttggtgacgtctgttgccaatttggt 3，(R)(SEQ ID NO 91)實施例實施例1CDR 移植利用計算模建，將來自結合TNF的納米抗體(SEQ ID NO 10)的⑶R環 1 (SGFTFSDYWM-SEQ ID NO 35)和環 3 (RSPSGFNR-SEQ ID NO 36)移植到野生型人纖連蛋白 III型組件第10結構域(“"^113”或“野生型Fn3”)的構架上。結合TNF的納米抗體和野 生型Fn3分子的氨基酸序列如下結合TNF的納米抗體(SEQ ID NO 10)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS野生型Fn3(SEQ ID NO 1)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT 利用相同的方法，將來自結合TNF的單域抗體(SEQ ID NO 40)的⑶R環 1 (SQAIDSY-SEQ ID NO 38)和環 3 (QVVWRPFT-SEQ ID NO 39)移植到野生型 Fn3 上。結合 TNF的單域抗體的氨基酸序列如下
結合TNF的單域抗體(SEQ ID NO 40)Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lieThr Cys Arg Ala Ser Gln Ala lie Asp SerTyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly LysAla Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro PheThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys ValGlu lie Lys Arg然后優化下文所示形式的DNA序列以在大腸桿菌中表達，并在德國Geneart AG公 司制備。所得的DNA片段用Ndel/BamHI消化，并連接至pET9a的相應位點(適當的側翼 DNA序列被添加到如下形式中)。形式 1)具有來自結合TNF的納米抗體的⑶Rl和⑶R3環的野生型Fn3-His標簽 (pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 41)2)具有來自結合TNF的納米抗體的⑶Rl和⑶R3環的野生型Fn3_Hi s標簽 (pET9a)，其中從該序列中去除了頭8個氨基酸EVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 42)3)具有來自結合TNF的單域抗體的⑶Rl和⑶R3環的野生型Fn3_Hi s標簽 (pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLL1SWDASQA1DSYYR1TYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVffRPFTPISINYRTHHHHHH(S EQ ID NO 43)4)具有來自結合TNF的單域抗體的⑶Rl和⑶R3環的野生型Fn3_Hi s標簽 (pET9a)，其中從該序列中去除了頭8個氨基酸EVVAATPTSLLISWDASQAIDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVffRPFTPISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 44)利用連接混合物轉化XLl-Blue或DH5 α感受態細胞。陽性克隆通過DNA測序來驗 證。構建體在包括BL21(DE3)在內的若干大腸桿菌菌株中表達。在誘導和表達之后，細胞 沉淀冷凍在_20°C，然后重懸于裂解緩沖液(20mM NaH2PO4、IOmM咪唑、500mM NaCl、每50ml 緩沖液 1 片無EDTA 的 Complete (Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase (Merck) [pH7. 4]中。 細胞在冰上超聲破碎并離心。上清液過濾，并上樣到M-NTA柱上。柱用洗滌緩沖液(同 裂解緩沖液，但具有20mM咪唑)洗滌，然后用洗脫緩沖液(同裂解緩沖液，但高達500mM咪 唑)洗脫。樣品在Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra_15管中濃
35縮，上樣到Superdex制備級柱(Amersham)上，并用IOmM Tris或PBS洗脫。樣品再次在 Bis-Tris凝膠上分析。實施例2#封千連屈S好ffl槐細_基于對野生型Fn3序列的檢查，鑒定了作為進行氨基酸修飾的潛在位點的位置， 所述修飾為例如用半胱氨酸或非天然氨基酸殘基進行取代以促進聚乙二醇化。例如，如下 所述分析了絲氨酸殘基。總共11個絲氨酸殘基，在下面的序列中以下劃線標出；還參見圖 1，其顯示了野生型Fn3分子，其中絲氨酸殘基以枝杈表示。野生型Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)分析中排除了靠近結合表面的絲氨酸殘基，例如屬于N-末端區域并還與TO和BC 環接觸的Ser 2 (在下面的序列中以下劃線標出的Ser殘基)。 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)Ser 53-Ser 55——這些殘基屬于DE環(在下面以下劃線標出)。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)Ser 81-Ser 84-Ser 85——這些殘基屬于!7G環(在下面以下劃線標出)。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)進行修飾的候選絲氨酸包括Ser 17-Ser 21-Ser 43-Ser 60_Ser89。這些絲氨酸 殘基均暴露于溶劑，并且除Ser 43之外，它們都是β鏈的一部分(見圖2)。Ser 17和Ser21分別位于B鏈的起點和末端。Ser 60位于E鏈的末端。Ser 21和Ser 60位于兩個相鄰的鏈上，所述兩鏈形成纖連蛋白的三鏈片層。Ser 89位于G鏈的中部，G鏈也是形成4鏈片層的最后一條鏈。相應地，Ser 89 也暴露于溶劑，并且是外部分子可及的。Ser 43位于分子底部，屬于CD環，處于朝向溶劑彎曲的環末端(見圖2)。用于潛在修飾位點的其他殘基包括位于β鏈上并暴露于溶劑的如下殘基 V11-L19-T58-T71 (在下面的序列中以下劃線標出)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)參照圖3，顯示了三鏈片層(鏈A-B-E)。片層底部分布著候選殘基Serl7和Ser 60。候選殘基Ser 21位于頂部。Ser 55已經排除，因其靠近結合表面。位于靠近A鏈起點的纈氨酸11似乎在纖連蛋白組件序列中并不保守。位于B鏈中部的亮氨酸19也不是保守位置。蘇氨酸58位于E鏈末端。參照圖4(支架另一側；4鏈片層)，蘇氨酸71的定位靠近Ser 89。此位置也不保 守。需要注意的是，纖連蛋白分子的這部分形成一種“C”結構。re環和CD環彼此相望(見圖5)。視與分子相連的PEG分子的大小而定，分子該側可能不易于聚乙二醇化。實施例3Fn3序列的聚乙二醇化結合TNF 的 Fn3 (SEQ ID NO :3)、結合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T) (SEQ ID NO :4)、野生 型Fn3(SEQ ID NO 1)和野生型Fn3 (RGD至RGA) (SEQ ID NO 2)的聚乙二醇化利用(1)半 胱氨酸和⑵非天然氨基酸如下進行，以增加Fn的半衰期。結合TNF 的 Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 3)結合TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 4)野牛型Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO !)野牛型Fn3序列(RGD至RGA)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 2)利用半胱氨酸聚乙二醇化優化對應于前述結合TNF的Fn3和野生型Fn3序列的DNA序列，以在大腸桿菌中 表達，并在德國Geneart AG公司制備。為插入C-末端半胱氨酸殘基，結合TNF的序列利用 引物6(SEQ ID NO 21)和7 (SEQ IDNO :22)擴增，而野生型序列利用引物6 (SEQ ID NO 21) 和8 (SEQ IDNO 23)擴增(參見上文材料和方法章節所述的引物)。PCR產物用Ndel/BamHI 消化，并克隆至pET9a的相應位點。另夕卜，結合TNF的序列還利用引物9 (SEQ ID NO 24)和 10 (SEQ ID NO :25)擴增，而野生型序列利用引物 9 (SEQ ID NO 24) ^P 11 (SEQ ID NO 26) 擴增。PCR產物用BamHI/Hindlll消化，并克隆至帶有dsbA信號序列的pQE_80L的相應位 點ο形式 1)結合 TNF 的 Fn3 序列 _3xA 接頭 _C_3xA 接頭-His 標簽(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 48)2)結合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)序列-3xA 接頭 _C_3xA 接頭-His 標簽(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 49)3)野生型Fn3序列_3xA接頭_C_3xA接頭-His標簽(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
37
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 50)4)野生型 Fn3 (RGD 至 RGA)序列 _3xA 接頭 _C_3xA 接頭-His 標簽(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO:51)4) dsbA信號序列-結合TNF的Fn3序列_3xA接頭-C_3xA接頭-His標簽 (PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPffASLATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 52)5) dsbA 信號序列-結合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)序列-3xA 接頭 _C_3xA 接頭-His 標簽(PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 53)6) dsbA信號序列_野生型Fn3序列_3xA接頭_C_3xA接頭-His標簽(pQE_80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQIDNO 54)7) dsbA信號序列_野生型Fn3 (RGD至RGA)序列_3xA接頭_C_3xA接頭-Hi s標簽 (PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 55)8)野生型 Fn 序列-(RGD 至 RGA) His 標簽(pETOa)
MVS DVPRDLEVVAATPTS LLlSffDAPAVTVRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTHHHHHH(SEQ IDNO 37)利用連接混合物轉化XLl-Blue或DH5 α感受態細胞。陽性克隆通過DNA測 序來驗證。構建體在包括KS474、TGl(-)和BL21(DE3)在內的若干大腸桿菌菌株中表 達。在誘導和表達之后，細胞沉淀冷凍在_20°C，然后重懸于裂解緩沖液(20mM NaH2PO4, IOmM 咪唑、500mM NaCl、每 50ml 緩沖液 1 片無 EDTA 的 Complete(Roche)、2mM MgCl2UOU/ ml Benzonase(Merck) [pH7. 4]中。細胞在冰上超聲破碎并離心。上清液過濾，并上樣到 Ni-NTA柱上。柱用洗滌緩沖液(同裂解緩沖液，但具有20mM咪唑)洗滌，然后用洗脫緩 沖液(同裂解緩沖液，但高達500mM咪唑)洗脫。樣品在Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上 分析，然后在Amicon Ultra_15管中濃縮，上樣到Superdex制備級柱(Amersham)上，并用 PBS [pH6. 5-7. 2]洗脫(有時在凝膠過濾之前應用溫和還原)。樣品再次在Bis-Tris凝膠 上分析。純化的蛋白質補充DTT (終濃度10 μ M)，然后通過Amicon Ultra_4管，IOOk過濾 以除去內毒素。使用HiTrap脫鹽柱去除DTT。樣品于pH 5. 5的50mM 緩沖液中，在室溫與5-10摩爾過量的PEG-馬來酰亞胺偶聯約4小時，通過SDS-PAGE和MS分析聚乙二醇 化的效率。通過HiTrap-SP-FF柱、接著用PBS或Tris透析而除去過量的PEG。與相應抗原 的結合通過ELISA來驗證。PEG化位點通過還原、烷基化和胰蛋白酶消化來確定。IOOyg 樣品干燥，于100 μ 1終體積中與6. 4Μ尿素、0. 32Μ NH4CO3及0. OlM DTT在50°C于氬氣下溫 育30分鐘，然后加入IAA (0. 03M)，室溫暗中溫育15分鐘。樣品脫鹽、干燥、然后于50 μ 1終 體積中與0. 8Μ尿素、0. 04Μ NH4C03、0. 02M Tris, pHIO及1 μ g胰蛋白酶溫育，并通過LC-MS 分析。在體內測定這些構建體的半衰期。每種化合物10mg/kg通過靜脈內施用給Lewis 大鼠(η = 3)，于給藥前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小時取樣。使用CM5芯片和標準胺 偶聯進行Biacore分析。流室(flow cell) 1為空白(用EDC/NHS進行表面活化，隨后用乙 醇胺失活)，用于參照扣除。流室2用THE抗HIS mAb (GenScript Corp)包被，用于PK讀出。 流室3和4用施用給動物的化合物包被(表面飽和)，用于免疫原性讀出。大鼠血清樣品 用HBS-EP和NBS還原劑(Biacore ；終濃度lmg/ml) 1 8稀釋。制備標準曲線用于化合物 定量，在大鼠血清(GeneTex)中制備施用給動物的相應化合物的1 2稀釋系列，從20mg/ 1向下至0. 078mg/l。大鼠血清用HBS-EP和lmg/ml NSB還原劑1 8稀釋。使用XLfit 4. 2擬合標準曲線數據，用于計算血清樣品中的化合物濃度(PK)。使用WinNonlin軟件計 算了化合物半衰期。使用非房室模型擬合PK數據。野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys在大腸桿菌中表達、純 化并用SDS PAGE分析(圖8a)。除了單體外，還觀察到該半胱氨酸變體的二聚體。LC-MS 顯示了未修飾物的質量為10. 85kDa，而半胱氨酸變體的質量為11.38kDa，這些分子量相應 于預期的蛋白質(數據未顯示)。野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys用30kDa PEG-馬來酰亞胺修飾。圖8b通過SDS-PAGE 顯示存在PEG化蛋白質，這進一步通過MALDI-TOF MS得到證實。該PEG化樣品顯示出 42. 8kDa的麗，由于PEG導致了寬峰。PEG化位點通過對還原、烷基化和胰蛋白酶消化的PEG 化和非PEG化樣品進行LC-MS分析而確定(數據未顯示)。比較肽圖譜顯示，在PEG化樣品 中缺了在RT 10. 89min的峰。該肽具有1527. 7Da的單種同位素麗，相應于預期蛋白質的 T [95-108]H(于位置99含有半胱氨酸的肽)(數據未顯示)。體內數據顯示，PEG化野生型10Fn3(圖10)與未修飾的10Fn3(圖9)比較具有 顯著半衰期改善。未修飾的10Fn3的平均半衰期為0. 52h，而對于PEG化10Fn3這增加至 3. 6h(圖11)。使用動物EV3不能檢測到信號。該大鼠研究的結果說明，當制備為PEG化綴合物時，纖連蛋白(10Fn3)的體內血清 半衰期可以顯著地延長。可以使用以下公式，將來自此大鼠研究的體內半衰期結果外推至人公式權利要求
包含與非Fn3部分連接的基于III型纖連蛋白(Fn3)的結合分子的綴合物，其中該Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3β鏈結構域序列和連接在每一Fn3β鏈結構域序列之間的環區序列，其中環區序列結合特異性靶標。
2.權利要求1的綴合物，其中非Fn3部分能夠結合第二靶標。
3.權利要求1的綴合物，其中非Fn3部分增加Fn3基結合分子體內施用時的半衰期。
4.權利要求1的綴合物，其中非Fn3部分包含抗體Fc區。
5.權利要求4的綴合物，其中抗體Fc區與Fn3基結合分子融合于選自N末端區和C端 末區的區域。
6.權利要求4的綴合物，其中抗體Fc區與Fn3基結合分子融合于選自如下的區域環 區、β鏈區、β樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區 域、及N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。
7.權利要求4的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期大 至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
8.權利要求4的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期大 至少5-30倍。
9.權利要求4的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 長至少2-5小時、5-10小時、10-15小時、15-20小時、20-25小時、25-30小時、35-40小 時、45-50小時、50-55小時、55-60小時、60-65小時、65-70小時、75-80小時、80-85小時、 85-90 小時、90-95 小時、95-100 小時、100-150 小時、150-200 小時、200-250 小時、250-300 小時、350-400 小時、400-450 小時、450-500 小時、500-550 小時、550-600 小時、600-650 小時、650-700 小時、700-750 小時、750-800 小時、800-850 小時、850-900 小時、900-950 小時、950-1000 小時、1000-1050 小時、1050-1100 小時、1100-1150 小時、1150-1200 小 時、1200-1250 小時、1250-1300 小時、1300-1350 小時、1350-1400 小時、1400-1450 小時、 1450-1500 小時。
10.權利要求4的綴合物，其中綴合物的體內半衰期為至少9.4小時。
11.權利要求1的綴合物，其中非Fn3部分包括血清白蛋白(SA)、或轉鐵蛋白、或其部分。
12.權利要求11的綴合物，其中血清白蛋白(SA)或其部分是人血清白蛋白(HSA)。
13.權利要求12的綴合物，其中HSA與Fn3基結合分子綴合于選自如下的區域環區、 β鏈區、β樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區域、 及N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。
14.權利要求12的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
15.權利要求12的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少25-50倍。
16.權利要求12的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰 期長至少2-5小時、5-10小時、10-15小時、15-20小時、20-25小時、25-30小時、35-40小 時、45-50小時、50-55小時、55-60小時、60-65小時、65-70小時、75-80小時、80-85小時、 85-90 小時、90-95 小時、95-100 小時、100-150 小時、150-200 小時、200-250 小時、250-300 小時、350-400 小時、400-450 小時、450-500 小時、500-550 小時、550-600 小時、600-650 小時、650-700 小時、700-750 小時、750-800 小時、800-850 小時、850-900 小時、900-950 小時、950-1000 小時、1000-1050 小時、1050-1100 小時、1100-1150 小時、1150-1200 小 時、1200-1250 小時、1250-1300 小時、1300-1350 小時、1350-1400 小時、1400-1450 小時、 1450-1500 小時。
17.權利要求12的綴合物，其中綴合物的體內半衰期為至少19.6小時。
18.權利要求12的綴合物，其中結合血清白蛋白(SA)、或轉鐵蛋白、或其部分的多肽是 抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗轉鐵蛋白多肽。
19.權利要求18的綴合物，其中抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗轉鐵蛋白多肽與Fn3 基結合分子綴合于選自如下的區域環區、β鏈區、β樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末 端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端區域、及N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。
20.權利要求18的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
21.權利要求18的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少10-35倍。
22.權利要求18的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰 期長至少2-5小時、5-10小時、10-15小時、15-20小時、20-25小時、25-30小時、35-40小 時、45-50小時、50-55小時、55-60小時、60-65小時、65-70小時、75-80小時、80-85小時、 85-90 小時、90-95 小時、95-100 小時、100-150 小時、150-200 小時、200-250 小時、250-300 小時、350-400 小時、400-450 小時、450-500 小時、500-550 小時、550-600 小時、600-650 小時、650-700 小時、700-750 小時、750-800 小時、800-850 小時、850-900 小時、900-950 小時、950-1000 小時、1000-1050 小時、1050-1100 小時、1100-1150 小時、1150-1200 小 時、1200-1250 小時、1250-1300 小時、1300-1350 小時、1350-1400 小時、1400-1450 小時、 1450-1500 小時。
23.權利要求18的綴合物，其中綴合物的體內半衰期為至少7.7小時。
24.權利要求1的綴合物，其中非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。
25.權利要求24的綴合物，其中PEG部分連接于巰基基團或胺基團。
26.權利要求24的綴合物，其中PEG部分通過定點聚乙二醇化與Fn3基結合分子連接。
27.權利要求24的綴合物，其中PEG部分連接于Cys殘基。
28.權利要求24的綴合物，其中PEG部分連接于非天然氨基酸殘基。
29.權利要求24的綴合物，其中PEG部分連接于Fn3基結合分子中選自如下的區域上 環區、β鏈區、β樣鏈、C-末端區域、C-末端和最C-末端的β鏈或β樣鏈之間、N-末端 區域、及N-末端和最N-末端的β鏈或β樣鏈之間。
30.權利要求24的綴合物，其中PEG部分具有大約2kDa至大約IOOkDa的分子量。
31.權利要求24的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
32.權利要求24的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰期 大至少5-25倍。
33.權利要求24的綴合物，其中綴合物的半衰期比未綴合的Fn3基結合分子的半衰 期長至少2-5小時、5-10小時、10-15小時、15-20小時、20-25小時、25-30小時、35-40小 時、45-50小時、50-55小時、55-60小時、60-65小時、65-70小時、75-80小時、80-85小時、 85-90 小時、90-95 小時、95-100 小時、100-150 小時、150-200 小時、200-250 小時、250-300 小時、350-400 小時、400-450 小時、450-500 小時、500-550 小時、550-600 小時、600-650 小時、650-700 小時、700-750 小時、750-800 小時、800-850 小時、850-900 小時、900-950 小時、950-1000 小時、1000-1050 小時、1050-1100 小時、1100-1150 小時、1150-1200 小 時、1200-1250 小時、1250-1300 小時、1300-1350 小時、1350-1400 小時、1400-1450 小時、 1450-1500 小時。
34.權利要求24的綴合物，其中綴合物的體內半衰期為至少3.6小時。
35.具有改善的藥代動力學性質的綴合物，該綴合物包含與結合抗體Fc區的多肽連 接的基于纖連蛋白III型(Fn3)的結合分子，其中該Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3 β 鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中綴合物結合特異性 靶標并具有至少9. 4小時的血清半衰期。
36.具有改善的藥代動力學性質的綴合物，該綴合物包含與人血清白蛋白(HSA)部分 連接的基于纖連蛋白III型(Fn3)的結合分子，其中該Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3 β 鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中綴合物結合特異性 靶標并具有至少19. 6小時的血清半衰期。
37.具有改善的藥代動力學性質的綴合物，該綴合物包含與結合人血清白蛋白(HSA) 部分的多肽連接的基于纖連蛋白III型(Fn3)的結合分子，其中該Fn3基結合分子包含至 少兩個Fn3i3鏈結構域序列和連接在每一 Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中綴合 物結合特異性靶標并具有至少7. 7小時的血清半衰期。
38.具有改善的藥代動力學性質的綴合物，該綴合物包含與PEG部分連接的基于纖連 蛋白III型(Fn3)的結合分子，其中該Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3 β鏈結構域序列 和連接在每一 Fn3i3鏈結構域序列之間的環區序列，其中綴合物結合特異性靶標并具有至 少3. 6小時的血清半衰期。
39.具有改善的藥代動力學性質的綴合物，該綴合物包含與抗FcRn部分連接的基于 纖連蛋白III型(Fn3)的結合分子，其中該Fn3基結合分子包含至少兩個Fn3 β鏈結構域序列和連接在每一Fn3 β鏈結構域序列之間的環區序列，其中綴合物在酸性ρΗ以高親和性 而在中性PH以低親和性與新生兒FcR受體(FcRn)結合。
40.權利要求39的綴合物，其中酸性ρΗ為大約1至大約7。
41.權利要求39的綴合物，其中酸性ρΗ為大約6。
42.權利要求39的綴合物，其中中性ρΗ為大約7至大約8。
43.權利要求39的綴合物，其中中性ρΗ為大約7.4。
44.任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物，其中Fn3結構域來源于至少兩種纖 連蛋白組件。
45.任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物，其中Fn3結構域來源于至少三種或 三種以上纖連蛋白組件。
46.包含編碼任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物的序列的核酸。
47.包含與啟動子有效連接的權利要求46的核酸的表達載體。
48.包含權利要求47的核酸的細胞。
49.權利要求48的細胞，其中細胞是哺乳動物細胞。
50.權利要求49的細胞，其中哺乳動物細胞是人哺乳動物細胞。
51.權利要求49的細胞，其中哺乳動物細胞是CHO細胞。
52.產生與靶標結合的任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物的方法，包括表 達包含編碼任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物的序列的核酸。
53.權利要求52的方法，還包括在哺乳動物細胞中表達該核酸。
54.權利要求53的方法，其中哺乳動物細胞是人哺乳動物細胞。
55.權利要求53的細胞，其中哺乳動物細胞是CHO細胞。
56.包含任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴合物以及載體的組合物。
57.治療受試者疾病的方法，所述疾病選自自身免疫病、炎癥、癌癥、感染性疾病、心血 管疾病、胃腸道疾病、呼吸道疾病、代謝病、肌肉骨骼疾病、神經變性病、精神性疾病、眼科疾 病、和移植排斥，該方法包括給受試者施用任何前述權利要求的結合分子、綴合物或組合 物。
58.在樣品中檢測蛋白質的方法，包括標記任何前述權利要求的Fn3基結合分子或綴 合物，使標記的結合分子或綴合物與樣品接觸，和檢測結合分子或綴合物與蛋白質之間的 復合物形成。
59.包含綴合物的組合物用于治療疾病的用途，所述疾病選自自身免疫病、炎癥、癌癥、 感染性疾病、心血管疾病、胃腸道疾病、呼吸道疾病、代謝病、肌肉骨骼疾病、神經變性病、精 神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中該綴合物包含與非Fn3部分連接的基于纖連蛋白 III型(Fn3)的結合分子，且其中該綴合物結合特異性靶標，并具有比未綴合的Fn基結合分 子大至少3. 6倍的半衰期。
60.權利要求59的用途，其中非Fn3部分選自PEG、HSA、抗HSA、和抗體Fc區。
61.組合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途，其中所述疾病選自自身免疫病、炎 癥、癌癥、感染性疾病、心血管疾病、胃腸道疾病、呼吸道疾病、代謝病、肌肉骨骼疾病、神經 變性病、精神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中所述組合物包含含有與非Fn3部分連接 的基于纖連蛋白III型(Fn3)的結合分子的綴合物，其中該綴合物結合特異性靶標，并具有比未綴合的Fn基結合分子大至少3. 6倍的半衰期。
62.權利要求61的用途，其中非Fn3部分選自PEG、HSA、抗HSA、和抗體Fc區。
全文摘要
本發明提供了基于纖連蛋白的結合分子，以及將供體CDR引入到基于纖連蛋白的結合支架尤其是Fn3中的方法。本發明基于纖連蛋白的結合分子可以進一步與其他部分例如Fc、抗FcRn、HSA、抗HSA、和PEG綴合，以，尤其是在哺乳動物細胞中，提高半衰期和穩定性。本發明還提供了篩選此類分子與靶抗原的結合以及制備和純化候選結合劑的方法。
文檔編號A61K47/48GK101965198SQ200880127516
公開日2011年2月2日 申請日期2008年12月22日 優先權日2007年12月27日
發明者B·布拉尼迪, F·科爾賓格, K·J·維森特, S·埃韋特 申請人:諾瓦提斯公司