瘧疾疫苗的制作方法

專利名稱：瘧疾疫苗的制作方法
瘧疾疫苗本發明涉及用于治療瘧疾的穩定化的脂蛋白粒子，其制備方法，其在醫藥中的 應用，特別是在預防瘧疾感染中的應用，包含所述粒子的組合物/疫苗，以及所述組合 物/疫苗特別是在治療中的應用。瘧疾，是全世界主要的健康問題之一，每年超過2-4百萬人死于該病。該病的 最流行的形式之一由原生動物寄生蟲間日瘧原蟲(Rvivax)所引起，該間日瘧原蟲在熱帶 和亞熱帶地區被發現。令人感興趣的是，該寄生蟲可以在低至15°C的溫度下完成其蚊體 周期，這使得該病在溫帶氣候中得以蔓延。該病的最急性形式之一由原生動物寄生蟲惡性瘧原蟲(Rfalciparam)所引起，該 惡性瘧原蟲是導致由瘧疾造成的大多數死亡的原因。瘧原蟲的生命周期是復雜的，需要兩種寄主即人和蚊用于完成生命周期。人的 感染開始于子孢子通過被感染蚊子的叮咬被接種進入血流中。所述子孢子移到肝并感染 那里的肝細胞，其中所述子孢子經由紅細胞外的胞內階段分化成裂殖子階段，其感染紅 細胞(RBC)以啟動在無性血內階段中的循環復制。該周期通過在RBC中許多裂殖子分 化成有性繁殖階段的配子體而完成，所述配子體被蚊子攝入，在蚊子體內，所述配子體 在蚊子中腸內經由一系列階段發展生成子孢子，其移到唾液腺。由于由間日瘧原蟲引起的疾病很少致命的事實，預防和治療瘧疾的努力已集中 于更加致命形式的由惡性瘧原蟲引起的疾病。盡管由間日瘧原蟲引起的疾病不常導致患者死亡，由于看起來日益增多的大量 的病例，對患者生命質量的顯著影響，日益增加的關于該病導致貧血癥和死亡的嚴重事 件的報導，以及經濟影響，仍然需要用于該病的有效疫苗。另外，對該病的兩種病因都 能夠提供防護的單一疫苗將是有利的。間日瘧原蟲的特征在于，一些蟲株能夠通過在進入外周循環以顯現臨床癥狀之 前在肝內保持潛伏而造成延遲感染。因此，當例如穿過污染地區時，對象可被感染，但 是可能歷時數月不表現出癥狀。這是引起疾病蔓延的潛在原因，并且由于這一緣故，到 污染區域旅行的人在到該污染區域旅行之后的規定的一段時間內不允許捐贈輸血。間日瘧原蟲瘧疾感染在肝內保持潛伏，而所述寄生蟲正經歷紅細胞內裂殖生長 前(pre-erthrocytic shizogony)階段。如果所述寄生蟲在其離開肝之前在該階段受到控制， 在患者中觀察不到疾病的臨床癥狀。瘧原蟲的子孢子階段被確定為是瘧疾疫苗的潛在的靶標。使用去活化(經 照射的)子孢子的疫苗已顯示誘導對實驗人類瘧疾的防護(AmJ，Trap.Med.Hyg 24 297-402，1975)。然而，根據這一方法論，采用經照射的子孢子來生產用于一般人群的 瘧疾疫苗在實踐中和就后勤學而言是不可能的。所述子孢子的主要表面蛋白被稱為環子孢子蛋白(CS蛋白)。認為在子孢子從 被蚊子叮咬的最初接種位置進入循環(在那里子孢子移到肝處)期間，所述蛋白參與子孢 子的移動和侵入。瘧原蟲的CS蛋白的特征在于，側接非重復的氨基(N端)片段和羧基(C端)片段的中央重復結構域(重復區)。間日瘧原蟲的中央結構域由重復單元、通常是九個串聯 氨基酸的若干區組組成。在某些亞洲株中，在所述中央重復區之后，存在大約12個氨基酸的附加序列 (參見SEQ ID No 11)。后者的功能是未知的。然而，據一些人假設，所述氨基酸可能 與疾病臨床癥狀的延遲發病相關聯，盡管尚未對此進行考察。認為N端的特征在于被稱 為I區的5個氨基酸的序列(參見SEQ ID No 1)。還認為C端的特征在于包括被稱為II 區的12個氨基酸的序列。后者包含細胞粘附基序，其在所有的瘧疾CS蛋白中是高度保 守的(參見SEQIDNo.2)。若干研究小組已提出了基于環子孢子蛋白的亞單位疫苗。完全基于所述中央重 復區的這些疫苗中的兩個在二十世紀八十年代初經歷臨床試驗；一個疫苗是合成肽，另 一個疫苗是重組蛋白(Ballou等人，Lancet: June 6 (1987)，第1277頁起，和Herrington等 人，Nature 328: 257(1987))。這些疫苗在刺激抗子孢子應答中獲得成功。盡管如此， 應答幅度是令人失望的，一些疫苗根本不產生應答。另外，在隨后的注射之后，抗體水 平“加強”的缺乏以及體外淋巴細胞增殖試驗的結果暗示了，這些志愿者中大多數的T 細胞不識別免疫顯性重復(immuno-dominantrepeat)。另外，這兩個疫苗的效率勉強說得 過去，只有一個被接種的志愿者沒有發展成寄生蟲血癥。這些疫苗沒有作進一步討論。WO 93/10152和WO 98/05355描述了來源于惡性瘧原蟲的CS蛋白的疫苗， 并且使用其中所述的方法在朝著抗惡性瘧原蟲的疫苗方面似乎有了一些進展，還參見， Heppner 等人，2005，Vaccine 23，2243-50。迄今為止，在臨床上最先進的瘧疾疫苗基于被稱作RTS，S的脂蛋白粒子(又名 病毒樣粒子)。該粒子包含惡性瘧原蟲的CS蛋白的一部分，該部分實質上與惡性瘧原蟲 (蟲株NF54/3D7)的CS蛋白的氨基酸207-395相對應，該部分通過線性接頭在框架內融 合至來自乙型肝炎的S抗原的N端。所述接頭可包括來自S-抗原的preS2的一部分。 詳細內容請參見以下的討論。惡性瘧原蟲內的CS蛋白具有保守的中央重復區。相比之下，間日瘧原蟲的CS 蛋白的至少兩種形式(被稱為VK210或I型以及VK247或II型)是已知的。這使得更 難以鑒定具有全部所需性質諸如免疫原性的CS蛋白的構建體，該構建體提供對間日瘧原 蟲的總體防護而與CS蛋白的具體類型無關，因為針對I型中央重復區的抗體未必識別相 應的II型區上的表位，反之亦然。就本發明人所知曉的程度，尚未提議基于間日瘧原蟲的單一蟲株的與RTS，S相 當的粒子。雜合間日瘧原蟲CS蛋白描述于WO 2006/088597中。包含WO 2006/088597的雜合蛋白以及來自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白(本文 中被稱作CSV-S)以及包含該融合蛋白的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057301中。包含CSV-S、RTS和任選的S單元的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057296中。目前，RTS，S瘧疾疫苗作為凍干抗原被提供，其在遞送之前不久用助劑進行重 新構成。這是因為該抗原當儲存歷時相當長的時段時不穩定，特別是在助劑的存在下。 所述不穩定性自身表現為團聚和/或降解。
到2018/2019年，據估計需要8300萬劑量的瘧疾疫苗。目前的凍干(冷凍干 燥)方法花費約40小時。因此，目前的方法不可能滿足未來的需求。有可能將生產周 期縮短到約28小時，但是這仍不大可能滿足所述需求。另外，進一步縮短周期時間看來 導致出現不合格產品。瘧疾疫苗主要在基礎設施(infra-structure)和設備貧乏的國家中用于遞送，因 此，在直到給藥前是穩定的疫苗提供形式是至關重要的，特別是如果提供的是液體制劑 時。由發明人提供的初始數據表明，在磷酸鹽緩沖鹽水中制備的、含有殘留量的聚 山梨醇酯80 (0.0062% w/w)且不含其它賦形劑的、pH為6.1的RTS，S純體積(purified bulk),在加速穩定性試驗(即在37°C下儲存7天)后，顯示顯著的降解和氧化性聚集。 在4°C下儲存2個月后觀察到輕微聚集和降解。考察了以下的選項· pH從6.1增加到7.4似乎降低了 S抗原降解，但是增加CS蛋白降解；·聚山梨醇酯80 (也稱為吐溫80)濃度增加到0.05%、0.5%和1.0%似乎增加聚 集和降解二者，這是令人驚訝的，因為吐溫80通常降低抗原聚集(據發明人假設，這是 由在土溫內存在殘留的過氧化物所導致的，殘留的過氧化物可能催化蛋白/抗原內的硫 醇基的催化氧化-使用本發明的還原劑似乎防止這一效果)；和·加入蔗糖(6.2% w/w)對聚集或降解沒有影響。據假設，所述聚集過程在許多階段中發生，并且如果這些階段之一可被成功地 阻止的話，則可以阻止聚集和/或降解(參見“Minimizingprotein inactivation “， D.B.Volkin 禾口 A.M.Klibanov， “ Protein function apractical approach “ , T.E.Creighton 編-IRL Press, Oxford University Press)。第一階段是天然蛋白解折疊，從而暴露出其疏水性更大的區域。該疏水性區域 的暴露導致若干蛋白組在一起。最后階段是所述蛋白通過二硫鍵的形成而發生不可逆變 性。還可能的是，為使所述抗原增溶而被加入的聚山梨醇酯80含有殘留的過氧化 物，殘留的過氧化物催化聚集和/或降解。本發明人嘗試了許多的穩定試劑/穩定方法，例如，糖，多元醇，共溶劑，聚 合物，離子，pH，緩沖劑，抗氧化劑，螯合劑和表面活性劑，它們都不提供所需效果。 例如，加入抗壞血酸產生顯著的聚集。使用單獨的EDTA或在抗氧化的存在下使用EDTA 不阻止聚集。另外，加入亞硫酸鹽不提供所需的穩定效果。一些常見的穩定劑與在最終 的瘧疾制劑中所采用的輔助制劑不相容。本發明人目前相信，瘧原蟲CS蛋白(惡性瘧 原蟲和/或間日瘧原蟲)的脂蛋白粒子可采用特定的穩定劑進行穩定化用于儲存，例如， 包含至少一個硫醇(-SH)基團的還原劑，諸如硫代硫酸鹽，N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘 油，半胱氨酸，還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉或其混合物，特別是N-乙酰半胱氨酸，一 硫代甘油，半胱氨酸，硫代乙酸鈉及其混合物，特別是一硫代甘油，半胱氨酸及其混合 物。作為這些包含至少一個硫醇(-SH)基團的還原劑的替代物或者與這些還原劑相 組合，本發明使用的脂蛋白粒子可通過從它們被儲存在內的容器中除去氧和/或使所述制劑避光(例如通過使用褐色玻璃容器)而被穩定化或進一步穩定化，可保護/進一步保 護所述抗原。因此，本發明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含a)免疫原性粒子RTS，S，和/或b)來源于一種或多種間日瘧原蟲蟲株的CS蛋白和來自乙型肝炎的S抗原以及任 選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和/或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括(或選自)具有至少一個硫醇官能團的還原劑的穩定劑，例如，如上所述 的還原劑，諸如一硫代甘油，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸或其混合物。在一個方面，本發明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含上述的a)、b)、C)和任選 的d)，并且其中在其制備中采用諸如從容器中除去氧和/或通過例如使用褐色玻璃容器 使所述制劑避光的保護措施。有利地是，包含來自瘧原蟲的CS蛋白以及來自肝炎的S抗原的脂蛋白粒子抗原 可通過采用一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物和/或諸如從小瓶中除去氧和/或通過例如 使用褐色玻璃容器使所述制劑避光而被足夠地穩定化。序列表SEQ.ID.No.l 間日瘧原蟲的N端的I區SEQ.ID.No.2是在間日瘧原蟲的C端中的II區的高度保守部分SEQ.ID.No.3-9間日瘧原蟲的I型CS蛋白的多種重復單元SEQ.ID.No.10間日瘧原蟲的II型CS蛋白的主要重復單元SEQ.ID.No.ll在間日瘧原蟲的亞洲株中發現的附加氨基酸SEQ.ID.No.12間日瘧原蟲的雜合蛋白CSV的核苷酸序列(為在大腸桿菌中表達而被優化)SEQ.ID.No.13 間日瘧原蟲的雜合蛋白CSV的氨基酸序列SEQ.ID.No.14 間日瘧原蟲的II型CS蛋白的次要重復單元SEQ.ID.No.15 間日瘧原蟲的雜合蛋白CSV的核苷酸序列(為在酵母中表達而被優化)SEQ.ID.No.16雜合融合蛋白CSV_S的核苷酸序列SEQ.ID.No.17雜合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列SEQ.ID No. 18 RTS表示盒的核苷酸序列SEQ.ID No. 19 來自 SEQ ID No. 18 的預期 RTS 融合蛋白SEQ ID Nos.20到25包含CpG的寡核苷酸的實施例。


圖lpRIT15546酵母游離型載體的質粒圖譜；圖2通過在將所需抗原與來自乙型肝炎的S抗原“融合”中使用的GSK制備的 質粒pGFl-S2的質粒圖譜。(在切除12bp SmaI DNA片段之后)在SmaI位點之間的克 隆異源DNA序列與S基因產生符合讀框的融合；
圖3pRITl5582的質粒圖譜；用XhoI消化釋放攜帶CSV-S表達盒加LEU2選擇性標記的8.5kb的線形DNA片
段，用于插入所述酵母染色體內；圖4用于整合CSV-S表達盒的線性XhoI片段的限制圖譜；圖5在蟲株Y1835中產生的CSV-S，S混合粒子的電子顯微照片；CSV-S, S粒子從可溶性細胞抽提物(基于RTS，S純化法)純化并經歷電子顯 微鏡分析。在用磷鎢酸進行負染色之后可見到粒子。比例等于IOOnm ；圖6顯示在37°C +/-AOT-Novex凝膠中在非還原(左)和還原(右)條件下儲 存7天之后，在與ASOl混合之前(上)或與ASOl在25°C混合24小時之后(下)的SDS page分析，l.Mw2.PB TO3.PB7 天 37°C4.NaClP047 天 37°C5.NaCl P047 天 37 °C +AOT 褐色玻璃6.NaCl P047 天 37 °C +AOT 白色玻璃7.MTG 0.01 % 7 天 37°C8.MTG 0.01 % 7 天 37°C +AOT 褐色玻璃9.MTG 0.01 % 7 天 37°C +AOT 白色玻璃10.MTG 0.04% 7 天 37°C11.MTG 0.04% 7 天 37°C +AOT 褐色玻璃12.MTG 0.04% 7 天 37°C +AOT 白色玻璃；圖7顯示在還原(左)和非還原(右)條件下在37°C -Novex凝膠中儲存14天 之后，在與ASOl混合之前或與ASOl混合在25°C歷時24小時之后的SDS page分析；圖8顯示在還原(左)和非還原(右)條件下在37°C -Novex凝膠中儲存5周之 后，在與ASOl混合之前或與ASOl混合在25°C歷時24小時之后的SDS page分析；對于圖7圖8:l.Mw2.PB TO 還原3.RTS, S NaCl P045 周 37°C還原4.RTS, S MTG 0.01% 5 周 37°C還原5.RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C還原6. (RTS，S NaCl P045 周 37°C ) /ASOIE 24 小時 25°C還原7.(RTS，SMTG0.01% 5 周 37°C )/AS01E24 小時 25°C還原8. (RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C )/ASOIE 24 小時 25°C還原9.PB TO 非還原10.RTS, S NaCl P045 周 37°C非還原11.RTS, S MTG 0.01% 5 周 37°C非還原12.RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C非還原
13.(RTS，S NaCl P045 周 37°C )/ASOIE 24 小時 25°C非還原14. (RTS, SMTG001% 5 周 37°C )/AS01E24 小時 25°C非還原15.(RTS，S MTG 0.04% 5 周 37°C )/ASOIE 24 小時 25°C非還原圖9通過混合ELISA α CSP- α -S顯示在有或者沒有一硫代甘油的液體制劑中的 RTS，S抗原性；圖10顯示抗CS血清學結果；圖11顯示抗HBS血清學結果；圖12顯示CS特異性CD4T細胞應答；圖13顯示HBs特異性CD4T細胞應答；圖14顯示CS特異性CD8T細胞應答；圖15顯示HBs特異性CD8T細胞應答；發明詳述采用N-乙酰半胱氨酸、一硫代甘油、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉 或其混合物的本發明的方面具有另外的優點，該優點在于該實施方案提供了可行的替代 硫酸鈉的生產備選方案(可能希望避免硫酸鈉的使用)。盡管不希望束縛于理論約束，據本發明人假設，在穩定劑/還原劑中的硫醇官 能團與抗原中的硫醇官能團結合，從而阻斷所述位點并防止該位點與不同抗原分子上的 硫醇官能團發生鍵合/相互作用。另外，因為所述穩定劑/還原劑相對小，還認為在所 述抗原內的表位、特別是構象表位不被破裂，從而所述抗原的免疫原性得以被保留，并 防止發生聚集。替代地或另外地，吐溫(tween)中的過氧化物被淬滅。在本發明的一個方面，所述穩定劑是一硫代甘油。在本發明的一個方面，所述穩定劑是半胱氨酸。在本發明的一個方面，所述穩定劑是N-乙酰半胱氨酸。所述穩定劑例如可以按如下范圍的量被使用0.01到10% w/v,諸如1到5%，
2 至Ij 6 %，4 至Ij 7 %，3 至Ij 8 %，諸如 0.01 至Ij 1 %，0.2 至Ij 0.4 %, 0.1 % 至Ij 0.5 %，0.3 到 0.8%, 0.6 到 0.9%，例如實質上是 0.2，0.4，0.5 禾口 0.8%，或者諸如 0.01 到 0.1 %，0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08%， 0.02 至Ij 0.05%， 0.02 至Ij 0.08%或 0.05 至Ij 0.08% w/v。替代地，所述穩定劑例如可以按如下范圍的量被使用0.01到10%w/w，諸如 1 至丨J5%， 2 至Ij 6%，4 至Ij 7%， 3 至Ij 8%，諸如 0.01 至Ij 1 %，0.2 至Ij 0.4%，0.1%至Ij 0.5%， 0.3 至Ij 0.8%，0.6 到 0.9%，例如實質上為 0.2，0.4，0.5 禾Π 0.8%，或者諸如 0.01 到 0.1 %， 0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08 %， 0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08 % 或 0.05 至Ij 0.08% w/w。半胱氨酸的適合量為總制劑重量的0.1到1.0%。因此，例如，在一個500μ1的 人用劑量中，半胱氨酸的量為IOOyg到5000 μ g范圍，諸如500 μ g。在一個方面，本發明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含a)免疫原性粒子RTS，S，和/或b)來源于一種或多種間日瘧原蟲蟲株的CS蛋白和來自乙型肝炎的S抗原以及任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和C)穩定劑，其包括一硫代甘油。本發明的這一方面可進一步采用另外的保護措施，諸如從所述容器/小瓶除去 氧和/或通過例如使用褐色玻璃容器使所述制劑避光。一硫代甘油由式HSCH2CH (OH) CH2OH表示并且還被稱作3-巰基-1，2-丙二醇 或1-硫代甘油。用于本發明的適合量包括但不限于以下的范圍0.01到10%，諸如0.01 至Ij 或 0.01 至Ij 0.1%， 0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08%， 0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08 % 或 0.05 至Ij 0.08 % w/v，例如 0.011， 0.012， 0.013， 0.014， 0.015， 0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08% w/v。250 μ 1 的單一人用劑量可 含有例如10到2500 μ g，諸如25到250 μ g的一硫代甘油，例如50，125或200 μ g的一 硫代甘油。替代地，用于本發明的適合量包括但不限于以下的范圍0.01到10%諸如0.01 至ljl%，0.01 至Ij 0.1%，0.01 至Ij 0.02%，0.01 至Ij 0.05%，0.01 至Ij 0.08%，0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08% 或 0.05 至Ij 0.08% w/w，例如 0.011， 0.012， 0.013， 0.014， 0.015， 0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08% w/w。有利地是，當根據本發明使用一硫代甘油時，似乎與輔助制劑例如水包油型乳 液或包含MPL和/或QS21的脂質體制劑相容。另外，一硫代甘油降低了由MPL和QS21的脂質體輔助制劑誘導的脂蛋白粒子 聚集，從而提供與制備之后不久經純化的大體積的液體制劑相類似的液體制劑。在本說明書的背景下，經純化的體積(purified bulk)是指在超過兩個劑量的大體 積量下經純化的抗原。在本說明書背景下，最終體積(final bulk)是指超過一個或兩個劑量的經純化的 抗原和賦形劑諸如磷酸鹽緩沖鹽水，不包括輔助組分。當使用0.01%的一硫代甘油、在缺乏助劑的條件下以50yg/ml配制RTS，S 時，其在37°C儲存7天之后具有與新鮮體積相同的特性。0.01% —硫代甘油也足夠避免 RTS, S發生由光催化的聚集。盡管如此，對于瘧原蟲CS蛋白的脂蛋白粒子的、例如在100 μ g/ml的抗原和例 如最多1.0% w/v諸如0.02、0.05或0.08%的一硫代甘油的液體制劑而言，期待獲得其約 2或3年的貨架壽命。在本發明的一個方面，所述還原劑不是二硫蘇糖醇。所述疫苗的液體組分，包括其輔助組分，可要求在約4°C下儲存。本發明的所述制劑具有適于注射的pH和滲克分子濃度(osmolality)。適當地， 所述液體制劑的pH為約6.5到7.2，諸如約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0或7.1。本發明的所述制劑可進一步包含防腐劑諸如硫柳汞，例如，當超過10個劑量被 一起提供時。然而，在至少一個實施方案中，本文所述的制劑不含硫柳汞。研究顯示，與0.01或0.04% —硫代甘油一起儲存的例如在50 μ g/ml下的RTS， S在4°C或37°C下歷時5周之后，沒有可檢測的由非特異性吸收導致的抗原損失。另外，在加速穩定性，即在37°C下儲存7天、然后暴露于強光下約15小時(在 本文被稱作加速氧化試驗AOT)之后，未觀察到RTS，S粒度分布發生改變。
在一個方面，本發明提供了作為單獨的液體制劑的瘧疾疫苗用組分以及適于加 到該單獨液體制劑中的助劑，任選地作為包括每個成分(element)的單獨的小瓶的藥包 (kit)被提供。在該實施方案的一個方面，每個小瓶在視覺上是不同的，例如，在一個小 瓶上的卷邊蓋是有顏色的，從而使該小瓶與其它小瓶區分開，和/或一個小瓶是琥珀色 的(諸如包含所述抗原的小瓶)并且另一個小瓶是透明的(諸如包含所述助劑的小瓶)。適合的小瓶包括例如3mL的玻璃小瓶。在一個方面，本發明提供了包含抗原和穩定劑(或本文所述的還原劑)的凍干組 分，其然后可用液體助劑重新構成。所述凍干組分和所述液體助劑(諸如MPL和QS21的 水包油型制劑或脂質體制劑)可作為藥包被提供。本發明的這一方面具有以下的優點 其不需要在重新構成之后立即使用，而是在儲存至少24小時是穩定的，例如，當在混合 之后在25°C下儲存時抗原的抗原性保持至少24小時。在下文詳細地討論助劑。在本發明的一個方面，提供了最終的液體制劑。最終的液體制劑是指包含最多 10個劑量諸如1或2個劑量并包含除助劑組分以外的全部賦形劑的液體制劑。在一個方面，所述組分或最終疫苗作為單劑量被提供。在本說明書背景下的疫苗是包含全部所述組分的免疫原性制劑，所述組分包括 適于注射進人體的輔助組分。在一個方面，所述組分或最終疫苗作為雙劑量被提供。這可能是有利的(例 如，當對于一個劑量而言的量較小時)，因為提供兩個劑量可以使得在重新構成和/或給 予所述最終制劑時重要組分的損失最小化。因此，疫苗例如作為2個小瓶制劑的雙劑量形式被提供，其包含小瓶1 500μ1(2個劑量)的RTS，S，2 X濃縮(100 μ g/ml) +—硫代甘油 (0.02、0.05 或 0.08% )小瓶2 500μ1(2個劑量)的助劑，2Χ濃縮(ASOl)在重新構成之后，所述制劑提供Iml(2個劑量)的在ASOl中的RTS，S， +0.01、0.025或0.04%的一硫代甘油。間日瘧原蟲抗原本發明使用的CSV-S蛋白可包含來源于間日瘧原蟲的CS蛋白的一部分 (CSV)。該CSV抗原可以是天然蛋白，諸如在間日瘧原蟲的I型CS蛋白中發現的和/ 或在間日瘧原蟲的II型蛋白中發現的。替代地，所述CSV蛋白可能是包含來自所述I型 和II型CS蛋白的成分的雜合蛋白或嵌合(chimeric)蛋白。當后者被融合至所述S抗原 時，這在本文中被稱作雜合融合蛋白。CSV-S在本文中作為通用術語被使用，用于涵蓋包含來自間日瘧原蟲的CS蛋白 的序列/片段和來自乙型肝炎的S-抗原的序列的融合蛋白。所述雜合/嵌合蛋白通常包括至少一個來源于間日瘧原蟲的I型環子孢子蛋白的中央重復區段的重復單元，以 及至少一個來源于間日瘧原蟲的II型環子孢子蛋白的中央重復區段的重復單元。通常，所述雜合蛋白還將含有來自瘧原蟲諸如間日瘧原蟲的CS蛋白的N端片 段，例如，包含I區諸如由SEQIDNal所示的氨基酸的片段。
通常，所述雜合蛋白將包含來自瘧原蟲諸如間日瘧原蟲的CS蛋白的C端片段， 例如包含II區諸如由SEQ ID No 2所示的基序的片段。盡管不希望束縛于理論，認為所述的N端和C端片段包括若干個T細胞和B細 胞表位。本發明可使用任何適合的間日瘧原蟲蟲株，包括拉丁，美洲(即，Sail， Belem)，朝鮮，中國，泰國，印度尼西亞，印度和越南。在SEQID No 13中的構建體基 于朝鮮蟲株(更準確地說，基于南朝鮮蟲株)。具有I型CS蛋白的間日瘧原蟲比具有II型CS蛋白的間日瘧原蟲更普遍。因 此，在一個方面，本發明采用了來自I型的CS蛋白。在可供選擇的方面，本發明提供了 包含來自I型的重復單元和來自II型的重復單元的雜合蛋白，例如，其中在雜合蛋白中包 含了比II型重復單元更多的來自I型的重復單元。更準確地說，本發明的所述雜合蛋白可包含1到15個來自I型的重復單元，諸 如9個來自I型的重復單元。來自I型CS蛋白的適合的重復單元的實例在SEQ ID No.s3到9中給出。在一個實施方案中，本發明提供了具有不同的I型重復單元的混合物的雜合蛋 白，諸如各自在SEQ ID No.s 3到9中被列舉的那些重復單元。一個或多個重復單元可在雜合蛋白中被復制，例如，SEQIDNo 3和/或4的兩 個重復單元可被并入所述構建體中。a)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 3所示單元。b)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 4所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)段中的單元組合。c)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 5所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)和b)段中的單元組合。d)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 6所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)_c)段中的一個或多個單元組合。f)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 7所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)-d)段中的一個或多個單元組合。g)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 8所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)_f)段中的一個或多個單元組合。h)在一個方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 9所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)-g)段中的一個或多個單元組合。得自II型CS蛋白的適合的組分重復單元的實例在SEQ ID No.10和14諸如SEQ ID No.10中被給出。在本發明的一個方面，提供了具有5個或更少的來源于II型的重復單元諸如例如 SEQ ID No.10所示的一個重復單元的雜合蛋白。所述雜合蛋白還可包含在某些間日瘧原蟲的亞洲蟲株中發現的在所述重復區末 端被發現的12氨基酸插入，例如SEQ ID No. 11所示。在一個實施方案中，所述雜合蛋白包含來源于間日瘧原蟲CS蛋白的約257個氨基酸。
本發明的來源于csv的抗原組分通常被融合至所述s蛋白的氨基端。據信，所述得自乙型肝炎的表面抗原的存在加強了所述cs蛋白部分的免疫原 性，有助于穩定性，和/或幫助所述蛋白的可重現生產。在一個實施方案中，所述雜合融合蛋白包含約494個氨基酸，例如其中的約257 個氨基酸來源于間日瘧原蟲CS蛋白。所述雜合融合蛋白還可包含另外的來源于惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲的 抗原，例如，其中所述抗原選自DBP，PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl 禾口 RBP，或其片段。來源于惡性瘧原蟲的抗原的其它實例包括，PffiMP-1，Pfs 16抗原，MSP-1， MSP-3, LSA-I, LSA-3，AMA-1和TRAP。其它瘧原蟲抗原包括惡性瘧原蟲EBA， GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白(Sequestrin)，Ρβ32, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲中的類似物。在一個實施方案中，所述雜合融合蛋白(CSV-S)具有如SEQIDNo.17中所示的 氨基酸序列。在所述序列中，氨基酸6到262源自于CSV，以及氨基酸269到494源自 于S。剩余的氨基酸通過基因構建被引入(其視具體情況而定是不同的)。這四種氨基 酸，即Met、MetAla Pro,特別地來源于質粒pGFl_S2 (參見圖4)。SEQ id No 17所示蛋白的核苷酸序列在SEQIDNo 16中給出。編碼免疫原性cs多肽的多核苷酸序列可能是為哺乳動物細胞而被優化的密碼 子。這種密碼子優化詳細描述于WO 05/025614中。rts，s被稱作RTS的本發明的蛋白粒子的組分(即，來源于惡性瘧原蟲)可以根據WO 93/10152所述制備，該文獻包括RTS*的說明(來自惡性瘧原蟲NF54/3D7蟲株-本文稱 作 RTS)。在本發明的一個或多個實施方案中，在所述融合蛋白中采用的來源于惡性瘧原 蟲的抗原可實質上是其全CS蛋白。在本發明的一個實施方案中，采用了全長s-抗原。在另一個實施方案中，采用 了所述s-抗原的片段。在一個實施方案中，所述來源于惡性瘧原蟲的抗原在中央重復區中包含至少4 個重復單元。更準確地說，該抗原包含含有至少160個氨基酸的序列，其與所述CS蛋白 的C端部分實質上同源。所述CS蛋白可缺乏自C端起最后的12到14個(諸如12個)
氨基酸。更準確地說，所采用的來源于惡性瘧原蟲的融合蛋白是由SEQ IDNo 18所示的 RTS表達盒的核苷酸序列編碼的融合蛋白。來自乙型肝炎的s-抗原適合的S抗原可包含preS2區。適合的血清型的實例是adw(Nature280 815-819， 1979)。通常，所述來自乙型肝炎的序列將是全長s-抗原。通常，所述pres2區將不被 包括在內。在一個方面，本發明的所述雜合融合蛋白包含來源于突變s蛋白的一部分，例如，在美國申請公開No.2006/194196(還作為W02004/113369公開)中所述的。該文獻 描述了突變標記的HDB05。其特別地描述了在圖1和圖6中的突變蛋白和野生型蛋白的 比較以及在圖4和圖5中描述了突變蛋白的基因。其中的序列12到22描述了突變S蛋 白的特定多肽。上述每種作為參考并入本文。所述融合蛋白CSV-S可例如采用質粒pGFl-S2(有關詳細情形參見圖2以及實施 例)制備，當與CSV對應的適當的序列被插入在SamI克隆位點時，質粒pGFl_S2可在適 合的條件下產生所述融合蛋白CSV-S。編碼本發明蛋白的DNA序列可側接轉錄控制元件(優選來源于酵母基因)并被 并入表達載體中。本發明所用雜合蛋白的表達盒可例如被構建為包括以下特征·啟動子序列，例如來源于釀酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。·編碼適當的融合蛋白的序列。·被包含在所述序列內的轉錄終止序列，例如，來源于釀酒酵母ARG3基因。特定的啟動子的實例是來自Musti等人的釀酒酵母TDH3基因的啟動子。適合的質粒則因此可被采用，以將編碼所述雜合融合蛋白的序列插入到適合的 合成用寄主中。適合質粒的實例是pRIT 15546，即2微米基的用于攜帶適合表達盒的載 體，有關詳細情形參見圖1和實施例。所述質粒通常包含內裝標記以幫助選擇，例如編碼抗生素抗性或LEU2或HIS營 養缺陷型的基因。通常，所述寄主將具有用于所述粒子中各融合蛋白的表達盒，并且還可具有一 個或多個用于被整合到其基因組內的S抗原的表達盒。本發明還涉及使用本發明載體轉化的宿主細胞。宿主細胞可以是原核的或真 核的，但優選是酵母，例如酵母菌屬(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)諸如在 ATCC 數據庫中的 DC5(登錄號 20820)，名為 RIT DC5cir(o)。保藏人Smith Kline-RIT)
和非酵母菌屬酵母。這些包括裂殖糖酵母(例如粟酒裂殖糖酵母)，克盧費氏酵母(例 如，乳克盧費氏酵母)，畢赤氏酵母(例如巴斯德畢赤氏酵母)，漢遜氏酵母(例如多形 漢遜氏酵母)，脂耶氏酵母(例如解脂脂耶氏酵母)和許旺氏酵母(例如西方許旺氏酵 母)。適合的重組酵母菌株是用于表達所述融合蛋白的Y1834(以及其應用構成本發明 的一部分)，其制備參見實施例。本發明所使用的所述核苷酸序列或其部分(諸如編碼所述CS/雜合蛋白的部分， 但是任選不是編碼蛋白S的部分)可為在寄主諸如酵母中表達而被優化的密碼子。所述宿主細胞可包含來源于間日瘧原蟲的融合蛋白所用的表達盒，和來源于惡 性瘧原蟲的所述融合蛋白所用的表達盒，以及任選的S抗原。在某些寄主諸如酵母細胞中，一經表達，所述融合蛋白(包含所述S抗原)自發 組裝成由所述融合蛋白的眾多單體組成的蛋白結構/粒子。當所述酵母表達兩種不同的 融合蛋白(或融合蛋白和S抗原)時，這些被認為在粒子中進行共組裝。當被選擇的受體酵母菌株在其基因組中已攜帶若干乙型肝炎S表達盒的整合拷 貝時，則組裝的所述粒子還可包含未融合S抗原的單體。
這些粒子還可被稱作病毒樣粒子(VLP)。所述粒子還可被稱作多聚體型脂蛋白 粒子，或被簡稱為免疫原性粒子。因此，提供了包含以下單體的免疫原性蛋白粒子a.包含來源于間日瘧原蟲的CS蛋白的序列的融合蛋白(諸如CSV-S)，和/或b.包含來源于惡性瘧原蟲的CS蛋白的序列的融合蛋白(諸如RTS)，和C.任選的未融合S抗原，其中所述粒子與例如上文所定義的穩定劑諸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合 物結合使用。在一個方面，本發明提供包含如上所定義的單體a)和/或b)和C)的免疫原性 蛋白粒子，以及其中已從容納所述粒子的容器或小瓶中除去氧和/或其中例如通過褐色 玻璃容器使所述粒子避光保護的保護措施。在另一個方面，本發明提供了與本文所定義的例如選自一硫代甘油、半胱氨酸 或其混合物的還原劑結合使用的包含以下各項的融合蛋白的應用a)來源于間日瘧原蟲的CS蛋白的序列(例如，來自I型和/或II型的重復區的 序列)，b)來源于惡性瘧原蟲的CS蛋白的序列(諸如來自其重復區的序列)，和c)來自乙型肝炎的S抗原的序列，當其在適合的寄主中被表達時提供包含所述融合蛋白和任選的未融合S抗原的 病毒樣粒子，以生成粒子。在另一個方面，本發明提供了在其中已除去氧和/或通過例如使用褐色玻璃容 器使所述蛋白/粒子避光保護的環境中，包含以下各項的融合蛋白的應用a)來源于間日瘧原蟲的CS蛋白的序列(例如，來自I型和/或II型的重復區的 序列)，b)來源于惡性瘧原蟲的CS蛋白的序列(諸如來自其重復區的序列)，和c)來自乙型肝炎的S抗原的序列，當其在適合的寄主中被表達時提供包含所述融合蛋白和任選的未融合S抗原的 病毒樣粒子，以生產粒子。因此，本發明提供了具有至少一個硫醇官能團的還原劑例如本文所述的諸如一 硫代甘油、半胱氨酸或其混合物、特別是一硫代甘油用于穩定免疫原性脂蛋白粒子形式 的包含來源于間日瘧原蟲的CS蛋白的融合蛋白和/或來源于惡性瘧原蟲的CS蛋白的融 合蛋白(諸如RTS)的蛋白粒子的應用。因此，本發明提供可具有至少一個硫醇官能團的還原劑，例如本文所述的諸如 一硫代甘油，用于穩定包含CSV-S和/或RTS單元的VLP的應用。在一個方面，本發 明提供了基本上由CSV-S和/或RTS單元組成的粒子。在可供選擇的方面，所述生成的 粒子包含或基本上由CSV-S和/或RTS以及S單元組成。據假設，本發明所使用的所述脂蛋白粒子可為在體內進一步刺激對所述抗原蛋 白的免疫應答作貢獻。據進一步假設，加入具有至少一個硫醇官能團的穩定劑例如本文所述的諸如一 硫代甘油、半胱氨酸及其混合物為每種粒子提供了內穩定化作用，從而所述試劑可在被給出的粒子內被結合或內在化。本發明還涉及包含與適合的賦形劑例如稀釋劑混合的免疫保護量的本發明的穩 定化的蛋白粒子的疫苗。在本說明書背景下的疫苗是指包含全部所述組分(包括輔助組分在內)并適于注 射進人類患者的制劑。在本發明背景下的穩定化意欲表示其中具有至少一個硫醇官能團的穩定劑(本 文中還被稱作還原劑)例如本文所述的諸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物被省略的 相應制劑，例如當在37°C下儲存7或14天和/或當在加速穩定性條件下儲存時諸如在 37°C下儲存7天、然后在強光存在下處理約15小時。穩定性可涉及以下方面粒子大小(例如通過光散射技術、篩析(SizeExclusion) 色譜法或場流分級法測量的)和/或聚集/降解(例如通過SDS-page和蛋白質印跡 (Western Blot)測量的)和/或抗原性(例如通過ELISA測量的)和/或免疫原性(例如 在體內測量的)。在一個方面，穩定性是指不存在聚集和降解的。組合物在本說明書的背景下，賦形劑是指在藥物制劑中的自身沒有治療效果的組分。 助劑是一種賦形劑，因為盡管在不存在治療性組分諸如抗原的條件下，存在由所述助劑 產生的生理作用，但是這一生理作用是非特異性的并且其自身是非治療性的。稀釋劑或 液體載體落入賦形劑的定義范圍內。在本說明書的背景下，免疫原性意欲是指能夠引發對所使用的融合蛋白的CS部 分和/或S抗原部分的特異性免疫應答的能力。該應答可以是例如當所述脂蛋白粒子在 可能包含/要求適合的助劑的適當的制劑中被給藥時。可能要求包含類似于或小于初始 劑量的劑量的加強劑，以獲得所需的免疫原性應答。本發明的所述組合物/藥物制劑還可包含與一種或多種另外的抗原的混合物， 所述另外的抗原為諸如來源于惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲的那些，例如其中所述抗原 選自 DBP，PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl 和 RBP 或其片段。來源于惡性瘧原蟲的抗原的其它實例包括PffiMP-1，Pfs 16抗原，MSP_1， MSP-3, LSA-I, LSA-3，AMA-1和TRAP。其它瘧原蟲抗原包括惡性瘧原蟲EBA， GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白，Pf332，STARP, SALSA, PfEXP 1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲中的類似物。本發明的所述組合物/藥物制劑還可包含與含有CSV-S的粒子混合的RTS，S 的粒子(如WO 93/10152所述)。在本發明的疫苗中，可直接使用所述粒子的水性溶液。替代地，經過或未經過 先前冷凍干燥的蛋白可與助劑混合或被助劑所吸附。助劑適合的助劑是選自以下組中的那些金屬鹽，水包油型乳液，Toll樣受體激動 劑(特別是Toll樣受體2激動劑，Toll樣受體3激動劑，Toll樣受體4激動劑，Toll樣受 體7激動劑，Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體9激動劑)，皂草苷或它們的組合，前提條件是金屬鹽僅僅用于與另一種的助劑組合使用而非單獨使用，除非它們以至多約60% 的所述抗原被吸附到所述金屬鹽上的方式進行配制。在一個實施方案中，所述助劑不包 括金屬鹽作為唯一助劑。在一個實施方案中，所述助劑不包括金屬鹽。在一實施方案中，所述助劑是Toll樣受體(TLR)4配體，例如諸如脂質A衍生 物的激動劑，所述脂質A衍生物特別是單磷酰脂質A或更特別是3-去酰基化單磷酰脂質 A(3D-MPL)。3-去酰基化單磷酰脂質A從美國專利No.4,912,094和英國專利申請 No.2,220,211 (Ribi)中已知并且可得自 Ribi Immunochem，Montana, USA。3D-MPL由Corixa公司以商標MPL 銷售并且主要促進具有IFN_g (Thl)表型 的CD4+T細胞應答。其可以根據GB 2220211A中所公開的方法制備。在化學上講，其 是3-去酰基化單磷酰基脂質A與3、4、5或6個酰基化鏈的混合物。在本發明的所述組 合物中優選使用小粒子3D-MPL。小粒子3D-MPL具有使得其可被無菌過濾通過0.22 μ m 過濾器的粒度大小。這種制備物描述于WO 94/21292中。脂質A的合成衍生物是已知 的并被認為是TLR4激動劑，包括但不限于OM174 (2-脫氧-6_0-[2-脫氧_2_[ (R) _3_十二碳酰基氧基十四碳酰基氨 基]-4-o-膦酰基-β -D-吡喃葡糖基]-2_[ (R) -3-羥基十四碳酰基氨基h α -D-吡喃葡糖 基磷酸二氫酯)，(WO 95/14026)；OM 294DP (3S，9R) _3_[ (R)-十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基]-4_氧代_5_氮 雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四碳酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氫酯) (W099/64301 和 WO 00/0462)；OM 197MP-AC DP (3S_，9R) _3_[ (R)-十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基]_4_氧 代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四碳酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-磷酸二氫酯10-(6_氨 基己酸酯)(WO 01/46127)。一般地，當使用3D-MPL時，所述抗原和3D-MPL使用明礬遞送或者存在于水 包油型乳液或多相水包油型乳液中。并入3D-MPL是有利的，因為其是效應器T細胞應 答的刺激物。可使用的其它的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，諸如在WO 9850399或US 6303347中公開的那些(也公開了用于制備AGPs的方法)，或如在US 6764840中公開的AGPs的藥學可接受的鹽。一些AGPs是TLR4激動劑，以及一些是 TLR4拮抗劑。認為二者都可用作助劑。另一種用于本發明的免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。Quil A是從南美樹木皂 樹Quilaja Saponaria Molina中分離的皂草苷制備物并且由Dalsgaard等人在1974首次描述 為具有助齊[|活性(〃 Saponin adjuvants “，Archiv.fiir die gesamte Virasforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, ρ243_254)。Quil A的經純化的級分已通過HPLC被分離，其保
留了助劑活性而不具有與Quil A有關的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21 (又名QA7 和QA21)。QS21是來源于皂樹Quilaja Saponaria Molina的樹皮的天然皂草苷，其誘導 CD8+細胞毒T細胞(CTLs)、Thl細胞和支配性IgG2a抗體應答。特定的QS21制劑已有描述，其進一步包括甾醇(WO 96/33739)。QS21 甾醇 的比率一般為1 100到1 1重量/重量級別。通常，存在過量的甾醇，QS21 甾醇的比率為至少1 2w/w。一般對于人類給藥而言，QS21和甾醇在疫苗中將以每劑量約 1 μ g到約100 μ g、諸如每劑量約10 μ g到約50 μ g的范圍存在。所述脂質體通常包括中性脂質，例如卵磷脂，其在室溫下通常是非晶體，例如 蛋黃卵磷脂，二油酰基卵磷脂或二月桂酰基卵磷脂。所述脂質體還可包含帶電荷的脂 質，其增加了用于由飽和脂質構成的脂質體的脂質體-QS21結構的穩定性。在這些情 況下，帶電荷脂質的量通常是1-20% w/w,諸如5-10%。甾醇磷脂的比率是1-50% (mol/mol),諸如 20-25%。這些組合物可包含MPL (3-去酰基化單磷酰脂質A，又名3D_MPL)。3D-MPL 從GB 2220211 (Ribi)中已知是三種類型的具有4、5或6個酰基化鏈的去_0_酰基化單磷 酰脂質A的混合物并且由Ribi Immunochem, Montana生產。所述皂草苷可以分別是膠束、混合膠束(通常然而并非唯一地具有膽汁鹽)的形 式，或者可為ISCOM基質形式(EP 0109942)、脂質體或相關的膠態結構的形式諸如蝸桿 樣或環樣多聚體復合物以及當使用膽固醇和脂質進行配制時的脂質/層狀結構和薄片的 形式，或者為水包油型乳液的形式(例如在WO 95/17210中)。通常，所述皂草苷以脂質體制劑、ISCOM或水包油型乳液的形式存在。還可使用免疫刺激性寡核苷酸。用于本發明的助劑或疫苗中的寡核苷酸的實例 包括含有CpG的寡核苷酸，通常含有被至少三個、更優選被至少六個或更多個核苷酸分 開的兩個或更多個二核苷酸CpG基序。CpG基序是跟隨有鳥苷酸的胞嘧啶核苷酸。所 述CpG寡核苷酸一般是脫氧核苷酸。在一個實施方案中，在所述寡核苷酸中的核苷酸間 鍵合是二硫代磷酸酯鍵，或更優選是硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯鍵和其它的核苷酸間 鍵也落入本發明的范圍內。還被包括在本發明的范圍內的是具有混合的核苷酸間鍵合的 寡核苷酸。用于產生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US 5,278,302 和 WO 95/26204 中。寡核苷酸的實例如下所示TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) -SEQ ID No.20TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) -SEQ ID No.21ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG-SEQ ID No.22TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) -SEQ ID No.23TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) -SEQ ID No.24TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) -SEQ ID No.25所述序列可包含用硫代磷酸酯改性的核苷酸間鍵合。替代的CpG寡核苷酸可包含上述的一種或多種序列，對所述序列進行無關緊要 的缺失或附加。所述CpG寡核苷酸可通過本領域已知的任何方法合成(例如，參見EP 468520)。方便地是，這種寡核苷酸可采用自動合成器來合成。TLR 2激動劑的實例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉類諸如咪喹莫特和雷西 莫特是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(在人類中是TLR8，在 小鼠中是TLR7)，而雙鏈RNA和聚肌胞苷酸(聚肌苷酸-聚胞苷酸-病毒RNA的市售的 合成模擬物)是TLR 3激動劑的示例。3D-MPL是TLR4激動劑的實例，而CpG是TLR9激動劑的實例。免疫刺激劑可替代地或附加地被加入。在一個實施方案中，該免疫刺激劑將是 3-去酰基化單磷酰脂質A(3D_MPL)。在一個方面，所述助劑含有3D-MPL。在一個方面，所述助劑含有QS21。在一個方面，所述助劑含有CpG。在一個方面，所述助劑被配制為水包油型乳液。在一個方面，所述助劑被配制為脂質體。助劑組合包括3D-MPL 和 QS21 (EP 0671948B1)，包含 3D-MPL 和 QS21 的水包 油型乳液(WO 95/17210，WO 98/56414),在脂質體制劑中的3D-MPL和QS21，或與其 它載體進行配制的3D_MPL(EP 0689454B1)。其它助劑系統包括3D-MPL、QS21和CpG 寡核苷酸的組合，如US6558670和US 6544518所述。在一個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述的穩定化的粒子與3D-MPL 和稀釋劑組合的疫苗。所述稀釋劑一般是水包油型乳液或明礬。疫苗制備物通常描述于New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人編 輯，University Park Press，Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978 中。在脂質體內的囊封 由例如Fullerton等人描述于美國專利4,235,877中。在每個疫苗劑量中存在的本發明的蛋白粒子的量被選擇為誘導免疫保護應答而 無典型疫苗中的顯著的不良副作用的量。這種量將根據使用哪種特異性免疫原以及所 述疫苗是否采用助劑而異。通常，可以預期每個劑量將包含I-IOOOyg的蛋白，優選 l-200yg的蛋白，最優選IO-IOOyg的蛋白。對于特定疫苗的最佳量可通過標準研究來 確定，所述標準研究涉及觀察對象中的抗體滴度以及其它應答。在最初接種疫苗后，對 象優選在約4周內接受加強接種，然后只要存在感染風險，則每六個月重復進行加強接 種。對本發明蛋白的免疫應答通過使用助劑和/或免疫刺激劑得以被增強。使用的3D-MPL的量通常較小，但是根據疫苗制劑的不同而異，可為每劑量 1-1000 μ g，例如每劑量1-500 μ g，或每劑量1到100 μ g，諸如每劑量50或25 μ g。在本發明的助劑或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常較小，但是 根據疫苗制劑的不同而異，可為每劑量1-1000 μ g，例如每劑量l-500yg，諸如每劑量 1-100 μ g。在本發明的助劑中使用的皂草苷的量可為每劑量l-1000yg，例如每劑量 1-500 μ g，諸如每1-250 μ g，特別是每劑量1-100 μ g，尤其是每劑量50或25 μ g。制劑本發明的制劑可用于預防性或治療性目的。因此，本發明提供了本文所述的疫 苗組合物，其用于醫藥用途，例如，用于治療(或預防)瘧疾(或用于制備用于治療/預 防瘧疾的藥物)。本發明的另一個方面提供了制備本發明的疫苗組分和疫苗以及包含各成分的藥 包的方法，該方法包括在適合的寄主例如酵母中表達編碼所述蛋白的DNA序列，并回 收作為脂蛋白粒子的產物，并將后者與本文所定義的至少一種穩定劑、特別是一硫代甘 油、半胱氨酸及其混合物、諸如一硫代甘油混合。
最終體積通常被無菌地分配在3ml玻璃小瓶中，然后將玻璃小瓶寬松地塞上并 轉移到冷凍干燥器中經歷約40小時的凍干循環。在制備所述抗原組分的過程中，所述賦形劑通常被加入并混合，以及作為最終 步驟，所述抗原/脂蛋白粒子將被加入。對于該制備物，也可最后施加保護措施諸如從 小瓶中除去氧或通過使用褐色玻璃容器使所述疫苗避光，并結合使用穩定劑或作為備選 措施。在本發明的其中除去氧的方面中，所述制劑/組分/粒子等可在氮氣下儲存。所述助劑經常被加入到所述抗原的液體制劑(或所述抗原的凍干制劑)中以形成疫苗。本發明的另一個方面在于通過給予如上所述的有效量的疫苗治療容易受瘧原蟲 感染的患者的方法。在另一個方面，提供了用于本發明的治療用的疫苗的抗原成分或疫苗(或它們 在制備用于治療/預防瘧疾的藥物的用途)。本發明還包括初免加強方案，包括本文所述的各種組分中的一種或多種。在本說明書的背景下，“包括”被解釋為“包含”。在一個方面，本發明提供了在3mL玻璃小瓶例如琥珀小瓶中的本文所述的穩定 化的瘧疾抗原，所述小瓶任選地在填充之前用氮氣吹掃以除去小瓶中的氧物質。使用的小瓶可以是硅化的或非硅化的。本發明還延伸到由或基本上由本文所述的本發明的各方面組成的單獨的實施方 案，其視情況而定包括某些要素。顯示了以下的實施例用于說明所述方法，其用于制備本發明的粒子。
實施例
實施例1
用于RTS，S瘧疾疫苗的單一兒科劑量(2小瓶制劑)的組分的處方
組分量
RTS，S25 μ g
NaCl2.25mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM
一硫代甘油125 μ g
注射用水使體積達250 μ L
以上處方的制備方法為將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、
鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當稀釋50倍時為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的 混合物中。最后，調節pH到7.0 士0.1。這可作為與助劑(例如，MPL和QS21的脂質體制劑)的單獨的小瓶在一起的小
瓶被提供。組分量1，2- 二-油酰基-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ g
MPL25 μ gQS2125 μ gNaCl2.25mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM注射用水使體積達250 μ L對于給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進行， 然后振搖。然后，以常規方式給予所述劑量。最終液體制劑的ρΗ為約6.6+/-0.1。 實施例IA
本發明的最終兒科液體制劑(1小瓶)可根據以下處方制備。 組分量
RTS, S25 yg
4.5mg
IOmM 125 μ g
NaCl
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) 一硫代甘油1，2- 二-油酰基-sn-甘油基_3_磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ gMPL25 μ gQS2125 μ g注射用水使體積達500 μ L上述液體制劑的ρΗ或者被調節到7.0+/-0.1 (其對于抗原穩定性而言是有利的， 但是對于MPL的穩定性而言完全沒有利)，或者被調節到6.1+/-0.1 (其對于MPL穩定性 而言是有利的，但是對于RTS，S穩定性而言完全沒有利)。因此，該制劑意欲在制備后 迅速使用。上述制劑如下制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC1 1500mM、磷酸鹽緩 沖液(Na/K2)500mM(當稀釋50倍時為ρΗ 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的混合 物中。然后，加入包含MPL與QS21的脂質體的預混合物，并且最后調節ρΗ。實施例IB本發明的RTS，S的最終成人劑量(1小瓶制劑)可如下制備組分量RTS, S50 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油250 μ g1，2- 二-油酰基-sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 1000 μ g膽固醇250 μ gMPL50 μ gQS2150 μ g注射用水使體積達500 μ L
實施例IC可例如在填充之前用氮氣吹掃琥珀小瓶而后將實施例1、IA或IB置于該小瓶中 來制備實施例IC。實施例2本發明的組分還可作為用于兒科人群的二劑量(2小瓶制劑)被提供。組分量RTS, S50 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油250 μ g注射用水使體積達500 μ L上述制劑的制備方法為將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷酸 鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當稀釋50倍時為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的 混合物中。最后，調節pH到7.0 士0.1。這可作為與助劑(例如，MPL和QS21的脂質體制劑)的單獨的小瓶在-
瓶被提供。組分量1，2- 二-油酰基-sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 1000 μ g 然后振搖最終液體制劑的pH為約6.6+/-0丄
-起的小
250 μ g 50 μ g 50 μ g
膽固醇 MPL QS21
NaCl4.5mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM
注射用水使體積達500 μ L
對于給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進行， 然后以常規方式吸取單一劑量(500 μ L)并給藥。
實施例2Α
本發明的最終兒科液體制劑(1小瓶)可根據以下處方被制備為雙劑量。
組分量
RTS, S50 yg
NaCl9mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM
-硫代甘油
250 μ g
1，2- 二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC) IOOOyg
膽固醇
MPL
QS21
注射用水
250 μ g 50 μ g 50 μ g 使體積達1000 μ L
上述液體制劑的pH或者被調節到7.0+/-0.1 (其對于抗原穩定性而言是有利的， 但是對于MPL的穩定性而言完全沒有利)，或者被調節到6.1+/-0.1 (其對于MPL穩定性 而言是有利的，但是對于RTS，S穩定性而言完全沒有利)。因此，該制劑意欲在制備后 迅速使用。上述制劑按如下方法制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷 酸鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當稀釋50倍時為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液 的混合物中。然后，加入包含MPL與QS21的脂質體的預混合物，并且最后調節pH。
實施例2B
本發明的RTS，S的最終成人劑量(1小瓶制劑)可如下被制備成雙劑量 組分量
RTS, SIOOyg
9mg
IOmM 500 μ g
NaCl
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) 一硫代甘油1，2- 二-油酰基-sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 2000 μ g膽固醇500 μ gMP100 μ gQS21100 μ g注射用水使體積達1000 μ L實施例2C可例如在填充之前用氮氣吹琥珀小瓶而后將實施例2、2Α或2Β置于該小瓶中來 制備實施例2C。實施例3用于填充體積為500 μ 1的RTS，S瘧疾疫苗的單一兒科劑量(2小瓶制劑)的組 分的處方。組分量RTS, S25 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油50 μ g 或 200 μ g注射用水使體積達500 μ L上述制劑按如下方法制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷 酸鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當稀釋50倍時為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液 的混合物中。最后，調節pH到7.0士0.1。這可作為與助劑(例如，填充體積為500 μ 1的MPL和QS21的脂質體制劑)的 單獨的小瓶在一起的小瓶被提供。組分量1，2- 二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ g
MPLQS21NaCl
25 μ g 25 μ g 4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2)注射用水
IOmM 使體積達500 μ L為了給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進行， 然后振搖。然后以常規方式給藥所述劑量。最終液體制劑的ρΗ為約6.6+/-0.1并且注射體積為1ml。實施例4加速穩定性結果指示如下· ρΗ和滲克分子濃度與注射相容；·關于RTS，S含量在4°C或37°C歷時5周后，沒有由非特異性吸附導致的 抗原損失；·關于抗原完整性(參見圖6、7和8)·在加速穩定性之后(37°C 士AOT歷時7天，37°C歷時14天)沒有顯著降解；·沒有惰化(without inerting)，要求抗氧化劑(一硫代甘油)以避免在加速穩定 性(37°C 士AOT歷時7天，37°C歷時14天)之后發生氧化性聚集；ο在37°C 0.01%足以避免聚集；ο對于在37°C +AOT下的穩定性需要0.04% ；·琥珀色玻璃確保抗原避光(在AOT之后觀察到的)；·在加速穩定性(37°C歷時7天)之后RTS，S粒度分布不發生改變；·關于抗原性(參見圖9)；·沒有惰化(withoutinerting)，要求抗氧化劑(一硫代甘油)以避免在加速穩定
性(37°C 士AOT歷時7天)之后發生氧化性聚集和抗原性增加；ο 0.01%允許很穩定的抗原性(80-120% )；ο 0.04%在加速穩定性之后誘導輕微的抗原性降低(-10% )；·在與ASOl (含有MPL和QS21的脂質體助劑制劑)混合時·在混合之后RTS，S完整性和抗原性在25°C保持至少24小時。在有或者沒有一硫代甘油時將這些RTS，S液體制劑在37°C儲存7天、14天， 圖8或甚至5周之后，已進行了 SDS-Page分析。圖6表明·在沒有一硫代甘油的條件下在37°C儲存7天之后發生輕微的RTS，S聚集 (孔3和4)；在暴露于AOT下之前在37°C在白色小瓶中儲存7天后完全聚集和輕微降解 (孔6)，而琥珀色玻璃避免RTS，S發生由光誘導的降解和氧化性聚集(孔5)；·在有一硫代甘油0.01 %的條件下該濃度足夠使RTS，S在37°C下儲存時穩 定7天(孔7)，但是在加速氧化試驗(AOT)累積下該濃度不足夠(孔9)，除了與琥珀色 玻璃組合使用之外(孔8)； 在有一硫代甘油0.04%的條件下該濃度足夠使RTS，S在37°C下儲存時穩 定7天(孔10)，當使用加速氧化試驗累積時也是如此(孔12)；在這種情況下，不要求填充到琥珀色玻璃小瓶中(孔11)；·與ASOl混合對RTS，S特性沒有影響，即使在25°C儲存24小時之后。圖7顯示需要一硫代甘油來避免RTS，S聚集，但是兩個濃度都能夠使RTS，S 在37°C儲存時穩定至少14天(孔11和12，相對于孔10)。圖8顯示在37°C歷時5周之后，在全部制劑中都發生RTS，S聚集和降解；ASOl 在全部制劑中加重聚集。實施例5對于包含0、0.01 %或0.04 %的一硫代甘油的制劑，通過混合 ELISAa CSP-α S,在 TO (士 AOT)或在 37°C儲存 7 天(士 AOT)或 5 周時，測定 RTS，S 抗原性；已經在與ASOl重新構成之前、剛剛重新構成之后和重新構成之后在25°C 24小 時測量RTS，S抗原性。圖9表明·在沒有一硫代甘油的條件下ο暴露于675W下歷時15小時(AOT)促使抗原性增加50-60% (這可以與在 SDS-Page中觀察到的氧化性聚集相關聯)，但是裝入琥珀色玻璃小瓶將這一抗原性增加 限制到 20% ；ο在37°C儲存7天促使抗原性增加 30-40% (這也可以與在SDS-Page中觀察 到的氧化性聚集相關聯)；ο在37°C下7天到5周之間，抗原性降低 30% ；ο在25°C歷時24小時之后，ASOl促使抗原性增加 20 這也可以與在 SDS-Page中觀察到的聚集增加相關聯)； 在有0.01%—硫代甘油的條件下ο —硫代甘油保護RTS，S避免發生由于在37°C儲存7天、AOT誘導的(使琥 珀色玻璃無用)或與ASOl混合所誘導的抗原性增加(但是當在ASOl中在25°C儲存24小 時累積到在37°C儲存7天時，該增加為 20%);ο在37°C下7天和5周之間抗原性降低 20% (—不合格(out ofspec))； 在有0.04%—硫代甘油的條件下ο —硫代甘油保護RTS，S避免發生由AOT誘導的抗原性增加，使褐色玻璃無 用；ο在37°C儲存7天促使抗原性降低 20% ；ο在37°C下7天到5周之間不發生抗原性降低；ο在25°C歷時24小時之后，ASOl促使抗原性增加 30-40%。實施例6為了考察一硫代甘油被固定到RTS，S上對單克隆抗體識別RFl-表位(S)的影 響，在使用或未使用一硫代甘油(MTG)進行穩定的RTS，S液體制劑中，在TO (時間0) 或在37°C儲存7天之后(7天)，通過ELISA抑制試驗測定了 RTS，S對RFl腹水的反應 性(參見表1)。表權利要求
1.瘧疾疫苗用組分，其包括a)免疫原性粒子RTS，S和/或b)來源于一種或多種間日瘧原蟲蟲株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任選的 未融合S抗原的免疫原性粒子，或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括具有至少一個硫醇官能團的穩定劑或其混合物的穩定劑。
2.權利要求1所述的組分，其中所述穩定劑是N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘油，半胱 氨酸，還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉，或其混合物。
3.權利要求2所述的組分，其中所述穩定劑是一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物。
4.權利要求1到3中任一項所述的組分，其中所述組分是液體制劑。
5.權利要求4所述的組分，其中所述液體制劑的pH為約6.5到7.2。
6.權利要求1到3中任一項所述的組分，其中所述組分經過凍干。
7.權利要求1到6中任一項所述的組分，其中所述穩定劑是半胱氨酸并在0.1到1.0% w/w的范圍內存在。
8.權利要求1到7中任一項所述的組分，其中所述穩定劑是一硫代甘油，其在所述制 劑中在0.01到w/w的范圍內存在。
9.權利要求1到8中任一項所述的組分，其中所述組分被儲存在玻璃小瓶中。
10.權利要求9所述的組分，其中所述玻璃小瓶是琥珀色的。
11.權利要求9或10所述的組分，其中所述玻璃小瓶是硅化的。
12.權利要求9或10所述的組分，其中所述玻璃小瓶是非硅化的。
13.權利要求1到12中任一項所述的組分，其中所述組分包含除助劑組分以外的一個 劑量的注射用成分。
14.權利要求13所述的組分，其中所述一個劑量包括25μ g的RTS，S。
15.權利要求14所述的組分，其進一步包含2.25mg的氯化鈉。
16.權利要求14或15所述的組分，其進一步包括125μ g的一硫代甘油。
17.權利要求13到16中任一項所述的組分，其進一步包含250μ L的注射用水。
18.權利要求1到12中任一項所述的組分，其中所述組分包含除助劑組分以外的兩個 劑量的注射用成分。
19.權利要求1到12和18所述的組分，其中所述一個劑量包含50μ g的RTS，S。
20.權利要求19所述的組分，其進一步包含4.5mg的氯化鈉。
21.權利要求19或20所述的組分，其進一步包含250μ g的一硫代甘油。
22.權利要求1到12或19到21中任一項所述的組分，其進一步包含500μ L的注射用水。
23.權利要求1到23中任一項所述的組分，其進一步包含其它的瘧疾抗原。
24.權利要求23所述的組分，其中所述其它的瘧疾抗原源自于惡性瘧原蟲和/或間日 瘧原蟲，其中所述抗原選自DBP諸如Pv RII，即DBP的受體結合結構域，PvTRAP， PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, Pv ΑΜΑ, RBP 或其片段，PffiMP-1，Pfsl6 抗原，MSP-1，MSP-3，LSA-I, LSA-3，AMA-1 和 TRAP, EBA, GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白，Ρβ32，STARP, SALSA, PfEXPl,Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲中的類似物。
25.瘧疾用疫苗，其包含權利要求1到23中任一項所述的組分和選自以下的助劑a.包含QS21和3D-MPL的水包油型制劑，或b.包含QS21和3D-MPL的脂質體制劑。
26.用于制備權利要求1到24中任一項所述的組分的方法，包括在適合的寄主中表達 編碼所述蛋白的DNA序列，回收產物并將所回收的產物與穩定劑混合。
27.權利要求1到24中任一項所述的瘧疾疫苗用組分或權利要求25所述的疫苗，其 用于預防或治療瘧疾。
28.權利要求1到24中任一項所述的組分或權利要求25所述的疫苗在制備用于預防 或治療瘧疾的藥物中的應用。
29.通過給予有效量的權利要求25所述的疫苗來治療易感瘧原蟲感染的患者的方法。
全文摘要
本發明公開了瘧疾疫苗用組分，其包括a)免疫原性粒子RTS，S和/或b)來源于一種或多種間日瘧原蟲蟲株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括具有至少一個硫醇官能團的穩定劑或其混合物的穩定劑。本發明還公開了制備所述組分的方法，所述組分的藥物用途，特別是在預防瘧疾感染中的應用，包含所述組分的組合物/疫苗，以及所述組合物/疫苗的應用，特別是在治療中的應用。
文檔編號A61K39/015GK102026657SQ200880127241
公開日2011年4月20日 申請日期2008年12月18日 優先權日2007年12月21日
發明者D·I·勒穆瓦, F·E·J·F·沃特斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司