用于改進對表達cd138的腫瘤細胞的靶向的方法和試劑的制作方法

專利名稱：用于改進對表達cd138的腫瘤細胞的靶向的方法和試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抵抗抗原CD138的免疫綴合物和包含所述免疫綴合物的組合物在減 少基質細胞粘著至表達⑶138的靶細胞上的應用，從而更有效地治療涉及表達⑶138的細 胞的疾病狀態。
背景技術：
作為細胞外基質的受體的⑶138在多發性骨髓瘤(MM)細胞上過表達，并且已經表 現出影響MM細胞發育和/或增殖。舉例而言，CD138還在卵巢癌、腎癌、膽囊癌、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌、結腸癌細胞和霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL) 等的細胞上表達。在此用于說明本發明，特別是提供關于實施的額外詳細說明的出版物和包括專利 等的其它材料，均通過參考并入。方便起見，所述出版物在下文中按照作者和日期引用，和 /或按照所附目錄中的作者依照字母順序列出。Tassone等(2004)已經報道了鼠IgGl抗體B-B4對在MM細胞表面上表達的 ⑶138抗原的良好結合。Tassone還報道了包含類美登素(maytansinoid)DMl作為效應分 子的免疫綴合物B-B4-DM1對多發性骨髓瘤細胞的高細胞毒性活性(還參見美國專利公開 20070183971)。Tassone還指出其B-B4綴合物即使在骨髓微環境中也有效，所述骨髓微環境誘導 多發性骨髓瘤(MM)細胞對通常施用至MM患者的許多藥物(包括例如地塞米松)產生抗性。 Tassone的免疫綴合物能夠有效地破壞骨髓基質環境中的MM腫瘤細胞。盡管Tassone等已經為提供MM的有效治療和可以在此類治療中使用的物質的組 成作為貢獻，但本領域仍然存在許多需要。仍然存在對改進使用基于B-B4的免疫綴合物的治療的需要。還存在對使用顯示 一種或多種有利性質的基于B-B4的免疫綴合物的有效治療的需要。免疫綴合物的性質優 選包括改進的抗原結合、改進的腫瘤細胞(特別是表達CD138的腫瘤細胞以及其附屬細胞) 殺傷或對靶標更均勻的結合，但特別是更有效地抗擊與表達CD138的細胞有關的疾病狀態 的能力。

發明內容
本發明涉及一種用于減少有需要的受試對象的腫瘤細胞中基質細胞粘著至表達 CD138的腫瘤細胞的方法，所述方法包括
以對于減少基質細胞粘著至表達CD138的腫瘤細胞而言有效的量對所述腫瘤細 胞施用靶向所述表達CD138的腫瘤細胞(特別是含有如本文所公開的可切割連接子和效應 子的表達CD138的腫瘤細胞)的免疫綴合物，以及可選地以抑制、延緩和/或預防腫瘤細胞 生長的量對所述腫瘤細胞施用其它細胞毒性劑。所述粘著可以減少至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約 70%、約80%以上，和/或可以導致對粘著介導的藥物抗性的緩解，所述抗性包括粘著介導 的抵抗其它細胞毒性劑(其不是上述免疫綴合物中的一種)的藥物抗性，并且其中以抑制、 延緩和/或預防腫瘤細胞生長的量施用所述其它細胞毒性劑。可以依次地施用所述免疫綴 合物和該細胞毒性劑，其中所述細胞毒性劑可以在施用所述免疫綴合物之后施用，或可以 同時施用。本發明的免疫綴合物特別地包含(a)基因工程靶向抗體，和(b)效應分子，其中所述免疫綴合物均勻地靶向表達⑶138的靶細胞。本發明的基因工程靶向抗體可以⑴基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區(ABR)，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體。
所述ABR可以分別包含(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸殘基99 111的重鏈可變區⑶R3禾口(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基89 97的輕鏈可變區CDR3。所述ABR還可以分別包含(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸殘基31 35和51 68的重鏈可變區⑶Rl和 CDR2，和/或(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基24 34和50 56的輕鏈可變區⑶Rl和 CDR2。所述另外的抗體區可以分別包含(a) SEQ ID NO 1的氨基酸殘基123 448，和/或(b) SEQ ID NO 2 的氨基酸殘基 108 214，以及其突變體，所述突變體 (i)維持或降低所述基因工程靶向抗體的抗體依賴性細胞毒性和/或補體依賴性 細胞毒性，和/或(ii)穩定所述基因工程靶向抗體。效應分子可以經由連接子連接至所述基因工程靶向抗體。所述連接子可以包含二 硫鍵。效應分子(例如DM4)可以在靶向抗體和該效應分子之間提供空間位阻。效應分子 可以為至少一種類美登素(maytansinoid)(例如DM1、DM3或DM4)、紫杉烷或CC1065，或其 類似物。所述免疫綴合物可以結合CD138，靶向變異(targeting variation)小于150%、 140%、130%、120%、110%、100%、90%、80%、70%、60%或 50%。
本發明還涉及一種免疫綴合物，所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。所述免疫球蛋白 重鏈或其一部分的恒定區可以為IgG4同型的恒定區。本發明還涉及一種治療受試對象中的MM的方法，所述方法包括提供一種或多種本文指定的免疫綴合物，和以對治療多發性骨髓瘤而言有效的量對所述受試對象施用所述免疫綴合物。所述免疫綴合物的靶向劑可以包含與SEQ ID NO :2具有至少約70%序列同一性 的輕鏈序列。所述免疫綴合物的靶向劑還可以包含與SEQ IDNO :1具有至少約70%序列同 一性的重鏈序列。本發明還涉及一種用于免疫綴合物介導的藥物輸送的方法，所述方法包括提供一種或多種本文指定的免疫綴合物，和以治療有效量施用所述免疫綴合物，其中所述IgG4同型緩解ADCC、補體依賴性細 胞毒性和/或Fc-介導的肝FcR的靶向。本發明還涉及一種抑制、延緩和/或預防細胞培養物中的腫瘤細胞生長的方法， 所述方法包括以抑制、延緩和/或預防腫瘤細胞生長有效的量對所述細胞培養物施用一種或多 種本文指定的一種或多種免疫綴合物。所述有效的量可以誘導表達CD138的腫瘤細胞和可 選的不表達CD138的輔助細胞(特別是腫瘤基質細胞)中的細胞死亡或連續細胞周期的停 滯。所述細胞培養物中的細胞可以獲自癌癥患者，并且在施用所述有效量的所述免疫綴合 物后，可以將所述細胞培養物的細胞再植入所述癌癥患者。本發明還涉及一種用于在有需要的患者中抑制、延緩和/或預防包含⑶138腫瘤 細胞的腫瘤生長和/或此類腫瘤的腫瘤細胞的擴散的方法，所述方法包括以抑制或降低所述腫瘤生長和/或所述腫瘤細胞擴散的量，對所述患者施用至少 一種或多種上述免疫綴合物，其中所述免疫綴合物抑制、延緩或預防所述腫瘤細胞的生長和/或擴散。所述免疫綴合物的效應分子可以為毒素、細胞毒性酶、低分子量細胞毒性藥物、成 孔劑、生物響應修飾劑、前藥激活酶、抗體、細胞因子或放射性核素。可以以5mg/m2 約300mg/m2的單次劑量可選地以每小時、每天、每周或其組合施 用本發明的免疫綴合物。包括每小時、每天和每周方案等的多劑量方案為本發明的一部分，并且特別包括 間隔為5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、 15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3
天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周的施用。本發明還涉及一種用于在有需要的患者中抑制、延緩和/或預防腫瘤的生長和/ 或惡性腫瘤細胞的擴散的方法，所述方法包括(a)以對于降低腫瘤負荷而言有效的量對所述患者施用一種或多種細胞毒性劑和 /或放射；和
(b)以對于抑制、延緩或預防腫瘤的生長和/或腫瘤細胞的擴散而言有效的量，對 所述患者施用至少一種本文指定的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物抑制、延緩或預防包含表達CD138的細胞的腫瘤細胞的生長 和/或擴散。特別地，本發明任何實施方式的細胞毒性劑可以為美法侖(mephalan)、長春新 堿(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、環磷酰胺、足 葉乙甙(etoposide)、阿糖胞苷(cytarabine)、順鉬、沙利度胺(thalidomide)、潑尼松 (prednisone)、沙利度胺、硼替佐米(bortezomib)、來那度胺(Ienalidomide)、索拉非尼 (sorafenib)、羅明待辛(romicbpsin)或其組合，或可以為基于抗體的細胞毒性劑。本發明還涉及一種用于治療患有會從抑制骨髓瘤細胞存活受益的疾病的受試對 象的方法，所述方法包括(a)提供至少一種本文指定的任何免疫綴合物，和(b)對所述受試對象施用所述免疫綴合物，從而選擇性地降低所述受試對象的骨 髓瘤細胞的存活或生長。本發明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含用于抑制、延緩和/或預防 腫瘤的生長和/或腫瘤細胞的擴散的本文指定的任何免疫綴合物，以及一種或多種藥物可 接受賦形劑。所述藥物組合物可以包含本文所指定的細胞毒性劑。本發明還涉及一種試劑盒，所述試劑盒在分開的容器中包含組合使用以抑制、延 緩和/或預防腫瘤的生長和/或腫瘤細胞的擴散的藥物組合物，其中一個容器包含有效量 的上述藥物組合物，和其中另一容器包含含有有效量的用于抑制、延緩和/或預防腫瘤的 生長和/或腫瘤細胞的擴散的試劑(優選細胞毒性劑)的第二藥物組合物，以及一種或多 種藥物可接受賦形劑。本發明還涉及一種用于在有需要的受試對象中抑制、延緩和/或預防包含CD138 腫瘤細胞的腫瘤生長和/或此類腫瘤的腫瘤細胞的擴散的方法，所述方法包括(a)提供免疫綴合物，所述免疫綴合物包含經由可切割連接子連接至效應分子的抗⑶138的基因工程靶向抗體，其中所述效 應分子是空間位阻性的，和(b)以抑制、延緩和/或預防所述腫瘤的生長和/或所述腫瘤細胞的擴散的量，對 所述受試對象施用所述(a)的免疫綴合物，其中所述(a)的免疫綴合物提供的腫瘤生長抑 制活性比其無位阻對應物(counterpart)的活性高出約10%、約20%、約30%、約40%以上。包含非可切割連接子的無位阻對應物的腫瘤生長抑制活性可以高于其包含可切 割連接子的無位阻對應物的腫瘤生長抑制活性，例如可以高出至少約5%、至少約10%、至 多約15%。所述抗CD138的基因工程靶向抗體可以基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合 區構成，或可以包含非人類抗體的抗CD138抗原結合區和另外的抗體區，其中所述另外的 抗體區的至少一部分出自人類抗體。所述可切割連接子可以包含二硫鍵。所述效應分子可以為DM4。所述免疫綴合物可以是藥物組合物的一部分，并且可以以至少一次量為約5mg/m2 約300mg/m2的劑量施用 至所述受試對象。本發明提供一種用作藥物的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138。本發明提供另一種用作藥物的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。特別地，在本發明的一個方面，將上述段落的免疫綴合物用于治療多發性骨髓瘤。 特別地，所述免疫綴合物能夠用于制造多發性骨髓瘤治療用藥物。本發明還提供一種免疫綴合物，所述免疫綴合物用于將免疫綴合物介導的藥物 輸送至患者，特別是用于緩解ADCC、補體依賴性細胞毒性和/或Fc-介導的肝FcR靶向， 其中所述免疫綴合物包含靶向CD138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包 含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ IDNO 1具有至少70%序列同一性，并且所述免疫球蛋白重鏈或其一部分的恒定區為IgG4 同型的恒定區。本發明還提供用于治療患者中癌癥的腫瘤細胞，其中所述腫瘤細胞已經在細胞培 養中用免疫綴合物處理，所述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138。本發明還提供用于治療患者中癌癥的腫瘤細胞，其中所述腫瘤細胞已經在細胞培 養中用免疫綴合物處理，所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。本發明提供一種用于在患者中抑制、延緩和/或預防包含⑶138腫瘤細胞的腫瘤 生長和/或此類腫瘤的腫瘤細胞的擴散的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和
另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138。作為另一種選擇，本發明提供在患者中抑制、延緩和/或預防包含⑶138腫瘤細胞 的腫瘤生長和/或此類腫瘤的腫瘤細胞的擴散的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。此外，本發明提供一種藥物，所述藥物包含免疫綴合物和一種或多種癌癥藥物作 為組合制劑，以用于同時、分開或依次地用于治療包含表達CD138的細胞的腫瘤細胞，其中 所述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138，并且其中所述一種或多種癌癥藥物能夠降低腫瘤負荷。作為另一種選擇，本發明提供一種藥物，所述藥物包含免疫綴合物和一種或多種 癌癥藥物作為組合制劑，以用于同時、分開或依次地用于治療包含表達CD138的細胞的腫 瘤細胞，其中所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性，并且其中所述一種或多種癌癥藥物能夠降低腫瘤負荷。在上兩段應用的另一方面，將所述組合制劑施用至已經采用放射治療的患者。在一個替代性方面，本發明提供免疫綴合物在制備用于治療包含表達CD138的細 胞的患者中的腫瘤細胞的藥物中的應用，所述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138。以及其中將所述藥物施用至已用放射治療的患者，以降低腫瘤負荷。此外，本發明提供免疫綴合物在制備用于治療包含表達CD138的細胞的患者中的 腫瘤細胞的藥物中的應用，所述免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性，以及其中將所述藥物施用至已用放射治療的患者，以降低腫瘤負荷。在上述段落中，所述藥物能夠抑制、延緩和/或預防患者中腫瘤的生長和/或惡性 腫瘤細胞的擴散。此外，本發明還提供一種用于抑制個體中骨髓瘤細胞存活的免疫綴合物，其中所 述免疫綴合物包含(a)基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體(i)基本上由非人類抗體的抗CD138抗原結合區構成，或(ii)包含抗CD138抗原結合區，其中所述抗原結合區出自非人類抗體，和另外的抗體區，其中所述另外的抗體區的至少一部分出自人類抗體，以及(b)效應分子其中所述免疫綴合物均勻地結合至⑶138。此外，本發明提供一種用于抑制個體中骨髓瘤細胞存活的免疫綴合物，其中所述 免疫綴合物包含靶向⑶138的靶向劑，所述靶向劑包含分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%序列同一性。特別地，在上兩段中所述免疫綴合物能夠選擇性地降低個體中所述骨髓瘤細胞的 存活或生長。此外，本發明提供一種免疫綴合物，所述免疫綴合物用于在個體中抑制、延緩和/ 或預防包含CD138腫瘤細胞的腫瘤的生長和/或此類腫瘤的腫瘤細胞的擴散，其中所述免 疫綴合物包含經由可切割連接子連接至效應分子的抗⑶138基因工程靶向抗體，其中所述 效應分子為空間位阻性的。特別地，在上段中，所述免疫綴合物能夠提供的抑制腫瘤生長的活性比其無位阻 對應物活性高出約10 %、約20 %、約30 %、約40 %以上。本發明還提供一種CD138靶向劑，所述CD138靶向劑用于減少受試對象的腫瘤細 胞中的基質細胞粘著至表達CD138的腫瘤細胞的方法。本發明還提供一種藥物，所述藥物包含CD138靶向劑和其它試劑(例如靶向免疫 綴合物或細胞生長抑制劑)作為組合制劑以用于同時(共施用)、分開或依次地用于減少受 試對象的腫瘤細胞中的基質細胞粘著至表達CD138的腫瘤細胞的方法。特別地，在上段中，所述組合制劑能夠抑制、延緩和/或預防受試對象中腫瘤細胞 的生長。


圖1提供連接有效應分子的nBT062的示意圖。圖2為BT062的化學示意圖。圖3顯示安絲菌素P-3向美登醇(maytansinol)的轉換(簡化起見省略立體化 學)。圖4顯示DM4的代表性合成圖。
圖5為抗體綴合(nBT062至DM4)的示意圖。圖 6 顯示對 nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DMl、nBT062-SMCC-DMl 和 nBT062 抗體 與0PM-2細胞的結合的分析。將不同濃度的ΠΒΤ062和綴合物給予所述細胞，并通過FACS 分析測定平均熒光。圖 7 (A)-(D)描述 nBT062-DMx 綴合物對 M0LP-8(CD138+)和 BJAB (CD138-)細胞的 體外細胞毒性。在平底板中培養所述細胞，并且與指定濃度的免疫綴合物一起溫育5天。加 入WST試劑，過3個小時估算細胞活力。在(D)中，在存在或不存在阻斷抗體(ΙμΜ ηΒΤ062) 時分析nBT062-SPDB-DM4的細胞毒性活性。圖8顯示用㈧PBS、⑶ΠΒΤ062抗體、(C)游離DM4或⑶非靶向綴合物 huC242-DM4處理的個體小鼠，在用M0LP-8腫瘤細胞接種后隨時間(天)的腫瘤體積。圖 9 顯示用(A)PBS, (B) nBT062-SPDB_DM4、(C) B-B4-SPP-DM1 或(D) nBT062-SPP-DMl處理的個體小鼠在用M0LP-8腫瘤細胞接種后隨時間(天)推移的腫瘤體積。圖10描述CB. 17SCID小鼠中M0LP-8人類多發性骨髓瘤異種移植物在接種后隨時 間(天)推移的平均腫瘤體積(+/-SD)。圖IlA和B顯示在SCID小鼠的大體積(bulky)M0LP_8腫瘤模型中，nBT062_DMx針 對CD138+M0LP-8腫瘤細胞的抗腫瘤活性。對于各組，腫瘤體積以平均值(+/-SD)給出。圖12為反映在人類骨髓的環境中的SCIDhu/INA-6模型中含有DMx綴合物的 ΠΒΤ062對多發性骨髓瘤細胞的抗腫瘤效力的圖。將由多發性骨髓瘤細胞產生的可溶性 人類IL-6受體(shuIL-6R)用作腫瘤負荷的指示物。三角形nBT062-SPP_DMl，正方形 nBT062-SPDB-DM4 ；菱形運載劑對照。圖13顯示體外nBT062-SPDB-DM4介導的旁觀者殺傷(bystander killing)。將 CD138陽性0PM2細胞和CD138陰性Namawla細胞與不同濃度的nBT062-SPDB_DM4 —起培
養，并測定細胞活力。OD45tl值代表細胞活力的測定值。圖14在(A)中顯示通過不同MM細胞的⑶138表達，在(B)中顯示D0X40細胞(上 圖)和OPMl細胞(下圖)的顯微分析。⑶138顯示在右側，核酸顯示在左側。圖 15 (A)描述 40 小時、80 小時和 120 小時后 nBT062-SMCC-DMl、nBT062-SPDB-DM4 和nBT062-SPP-DMl對MM細胞的細胞毒性。圖15(B)描述從三個不同的患者分離的MM 細胞用nBT062-SPDB-DM4處理2天后的細胞活力。圖15(C)顯示在確定細胞活力前與 nBT062-SPDB-DM4 一起培養72h的源自3個健康受試對象的外周血單核細胞(PBMC)。圖16(A)顯示其中OPMl細胞已經用免疫綴合物處理0h、12h或24h的細胞周期 分析，并通過PI染色分析細胞周期曲線。圖16(B)中，在存在或不存在免疫綴合物時培養 OPMl細胞24h、48h或72h。通過Apo 2. 7抗體染色和流式細胞儀分析估算凋亡細胞百分比。 圖16 (C)中，在存在885μ g/ml nBT062-SPDB_DM4時培養OPMl細胞指定的時間(左圖)，或 用不同濃度的免疫綴合物(中圖)培養OPMl細胞。泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制劑 zVAD-fmk阻斷的nBT062-SPDB-DM4誘導半胱天冬酶_8、_9和-3以及聚(ADP-核糖)聚合 酶(PARP)在OPMl細胞中的切割(右圖)。圖17在(A) (C)中顯示IL-6、IGF-I和BMSC對匪細胞生長和匪細胞對免疫 綴合物的敏感性的影響。圖17(D)顯示使用地塞米松代替免疫綴合物的實驗。圖17(E)顯示在存在或不存在免疫綴合物時，采用腫瘤細胞和BMSC共培養物的細胞粘著實驗結果。圖18㈧描述對通過OPMlepp細胞的GFP表達的分析。圖18⑶顯示在用 5X IO6OPMIgfp 細胞注射的 SCID 組中，nBT062-SPDB_DM4、nBT062-SPP-DMl 或緩沖液對 照對腫瘤尺寸的影響。圖18(C)中與僅用運載劑處理的對照組(實線；正常鹽水，η = 5)相比，nBT062-SPDB-DM4顯著地增加存活(P < 0. 0023，虛線，η = 5)。圖18(D)證明 nBT062-SPDB-DM4誘導體內凋亡。
具體實施例方式本發明涉及一種包含CD138靶向劑的免疫綴合物，和所述免疫綴合物的效應分子 向靶點的輸送，以及所述效應分子在靶細胞、組織和器官中、其上或其附近的位點特異性釋 放。可以通過在靶點處從免疫綴合物的靶向劑部分切割/分離而激活所述效應分子。本發 明特別涉及這些免疫綴合物在抗擊體內腫瘤生長中的應用，和這些免疫綴合物克服或減少 在骨髓微環境中遭遇的保護性機制的能力的應用。可以對需要治療性治療的受試對象或分離自需要治療性治療的此類受試對象的 細胞施用本發明的免疫綴合物。可以通過在靶細胞、組織或器官中、其上或其附近切割/分 離而從所述免疫綴合物釋放效應分子。在一實例中，對患有癌癥的患者施用所述免疫綴合物，所述免疫綴合物包含靶向 表達⑶138的細胞的抗體ΠΒΤ062，以及至少一種作為效應分子的高細胞毒性藥物或毒素。 在該實例中，對患者靜脈內施用治療有效量的免疫綴合物，以使所述免疫綴合物在癌細胞 中富集。然后通過自然手段使所述效應分子從所述抗體釋放。在切割之后或期間，可以通過 烷基化穩定所述效應分子，并且使所述效應分子擴散到周圍的不表達CD138的輔助細胞， 例如基質細胞。在第二實例中，對患有癌癥的患者施用所述免疫綴合物，所述免疫綴合物包含靶 向表達CD138的細胞的抗體ΠΒΤ062，和作為效應分子的至少一種高細胞毒性藥物或毒素， 以及另外的細胞毒性劑。在該實例中，依次施用治療有效量的免疫綴合物和細胞毒性劑。首 先對患者靜脈內施用所述免疫綴合物，以使所述免疫綴合物在骨髓微環境中的癌細胞中富 集。所述免疫綴合物基本上克服了細胞粘著介導的藥物抗性(CAM-DR)，并且破壞了骨髓微 環境中相當大部分的表達CD138的腫瘤細胞。特別地，所述效應分子通過天然手段從所述 抗體釋放并且破壞腫瘤細胞。所述免疫綴合物至少部分地避免腫瘤細胞粘著至基質細胞， 某些所述基質細胞可能被擴散的效應分子破壞。12小時的時間間隔后，施用所述細胞毒性 劑。細胞毒性劑(其活性通常被CAM-DR至少降低)能夠作用于不與基質細胞相粘連的腫 瘤細胞上并且破壞逃過免疫綴合物作用的表達CD138的腫瘤細胞。CD138 或粘結蛋白聚糖-l(syndecan-l)(也稱 SYNDl ；SYNDECAN ；SDC ；SCDl ；CD138 抗原，SwissProt登錄號P18827人類)為一種膜糖蛋白，最初記載其存在于源自上皮的細 胞上，隨后發現于造血細胞上(Sanderson，1989)。⑶138具有長的細胞外結構域，該細胞外 結構域與可溶性分子(例如生長因子EGF、FGF、HGF)和不溶性分子(例如細胞外基質成分 膠原蛋白和纖連蛋白)通過硫酸乙酰肝素鏈結合(Langford，1998 ；Yang，2007)，并且充當 細胞外基質的受體。CD138還通過由粘附細胞表達的肝素結合分子介導細胞與細胞的粘著。 已經顯示⑶138起骨髓瘤細胞的生長因子的共受體的作用(Bisping，2006)。血漿細胞分化的研究表明，CD138也必須被視為一種分化抗原(Bataille，2006)。在惡性造血中，⑶138在大多數的以下細胞上高度表達MM細胞、卵巢癌、腎癌、膽 囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌細胞和霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋 巴性白血病(CLL) (Horvathova，1995)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML) (Seftalioglu, 2003 (a) ；Seftalioglu, 2003 (b))、實體組織肉瘤、結腸癌以及表達 CD138 的 其它惡性血液病和實體腫瘤的細胞(Carbone等，1999 ；Sebestyen等，1999 ；Han等，2004 ； Charnaux 等，2004 ；0，Connell 等，2004 ；Oroszh 和 Kopper，2001)。已經對⑶138表達顯示為陽性的其它癌癥為多種卵巢腺癌、膀胱移行細胞癌、腎 透明細胞癌、肺鱗狀細胞癌、乳腺癌和子宮癌(參見，例如，Davies等，2004 ；Barbareschi 等，2003 ；Mennerich 等，2004 ； Anttonen 等，2001 ；Wijdenes, 2002)。在正常人類造血腔中，CD138表達局限于血漿細胞(WijdeneS，1996 ;Chilosi， 1999)，并且⑶138不在外周血淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和紅細胞上表達。特別地，⑶34+ 干細胞和祖細胞(progenitor cell)不表達⑶138，并且抗⑶138mAb不影響造血干細胞培 養物中集落形成單位的數量(Wijdenes，1996)。在非造血腔中，⑶138主要在肺、肝、皮膚、 腎和腸內的單層上皮和復層上皮上表達。在內皮細胞上僅看到弱的染色(Bernfield，1992 ； Vooijs，1996)。據報道，CD138以多態性形式存在于人類淋巴瘤細胞中(Gattei，1999)。已經報道單克隆抗體 B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1. BB. 210、2Q1484、 5卩7、104-9、281-2，特別是8-84對0)138有特異性。其中B-B4、1D4和MI15既識別CD138 的完整分子也識別其核心蛋白，并且據顯示識別相同或密切相關的表位(Gattei，1999)。此 前的研究報道，B-B4不識別可溶性CD138，但僅識別膜結合形式的CD138 (Wi jdenes，2002)。B-B4，一種鼠IgGlmAb，與人類粘結蛋白聚糖-1(⑶138)上的核心蛋白的90 95 位殘基之間的線性表位結合(Wi jdenes，1996 ；Dore, 1998)。與CD138的表達模式一致，據顯 示B-B4與血漿細胞系RPMI8226強烈地反應，但不與內皮細胞反應。同樣與⑶138的表達模 式一致，B-B4還與上皮細胞系A431(源自角質形成細胞源)和H印G2(源自肝細胞)反應。 免疫毒素B-B4-皂草素對血漿細胞系RPMI8226也是高度毒性的，事實上比游離皂草素的毒 性明顯更強。然而，從兩個受測的上皮細胞系看出，B-B4-皂草素僅對細胞系A431顯示毒 性，但在集落形成測試中皂草素對A431細胞的生長暈未顯示出抑制作用(Vooi js，1996)。 其它研究者報道了 MM相關抗原抗腫瘤缺少特異性(Couturier，1999)。在本發明的背景下，抗體/免疫綴合物“基本上由特定成分組成”是指抗體/免疫 綴合物由指定的成分和任何不會在實質上影響所述抗體的基本特性的其它材料或成分組 成。本發明使用術語“腫瘤細胞”來包括癌細胞以及可能形成或可能不形成實體腫瘤 的部分的癌前細胞。本發明的“靶向劑”能夠與由靶細胞表達的分子相連，并且包括肽和非肽類。特別 地，本發明的靶向劑包括靶向抗體和非免疫球蛋白靶向分子，所述非免疫球蛋白靶向分子 可以基于包括但不限于AFFILIN 分子、ANTICALINS⑧和AFFIB0DIES 的非免疫球蛋白蛋 白。非免疫球蛋白靶向分子還包括非肽靶向分子(例如靶向DNA和RNA寡核苷酸(適體))， 以及生理學配體，特別是所關注的抗原的配體，例如CD138。本發明的“靶向抗體”為天然抗體或基于天然抗體，或通過合成或通過基因工程而產生，并且與目的細胞(靶細胞)上的抗原結合。本發明的靶向抗體包括單克隆抗體、多克 隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、或抗體片段。所述靶向抗體可以被基因工程 化以便例如提高其與靶細胞的親和性(Ross，2003)，或減少其免疫原性。所述靶向抗體可以 與包括效應分子的脂質體制劑相連(Carter，2003)。抗體片段包含完整抗體的一部分，優選 完整抗體的抗原結合區或可變區。本發明的抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和 Fv片段以及雙鏈抗體(diabody)；結構域抗體(domain antibody) (dAb) (Ward，1989 ；美國 專利6，005, 079)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。在單鏈可 變片段抗體(scFv)中，重鏈和輕鏈(VH和VL)可以通過短的氨基酸連接子連接，所述連接 子具有例如(Gly4Ser)n的序列并且具有足夠的柔性而使兩個結構域能裝配成功能性抗原 結合袋。添加各種信號序列可以使得靶向抗體具有更精確的靶向性。添加輕鏈恒定區(CL) 可以允許經由二硫鍵的二聚化，從而提供更高的穩定性和親合力。如果可獲得針對所關注 的靶標的mAb，可以通過RT-PCR獲得用于構建scFv的可變區，所述RT-PCR從提取自親本雜 交瘤的mRNA克隆出該可變區。作為另一種選擇，所述scFv可以通過噬菌體展示技術從頭 產生(Smith，2001)。如本文所用，當參照靶向抗體使用時，術語“功能片段”是指能夠特異 性結合抗原的靶向抗體的一部分，所述抗原與所參照的抗體特異性地結合。本發明的雙特 異性抗體可以例如具有對靶組織有反應性的至少一條臂，以及對連接子部分有反應性的一 條臂(美國專利公開20020006379)。本發明的雙特異性抗體還可以與靶細胞上的超過一種 抗原結合(Carter，2003)。本發明的抗體可以通過例如引入半胱氨酸殘基來引入巰基來修 飾(01afsen,2004)。根據本發明，所述靶向抗體可以源自任何來源，并且可以為但不限于駱駝抗體、小 鼠抗體、嵌合人類/小鼠抗體或嵌合人類/猴抗體，特別是例如ΠΒΤ062等的嵌合人類/小 鼠抗體。人源化抗體為含有源自人類抗體和源自非人類抗體的序列的抗體，其也在本 發明范圍內。用于將抗體人源化的合適方法包括CDR移植(互補決定區移植)(EP 0 239 400 ；WO 91/09967 ；美國專利 5，530，101 ；和 5，585，089)、表面修飾(veneering) 或表面重塑(resurfacing) (EP 0 592 106 ；EP 0 519 596 ；Padlan, 199 ；Studnicka 等，1994 ；Roguska 等，1994)、鏈改組(chain shuffling)(美國專利 5，565，332)以及 De Immuno sat ion (Bi ο vat ion，LTD)。在CDR移植中，將來自例如mAb B-B4等的小鼠互補 決定區(CDR)移植至人類可變框架，然后將該人類可變框架與人類恒定區連接，從而形成 人類B-B4抗體(hB-B4)。現在已經將幾種通過⑶R-移植人源化的抗體用于臨床，包括 MYL0TARG (Sievers 等，2001)和 HECEPTIN(Pegram 等，1998)。表面重塑技術使用分子模塑、統計分析和誘變的組合來將抗體可變區的非⑶R 表面改變成與靶標宿主的已知抗體表面類似。在例如美國專利5，639，641中公開了用于 將抗體表面重塑的策略和方法，以及用于降低不同宿主內抗體免疫原性的其它方法。可 以通過包括噬菌體展示方法的本領域已知的各種方法來制備人類抗體。還參見美國專利 4，444，887,4, 716，111,5, 545，806 和 5，814，318 ；以及國際專利申請公開 WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 WO 91/10741。經受任何非天然修飾的靶向抗體，例如，嵌合人類/小鼠抗體或嵌合人類/猴抗 體、人源化抗體或經基因工程化以便例如提高與靶細胞的親和性或減少其免疫原性的抗
13體，以及抗體片段、特別是已經經受任何非天然修飾的此類靶向抗體的功能片段、雙鏈抗 體；結構域抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和多特異性抗體在本文也稱為基因工程靶向抗 體。嵌合抗體，保留非人類抗體(例如它們所基于的小鼠抗體)的抗體結合區(ABR或 Fab區)，同時可以由例如人類抗體提供任何恒定區。通常，抗體恒定區的嵌合和/或交換 不會影響抗體的親和力，這是因為有助于抗原結合的抗體區不受交換的影響。在本發明的 優選實施方式中，本發明的基因工程抗體，特別是嵌合抗體可以比其所基于的對應非人類 抗體具有更高的結合親和力(通過Kd值表達)。具體地，ΠΒΤ062抗體和基于該抗體的抗體 可以比小鼠B-B4具有更高的抗體親和性。在本發明的另一實施方式中，包含這些基因工程 抗體/嵌合抗體的免疫綴合物也顯示出這種更高的抗體親和性。在某些實施方式中這些免 疫綴合物也可以顯示其它有利性質，例如比其含有B-B4的對應物使腫瘤負荷降低得更多。 在優選實施方式中，基因工程化、特別是嵌合的靶向抗體顯示出特征為解離常數K11(IiM)小 于1. 6、小于1. 5或為1. 4或約小于1. 4的結合親和力，而其小鼠對應物的特征在于解離常 數K11(IiM)為約1.6或大于1.6。優選包含靶向抗體等靶向劑的免疫綴合物的特征在于，解 離常數KD(nM)小于2. 6、小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于 1.9或為約1.9，而包含小鼠對應物抗體的免疫綴合物的特征可以在于解離常數K11(IiM)為 約2. 6或大于2. 6 (比較表3、材料和方法)。也可以使用完全人類抗體。可以通過噬菌體展示方法篩選這些抗體，其中⑶138 或其抗原性決定子用于選擇性地與表達例如B-B4可變區的噬菌體結合(參見，Krebs, 2001)。有利的是，該方法可以與親和力成熟技術聯合，來提高抗體的親和力。本文涉及的 所有抗體均為分離的抗體。在一個實施方式中，未綴合形式的靶向抗體被中等或較弱地內化。在37°C下溫育 3小時后，中等內化構成約30% 約75%的抗體內化，弱內化構成約0. 01% 最大約30% 內化。在另一優選實施方式中，所述靶向抗體結合CD138，例如抗體B-B4、BC/B-B4、B-B2、 DL-101、1D4、MI15、1. BB. 210、2Q1484、5F7、104_9、281_2，特別是 B-B4。通過將 SP02/0 骨髓 瘤細胞與Balb/c小鼠的脾細胞雜交產生的雜交瘤細胞，已經于2007年12月11日保藏在 DSMZ—Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg l，D-38124Braunschweig。這些表達B-B4的雜交瘤細胞的識別號為DSM ACC2874。在 另一實施方式中，所述靶向抗體基本上不結合非細胞表面表達的CD138。在本發明的背景 下，當特異性抗體的名稱與術語“靶向抗體”結合(例如“ΠΒΤ062靶向抗體”)時，這是指該 靶向抗體具有抗體ΠΒΤ062的結合特異性。如果說靶向抗體“基于”一種特異性抗體，這是 指該靶向抗體具有該抗體的結合特異性，但可以采用與上述對靶向抗體的描述一致的任何 形式。在本發明的背景下，當特異性抗原的名稱與術語“靶向抗體”結合(例如“CD138靶 向抗體”)時，這是指該靶向抗體具有對CD138的結合特異性。在本發明的背景下，如果例 如描述靶向抗體“選擇性地”進行某事，例如“選擇性地靶向細胞表面表達的CD138”，或對 某事是“選擇性的”，這是指在所提供的實例的情況下，與任何其它抗原相比，對細胞表面表 達的⑶138存在顯著的選擇性(即，對⑶138陽性細胞比對于⑶138陰性細胞更高的親和 性)。由于該選擇性，顯著減少了甚至避免給定環境中不利的副作用。本發明的“非免疫球蛋白靶向分子”包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。將包括在該定義中的小的非免疫球蛋白蛋白設計成對特別是表面表達的 ⑶138具有特異性親和性。這些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子，例如 具有相對低分子量(例如IOkDa 20kDa)的Affilin 分子。合適的支架包括例如Y晶 體。這些分子在其自然狀態對靶標分子無特異性結合活性。通過對蛋白表面經由溶劑暴露 的氨基酸的局部限定隨機化而進行基因工程化，形成全新的結合位點。由此將此前的非結 合蛋白轉變成特異性結合蛋白。可以將此類分子特異地設計成結合例如CD138等的靶標， 并允許特異性輸送一種或多種效應分子(參見，www. scilproteins. com的scil Proteins GmbH, 2004) 0另一種非免疫球蛋白靶向分子源自脂鈣蛋白(lipocalin)，并且包括例如 ANTICALINS ，所述ANTICALINS 與免疫球蛋白在結構上具有某種程度的相似性。然而脂鈣 蛋白由具有160 180個氨基酸殘基的單鏈多肽構成。可以將脂鈣蛋白的結合袋改造以便 以高親和性和特異性來識別所關注分子(參見，例如，Beste等，1999)。人工細菌受體(例 如商標為Affibody (Affibody AB)的受體)也在本發明范圍內。這些人工細菌受體分子 為較小的簡單蛋白，并且可以由基于蛋白A(金黃色葡萄球菌)的一種IgG結合結構域的支 架的三螺旋束構成。這些分子具有與許多免疫球蛋白類似的結合性質，但是明顯更小，分子 量通常不超過IOkDa,并且相對穩定。合適的人工細菌受體分子例如美國專利5，831，012 ； 6，534，628 和 6，740，734 中所述。其它“非免疫球蛋白靶向分子”為正討論的抗原的生理學配體。⑶138的生理學 配體包括但不限于例如ADAMTS4(聚蛋白多糖酶-1)、抗凝血酶-3、bFGF、組織蛋白酶G、 CCL5 (RANTES)、CCL7、CCLll、CCLl7、CD44、膠原蛋白(1型膠原蛋白、2型膠原蛋白、3型膠原 蛋白、4型膠原蛋白、5型膠原蛋白、6型膠原蛋白)、CXCL1、彈性蛋白酶、gpl20、HGF[肝細胞 生長因子]、層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2、層粘連蛋白_5、中期因子(midkine)、MMP-7、嗜 中性粒細胞彈性蛋白酶和多效生長因子(pleiotrophin) (HBNF，HBGF-8)。非肽靶向分子包 括但不限于與CD138結合的DNA和RNA寡核苷酸(適體)。本發明的“效應分子”為如下的分子或衍生物或其類似物所述分子連接至靶向 劑、特別是靶向抗體和/或基因工程靶向抗體，并且對靶細胞發揮所期望的作用，例如凋 亡、或另一類型的細胞死亡、或連續的細胞周期停滯。本發明的效應分子包括在靶細胞中 能夠發揮所期望作用的分子，并且包括，但不限于，毒素、藥物(特別是低分子量細胞毒性 藥物)、放射性核素、生物響應修飾劑、成孔劑、核糖核酸酶、具有凋亡誘導活性的凋亡信號 傳導級聯的蛋白、細胞毒性酶、前藥激活酶、反義寡核苷酸、抗體或細胞因子以及其功能衍 生物或類似物/片段。毒素可以包括細菌性毒素，例如但不限于白喉毒素或外毒素A ；植物 毒素，例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡誘導活性的凋亡信號傳導級聯的蛋白包括但不 限于粒酶B、粒酶A、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、截短的 Bid(tBid)、Bax 和 Bak。在優選實施方式中，所述效應子增加免疫綴合物的內部效應子輸送，尤其當免疫 綴合物的靶向抗體所基于的抗體的天然形式可被較弱地內在化時。在另一優選實施方式 中，所述效應子的天然形式是非選擇性的。在某些實施方式中，當處于天然形式時，所述效 應子具有高度的非選擇性毒性，包括系統毒性。本發明效應分子的“天然形式”為在與靶向 劑連接而形成免疫綴合物之前的效應分子。在另一優選實施方式中，與靶向劑綴合后基本 上消除了效應分子的非選擇性毒性。在另一優選實施方式中，當到達靶細胞時，所述效應分子在靶細胞中引起死亡或連續的細胞周期停滯。本發明的藥物效應分子包括但不限于 如下的藥物包括例如充當微管蛋白聚合的抑制劑的小型高細胞毒性藥物(例如類美登素 類、多拉司他汀(dolastatins)、奧雷司他汀(auristatin)和念珠藻環肽(cryptophycin)) 的藥物；DNA烷基化劑，如CC-1065類似物或衍生物(美國專利5，475，092 ；5, 585，499 ； 6，716，821)和倍癌霉素(duocarmycin)；烯二炔類(enediyne)抗生物例如卡里奇霉素 (calicheamicin)和埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及強效類紫杉烷(taxoid)(紫杉烷) 藥物(Payne，2003)。特別優選類美登素類和卡里奇霉素類。效應子類美登素包括任何 來源的類美登素，包括但不限于合成的美登醇和美登醇類似物和衍生物。多柔比星、道諾 霉素、甲氨蝶呤、長春堿、新制癌菌素、大分子霉素、三亞胺醌(trenimon)和α -鵝膏菌素 (amanitin)為本發明范圍內的一些其它效應分子。作為效應分子的反義DNA分子也在本發 明范圍內。當特定藥物或藥物種類的名稱與術語“效應子”或“效應分子”結合時，是指基 于該特定藥物或該藥物種類的本發明的免疫綴合物的效應子。美登素是最初源自埃塞俄比亞灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)的一種天然 產物(Remillard，1975 ；美國專利3，896，111)。該藥物抑制微管蛋白聚合，從而導致阻斷 有絲分裂和細胞死亡(Remillard，1975 ；Bhattacharyya, 1977 ；Kupchan, 1978)。美登素的 細胞毒性比臨床使用的影響微管蛋白聚合的抗癌藥(例如長春花生物堿類或紫杉醇)高 200 1000倍。然而，美登素的臨床試驗表明，其由于高的系統毒性而缺少治療窗。美登素 和類美登素類是高度細胞毒性的，但是其在癌癥治療中的臨床應用受其嚴重的系統性副作 用限制，該副作用主要歸因于其對腫瘤的不良選擇性。使用美登素的臨床試驗顯示出對中 樞神經系統和胃腸系統的嚴重副作用。類美登素類也已經從其它植物、包括滑桃樹(Trewia nudiflora)的種子組織分離 出(美國專利4，418，064)。某些微生物也產生類美登素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利4，151，042)。本發明還涉及任何來源的類美登素，包括合成的美登醇和美登醇類似物，其公開 于例如美國專利 4，137，230,4, 248，870,4, 256，746,4, 260，608,4, 265，814,4, 294，757、 4，307，016,4，308，268,4，308，269,4，309，428,4，313，946,4，315，929,4，317，821, 4，322，348,4, 331，598,4, 361，650,4, 362，663,4, 364，866,4, 371，533,4, 424，219 和 4，151，042 中。在一個優選實施方式中，類美登素為含巰基的類美登素，并且更優選根據Chari 等的美國專利6，333，410或Chari等(Chari, 1992)中公開的方法產生。在本發明的背景下，DM-I (N2-脫乙酰基-N2-(3-巰基氧代丙基)美登素)為 一種優選的效應分子。DMl比美登素的細胞毒性高3倍 10倍，并且通過借助于二硫鍵將 其連接至針對腫瘤相關抗原的單克隆抗體而已被轉化成前藥。某些此類綴合物(有時稱為 “腫瘤激活的前藥” (TAP))在血液腔中無細胞毒性，因為它們在與靶細胞連接時被激活并內 化，由此釋放藥物(Blattler，2001)。已經開發出幾種抗體-DMl綴合物(Payne，2003)，并 且在臨床試驗中評價。例如，在結直腸癌患者中huC242-DMl治療被良好耐受，不會誘導任 何可檢測的免疫響應，并且具有長循環時間(TOlcher，2003)。其它特別優選的類美登素包含含有空間位阻巰基鍵的側鏈，該類美登素例如但不 限于類美登素N2’-脫乙酰基-N2’-(4-巰基-1-氧代戊基)美登素(也稱為“DM3”)和N2’-脫乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巰基-1-氧代戊基)美登素(也稱為“DM4”)。DM4的合成如圖 3和圖4所示并且在本文其它部分有所描述。DM4與DMl和DM3的不同之處在于其在α C 處攜帶有甲基。當將DM4經由連接子(具體為但不限于包含二硫鍵的連接子)連接至例如 ΠΒΤ062等靶向劑時，會導致空間位阻。攜帶有空間位阻巰基的各種類美登素(擁有一個或 兩個取代基、特別是烷基取代基，例如DM4的甲基取代基)公開于2004年11月25日公布 的美國專利申請2004/0235840，本文通過參考并入其全部內容。由與DM3和DM4的硫原子 相鄰的碳上的例如甲基等烷基賦予的空間位阻可以影響免疫綴合物細胞內切割的速率。因 此可變的烷基單元可以影響體外和體內潛力、效力和安全性/毒性。如Goldmahker等在美國專利公開2006/0233814中所報道，一旦在靶標處釋放藥 物，此類空間位阻誘導游離藥物的烷基化(例如，甲基化)。烷基化可以增加該藥物的穩定 性，從而提供所謂的旁觀者效應。然而，本領域技術人員將意識到，當將效應子經由連接子 連接至靶向劑時，其它包含處在導致空間位阻的位置的例如烷基等取代基的效應分子也是 本發明的一部分(美國專利公開2004/0235840)。優選的是，這種位阻誘導游離藥物的化學 修飾(例如烷基化)從而增加其總體穩定性，這使得該藥物在表達CD138的腫瘤細胞中不 僅誘導細胞死亡或連續的細胞周期停滯，而且在必要時還影響例如支持或保護腫瘤免受藥 物影響且通常不表達CD138的輔助細胞(特別是腫瘤基質的細胞和腫瘤血管的細胞)以致 減少或喪失其支持或保護功能。還特別優選DNA烷基化劑作為效應分子，并且所述DNA烷基化劑包括但不限于 CC-1065類似物或衍生物。CC-1065為分離自澤耳鏈霉菌(Sti^ptomyces zelensis)的培養 物的強效抗腫瘤抗生物，并且在體外已經顯示出特殊的細胞毒性(美國專利4，169，888)。 例如美國專利5，475，092,5, 585，499和5，739，350所述的CC-1065類似物或衍生物落在本 發明范圍內。本領域技術人員會容易地意識到，美國專利5，846，545所述的修飾的CC-1065 類似物或衍生物，和例如美國專利6，756，397所述的CC-1065類似物或衍生物的前藥也 在本發明范圍內。在本發明的某些實施方式中，CC-1065類似物或衍生物可以如美國專利 6，534，660中所述而合成。作為優選效應分子的另一組化合物為紫杉烷，特別是高強效紫衫烷和含有巰基或 二硫基的紫杉烷。紫杉烷為抑制微管蛋白解聚從而導致維管組裝和細胞死亡速率增加的有 絲分裂紡錘體毒劑。在本發明范圍內的紫杉烷公開于例如美國專利6，436，931、6，340，701、 6，706，708 和美國專利公開 20040087649,20040024049 和 20030004210 中。其它紫杉燒 公開于例如美國專利6，002，023、美國專利5，998，656、美國專利5，892，063、美國專利 5，763，477、美國專利5，705，508、美國專利5，703，247和美國專利5，367，086中。本領域技 術人員可以理解，PEG化(PEGylated)的紫杉烷(例如美國專利6，596，757中所述的紫杉 烷)也在本發明范圍內。本發明的卡里奇霉素效應分子包括Y II、N-乙酰基卡里奇霉素和卡里奇霉素的 其它衍生物。卡里奇霉素以序列特異性方式與DNA的小槽結合，進行重排并使自由基暴露， 從而引起雙鏈DNA的斷裂，進而導致細胞凋亡和死亡。可用于本發明背景下的卡里奇霉素 效應分子的一個實例描述于美國專利5，053，394中。本發明的免疫綴合物包含至少一種靶向劑(特別是靶向抗體)和一種效應分子。 所述免疫綴合物可以包含例如用于穩定化的其它分子。對于免疫綴合物，術語“綴合物”通常用于定義靶向劑與一種或多種效應分子的有效結合，并不旨在僅指任一類有效結合， 特別是不限于化學“綴合”。只要所述靶向劑能夠與靶點結合，并且連接的效應子(特別 是當輸送至靶點時)如預期地充分起作用，任何連接模式都是適合的。本發明的綴合方法 包括但不限于在將效應分子和/或靶向抗體事先修飾或未事先修飾時將效應分子直接連 接至靶向抗體，或經由連接子連接。連接子可以在功能上分類成例如酸不穩定性連接子、 光不穩定性連接子、酶可切割連接子，例如可以被肽酶切割的連接子。在本發明許多實施 方式中優選可切割連接子。可以在細胞環境、特別是細胞內環境中存在的條件下切割此類 可切割連接子，當切割時所述環境對藥物釋放無有害作用。如存在于特定的細胞內區室的 PH4 5等低pH會切割酸不穩定連接子，而光不穩定連接子可以通過例如紅外光切割。然 而，優選被大多數細胞中存在的生理條件切割或者在該生理條件下切割的連接子，本文將 之稱為生理性可切割連接子。因此，在本發明許多實施方式中優選二硫鍵連接子。這些連 接子可通過能在生理條件下發生的二硫鍵交換而切割。優選的異雙官能二硫鍵連接子包括 但不限于N- 丁二酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(參見，例如Carlsson等 (1978))、N-丁二酰亞胺基4-(2_吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(參見，例如美國專利號 4，563，304)、N- 丁二酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(參見，例如CAS登記號 341498-08-6)、N_ 丁二酰亞胺基4_(N_馬來酰亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC)(參 見，例如Yoshitake等，(1979))和N- 丁二酰亞胺基4_甲基-4-[2-(5-硝基吡啶基)二硫 代]戊酸酯(SMNP)(參見，例如美國專利號4，563，304)。用于本發明組合物的最優選的連 接子分子為SPP、SMCC和SPDB。其它合適的連接子可以包括“非可切割性”鍵，例如但不限于磺酸丁二酰亞胺基 馬來酰亞胺基甲基環己烷甲酸酯(SMCC)，其為能夠將化合物與含SH化合物連接的異雙官 能連接子。雙官能連接子分子和異雙官能連接子分子，例如針對糖的異雙官能連接子分子 (例如S- (2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰胼(TPCH))，也在本發明范圍內(Vogel，2004)。例 如類美登素等效應分子可以經由兩步反應法綴合至靶向抗體，所述兩步反應法包括第一 步，將靶向抗體用交聯劑(例如N-丁二酰亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))修飾，以向 所述靶向抗體引入二硫代吡啶基。在第二步中，可以將具有巰基的反應性類美登素(例如 DMl)加入經修飾的抗體，從而引起在所述經修飾的抗體中硫代吡啶基的置換和二硫鍵連接 的細胞毒性類美登素/抗體綴合物的產生(美國專利5，208，020)。然而，一步綴合法，例如 在Chari等的美國專利公開20030055226中描述的方法，也在本發明范圍內。在本發明的 一種實施方式中，將同類或不同類的多種效應分子與靶向抗體相連。如本文別處所討論，所 用連接子的性質可能影響旁觀者殺傷(Kovtim等，2006)。也參見圖13的討論。可以經由例如美國專利6，716，821中所述的PEG連接基團，將CC-1065類似物或 衍生物綴合至所述靶向劑。卡里奇霉素可以經由連接子綴合至靶向抗體(美國專利5，877，296和美國專利 5，773，001)，或根據美國專利5，712，374和美國專利5，714，586中公開的綴合方法綴合至 靶向抗體。用于制備卡里奇霉素綴合物的另一優選方法記載于美國專利公開20040082764。 本發明的免疫綴合物可以采用重組融合蛋白的形式。術語“細胞毒性劑”包含“細胞毒性藥物/癌癥藥物”，包括化療劑，例如美法侖、環 磷酰胺、長春新堿、多柔比星和脂質體多柔比星(DOXIL)、環磷酰胺、足葉乙甙、阿糖胞苷和順鉬，例如潑尼松(prednisone)和地塞米松等糖皮質激素類和例如沙利度胺、硼替佐米、 來那度胺(Ienalidomide)等試劑，以及例如索拉非尼(sorafenib)等激酶抑制劑或例如羅 明待辛(romicbpsin)等HDAC (組蛋白脫乙酰酶)抑制劑，以及生長抑制劑、抗激素劑、抗血 管生成劑、保心劑、免疫刺激劑、免疫抑制劑、血管生成抑制劑、蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制 劑。該定義還包括抗體類細胞毒性劑，包括具有在本領域內了解的細胞毒性作用的免疫綴 合物和抗體。Anti-CD40為優選的抗體。其它抗體包括但不限于例如AVASTIN(貝伐單抗 (bevacizuab))或 MYELOMACIDE (米拉珠單抗(milatuzumab))。THAL0MID(a-(N-鄰苯二甲酰亞氨基)戊二酰亞胺；沙利度胺)是免疫調節劑。 沙利度胺的經驗式為C13HltlN2O4，克分子量為258. 2。沙利度胺的CAS號為50-35-1。其似乎 具有多種作用，包括以各種方式抑制骨髓瘤細胞生長和存活的能力和抑制新血管生長的能 力。VELCADE是用于治療多發性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑。據信VELCADE作用在骨髓 瘤細胞上而引起細胞死亡，和/或通過作用于骨微環境而間接作用，從而抑制骨髓瘤細胞 生長和存活。在不受特定理論或作用模式的限制下，VELCADE因而破壞正常細胞過程，導致 促進凋亡的蛋白酶體抑制。REVLIMID是免疫調節劑。認為REVLIMID影響骨髓瘤細胞中的多種途徑，從而誘導 凋亡、抑制骨髓瘤細胞生長、抑制血管內皮生長因子(VEGF)，由此抑制血管生成和降低骨髓 瘤細胞粘著至骨髓基質細胞。地塞米松為充當消炎劑和免疫抑制劑的合成糖皮質激素留體。當施用至癌癥患者 時，地塞米松能夠對抗癌癥治療的副作用。地塞米松還能夠單獨給藥或與包括沙利度胺、阿 霉素或長春新堿等的其它抗癌劑一起給藥。術語“與…組合”不限于在精確地同一時間施用。相反，該術語涵蓋依次或以一定 的時間間隔施用本發明的免疫綴合物與其它治療方案(例如放射治療)或試劑(特別是上 述的細胞毒性劑)，以使它們可以共同起作用，從而提供與僅使用本發明的免疫綴合物或例 如其它試劑的治療相比更大的益處。優選所述免疫綴合物和其它試劑累加地起作用，特別 優選它們協同地起作用。以對于預期目的有效的量合適地提供此類分子。熟練的醫學從業 者能夠根據經驗，或通過考慮試劑的藥代動力學和作用模式來確定各治療劑的合適劑量、 以及施用的合適時機和方法。如本發明的背景下所用，“共施用”是指與免疫綴合物同時施 用，通常是以組合劑型施用。術語“序列同一性”是指對核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常，比對所 述序列，從而獲得最高量級的匹配。“同一性”本身在本領域具有公知的含義，并且可以使用 已公開的技術計算(參見，例如 Computational Molecular Biology,Lesk,Α. Μ.編，Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith,D. W.編，Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.禾口 Griffin, H. G.編，Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J.編，M Stockton Press,New York,1991)。 盡管存在許多測定兩個多核苷酸或多肽序列之間同一性的方法，術語“同一性”對本領域技 術人員而言是公知的(CariIlo, H. & Lipton, D. , SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
任何特定的核酸分子是否與例如ΠΒΤ062核酸序列或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性，可以如下常規 確定使用已知的計算機程序例如DNAsis軟件(Hitachi Software, San Bruno，Calif.)進 行初始序列比對，然后使用ESEE3. 0版DNA/蛋白質序列軟件(cabotOtrog. mbb. sfu. ca)進 行多重序列比對。氨基酸序列是否與例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，96%、97%、98%或 99% 的同一性，能夠使用已知 的計算機程序例如 BESTFIT 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix 用第 8 版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison, Wis. 53711)而常規地確定。BESTFIT 使用 Smith 和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2 =482-489(1981)的局部同源性算法，來尋找兩個序列之間同源性最高的片 段。當使用DNAsis、ESEE, BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定特定序列是否與 本發明的參照序列具有例如95%同一性時，將參數設置如下在參照核酸或氨基酸序列的 全長上計算同一性百分比，允許同源性中的間隔(gap)至多為參照序列中核苷酸總數的5%。在本發明的背景下，如果提及與特定序列的殘基組合的序列同一性，則該序列同 一性涉及所指定的所有殘基的總和。基本抗體分子為雙官能結構，其中可變區與抗原結合，而剩下的恒定區可以引起 非抗原依賴性響應。大多數抗體類型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)由恒定區確定。這些類 型可以進一步分成亞類(同型)。例如，IgG類具有四種同型，即根據恒定區確定的IgGl、 IgG2、IgG3、和IgG4。各種人類抗體類型中，已知僅人類IgGl、IgG2、IgG3和IgM有效地激 活補體系統。盡管恒定區不形成抗原結合位點，恒定區和鉸鏈區的排布可以對所述分子賦 予片段柔性，這使其可與抗原結合。不同的IgG同型能夠與例如單核細胞、B細胞和NK細胞等細胞上的Fc受體結合， 從而激活細胞以釋放細胞因子。不同的同型還可以激活補體，導致局部或系統性炎癥。特別 是，不同的IgG同型可以以不同的程度結合Fc y R0 Fc Y R為一組屬于Ig超家族的表面糖蛋 白，主要在白細胞上表達。將Fc γ R糖蛋白分成三類，稱為Fc γ RI (⑶64) ,FcyRII (⑶32)和 FcyRIII(CD16)0盡管IgGl、IgG2和IgG3與各種此類Fc γ R糖蛋白強烈地結合，IgG4顯 示出弱得多的結合。具體而言，化64為？(^1 1的中間體結合劑，其產生相對低的ADCC(抗 體依賴性細胞毒性)甚至不產生ADCC，并且不與Fc γ RIIIA或Fc γ RIIA結合。IgG4也是 Fc y RIIB的弱結合劑，所述Fc y RIIB為抑制性受體。此外，IgG4僅介導微弱的補體固定或 不介導補體固定，具有微弱的補體依賴性細胞毒性(CDC)或不具有CDC。在本發明的背景 下，IgG4可以具體用于預防Fc介導的肝FcR靶向，這是因為其沒有顯示出與LSEC(肝竇狀 內皮細胞)上的FcR γ II的相互作用，還顯示出與Kupffer細胞(巨噬細胞)上的FcRy I III無相互作用或具有弱相互作用，并且與肝NK細胞上的FcR γ III無相互作用。進一步降 低任何⑶C的某些突變也是本發明的一部分。例如在327、330和331位的IgG4殘基顯示 出ADCC (抗體依賴性細胞毒性)和CDC的降低(Amour, 1999 ；Shields, 2001)。使抗體穩定 化的多種突變之一也是本發明的一部分(本文也稱為“穩定化突變”)。這些突變特別包括IgG4的CH2區中的亮氨酸突變成谷氨酸，和IgG4鉸鏈核心中的絲氨酸交換為脯氨酸。在 本發明的某些實施方式中，這些突變使半分子(half-molecule)的量減少至小于10%、小 于5%且優選小于2%或1%。此外，如此穩定化的抗體的體內半衰期可以增加幾天，包括1 天、2天、3天、4天和超過5天(Schuurman，1999)。本文所述的包括靶向抗體等靶向劑，還可以根據它們與抗原、特別是CD138的結 合親和性來描述或說明。例如靶向抗體等靶向劑的優選結合親和性的特征在于，解離常數 Kd(nM)小于1. 6、小于1. 5或約為1. 4或小于1. 4。對于包含如靶向抗體等所述靶向劑的免 疫綴合物而言，解離常數K11(IiM)優選小于1. 6、小于1. 5或小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小 于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于1. 9或約為1. 9。本發明的抗原結合區(ABR)會基于所用的靶向抗體或基因工程靶向抗體的類型 而變化。在天然存在的抗體中和在大多數嵌合抗體和人源化抗體中，抗原結合區由重鏈的 前兩個結構域和輕鏈組成。然而，在沒有輕鏈的重鏈抗體中，抗原結合區僅由例如重鏈的 前兩個結構域組成，而在將抗體分子的輕鏈和重鏈可變區合并于單個多肽鏈中的輕鏈抗體 (ScFv)中，ABR僅由一個多肽分子提供。FAB片段通常通過木瓜蛋白酶消化而獲得，并且具 有一條輕鏈和重鏈的一部分，因此包含僅具有一個抗原結合位點的ABR。另一方面，雙鏈抗 體為具有兩個抗原結合區的小的抗體片段。然而，在本發明的背景下，靶向抗體或基因工程 靶向抗體的抗原結合區為任何主要決定靶向抗體或基因工程靶向抗體的結合特異性的區 域。如果據稱ABR或另一靶向抗體區“出自某種抗體”，例如人類或非人類抗體，這是 指在本發明的背景下ABR或者與相應的天然存在的ABR相同，或者基于該相應的天然存在 的ABR。如果ABR具有天然存在的ABR的結合特異性，則該ABR基于天然存在的ABR。然而， 此類ABR可以包含例如點突變、添加、缺失或例如糖基化等翻譯后修飾。特別地，此類ABR可 以與天然存在的ABR的序列具有超過70 %、超過80 %、超過90 %、優選超過95 %、超過98 % 或超過99%的序列同一性。在本發明的背景下，靶向劑(例如靶向抗體，特別是包含靶向抗體的免疫綴合物) 的均勻靶向(homogenous targeting)是對與用該靶向劑獲得所述靶向的期望結果相關的 差異的量度。在本發明的某些實施方式中，所期望的結果通過與靶標的簡單結合而獲得。 即，例如，其中某種靶向劑提供抵抗隨后結合的防護的實施方式的情況。然而，靶向劑的均 勻性(homogeneity)可以通過例如包含所述靶向劑的免疫綴合物的效力而容易地估算。例 如，所述免疫綴合物針對例如CD138等腫瘤抗原(該腫瘤抗原包含旨在破壞腫瘤細胞和/ 或使腫瘤生長停滯的效應子)的效力可以通過包含表達CD138抗原的細胞的腫瘤的生長抑 制程度而確定。此類免疫綴合物可以在其效力方面顯示出較高的差異。例如，有時其可以以 高效力使腫瘤生長停滯，但其它時候該效力很難超過對照的效力。另一方面，免疫綴合物在 效力方面的較低差異，顯示出免疫綴合物和/或靶向劑分別一致地提供所期望的結果。一 種靶向均勻性定量方法為計算靶向差異(targeting variation) 0在包含某種靶向劑的免 疫綴合物使腫瘤生長停滯的情況下，靶向差異可以如下計算首先確定腫瘤達到預定體積 (例如300mm3)的時間。優選地，選擇預定體積從而使在達到所述預定體積之前和之后的任 何腫瘤生長均以大致相同的速率穩定地增加。在對于一組受試對象已經確定所述時間后， 計算受試對象組(例如，SCID小鼠或顯示均勻腫瘤生長的另一合適的模型)中這些時間的平均值(Tm)。然后將Tm與觀察值相關聯，所述觀察值獲自顯示出最低靶向效力并因此與達 到所述預定體積所需時間(Tf)最少的腫瘤相關的組內受試對象，并在另一方面，獲自顯示 出最低靶向效力并因此與達到所述預定體積所需時間(Ts)最多的腫瘤有關的組內受試對 象，所述相關性通過根據下式計算預定體積的靶向差異而獲得靴向差異[%] = Ts-Tf/TmX 100在一個優選實施方式中，本發明的包含基因工程靶向抗體的免疫綴合物的靶向差 異小于150%、小于140%、小于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于90%、小于 80%、小于70%、小于60%或小于50%，在某些實施方式中甚至小于45%。優選地，所述靶 向差異為約10% 約150%，優選約10% 約100%、約10% 約80%、約10% 約70%、 約10% 約60%、約10% 約50%。靶向的均勻性還可以通過其它手段(例如確定腫瘤生長延遲)而定量。另外，本 領域技術人員易于理解，特定尺寸的腫瘤體積僅僅是一個可以基于其而確定靶向差異的參 數。根據所期望的結果，可以使用其它參數，包括時間(例如衡量腫瘤生長延遲的時間)或 結合百分比(％)。本領域技術人員能夠容易地確定這些其它參數。圖9 (C)和(D)中顯示包含小鼠抗體BB4的免疫綴合物(BB4_SPP_DM1 ；圖9C)和包 含基于該抗體的基因工程靶向抗體nBT062的免疫綴合物(nBT062-SPP-DMl ；圖9D)之間， 靶向/結合的均勻性的差異。從這些圖可以看出，使用包含基因工程靶向抗體的免疫綴合 物獲得的結果比使用包含上述小鼠抗體的免疫綴合物獲得的結果明顯更均勻。這由于BB4 的抗體結合區在nBT062中未經修飾而特別顯著。由此，包含小鼠抗體的抗體結合區而不是 小鼠抗體其它部分的免疫綴合物顯示出遠超出本領域技術人員預期結果的性質。nBT062(也參見圖1)為小鼠人類嵌合IgG4mAb，為B-B4的一種嵌合形式。創造 該嵌合形式的B-B4來降低HAMA(人類抗小鼠抗體)響應，同時維持B-B4的抗體結合區 對CD138的功能。令人驚奇的是，使用包含該基因工程靶向抗體的免疫綴合物獲得的結果 明顯更加均勻(結果中的差異降低)。以下說明用于產生ΠΒΤ062的方案。表達ΠΒΤ062 的中國倉鼠卵巢細胞已經于2007年12月11日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D_38124Braunschweig0 識別號為DSM ACC2875。基于B-B4的CD138特異性嵌合抗體在本文通稱為c_B_B4。已從ΠΒΤ062用核苷酸序列的翻譯物預測了重鏈和輕鏈的氨基酸序列。重鏈和輕 鏈的預測氨基酸序列如表1所示。預測的可變區用粗體標出，預測的CDR用下劃線標出。表1. nBT062的預測的氨基酸序列nBT062 重鏈預測序列(SEQ ID NO 1)
1QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS
51 ILPGTGRTIY NEKFKGKATF TADISSNTVQ 101 YYCaTFYYAMD YWGQGTSVTV SSASTKGPSV 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY 301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM
NYWIEWVKQR PGH6LEWI6E MQLSSLTSED SAVYYCARRD
FPLAPCSRST SESTAALGCL SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK VDGVEVHNAK TKPREEQFNS PSSIEKTISK AKGQPREPQV VEWESNGQPE NNYKTTPPVL HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)
22
C端賴氨酸易于剪切，并且可以由于不完全切割而在某種程度上存在。括號中的 (K)不是SEQ ID NO 1的一部分。nBT062 輕鏈預測序列(SEQ ID NO 2) 權利要求
一種用于減少有需要的受試對象的腫瘤細胞中基質細胞粘著至表達CD138的腫瘤細胞的方法，所述方法包括以對于減少基質細胞粘著至表達CD138的腫瘤細胞有效的量對所述腫瘤細胞施用靶向所述表達CD138的腫瘤細胞的免疫綴合物，和可選地以抑制、延緩和/或預防腫瘤細胞生長的量對所述腫瘤細胞施用其它細胞毒性劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述免疫綴合物包含效應分子和靶向劑，其中所述 效應分子和所述靶向劑經由可切割連接子而相互連接。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述可切割連接子含有二硫鍵。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述連接子為SPP或SPDB。
5.如權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述粘著減少至少約10%、約20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80% 以上。
6.如權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述粘著減少導致粘著介導的藥物抗 性的緩解。
7.如權利要求6所述的方法，其中使對不是所述免疫綴合物的其它細胞毒性劑的粘著 介導的藥物抗性減少，并且其中以抑制、延緩和/或預防腫瘤細胞生長的量施用所述其它 細胞毒性劑。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述細胞毒性劑為美法侖、長春新堿、多柔比星、地 塞米松、環磷酰胺、足葉乙甙、阿糖胞苷、順鉬、沙利度胺、潑尼松、沙利度胺、硼替佐米、來那 度胺、索拉非尼、羅明待辛或其組合。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述細胞毒性劑為基于抗體的。
10.如權利要求1或2所述的方法，其中所述效應分子為空間位阻的。
11.如權利要求1或2所述的方法，其中所述效應分子為類美登素、紫杉烷或CC1065、 或其類似物的至少一種。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述效應分子為至少一種類美登素，例如DM1、DM3 或 DM4。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述效應分子為DM4。
14.如權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述免疫綴合物的靶向劑包含免疫球蛋白重鏈或其部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重鏈或其部分與SEQ ID NO 1具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性。
15.如權利要求7所述的方法，其中依次地施用所述免疫綴合物和所述細胞毒性劑，其 中在施用免疫綴合物之后施用細胞毒性劑。
16.如權利要求7所述的方法，其中將所述免疫綴合物和所述細胞毒性劑共同施用。
17.如權利要求1 4和7 9中任一項所述的方法，其中所述受試對象為罹患以 下疾病之一的癌癥患者多發性骨髓瘤、卵巢癌、腎癌、膽囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結 腸癌、霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性淋巴性白血病 (ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、實體組織肉瘤或結腸癌。
18.如權利要求17的方法，其中所述患者罹患多發性骨髓瘤。
全文摘要
本申請公開了對CD138具有特異性的免疫綴合物及其使用方法，該免疫綴合物減少表達CD138的腫瘤細胞粘著至基質細胞。該粘著的減少使得腫瘤細胞不僅對所述免疫綴合物易感，還對其它試劑、特別是細胞毒性劑易感。
文檔編號A61K47/48GK101945892SQ200880126958
公開日2011年1月12日 申請日期2008年12月23日 優先權日2007年12月26日
發明者克里斯托夫·尤爾克, 克里斯托夫·布魯切爾, 本杰明·德爾肯, 秀島輝, 肯尼思·安德森 申請人:生物測試股份公司;伊繆諾金公司;丹納-法伯癌癥研究所