蛋白制劑及其制備方法

專利名稱：蛋白制劑及其制備方法
蛋白制劑及其制備方法相關申請本申請要求2007年11月30日提交的美國臨時申請號61/004992的優先權利益， 該優先權申請的內容通過援弓I并入本文。
背景技術：
藥用蛋白制劑的一個基本原理是，必須克服某些不穩定性。蛋白的降解途徑可以 分成2個不同類別，包含化學不穩定性和物理不穩定性。化學不穩定性導致蛋白的修飾， 這通過鍵形成或切割來實現。化學不穩定性問題的實例包括脫酰胺化、外消旋化、水解、氧 化、β消除和二硫化物交換。另一方面，物理不穩定性不會導致蛋白的共價變化。相反，它 們包含蛋白的更高級結構(二級和以上)的變化。這些包括變性、向表面吸附、聚集和沉淀 (Manning 等人，Pharm. Res. 6，903 (1989))。廣泛接受的是，通過在制劑中包含其它分子，可以克服這些對藥用蛋白制劑的商 業生存力和功效具有巨大影響的不穩定性。通過在溶液中包含與蛋白相互作用的賦形劑來 保持蛋白穩定、可溶和不聚集，可以提高蛋白穩定性。例如，鹽化合物和其它離子物質是蛋 白制劑的非常常見的添加劑。通過以非特異性方式結合蛋白和增加熱穩定性，它們輔助對 抗蛋白的變性。鹽化合物(例如，NaCl, KCl)已經成功地用于商業胰島素制品來對抗聚集 和沉淀(上文，在911)。已經證實，當用作制劑添加劑時，氨基酸(例如，組氨酸，精氨酸) 會減少蛋白二級結構的改變(Tian等人，Int' 1 J. Pharm. 355，20 (2007))。常用的添加劑 的其它實例包括多元醇材料(例如甘油和糖)和表面活性劑例如去污劑，可以是非離子型 (例如，吐溫(Tween)，普盧蘭尼克(Pluronic))和陰離子型(十二烷基硫酸鈉)。添加劑在 所有液體商業蛋白制劑中的幾乎普遍的流行，暗示著沒有這樣的化合物的蛋白溶液可能遇 到由不穩定性導致的降解挑戰。蛋白制劑的基本目標是，維持特定蛋白以它的天然的、藥學活性的形式穩定延長 的時間段，以確保藥用蛋白藥物的可接受的貯存期限。但是，維持蛋白在溶液中的穩定性和 溶解度，是在治療劑中包含添加劑的藥物制劑的巨大挑戰。迄今為止，生物制劑需要其它賦 形劑來維持蛋白穩定性。通常，液體藥物制劑含有多種穩定性添加劑。例如，用于患者自己 施用人生長激素Norditropin SimpleXx 的液體制劑含有添加劑甘露醇(一種糖醇)、組氨 酸和泊洛沙姆188 ( —種表面活性劑)來穩定激素。藥物添加劑需要是可溶的、無毒的，并以對特定治療性蛋白提供穩定作用的特 定濃度來使用。由于添加劑的穩定作用是蛋白-和濃度-依賴性的，必須小心地測試考 慮用于藥物制劑的每種添加劑，以確保它不會造成不穩定性或對制劑的化學或物理構成 (make-up)產生其它負面作用。用于穩定化蛋白的成分可能造成儲存期間蛋白隨著時間的 穩定性或蛋白隨著環境變化的穩定性的問題。通常，如下實現長貯存期限通過以冷凍形式(例如，在-80°C )儲存蛋白，或通過 對蛋白進行低壓凍干過程，即通過以低壓凍干形式儲存蛋白，在即將使用前需要重配步驟， 和從而在患者方便性方面產生顯著不利。但是，為了儲存而冷凍蛋白制劑可能導致局部高 濃度的蛋白和添加劑，這會在制劑內產生局部極端的PH、降解和蛋白聚集。另外，本領域技術人員熟知，冷凍和融化過程經常影響蛋白穩定性，這意味著即使以冷凍形式儲存藥物蛋 白也會伴有由冷凍和融化步驟導致的穩定性喪失。另外，低壓凍干的第一個工藝步驟包含 冷凍，這可能不利地影響蛋白穩定性。在工業場合，在藥品生產(保持(holding)步驟，儲 存，再冷凍和再融化來增加藥物產品填充_完工的時限和批次大小彈性)和隨后的藥物產 品填充-完工(低壓凍干)的過程中，可能對藥物蛋白進行重復的冷凍-融化處理。眾所 周知，遇到蛋白不穩定性現象的風險隨著藥物蛋白遇到的冷凍_融化循環數目的增加而增 加，達到在重復的冷凍_融化過程中維持蛋白穩定性的制劑條件是一項挑戰性的任務。在 生物藥物工業中存在下述需要，即可以不產生不希望的制劑性質、特別是PH梯度、滲透性、 密度或蛋白或賦形劑濃度地冷凍和融化的制劑。基于蛋白的藥物產品經常需要為了治療功效而配制成高濃度。高度濃縮的蛋白 制劑希望用于治療用途，因為它們能實現更小體積的劑量，限制患者不適，且其包裝和儲 存更經濟。但是，高蛋白濃度制劑的開發存在許多挑戰，包括生產挑戰、穩定性挑戰、分析 挑戰、和尤其對于治療蛋白而言的遞送挑戰。例如，蛋白的聚集、不溶性和降解的困難，通 常隨著制劑中蛋白濃度的升高而增加(評論參見Shire，S.J.等人.J.Pharm.Sci.，93， 1390(2004))。添加劑可能造成以前沒有觀察到的不利作用，其在更低的添加劑或蛋白濃 度，提供有益作用。高濃度蛋白制劑的生產可能導致乳色、聚集和沉淀的顯著問題。除了可 能發生非天然蛋白聚集和微粒形成、可逆的自聯的可能性以外，可能導致增加的粘度或其 它性質，使注射遞送復雜化。高粘度也可能使通過過濾方法生產高蛋白濃度復雜化。因而，藥用蛋白制劑通常小心地平衡成分和濃度來增加蛋白穩定性和治療需求， 同時限制任何不利的副作用。生物制劑應當包括穩定的蛋白(甚至在高濃度)和特定量的 賦形劑，減少潛在的治療并發癥、儲存問題和總成本。隨著蛋白和其它生物大分子作為藥物分子獲得更多關注，用于遞送這樣的分子的 制劑變成一個重要的問題。盡管用于治療用途的蛋白的大規模生產取得革命性進展，這些 試劑在身體中的有效且方便的遞送仍然是一個重大挑戰，這歸因于它們固有的理化和生物 性質，包括較差的跨生物膜滲透，大分子量，短血漿半衰期，自聯，物理和化學不穩定性，聚 集，吸附和免疫原性。

發明內容
本發明指向下述令人驚奇的發現，即在水中配制的蛋白在長期液體儲存或其它處 理步驟(例如冷凍/融化和低壓凍干)過程中會維持溶解度以及穩定性，甚至在高濃度時。本發明涉及包含水和蛋白的蛋白水制劑的方法和組合物，其中所述蛋白是穩定 的，不需要其它試劑。具體地，本發明的方法和組合物是基于滲濾處理，其中使用水作為滲 濾介質，滲濾含有目標蛋白的第一溶液。該過程的進行，使得與水存在至少確定體積的交 換，例如5倍體積交換。通過執行本發明的方法，得到的水制劑具有與起始蛋白溶液相比顯 著降低的賦形劑總百分比。例如，發現水制劑與起始蛋白溶液相比減少了 95-99%賦形劑。 盡管賦形劑減少，蛋白保持可溶，且保持它的生物活性，甚至在高濃度時。在一個方面，本發 明的方法產生這樣的組合物，其包含增加濃度的蛋白，同時減少其它組分，例如離子型賦形 劑。這樣，水制劑中蛋白的流體動力學直徑比標準緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中 的相同蛋白更小。
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本發明的制劑與標準的緩沖制劑相比具有許多優點。在一個方面，所述水制劑包 含高蛋白濃度，例如50-200mg/mL或更多。在本發明的制劑中可以包含所有大小的蛋白，甚 至在提高的濃度。盡管蛋白是高濃度，所述制劑具有極微小的聚集，且可以使用各種方法和 形式來儲存，例如冷凍，而沒有高蛋白制劑可能預見到的有害作用。本發明的制劑不需要在 常規制劑中用于穩定溶液中的蛋白的賦形劑，例如，表面活性劑和緩沖系統。作為低水平 離子型賦形劑的結果，本發明的水制劑具有低電導率，例如，小于2mS/cm。本發明的方法和 組合物也會提供具有低重量摩爾滲透壓濃度的蛋白水制劑，例如，不大于30m0Smol/kg。另 外，本文所述的制劑勝過標準的制劑，因為它們具有降低的免疫原性，這是由于缺少蛋白穩 定化所需的其它試劑。本發明的方法和組合物可以用于提供包含水和任意類型的目標蛋白的水制劑。在 一個方面，本發明的方法和組合物用于大蛋白，包括大于47kDa的蛋白。抗體和其片段，包 括用于體內和體外目的的那些，是可以用于本發明的方法和組合物中的蛋白的另一個實 例。此外，制備蛋白和肽制劑必需的多步驟純化和濃縮過程經常在組合物中引入變異 性，使得制劑的精確組成可能隨批次而異。聯邦規程要求藥物組成在它們的制劑中高度一 致，無論生產位置或批號。本發明的方法可以用于建立在水中配制的蛋白溶液，以精確量向 其加回緩沖劑和賦形劑，以建立具有精確濃度的緩沖劑和/或賦形劑的蛋白制劑。在一個實施方案中，本發明提供了包含蛋白和水的水制劑，其中所述制劑具有某 些特征，例如，但不限于，低電導率，例如，小于約2. 5mS/cm的電導率，至少約10μ g/mL的蛋 白濃度，不超過約30m0Smol/kg的重量摩爾滲透壓濃度，和/或所述蛋白具有大于約47kDa 的分子量(Mw)。在一個實施方案中，本發明的制劑具有提高的穩定性，例如，但不限于，液體 形式長時間(例如，至少約3個月或至少約12個月)的穩定性或經過至少一個冷凍/融化 循環(如果不是更多個冷凍/融化循環)的穩定性。在一個實施方案中，制劑能以選自冷 凍、低壓凍干或噴霧干燥的形式穩定至少約3個月。在一個實施方案中，在本發明的制劑中包含的蛋白可以具有最小的大小，包括，例 如，大于約47kDa的Mw,大于約57kDa的Mw，大于約IOOkDa的Mw，大于約150kDa的Mw，大于 約200kDa的Mw，或大于約250kDa的Mw。在一個實施方案中，本發明的制劑具有低電導率，包括，例如，小于約2. 5mS/cm的 電導率，小于約2mS/cm的電導率，小于約1. 5mS/cm的電導率，小于約lmS/cm的電導率，或 小于約0. 5mS/cm的電導率。在一個實施方案中，在本發明的制劑中包含的蛋白具有給定的濃度，包括，例如， 至少約lmg/mL的濃度，至少約10mg/mL，至少約50mg/mL，至少約100mg/mL，至少約150mg/ mL,至少約200mg/mL，或大于約200mg/mL。在一個實施方案中，本發明的制劑具有不超過約15m0Smol/kg的重量摩爾滲透壓 濃度。在一個實施方案中，本發明提供了包含水和給定濃度的蛋白的水制劑，其中所述 蛋白具有這樣的流體動力學直徑(Dh)，它比給定濃度的緩沖溶液中的蛋白的Dh小至少約 50%。在一個實施方案中，蛋白的Dh比給定濃度的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的蛋白的Dh小 至少約50% ；蛋白的Dh比給定濃度的PBS中的蛋白的Dh小至少約60% ；蛋白的Dh比給定
9濃度的PBS中的蛋白的Dh小至少約70%。在一個實施方案中，本發明提供了包含蛋白的水制劑，所述蛋白例如，但不限于， 抗體或抗原結合片段，其中所述蛋白具有小于約5μπι的流體動力學直徑(Dh)。在一個實施 方案中，所述蛋白具有小于約3μπι的Dh。任意蛋白可以用于本發明的方法和組合物中。在一個實施方案中，所述制劑包含 治療蛋白。在一個實施方案中，所述制劑包含抗體或其抗原結合片段。可以包含在本發明 的方法和組合物中的抗體或抗原結合片段的類型包括、但不限于，嵌合抗體，人抗體，人化 抗體和結構域抗體(dAb)。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段是抗-TNFa，例如但 不限于阿達木單抗或golimumab或抗-IL-12抗體，例如但不限于J695。另外，本發明的制 劑也可以包含至少兩種不同類型的蛋白，例如，阿達木單抗和J695。在本發明的另一個實施方案中，所述制劑還可以包含非可離子化賦形劑。非可離 子化賦形劑的實例包括、但不限于，糖醇或多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，非離子型表面 活性劑(例如，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60)，和/或糖 (例如，蔗糖)。可以在本發明的制劑中另外包含的非可離子化賦形劑的其它非限制性實例 包括、但不限于，非_海藻糖，棉子糖，和麥芽糖。在一個實施方案中，所述制劑不包含選自下述的試劑張力調節劑，穩定劑，表面 活性劑，抗氧化劑，冷凍保護劑，填充劑，凍干保護劑，堿性組分和酸性組分。本發明的制劑可以適用于任意用途，包括體外和體內用途。在一個實施方案中，本 發明的制劑適合通過下述給藥模式施用給受試者，包括，但不限于，皮下的，靜脈內的，吸入 的，皮內的，透過皮膚的，腹膜內的，和肌肉內的給藥。本發明的制劑可以用于治療受試者的 病癥。本發明也包含可以用于遞送本發明的制劑的裝置。這樣的裝置的實例包括、但不 限于，注射器，筆，植入物，無針注射裝置，吸入裝置，和貼劑。在一個實施方案中，本發明的制劑是藥物制劑。本發明也提供了制備包含蛋白和水的水制劑的方法，該方法包含，提供在第一溶 液中的蛋白，使用水作為滲濾介質，對第一溶液進行滲濾，直到已經實現與水至少5倍體積 交換，從而制備水制劑。在一個實施方案中，在得到的制劑中的蛋白保留它的生物活性。本發明另外提供了制備蛋白的水制劑的方法，該方法包含，提供在第一溶液中的 蛋白，使用水作為滲濾介質，對第一溶液進行滲濾，直到已經實現與水至少5倍體積交換， 從而制備滲濾過的蛋白溶液；濃縮滲濾過的蛋白溶液，從而制備蛋白的水制劑。在一個實施 方案中，在得到的制劑中的蛋白保留它的生物活性。在一個實施方案中，通過離心，濃縮滲濾過的蛋白溶液。在一個實施方案中，所述滲濾介質由水組成。在一個實施方案中，用水對所述第一溶液進行滲濾，直到實現大于5倍體積交換 的體積交換。在一個實施方案中，用水對所述第一溶液進行滲濾，直到實現至少約6倍體積 交換。在一個實施方案中，用水對所述第一溶液進行滲濾，直到實現至少約7倍體積交換。在一個實施方案中，所述水制劑中的賦形劑終濃度比第一溶液小至少約95 %。在一個實施方案中，所述水制劑中的賦形劑終濃度比第一溶液小至少約99 %。在一個實施方案中，從哺乳動物細胞表達系統得到第一蛋白溶液，且已經純化，以
10去除宿主細胞蛋白(HCPs)。在一個實施方案中，本發明的方法還包含，向水制劑添加賦形劑。附圖簡述

圖1顯示了阿達木單抗參照標準品AFP04C (底線)、阿達木單抗DS(DF/UF處理前 (中線)和處理后(頂線)的藥品)的SEC色譜圖。圖2顯示了向DF/UF-處理過的阿達木單抗單體加入賦形劑化合物后，山梨醇(非 可離子化賦形劑)和NaCl (可離子化賦形劑)濃度對阿達木單抗單體的流體動力學直徑 (Dh)的影響。圖3顯示了 J695參照標準品(下圖)和pH調節至pH 4. 4的J695DS (上圖)的 IEC圖譜。圖4顯示了 pH 4. 7的用Mi 11 i_Q水DF/UF后的J695 (上圖)和pH調節至pH 4. 4 的DF/UF之前的J695DS (下面曲線)的IEC圖譜。圖5用圖形描述了流體動力學直徑(ζ-平均值)和阿達木單抗濃度(溶于WFI) 的關系。X 使用1. IrnPas作為假定的樣品粘度，用SOP測定，y 使用1. 9mPas作為假定的 樣品粘度，用SOP測定。圖6用圖形描述了流體動力學直徑(峰單體)和阿達木單抗濃度(溶于WFI)的 關系。X 使用1. IrnPas作為假定的樣品粘度，用SOP測定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣 品粘度，用SOP測定。圖7用圖形描述了流體動力學直徑(ζ-平均值)和J695濃度(溶于WFI)的關系。 X 使用1. ImPas作為假定的樣品粘度，用SOP測定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣品粘度， 用SOP測定。圖8用圖形描述了流體動力學直徑(峰單體)和J695濃度(溶于WFI)的關系。 X 使用1. ImPas作為假定的樣品粘度，用SOP測定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣品粘度， 用SOP測定。圖9顯示了依賴于注射用水中阿達木單抗濃度的阿達木單抗的賴氨酸0、1和2的 總和]。圖10顯示了依賴于注射用水中J695濃度的J695的峰1_7的總和]。圖11顯示了依賴于注射用水中J695濃度的J695的酸性峰的總和]。圖12顯示了依賴于注射用水(WFI)中J695濃度的J695的堿性峰的總和]。圖13顯示了在實施例12中進行的滲析的效率，顯示出組分的減少導致的制劑的 重量摩爾滲透壓濃度和電導率(BDS，74mg/ml，IOml樣品體積，SpectraPor7 MWCO 10k)。圖14顯示了滲析的阿達木單抗本體溶液的PH水平的穩定性。顯示出在相對于 去離子水滲析(1 1，000，000)之前和之后的pH水平(BDS，74mg/ml，10ml樣品體積， SpectraPor7 MWCO10k)。圖15顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達木單抗溶液的瓶子
圖譜密度數據。圖16顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達木單抗溶液的瓶子 圖譜PH數據。圖17顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達木單抗溶液的瓶子圖譜濃度數據。圖18顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達木單抗溶液的瓶子
圖譜重量摩爾滲透壓濃度數據。圖19顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達木單抗溶液的瓶子
圖譜電導率數據。圖20顯示了在DF/UF后在2-8°C儲存8. 5個月(下面曲線)或在DF/UF后在_80°C 儲存4. 5個月(上面曲線)的低離子型阿達木單抗(在圖20中稱作D2E7)溶液的SEC分 析。圖21顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在不同溶液和在水中配制的單克隆抗體1D4. 7的穩定性。圖22顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在水中和用不同緩沖劑配制的單克隆抗體13C5. 5的穩定性。空白=WFI對 照樣品。圖23顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和Τ4)在水中和添加不同賦形劑配制的單克隆抗體13C5. 5的穩定性。空白=WFI對 照樣品。圖24顯示了阿達木單抗濃度(WFI制劑)和溶液ρΗ對溶液粘度的影響。圖25顯示了不同濃度和ρΗ值的阿達木單抗溶液(WFI制劑)的濁度數據。圖26顯示了不同PH值和濃度的阿達木單抗溶液(WFI制劑)的流體動力學直徑 (Dh)數據。圖27顯示了不同濃度的阿達木單抗在ρΗ5水溶液中的按強度的大小分布圖(Dh測
量)O圖28顯示了 lOOmg/mL阿達木單抗在不同ρΗ水平的水中的按強度的大小分布。圖29也顯示了 100mg/mL阿達木單抗在不同ρΗ水平的水中的按強度的大小分布。圖30顯示了水中阿達木單抗的單體含量(SEC)。圖31顯示了水中阿達木單抗的聚集體含量(SEC)。圖32顯示了作為溶液溫度的函數的2種J695溶液(WFI制劑)的粘度。圖33用圖形描述了在許多不同制劑的重復冷凍/融化(f/t)循環過程中通過在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測量的1D4. 7抗體穩定性。圖34用圖形描述了在許多不同制劑的重復冷凍/融化(f/t)循環過程中通過在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 10 μ m)測量的13C5. 5抗體穩定性。圖35用圖形描述了在許多不同制劑的重復冷凍/融化(f/t)循環過程中通過在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測量的13C5. 5抗體穩定性。圖36用圖形描述了在許多不同制劑的重復冷凍/融化(f/t)循環過程中通過在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測量的7C6抗體穩定性。發明詳述I.定義為了更容易地理解本發明，首先定義一些術語。本文使用的術語"酸性組分"是指具有酸性pH(即小于7. 0)的試劑，包括溶液。酸性組分的實例包括磷酸，鹽酸，醋酸，檸檬酸，草酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，蘋果酸，羥乙酸 和富馬酸。在一個實施方案中，本發明的水制劑不包含酸性組分。本文使用的術語“抗氧化劑“意在表示會抑制氧化并從而用于預防氧化過程對 制品的破壞的試劑。這樣的化合物包括，作為實例且不限于，丙酮，硫酸氫鈉，抗壞血酸，抗 壞血酸棕櫚酸酯，檸檬酸，丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，氫化亞磷酸，單硫代甘 油，沒食子酸丙酯，蛋氨酸，抗壞血酸鈉，檸檬酸鈉，硫化鈉，亞硫酸鈉，亞硫酸氫鈉，甲醛合 次硫酸氫鈉，巰基乙酸，偏亞硫酸氫鈉，EDTA(乙二胺四乙酸鹽)，三胺五乙酸和本領域普通 技術人員已知的其它抗氧化劑。術語"水制劑"是指其中溶劑是水的溶液。本文使用的術語"堿性組分"是指堿性(即PH大于7. 0)的試劑。堿性組分的實 例包括氫氧化鉀(KOH)和氫氧化鈉(NaOH)。本文使用的術語"填充劑"意在表示用于增加可重配的固體的體積和/或在制 備過程中輔助控制制劑的性質的化合物。這樣的化合物包括，作為實例且不限于，葡聚糖， 海藻糖，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，乳糖，肌醇，山梨醇，二甲基亞砜，甘油，白蛋白，乳糖醛酸 鈣，和本領域普通技術人員已知的其它填充劑。本文使用的術語"電導率"是指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。一般而 言，導電性或比導電率是物質的傳導電流的度量。在溶液中，電流通過離子運輸來流動。因 此，隨著水溶液中存在的離子數量的增加，溶液會具有更高的電導率。電導率的度量單位 是mmhos(mS/cm)，可以使用出售的電導率計量器來測量，例如，購自OrionResearch，Inc. (Beverly,MA)0通過改變其中的離子濃度，可以改變溶液的電導率。例如，可以改變溶液中 離子型賦形劑的濃度，以便實現希望的電導率。本文使用的術語“冷凍保護劑“概括地包括為蛋白提供對抗冷凍誘發的應激的 穩定性的試劑。冷凍保護劑的實例包括多元醇例如甘露醇，且包括糖例如蔗糖，以及包括表 面活性劑例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙二醇，等。冷凍保護劑也有助于制劑的張力。本文使用的術語"超濾"或"UF"是指其中對溶液或懸浮液進行半透膜處理的 任意技術，所述半透膜截留下大分子并允許溶劑和小溶質分子穿過。超濾可以用于增加溶 液或懸浮液中大分子的濃度。在一個優選的實施方案中，超濾用于增加蛋白在水中的濃度。本文使用的術語"滲濾"或"DF"用于指一類專門的過濾，其中用溶劑稀釋滲余 物，并再次過濾，以降低可溶的滲透物組分的濃度。滲濾可以導致或不導致截留組分(包 括，例如，蛋白)的濃度的增加。例如，在連續滲濾中，以與產生濾液相同的速率將溶劑連續 加入滲余物。在該情況下，滲余物體積和截留組分的濃度在過程中不變。另一方面，在不連 續的或序貫的稀釋滲濾中，在超濾步驟之后是向滲余物側加入溶劑；如果加入滲余物側的 溶劑的體積不等于或大于產生的濾液的體積，則截留組分會具有高濃度。滲濾可以用于改 變大分子溶液或懸浮液的PH、離子強度、鹽組成、緩沖液組成或其它性質。本文使用的術語"滲濾/超濾"或"DF/UF"是指序貫或同時完成超濾和/或滲 濾的任意過程、技術或技術組合。本文使用的術語"滲濾步驟"是指在滲濾處理中總體積交換。術語"賦形劑"是指可以加入制劑中來提供希望的稠度(例如，改變容積性質)、 提高穩定性和/或調節重量摩爾滲透壓濃度的試劑。常用的賦形劑的實例包括、但不限于，
13糖，多元醇，氨基酸，表面活性劑，和聚合物。在本文中可互換使用的術語"離子型賦形劑" 或"可離子化賦形劑"是指具有凈電荷的試劑。在一個實施方案中，離子型賦形劑在某些 制劑條件(例如PH)下具有凈電荷。離子型賦形劑的實例包括、但不限于，組氨酸，精氨酸， 和氯化鈉。在本文中可互換使用的術語"非離子型賦形劑"或"非可離子化賦形劑"是指 不具有凈電荷的試劑。在一個實施方案中，非離子型賦形劑在某些制劑條件(例如PH)下 不具有凈電荷。非離子型賦形劑的實例包括、但不限于，糖(例如，蔗糖)，糖醇(例如，甘露 醇)，和非離子型表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)。本文使用的術語"第一蛋白溶液"或"第一溶液"是指用于本發明的方法中的 起始蛋白溶液或原料，即滲濾進水的起始蛋白溶液。在一個實施方案中，第一蛋白溶液包含 離子型賦形劑、非離子型賦形劑和/或緩沖系統。術語顆粒的"流體動力學直徑"或"Dh"是指具有水的密度和與顆粒相同的速 度的球的直徑。因而，本文使用的術語"蛋白的流體動力學直徑"是指使用動態光散射 (DLS)測得的溶液中蛋白的大小。DLS-測量儀器會以固定的散射角測量從溶液中的蛋白散 射的光的強度的時間依賴性波動。從強度的時間依賴性波動的強度自相關函數確定蛋白 Dh。使用DLS儀器軟件處理散射強度數據，以確定散射分子(即蛋白樣本)的流體動力學 直徑的值和尺寸分布。本文使用的術語"凍干保護劑"包括在干燥或冷凍干燥過程中去除水時為蛋白 提供穩定性的試劑，例如，通過維持蛋白的適當構象。凍干保護劑的實例包括糖，尤其二糖 或三糖。冷凍保護劑也可以提供凍干保護劑效應。當提及組合物例如水制劑時，本文使用的術語"藥物"可以用于治療疾病或病癥。術語"蛋白"意在包括這樣的氨基酸序列，其鏈長度足以產生更高水平的二級和 /或三級和/或四級結構。這是為了區別于不具有這種結構的"肽"或其它小分子量藥物。 在一個實施方案中，本文使用的蛋白具有至少約47kD的分子量。在本文使用的定義中包含 的蛋白的實例包括治療蛋白。“治療活性的蛋白"或"治療蛋白"是指可以用于治療目的 (即用于治療受試者的病癥)的蛋白。應當指出，盡管治療蛋白可以用于治療目的，本發明 不限于這樣的用途，因為所述蛋白也可以用于體外研究。在一個優選的實施方案中，治療蛋 白是融合蛋白或抗體或其抗原結合部分。在一個實施方案中，本發明的方法和組合物包含 至少兩種不同的蛋白，它們定義為具有不同氨基酸序列的兩種蛋白。其它不同的蛋白不包 括蛋白的降解產物。本文使用的短語"將蛋白溶于水"是指蛋白制劑，其中將蛋白溶于已經通過DF/ UF處理減少其中小分子(例如，緩沖劑，賦形劑，鹽，表面活性劑)的數量的水溶液。盡管通 過DF/UF處理不能在絕對意義上完全消除小分子，通過應用DF/UF可實現的理論上的賦形 劑減少足以排它地主要在水中建立蛋白制劑。例如，以連續模式DF/UF方法使用6體積交 換，理論上的賦形劑減少是 99. 8% (ci = e_x，其中ci是起始賦形劑濃度，χ是體積交換 數目)。術語"藥物制劑"是指這樣的制品，其形式允許活性成分的生物活性有效、且因 此可以施用給受試者用于治療用途。“穩定的"制劑是這樣的制劑，其中的蛋白在儲存后基本上保留它的物理穩定性
14和/或化學穩定性和/或生物活性。用于測量蛋白穩定性的各種分析技術可從本領域獲 知，評論見，例如，P 印 tide and ProteinDrug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. ,Marcel Dekker, Inc. , NewYork, N. Y. , Pubs. (1991)禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 29-90(1993)。在一個實施方案中，根據溶液中單體蛋白的百分比，降解的(例如，破碎的) 和/或聚集的蛋白的低百分比，確定蛋白的穩定性。例如，包含穩定蛋白的水制劑可以包括 至少95%單體蛋白。或者，本發明的水制劑可以包括不超過5%聚集體和/或降解的蛋白。術語"穩定劑"是指提高或另外地增強穩定性的賦形劑。穩定劑包括、但不限于， α -硫辛酸，α -生育酚，抗壞血酸棕櫚酸酯，苯甲醇，生物素，重亞硫酸鹽，硼，丁基化的羥 基茴香醚(BHA)，丁基化的羥基甲苯(BHT)，抗壞血酸和它的酯，類胡蘿卜素，檸檬酸鈣，乙 酰基-L-肉堿，螯合劑，軟骨素，鉻，檸檬酸，輔酶Q-10，半胱氨酸，半胱氨酸鹽酸鹽，3-去氫 莽草酸(DHS)，EDTA(乙二胺四乙酸；乙二胺四乙酸二鈉)，硫酸亞鐵，葉酸，富馬酸，沒食子 酸烷基酯，大蒜，葡糖胺，葡萄籽提取物，gugul，鎂，蘋果酸，偏亞硫酸氫鹽，N-乙酰基半胱氨 酸，煙酸，煙酰胺，蕁麻根，鳥氨酸，沒食子酸丙酯，pycnogenol，沙巴棕，硒，亞硫酸氫鈉，偏 重亞硫酸鈉，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀，酒石酸，硫代硫酸鹽，硫代甘油，硫代山梨醇，生育酚和它 們的酯，例如，生育酚醋酸酯，生育酚琥珀酸酯，tocotrienal, d_ α -生育酚醋酸酯，維生素 A和它的酯，維生素B和它的酯，維生素C和它的酯，維生素D和它的酯，維生素E和它的酯， 例如，維生素E醋酸酯，鋅，和它們的組合。術語"表面活性劑"概括地包括這樣的試劑，它們保護蛋白免受空氣/溶液界面 誘發的應激和溶液/表面誘發的應激。例如表面活性劑可以保護蛋白免于聚集。合適的 表面活性劑可以包括，例如，聚山梨醇酯，聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35. RTM.或泊洛沙姆 例如吐溫20，吐溫80或泊洛沙姆188。優選的去污劑是泊洛沙姆，例如，泊洛沙姆188，泊 洛沙姆407 ；聚氧乙烯烷基醚，例如Brij 35. RTM.，克列莫佛(Cremophor)Α25, Sympatens ALM/230 ；和聚山梨醇酯/吐溫，例如，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，和泊洛沙姆，例如，泊 洛沙姆188，和吐溫，例如，吐溫20和吐溫80。本文使用的術語"張力調節劑"意在表示可以用于調節液體制劑的張力的一種 或復數種化合物。合適的張力調節劑包括甘油，乳糖，甘露醇，右旋糖，氯化鈉，硫酸鎂，氯化 鎂，硫酸鈉，山梨醇，海藻糖，蔗糖，棉子糖，麥芽糖和本領域普通技術人員已知的其它物質。 在一個實施方案中，液體制劑的張力接近血液或血漿的張力。術語"水"意在表示已經純化(通常通過蒸餾或反滲透)去除污染物的水，在本 文中也指"純水"。在一個優選的實施方案中，在本發明的方法和組合物中使用的水不含 有賦形劑。在一個實施方案中，水包括適合施用給受試者的無菌水。在另一個實施方案中， 水意在包括注射用水(WFI)。在一個實施方案中，水是指蒸餾水或適用于體外試驗的水。在 一個優選的實施方案中，僅使用水作為滲濾介質，根據本發明的方法進行滲濾。本文使用的術語"抗體"包括完整抗體和其任意抗原結合片段(即"抗原結合 部分")或單鏈。“抗體"是指包含通過二硫鍵相互連接的至少2個重(H)鏈和2個輕(L) 鏈的糖蛋白或其抗原結合部分。每個重鏈包含一個重鏈可變區(在本文中縮寫為Vh)和一 個重鏈恒定區。重鏈恒定區包含3個結構域，CH1，CH2和CH3。每個輕鏈包含一個輕鏈可變 區(在本文中縮寫為VJ和一個輕鏈恒定區。輕鏈恒定區包含一個結構域CL。Vh和八區 域可以進一步細分成稱作互補性守的區域中。每個Vh和\由3個CDR和4個FR組成，它們按照下述次序從氨基端向羧基 端排列=FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用 的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述因子包 括免疫系統的不同細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。本文使用的術語抗體的“抗原結合部分"(或簡稱"抗體部分")是指抗體的一 個或更多個片段，其保留特異性地結合抗原(例如，TNFa，IL_12)的能力。已經證實，抗體 的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來實現。術語抗體的"抗原結合部分"所包含的結 合片段的實例包括(i)Fab片段，由\、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2 片段，包含在鉸鏈區通過二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和Cm結構域 組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的\和Vh結構域組成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward 等人，(1989)Nature341 544-546)，它由Vh或八結構域組成；和(vi)分離的互補性決定區 (CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結構域\和Vh由分開的基因編碼，使用重組方法，可以通 過合成的連接物使它們結合，將它們制成單個蛋白鏈，其中\和Vh區域配對，形成單價分子 (稱作單鏈 Fv(scFv)；參見例如，Bird 等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包含在術語抗體的" 抗原結合部分"中。使用本領域技術人員已知的常規技術，得到這些抗體片段，并以與完整 抗體相同的方式，篩選片段的效用。在本發明的一個實施方案中，抗體片段選自Fab，Fd， Fd'，單鏈 Fv (scFv)，scFva,和結構域抗體(dAb)。更進一步，抗體或其抗原結合部分可以是更大的免疫粘附分子的一部分，所述更 大的免疫吸附分子由抗體或抗體部分與一個或更多個其它蛋白或肽的共價或非共價締 合來形成。這些其它蛋白或肽可以具有下述功能，即允許純化抗體或其抗原結合部分或 允許它們彼此或與其它分子締合。因而，這樣的免疫粘附分子的實例包括使用抗生蛋白 鏈菌素核心區來制備四聚體單鏈可變片段(scFv)分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)和使用半胱氨酸殘基、標記肽和C-末端聚組氨 酸標簽來制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。使用常規技術，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，可以從完整 抗體制備抗體部分，例如Fab和F(ab' )2片段。此外，使用標準的重組DNA技術，可以得到 抗體、抗體部分和免疫粘附分子。當它們屬于形成同源對或組的結構家族或源自這樣的家族且保留該特征時，2個 抗體結構域是"互補的"。例如，抗體的Vh結構域和\結構域是互補的；2個Vh結構域不 是互補的，2個\結構域不是互補的。在免疫球蛋白超家族的其它成員中可以發現互補結 構域，例如T-細胞受體的V α和νβ (或γ和δ)結構域。術語"結構域"是指折疊的蛋白結構，其獨立于蛋白的其它部分地保留它的三級 結構。一般而言，結構域負責蛋白的獨立的功能性質，且在許多情況下，可以添加、去除或轉 移至其它蛋白，而不喪失蛋白的剩余部分和/或結構域的功能。單個抗體可變結構域是指 折疊的多肽結構域，其包含抗體可變結構域的序列特征。因此，它包括完整的抗體可變結構 域和修飾的可變結構域，例如其中一個或更多個環被替換為不是抗體可變結構域特征性的 序列，或已經截短的或包含N-或C-末端延伸的抗體可變結構域，以及至少部分地保留全長 結構域的結合活性和特異性的折疊的可變結構域片段。
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可以組合本發明的可變結構域，形成一組結構域；例如，可以組合互補結構域，例 如\結構域可以與Vh結構域組合。也可以組合非互補結構域。可以以許多方式組合結構 域，包含通過共價或非共價方式連接結構域。“ dAb"或"結構域抗體"是指特異性地結合抗原的單個抗體可變結構域(Vh或 Vl)多肽。本文使用的術語"抗原結合區"或"抗原結合部位"是指抗體分子的部分或其 抗原結合部分，它含有與抗原相互作用的氨基酸殘基，且賦予抗體對抗原的特異性和親和 力。
術語"表位"意在指能在一個或更多個抗體的抗原結合區被抗體識別和結合的 任意分子的部分。在本發明的上下文中，第一和第二"表位"理解為不同的且不被單個單 特異性抗體或其抗原結合部分結合的表位。短語"重組抗體"是指通過重組方式制備的、表達的、建立的或分離的抗體，例如 使用轉染進宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，從重組的、組合的抗體文庫分離的抗體， 從人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如，小鼠)分離的抗體(參見例如，Taylor等人 (1992)Nucl. AcidsRes. 20 =6287-6295)或通過任意其它方式制備、表達、建立或分離的抗 體，所述其它方式包括將特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)剪接到 其它DNA序列。重組抗體的實例包括嵌合的、⑶R-移植的和人化的抗體。術語〃人抗體〃是指具有與例如Kabat等人(參見Kabat，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242)所述的人種系免疫球蛋白序列相對應的或源自它們的可變 區和恒定區的抗體。但是，本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的 氨基酸殘基(例如，通過隨機的或位點特異性的體外誘變或通過體內體細胞突變引入的突 變)，例如在⑶Rs和尤其⑶R3中。本發明的重組人抗體具有可變區，也可以包含恒定區域，它們源自人種系免疫球 蛋白序列(參見 Kabat 等人(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第 5 版，U. S. D^artment of Healthand Human Services，NIH
發明者A·巴特, H-J·克洛司, K·卡樂塔, M·泰斯寇普, W·福侖賀夫 申請人:雅培制藥有限公司