激活蛋白受體樣激酶-1組合物及使用方法
                            
            
                            
            文檔序號：1146709閱讀：1752來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：激活蛋白受體樣激酶-1組合物及使用方法
            
技術領域：
            本發明關注涉及使用激活蛋白受體樣激酶-1 (activin receptor-likekinase-1, ALK-1)拮抗劑來治療與血管發生(angiogenesis)和/或淋巴管發生(Iymphangiogenesis) 有關的病癥的方法和組合物。
            
背景技術：
            維管聯結(vascular supply)的發育是許多生理性和病理性過程的基本要求。 活躍生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應。它們通過生成促血管發生因子 來滿足這一需要，所述促血管發生因子經由稱為血管發生(angiogenesis)的過程促進新 血管形成。血管的管形成是復雜但有序的生物學事件，牽涉所有或許多以下步驟a)自 已有的內皮細胞(EC)增殖出EC或自祖細胞分化出EC;b)EC遷移并接合以形成索樣結 構；c)血管索然后發生管發生(tubulogenesis)以形成具有中央內腔的血管；d)已有的 索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初級血管叢發生進一步重塑(remodeling)和整形 (reshaping)；及f)內皮周細胞(peri-endothelial cell)被募集來包圍內皮管，為血管提 供維持和調控功能，此類細胞包括用于小毛細血管的周細胞、用于更大血管的平滑肌細胞、 和心臟中的心肌細胞。Hanahan，D. Science 277 48-50 (1997) ；Hogan, B. L. & Kolodziej， P. A. Nature Reviews Genetics. 3 513-23 (2002) ;Lubiirsky，Β· & Krgisnow，M· A. Cell. 112 : 19-28(2003)。現在完全確立了血管發生牽涉多種病癥的發病機理。這些包括實體瘤和轉移、 動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內新血管疾病諸如增殖性視 網膜病例如糖尿病性視網膜病、年齡相關黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組 織和其它組織的免疫排斥、類風濕性關節炎、和銀屑病。Folkman等，J. Biol. Chem.，267  10931-10934(1992) ；Klagsbrun 等，Annu. Rev.Physiol. 53 :217_239(1991)；及 Garner Α. , “ Vasculardiseases “,于Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A.，Klintworth GK，編，第 2 版(Marcel Dekker, NY, 1994)，pp 1625-1710。在腫瘤生長的情況中，血管發生對于自增生至瘤形成的轉換，及為腫瘤的生長 和轉移提供營養似乎是至關重要的。Folkman等，Nature 339:58(1989)。新血管形成 (neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優勢和增殖自治。腫瘤 通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米 的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持“休眠”狀態而不進一步生長和傳播。有些腫 瘤細胞然后轉向血管發生表型以激活內皮細胞，所述內皮細胞增殖并成熟成新的毛細血 管。這些新形成的血管不僅讓原發性腫瘤繼續生長，而且讓轉移性腫瘤細胞傳播并再建 群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數種其它腫瘤的患者
            
4存活之間觀察到了相關性。Weidner 等，N. Engl. J. Med 324:1-6(1991) ；Horak 等，Lancet 340 1120-1124(1992) ；Macchiarini 等，Lancet340 :145_146 (1992)。尚未完全了解控制血 管發生轉換的精確機制，但是認為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發生刺激物與抑制物 的凈平衡(FolkmanNat Med 1(1) :27_31 (1995))。當前公認轉移對大多數(估計有90% )源自實體瘤的死亡負有責任(Gupta和 Massague, Cell 127，679-695 (2006))。轉移的復雜過程涉及一系列不同步驟，包括腫瘤細 胞脫離原發性腫瘤，腫瘤細胞內侵入淋巴管或血管，及腫瘤細胞在第二部位外侵和生長。對 許多腫瘤類型中區域性淋巴結的分析提示淋巴脈管系統是人類癌癥擴散的一個重要途徑。 此外，在幾乎所有癌瘤中，腫瘤細胞在淋巴結中的存在是最重要的不利預后因素。雖然先 前認為此類轉移唯一地涉及惡性細胞沿腫瘤附近現有淋巴管通行，但是最近的實驗性研究 和臨床病理學報告(綜述見 Achen 等，Br J Cancer 94(2006)，1355-1360 及 Nathanson, Cancer 98，413-423 (2003))提示淋巴管發生能被實體瘤誘導且能促進腫瘤擴散。這些和其 它最新研究提示靶向淋巴系統和淋巴管發生可能是限制癌癥轉移發生的一種有用治療策 略，這會給許多患者帶來顯著好處。發明概述本發明部分基于如下的發現，即調控ALK-I途徑的藥劑能夠削弱血管發生和淋巴 管發生。用ALK-I拮抗劑處理導致增強的內皮細胞萌芽、無組織的周細胞(pericyte)、和 不適當的血管發育(包括腫瘤和淋巴脈管系統)。用ALK-I拮抗劑處理腫瘤模型導致數 種類型的癌癥中對腫瘤生長的抑制。因而，本發明提供了用于破壞周細胞組織(pericyte organization)、抑制血管發生和/或淋巴管發生及用于靶向與血管發生和/或淋巴管發生 有關的病理學疾患的方法、組合物、試劑盒和制品。一方面，本發明提供了一種抑制淋巴管發生的方法，包括對需要抑制淋巴管發生 的受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述淋巴管發生得到抑制。在一些實施方案中， 所述受試者患有例如腫瘤(tumor)、癌癥(cancer)、細胞增殖性病癥(cell proliferative disorder)、黃斑變性(macular degeneration)、炎癥介導疾病(inflammatory mediated disease)、類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis)、糖尿病視網膜病(diabetic retinopathy)或銀屑病(psoriasis)。在一些實施方案中，所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病 癥是癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母細胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、或白血 病(leukemia)。另一方面，本發明提供了一種用于在受試者中治療與淋巴管發生有關的病理學疾 患的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述與淋巴管發生有關的 病理學疾患得到治療。所述與淋巴管發生有關的病理學疾患可以是例如腫瘤、癌癥、細胞增 殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑病。在一些實 施方案中，所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥是癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、或白血病。本發明還提供了 ALK-I拮抗劑在制備用于治療性和/或預防性處理病癥(諸如 與血管發生或淋巴管發生有關的病理學疾患)的藥物中的用途。此類疾患包括例如腫瘤、 癌癥、細胞增殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑 病。還提供了 ALK-I拮抗劑在制備用于治療性和/或預防性處理腫瘤轉移的藥物中的用途。又一方面，本發明提供了一種在受試者中抑制腫瘤淋巴管發生的方法，包括對所
            
5述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述腫瘤淋巴管發生得到抑制。還提供了一種 在受試者中抑制或預防腫瘤轉移的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑， 由此所述腫瘤轉移得到抑制或預防。在一些實施方案中，所述受試者已經形成或有風險形 成腫瘤轉移。所述腫瘤轉移可以是例如在淋巴系統中或在遠距離器官中。另一方面，本發明提供了一種在受試者中破壞周細胞組織(organization)的方 法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述周細胞組織得到破壞。在一些 實施方案中，所述受試者患有例如腫瘤、癌癥、細胞增殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、 類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑病。在一些實施方案中，所述腫瘤、癌癥或細胞增 殖性病癥是癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、或白血病。又一方面，本發明提供了一種在受試者中抑制腫瘤生長的方法，包括對所述受試 者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述腫瘤生長得到抑制。本發明還提供了一種在受試 者中治療腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮 抗劑，由此所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥得到治療。在一些實施方案中，所述腫瘤、癌癥 或細胞增殖性病癥是例如癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、或白血病。在一些實施方案中，本發明的方法進一步包括對所述受試者施用有效量的抗血管 發生劑。在一些實施方案中，所述抗血管發生劑是血管內皮生長因子(VEGF)的拮抗劑，例 如抗VEGF抗體。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體是貝伐單抗(bevacizumab)。在一些 實施方案中，本發明的方法進一步包括施用一種或多種化療劑。本發明還提供了一種在具有與血管發生有關的病理學疾患的受試者中增強抗血 管發生劑功效的方法，包括與所述抗血管發生劑組合地對所述受試者施用有效量的ALK-I 拮抗劑，由此增強所述抗血管發生劑的抑制性活性。在一些實施方案中，所述與血管發生有 關的病理學疾患是腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥。在一些實施方案中，所述ALK-I拮抗劑是ALK-I免疫粘附素。在一些實施方案 中，所述ALK-I免疫粘附素包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基22-352、SEQ ID NO 4的殘基 22-349、SEQ ID NO 6 的殘基 22-347、SEQ ID NO 8 的殘基 22-350 或 SEQ ID NO 10 的殘 基22-350。在其它實施方案中，所述ALK-I拮抗劑是抗ALK-I抗體或其抗原結合片段。還提供了 ALK-I拮抗劑，其用于預防、抑制或治療腫瘤轉移或者治療腫瘤、癌癥或 細胞增殖性病癥。所述ALK-I拮抗劑可以是例如ALK-I免疫粘附素或抗ALK-I抗體或其抗 原結合片段。在一些實施方案中，所述ALK-I免疫粘附素包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基 22-352、SEQ ID NO 4 的殘基 22-349、SEQ ID NO 6 的殘基 22-347、SEQ ID NO 8 的殘基 22-350或SEQ ID NO  10的殘基22-350。本發明還提供了一種用于治療腫瘤、癌癥或細胞 增殖性病癥的組合物，其包含有效量的ALK-I拮抗劑和藥學可接受載體。在一些實施方案 中，所述ALK-I拮抗劑是ALK-I免疫粘附素。在一些實施方案中，所述ALK-I免疫粘附素包 含 SEQ ID NO 2 的氨基酸殘基 22-352、SEQ ID NO 4 的殘基 22-349、SEQ ID NO 6 的殘基 22-347,SEQ ID NO :8的殘基22-350或SEQ IDNO  10的殘基22-350。在一些實施方案中， 所述ALK-I拮抗劑是抗ALK-I抗體。一方面，本發明提供了一種制品，其包含容器和裝在該容器內的組合物，其中所述 組合物包含ALK-I拮抗劑。另一方面，本發明提供了一種試劑盒，其包含ALK-I拮抗劑和關 于使用該ALK-I拮抗劑的指令。還提供了一種用于制備組合物的方法，包括混合治療有效
            
6量的ALK-I拮抗劑和藥學可接受載體。附圖簡述
            

            
圖1A-1B是在ALK1. Fc (5 μ g/ml)缺失(圖1A)或存在(圖1B)的情況中HUVEC 萌芽測定法第9天在3-D纖維蛋白凝膠中拍攝的相差顯微術圖像。圖2A-2F是來自于Pll收集并用抗⑶31和凝集素-FITC染色的大鼠視網膜的共 焦圖像。在出生后第4天(P4)、P6和P9給新生大鼠i. p.注射10mg/kgALKl. Fc或PBS。圖3A-3F是來自于Pll收集并用偶聯有Cy3的抗α平滑肌肌動蛋白(ASMA)和凝 集素-FITC染色的大鼠視網膜的共焦圖像。于Ρ4、Ρ6和Ρ9給新生大鼠i.p.注射10mg/kg ALKL Fc 或 PBS。圖4A-4F是來自于Pll收集并用偶聯有Cy3的抗α平滑肌肌動蛋白(ASMA)和凝 集素-FITC染色的大鼠視網膜的共焦圖像。于Ρ4、Ρ6和Ρ9給新生大鼠i.p.注射10mg/kg ALKL Fc 或 PBS。圖 5A-5B 的圖顯示了 ALK1. Fc (10mg/kg)在 HM7 (圖 5A)和 MV522 (圖 5B)異種移 植物中抑制腫瘤生長。呈現了腫瘤體積均值及SE。圖 6A-6B 的圖顯示了 ALK1. Fc (10mg/kg)在 C6 (圖 6A)和 Calu6 (圖 6B)異種移植 物中抑制腫瘤生長。呈現了腫瘤體積均值及SE。圖7的圖顯示了 ALK1. Fc在與抗VEGF組合時在HM7異種移植物中具有疊加性抗 腫瘤活性。圖8的圖顯示了 ALK1. Fc在與抗VEGF組合時在LL2異種移植物中具有加性抗腫 瘤活性。圖9A-9D的共焦圖像顯示了用PBS (圖9A)、ALK1. Fc (圖9B)、抗VEGF抗體 (B20-4. 1，5mg/kg)(圖9C)或抗VEGF抗體和ALK1. Fc (圖9D)處理的LL2腫瘤模型小鼠中
            
的腫瘤血管密度。圖10A-10B是來自用PBS (圖10A)或ALK1. Fc (圖10B)處理的新生小鼠的小腸絨 毛的共焦圖像。將組織用抗CD31染色以顯示毛細血管，及用抗LYVE-I染色以顯示毛細淋巴管。圖11A-11B是來自用PBS (圖11A)或ALK1. Fc (圖11B)處理的新生小鼠的單一小 腸絨毛的共焦圖像。將組織用抗⑶31染色以顯示毛細血管，及用抗LYVE-I染色以顯示毛 細淋巴管。圖12A-12F是來自用PBS (圖12A-C)或ALK1. Fc (圖12D-F)處理的新生小鼠的小 鼠尾部皮膚的共焦圖像。將組織用抗CD31染色以顯示毛細血管，及用抗LYVE-I染色以顯 示毛細淋巴管。圖13A-B的共焦圖像顯示了用PBS (圖13A)或ALK1. Fc (圖13B)處理的TIB68腫 瘤模型小鼠中的周細胞組織。圖14顯示了來自于P8收集并用抗⑶31染色的大鼠視網膜的共焦圖像。于P4和 P6 給小鼠 i. p.注射 PBS、ALK1. Fe、ALK1. Fe. 2、ALK1. Fe. 4 或 ALK1. Fe. 5。發明詳述除非另有說明，本發明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細 胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域的技術范圍內。這些技術在文
            
7獻中有充分解釋，諸如"Molecular Cloning =ALaboratory Manual，，，第二版(Sambrook 等， 1989) ；"OligonucleotideSynthesis，，(Μ· J. Gait 編，1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney 編，1987) ；“Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc. ) ；"Current Protocolsin Molecular Biology”(F. M. Ausubel 等編，1987，及其周期性的更新)；"PCR  The Polymerase Chain Reaction”(Mullis 等編，1994)。除非另有定義，本文中所使用的技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員 通常的理解具有相同的含義。以下文獻為本領域技術人員提供了本申請中所使用的許多術 語的一般性指導:Singleton 等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology, 第二片反，J. Wiley & Sons (New York，N. Y. 1994)；及 March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure，第四片反，John Wiley & Sons (New York, N. Y. 1992)。通過述及來完整收錄本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物。定義術語“ALK-1” (可互換地稱為“激活蛋白受體樣激酶-I (activinrec印tor-like kinase)”)，在用于本文時，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異 的(無論是天然的或合成的)ALK-I多肽。術語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短或分 泌形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在 的等位變體。術語“野生型ALK-1” 一般指包含天然存在ALK-I蛋白的氨基酸序列的多肽。 術語“野生型ALK-I序列”一般指在天然存在ALK-I中發現的氨基酸序列。“嵌合ALK-I ”分子指包含融合或鍵合至異源多肽的全長ALK-I或其一個或多個結 構域的多肽。嵌合ALK-I分子一般會與天然存在ALK-I共享至少一種生物學特性。嵌合 ALK-I分子的一個例子是為純化目的而帶上表位標簽的嵌合ALK-I分子。另一種嵌合ALK-I 分子是ALK-I免疫粘附素。在用于本文時，術語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(“粘附素”)的結合特異性與 免疫球蛋白恒定域的效應器功能聯合起來的抗體樣分子。在結構上，免疫粘附素包括不同 于抗體的抗原識別和結合位點(即是“異源”的)、具有期望結合特異性的氨基酸序列和免 疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配 體的結合位點的連續氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫 球蛋白獲得，諸如 IgG-l、IgG-2、IgG-3 或 IgG_4 亞型、IgA (包括 IgA-I 和 IgA_2)、IgE、IgD 或1#。術語“ALK-1免疫粘附素”與術語“ALK-1免疫球蛋白嵌合物”可互換使用，指將 ALK-I分子(天然的或變異的)的至少一部分與免疫球蛋白序列組合起來的嵌合分子。在 有些情況中，ALK-I免疫粘附素包含ALK-I的胞外結構域(EOT)或其足以結合ALK-I配體的 部分。在有些實施方案中，ALK-I免疫粘附素的ALK-I部分的N端可以以SEQ ID NO 2的 Asp22至Ser27 (含端點)的任何氨基酸殘基開始，而ALK-I免疫粘附素的ALK-I部分的C 端可以以SEQ ID NO :2的SerllO至Glu 118 (含端點)的任何氨基酸殘基結束。在有些實 施方案中，ALK-I免疫粘附素包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基1_118。在有些實施方案中， ALK-I免疫粘附素包含SEQ ID NO 2的氨基酸殘基22-118、SEQ ID NO 2的殘基23-118、 SEQ ID NO 2 的殘基 24-118、SEQ ID NO 2 的殘基 25-118、SEQ ID NO 2 的殘基 26-118、 或SEQ ID NO :2的殘基27-118。在有些實施方案中，未加工的ALK-I免疫粘附素是ALK1.
            
8Fc (SEQ ID NO :2)、ALK1. Fe. 2 (SEQ ID NO 4)、ALK1. Fe. 3 (SEQ ID NO 6)、ALK1. Fe. 4 (SEQ IDNO :8)或ALK1. Fe. 5 (SEQ ID NO  10)。在有些實施方案中，ALK-I免疫粘附素包含SEQ ID NO 2 的氨基酸殘基 22-352、SEQ ID NO 4 的殘基 22-349、SEQID NO 6 的殘基 22-347、SEQ ID NO :8的殘基22-350或SEQ ID NO  10的殘基22-350。免疫球蛋白序列優選但非必須 是免疫球蛋白恒定域(Fe區)。免疫粘附素可擁有人抗體的許多有價值的化學和生物學特 性。由于免疫粘附素可以自連接至適宜人免疫球蛋白鉸鏈和恒定域(Fe)序列的具有期望 特異性的人蛋白質序列來構建，可以使用完全人的構件來實現感興趣的結合特異性。此類 免疫粘附素對患者具有最低限度的免疫原性，而且對于長期或反復使用是安全的。在有些 實施方案中，Fc區是天然序列Fc區。在有些實施方案中，Fc區是變異Fc區。在有些實施 方案中，所述Fc區是功能性Fc區。ALK-I免疫粘附素的ALK-I部分和免疫球蛋白序列部分 可以通過最小限度的接頭相連接。已有記載用于治療用途的同多聚體免疫粘附素的例子包括用于阻斷HIV結合細 胞表面CD4的CD4-IgG免疫粘附素。自臨分娩前給產婦施用CD4-IgG的I期臨床試驗得 到的數據表明這種免疫粘附素在預防HIV的母嬰傳播方面可能是有用的(Ashkenazi等， Intern. Rev. Immunol. 10 219-227 (1993))   還已開發了一種結合腫瘤壞死因子(TNF)的 免疫粘附素。TNF是一種促炎細胞因子，其已顯示為感染性休克的主要介導物。根據感染 性休克的小鼠模型，一種TNF受體免疫粘附素已顯示出有希望成為治療感染性休克的臨床 應用的候選物(Ashkenazi，A.等，PNAS USA 88  10535-10539 (1991))   ENBREL  (依那 西普(etanerc印t)，一種包含融合至IgG Fc區的TNF受體序列的免疫粘附素)在1998年 11月2日經美國食品和藥品管理局(FDA)批準用于治療類風濕性關節炎。ENBREL 在類 風濕性關節炎治療中的新的擴充的用途在2000年6月6日得到FDA的批準。關于TNF阻 斷劑(包括 ENBREL )的最新信息參見 Lovell 等，N. Engl. J.Med. 342 :763-169 (2000)及 第 810-811 頁的同期社論(accompanying editorial) ；Weinblatt 等，N. Engl. J. Med. 340  253-259 (1999)；及綜述 Maini 和 Taylor，Annu. Rev. Med. 51 :207_229 (2000)。如果免疫粘附素結構的兩個臂具有不同的特異性，則該免疫粘附素根據雙特異性 抗體類推而稱為“雙特異性免疫粘附素”。Dietsch等，J. Immunol. Methods 162  123 (1993) 記載了這樣一種雙特異性免疫粘附素，其組合P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和粘附素分子的胞 外結構域，其中每一種選擇蛋白在自然界中在不同細胞類型中表達。結合研究指出了如此 形成的雙特異性免疫球蛋白融合蛋白具有與衍生它的單特異性免疫粘附素相比增強的結 合髓樣細胞系的能力。術語“異源粘附素”(heteroadhesin)與表述“嵌合異源多聚體粘附素”可互換使 用，指嵌合分子(氨基酸序列)的復合物，其中每一種嵌合分子組合一個生物學活性部分 (諸如每一種異源多聚體受體單體的胞外結構域)和一個多聚化結構域。“多聚化結構域” 促進異源多聚體復合物內嵌合分子的穩定相互作用。多聚化結構域可以經免疫球蛋白序 列、亮氨酸拉鏈、疏水區、親水區、或在嵌合異源多聚體的嵌合分子間形成分子間二硫鍵的 游離硫醇而相互作用。多聚化結構域可包含免疫球蛋白恒定區。另外，多聚化區可進行改 造，使得空間相互作用不僅促進穩定的相互作用，而且還促進自單體混合物形成異源二聚 體多過同源二聚體。通過將第一多肽的界面上的小氨基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或 色氨酸)替換來構建“隆起” (protuberance)。任選通過將大氨基酸側鏈用較小的側鏈(例
            
9如丙氨酸或蘇氨酸)替換而在第二多肽的界面上創建與隆起大小相同或相似的補償性“空 腔”(cavity)。免疫球蛋白序列優選但非必須是免疫球蛋白恒定域。本發明的嵌合物中的 免疫球蛋白模塊可以自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM，但優選IgGl 或IgG3獲得。術語“Fe區”在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區域，包括天然序列Fc區 和變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義 為自其Cys226或Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸(殘 基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗 體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體組合物可以包括所有K447殘基都被消除 的抗體群、無一 K447殘基被消除的抗體群、及混合了有K447殘基的抗體和沒有K447殘基 的抗體的抗體群。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)(明確收入本文作為參考)中的EU索引的編 號方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包 括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)； 吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區 與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用多種測定法來評估，例如本文中所公 開的。“天然序列Fc區”包含與在自然界中找到的Fc區的氨基酸序列相同的氨基酸序 列。天然序列人Fc區包括天然序列人IgGl Fc區(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2 Fc區；天然序列人IgG3 Fc區；和天然序列人IgG4 Fc區；以及它們的天然存在變體。“變異Fc區”包含由于至少一處氨基酸修飾(優選一處或多處氨基酸替代)而與 天然序列Fc區有所不同的氨基酸序列。優選的是，變異Fc區與天然序列Fc區相比或與親 本多肽的Fc區相比具有至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc 區中具有約1處至約10處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代。變異Fc區在本 文中優選與天然序列Fc區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約80%的同源性，最優選與它 們具有至少約90%的同源性，更優選與它們具有至少約95%的同源性。“分離的”抗體指已經鑒定且自其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它 蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據Lowry 法的測定，抗體重量超過95%，最優選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得 至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據還原性或非還原性條件下 的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成 分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常會通過至 少一個純化步驟來制備。術語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長或 完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展
            
10現出期望的生物學活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細描述的)。抗 體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對 其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它 集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(CDR)或高變區的三個區段。可變域中更加高 度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采 取折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成折疊片結構一部分的三個 ⑶R連接。每條鏈中的⑶R通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的⑶R—起促成 iKW^iiKW^^iiL^^S^ ( Kabat φ, Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。 H胃^fi 接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞的(細胞)毒性 中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各自具有 一個抗原結合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶 處理產生一個F (ab' )2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。“Fv”是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區由 緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中， 一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連，使得輕鏈和重鏈可在與 雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結構中相結合。正是在這種構造中，各可變域的三個⑶R相 互作用而在VH-VL 二聚體表面上確定了抗原結合位點。六個CDR共同賦予抗體以抗原結合 特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識 別和結合抗原的能力，只是親和力低于完整結合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab ‘片段與Fab片 段的不同之處在于重鏈CHl結構域的羧基末端增加了少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一 個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基團的 Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab ‘片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對 Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯形式。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。根據其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五 大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、 ε、Y、和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的。“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優選保留該部分存在于完整 抗體中時通常與之有關的至少一項、優選大多數或所有功能。抗體片段的例子包括Fab、 Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特 異性抗體。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，如此保留結合抗原 的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含Fc區的抗體片段，保留與Fc區存在于完 整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC
            
11功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是體內半衰期與完整抗體基本上相似的單 價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗原結合臂且其與能夠賦予該片段以體內穩定 性的Fc序列相連。 術語“高變區”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變 和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個高變區三個在VH中(H1、H2、 H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat互補決定 區(CDR)是以序列變異性為基礎的，而且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結構環的位置(Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，而 且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接觸(contact) ”高變區是以對 可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每-
            
-個的殘基。環
            
Kabat
            
AbM
            
Chothia
            
接觸
            
Ll L2 L3 Hl
            
L24-L34 L50-L56 L89-L97 H31-H35B
            
L24-L34 L50-L56 L89-L97 H26-H35B
            
(Kabat編號方式)HlH2H3
            
H31-H35
            
H26-H35
            
(Chothia編號方式)
            
H50-H65 H95-H102
            
H50-H58 H95-H102
            
L26-L32 L50-L52 L91-L96 H26-H32
            
H26-H32
            
H53-H55 H96-H101
            
L30-L36 L46-L55 L89-L96 H30-H35B
            
H30-H35
            
H47-H58 H93-H101高變區可包括如下“延伸的高變區”:VL中的24-36或24_34(Li)、46_56或 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。“框架”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的高變區殘基外的那些殘基。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成 群體的各個抗體相同和/或結合相同表位，除了生產單克隆抗體的過程中可能產生的可能 變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結合靶物的多肽序 列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序 列在內的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重 組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的靶物結合序列可進一步改變，例如 為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其 在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結合序列的抗體也是本 發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備 物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性 外，單克隆抗體制備物的優勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克 隆”表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生
            
12產抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法 (例如 Kohler 等，Nature 256:495(1975) ；Harlow 等，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第 2 版，1988 ;Hammerling 等，于Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,563-681, Elsevier, N. Y.，1981)、重組 DNA 法(參 見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(參見例如Clackson等，Nature 352:624-628(1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991) ；Sidhu 等，J.Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5)  1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34)  12467-12472 (2004) ；Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) :119-132(2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免 疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；WO 1991/10741 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature362 255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33 (1993)；美國專利 No. 5，545，806 ；5，569，825 ；5，591，669 (都屬于 GenPharm)； 5，545，807 ；W01997/17852 ；美國專利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ； 5, 633, 425 ；5, 661, 016 ；Marks 等，Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 :856_859(1994) ；Morrison,Nature 368:812—813(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnologyl4 826(1996)； Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區 殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔或 非人靈長類的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區 (FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒 有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體會包 含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環對應于非人 免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任 選還會包含至少部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節 參見 Jones 等，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323_329 (1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596 (1992)  還可參見以下綜述及其引用的參考文 獻Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1  105-115 (1998) ；Harris, Biochem.Soc. Transactions 23  1035-1038(1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5  428-433(1994)。“嵌合”抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于 特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種 或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要 它們展現出期望的生物學活性(美國專禾U No. 4，816，567 ；Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個子集。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在 于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv
            
13能夠形成結合抗原所需的結構。關于scFv的綜述參見Pluckthun，在Rosenburg和Moore 編的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第 113 卷中，Springer-Verlag, New York,pp.269-315(1994)。“抗原”指抗體可選擇性結合的預定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、 脂質、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。優選地，靶抗原是多肽。術語“雙抗體(diabody)”指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在 同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過 短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互 補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/或使用本 文所公開的用于生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人 抗原結合殘基的人源化抗體。“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改變、導 致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優選的親 和力成熟的抗體會具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的 抗體可通過本領域已知規程來生成。Marks等，Bio/Technology 10 :779_783 (1992)記 載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 CDR和/或框架殘 基的隨機誘變Barbas 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 3809-3813 (1994) ；Schier 等， Gene 169  147-155 (1995) ；Yelton 等，J. Immunol. 155  1994-2004 (1995) Jackson 等， J. Immunol. 154 (7) :3310_9 (1995) ；Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。抗體“效應器功能”指那些可歸于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體 Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補 體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細 胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指其中結合到某些細胞毒性細胞 (例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型 Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶 細胞的細胞毒性形式。該抗體“武裝”(arm)細胞毒性細胞，而且是此類殺傷作用絕對要求 的。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc y RI,Fc γ RII和 FcyRIII。Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9 :457_92 (1991)第 464 頁表 3 總結了造 血細胞上的FcR表達。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美 國專利No. 5，500，362或5，821，337或Presta美國專利No. 6，737，056中所記載的。可用于 此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外， 可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等，PNAS (USA) 95  652-656(1998)中所披露的。“人效應細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應器功能的白細胞。優選的是，該 細胞至少表達Fc y RIII并行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周 血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優
            
14選PBMC和NK細胞。效應細胞可以從天然來源例如血液分離。"Fe受體”或“FcR”描述結合抗體Fc區的受體。優選的FcR是天然序列人FcR。 此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII亞 類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fc γ RIIA ( “活化 受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區別主要在其胞質結構 域中。活化受體Fc γ RIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。 抑制受體Fc y RIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見 綜述Dagron，Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997))。FcR 的綜述參見 Ravetch 和 Kinet， Annu. Rev. Immunol. 9 :457_492(1991) ；Capel 等，Immunomethods 4 :25_34(1994) ；de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 =330-41(1995)  術語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未 來將會鑒定的。該術語還包括新生兒受體，FcRn，它負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer等， J. Immunol. 117 587(1976) ；Kim等，J. Immunol. 24 249(1994))并調節免疫球蛋白的穩態。WO 00/42072 (Presta)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體變體。在此 明確收入該專利出版物的內容作為參考。還可參見Shields等，J.Biol. Chem. 9⑵ 6591-6604(2001)。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。可 測定人FcRn高親和力結合多肽與人FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表達人FcRn的 經轉染的人細胞系或轉基因小鼠中，或者在施用了 Fc變體多肽的靈長類動物中。“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的 激活是由補體系統第一組分(Clq)結合其關聯抗原所結合的抗體(適宜亞類的)起始的。 為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202  163 (1996)中所記載的。具有更改的Fc區氨基酸序列及提高或降低的Clq結合能力的多肽變體記載于美 國專利No. 6，194，551 Bl和WO 99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內容作為參考。 還可參見 Idusogie 等，J. Immunol. 164 4178-4184 (2000)。“含Fc區多肽”指包含Fc區的多肽，諸如抗體或免疫粘附素。Fc區的C-末端賴 氨酸(依照EU編號系統的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者通過重組改 造編碼多肽的核酸。因而，依照本發明包含具有Fc區的多肽的組合物可包含具有K447的 多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒有K447殘基的多肽的混合物。“阻斷性”抗體或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗 體。優選的阻斷性抗體或拮抗性抗體實質或完全抑制抗原的生物學活性。“長期”施用指與短期模式相反，以連續模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活 性)維持較長一段時間。“間歇”施用指不是無間斷連續進行的治療，而是本質上周期性的。“病癥”或“疾病”指任何會受益于本發明的物質/分子或方法的治療的疾患。這包 括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待 治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤、癌瘤、母細胞瘤和肉瘤。與異常或過度淋 巴管發生有關的疾患包括但不限于腫瘤、癌癥、細胞增殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、 類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病和銀屑病。術語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥指癌癥。“腫瘤”在用于本文時指所有腫瘤性細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的， 及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌癥”、“癌性”、“細胞增殖性病癥”、 “增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。術語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖不受調 控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥 的更具體例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、 肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、 肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列 腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭頸癌。 血管發生失調可導致可通過本發明的組合物和方法來治療的許多病癥。這些病癥包括非贅 生性的和贅生性的疾患。贅生性病癥包括但不限于上文所描述的那些。非贅生性病癥包括但不限于不希望有的或異常的肥大、關節炎、類風濕性關節炎 (RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結節病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增 殖性視網膜病包括早產兒視網膜病、晶狀體后纖維組織增生、新血管性青光眼、年齡相關黃 斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、 視網膜/脈絡膜新血管形成、眼角的新血管形成(發紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動 靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Grave) 病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發性肺動脈高 壓、惡性肺積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭 部外傷/創傷有關的)、滑液炎癥(synovialinflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性 肌炎、肥大性骨形成、骨關節炎(0A)、頑固性腹水、多囊卵巢病、子宮內膜異位癥、第三空間 流體病(3rdspaCing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤 (uterine fibroids)、早產、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎)、腎 同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不希望有的或異常的組織塊生長(非癌癥)、 血友病性關節、肥厚性瘢痕、毛發生長的抑制、奧-韋二氏(Osier-Weber)綜合征、膿性肉芽 腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積 液(諸如與心包炎有關的)和胸腔積液。在用于本文時，“治療”或“處理”指試圖改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床 干預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括預防疾病的發 生或復發、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學后果、防止轉移、減緩疾病進展的 速率、改善或減輕疾病狀態、及免除或改善預后。在有些實施方案中，抗體用于延遲疾病或 病癥的發生/發展。“受試者”指脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人。哺乳動物包括，但不限于，牲畜 (諸如牛和綿羊)、運動用動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。為了治療目的，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動 物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛等。優選的是，哺乳動物指人。“有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現期望的治療或預防效果的量。物質/分子的“治療有效量”可根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重及該
            
16物質/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發期望應答的能力等因素而變化。治療有效量還 指該物質/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。“預防有 效量”指在必需的劑量和時間上有效實現期望的預防效果的量。通常而非必然，由于預防劑 量是在疾病發作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預防有效量會低于治療有效量。術語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的 物質。該術語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春 花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊 昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法倉(melphalan)、絲裂霄素(mitomycin)C、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如 溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素， 包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。 殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。“化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的例子包括烷化 劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN  環磷酰胺 (cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸 如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替 派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯類(acetogenin)(尤其 是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)) ； δ -9-四氫屈大
            
(tetrahydrocannabinol) ( jffi i；(dronabinol)， MARINOL   ) ; β _ 才立
            
帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸 (betulinicacid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN  )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR   )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭 (scopoletin)和 9_ 氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包 括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成 類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷 (teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他 汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素 (eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ；海綿 ^^ 素(spongistatin)；氣芥類 (nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽 磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷酰胺(ifosfamide)、雙氯 乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫 司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞 硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、
            
17福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司 汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素 (calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參見例如Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl. 33  183-186 (1994))；蒽環類抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ； 埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋 白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin), 氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin) > carabicin、洋紅霄素(carminomycin) ^ ^m  ^ MM (carzinophilin) > 色霉素(chromomycin)、方文線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比 星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比 星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、 麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic ac id)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素 (peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多 比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈佐星(str印tozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗 代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟 達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌 呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激 素類，諸如卡魯辜麗(calusterone)、丙酸屈他雄麗(dromostanolone propionate)、表 硫雄醇(印itiostanol)、美雄燒(m印itiostane)、睪內酉旨(testolactone)；抗腎上腺 類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)； 葉酸補無劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖 苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 唆(eniluracil)；安 口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙 (edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)； elfornithine ；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托 格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明 (Ionidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和 安絲菌素(ansamitocin)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫 哌達醇(mopidamol) ； 二 胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮 芥(phenamet)；吡柔比星(pirarybicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2-乙基酰胼 (ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖復合物(JHS NaturalProducts， Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺 (spirogermanium)；細交鏈 包菌麗酸(tenuazonic acid)；三亞月安酉昆(triaziquone) ；2,2'，2〃 _三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、桿抱菌素(roridin)A 禾口蛇 亍菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長 春地辛(vindesine) (ELDISINE  ，FILDESIN )；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮 芥(mannomustine) ；二漠甘露酉享(mitobronitol) ；二漠衛矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒 (pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “ Ara-C")；塞替派(thiotepa)； 類紫杉醇(taxoids)，例如 TAXOL   帕利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE  不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納 米顆粒劑型中白利他塞(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮 芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR   ) ；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)； 巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin) 和卡鉬(carboplatin)；長春堿(vinblastine) (VELBAN   )；鉬；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine) (ONCOVIN )；奧沙利鉬(oxaliplatin)；亞葉酸(Ieucovorin)；長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE )；能滅瘤(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霄素(daunomycin)； 氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ；二 氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃酸(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱 (capecitabine) (XELODA   )；任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多 種上述物質的組合，諸如CHOP(環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯合療法的縮 寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN )聯合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。 
            
 該定義還包括作用為調節、降低、阻斷、或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激 素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和 選擇性雌激素受體調節劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX  他莫昔芬)、EVISTA  雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔 芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone) 和FAREST0N 托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD)；功能為 抑制或關閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如LUPRON 和 ELIGARD  醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、 醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素類，諸 如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑 制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米 特(aminoglutethimide)、MEGASE   醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AR0MASIN   依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVIS0R  伏羅唑 (vorozole)、FEMARA  來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX   阿那曲唑(anastrozole)。另 外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate) (例如 BONEFOS   或 OSTAC   )、DIDR0CAL   依替膦酸鈉(etidronate)、NE-58095、 ZOMETA   唑來膦酸 / 唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)、F0SAMAX   阿倫 膦酸鹽(alendronate)、AREDIA   帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID   替魯膦酸鹽 (tiludronate)或 ACTONEL  利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)
            
19(1，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常(abherant)細胞 增殖的信號傳導途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮 生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERAT0PE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALL0VECTIN  疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID  疫苗；LURTOTECAN  拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX   rmRH ；lapatinib ditosylate (ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為 GW572016)；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內抑制細胞(諸如表達ALK-I的細 胞)生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的 藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如 誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(Vincas)(長春新堿 (vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓撲異構酶II抑制劑 諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊 苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如 DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、 雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿 啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara—C。更多信息可參見〈〈The Molecular Basis ofCancer)), Mendelsohn 禾口 Israel 編，第 1 章，題為 ‘‘Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs", Murakaini 等X，WB Saunders, Philadelphia, 1995, jt^jkWi 13頁。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))都是衍生自紫杉樹 的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE ，Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞 (TAXOL ，Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。帕利他塞和多西他賽促進由微管蛋 白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩定，導致對細胞中有絲分裂的抑制。疾病的“病理”包括所有危及患者康樂的現象。例如，這包括但不限于異常的或不 可控的細胞生長、轉移、對鄰近細胞正常機能的干擾、細胞因子或其它分泌產物的異常水平 釋放、炎性或免疫學應答的抑制或惡化、等。與一種或多種其它治療劑“聯合”施用包括同時(共同)施用和任何次序的序貫 施用。“載體”在用于本文時包括藥學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所采用的 劑量和濃度對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是PH緩 沖水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗 氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明 膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性 劑，諸如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。“脂質體”指由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的，可用于對哺乳動物 投遞藥物(諸如ALK-I多肽或其抗體)的小囊泡。脂質體的成分通常排列成雙層形式，與 生物膜的脂質排列相似。術語“VEGF”和“VEGF-A”可互換使用，指165個氨基酸的血管內皮細胞生長因子
            
20及相關的121個、145個、183個、189個和206個氨基酸的血管內皮細胞生長因子，如Leung 等，Science 246  1306 (1989) ；Houck 等，Mol. Endocrin. 5  1806 (1991)；及 Robinson 和 Stringer, Journal of Cell Science, 144(5) 853-865 (2001)所述，及其天然存在等位形 式和加工形式。"VEGF拮抗劑”指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性(包括其與 一種或多種VEGF受體的結合)的分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結合片段、 特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結合的受體分子及衍生物、抗VEGF受 體抗體和VEGF受體拮抗劑(諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑)、及融合蛋白(例 如 VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121_gelonin(Peregrine))。VEGF 拮抗劑還包括 VEGF 的 拮抗性變體、針對VEGF的反義分子、RNA適體(aptamer)、和針對VEGF或VEGF受體的核酶 (ribozyme)。“抗VEGF抗體”指以足夠親和力和特異性結合VEGF的抗體。抗VEGF抗體可在靶 向和干預其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患時用作治療劑。參見例如美國專利6，582，959 ； 6，703，020；W098/45332 ；WO 96/30046 ；W094/10202 ；W02005/044853 ；EP 0666868B1 ；美 國專利申請 20030206899，20030190317，20030203409，20050112126，20050186208，和 20050112126 ；Popkov φ, Journalof Immunological Methods 288  149-164(2004)；及 W02005012359。抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會 結合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bTOF。抗VEGF抗體“貝伐單抗”(bevacizumab，BV)，也 稱為“rhuMAb VEGF"或“Avastin  ”，是依照 Presta 等，Cancer Res. 57 :4593_4599 (1997) 生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。它包含突變的人IgGl框架區和來自阻斷人VEGF結 合其受體的鼠抗hVEGF單克隆抗體A4. 6. 1的抗原結合互補決定區。貝伐單抗大約93%的氨 基酸序列，包括大部分框架區，衍生自人IgGl，而大約7 %的序列衍生自鼠抗體A4. 6.1。貝 伐單抗具有約149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF 抗體(包括抗VEGF抗體片段“ranibizumab”，也稱為“Lucentis ”)進一步記載于2005 年2月26日公告的美國專利No. 6，884，879。術語“生物學活性”和“有生物學活性的”就ALK-I多肽而言指與ALK-I有關的物 理/化學特性和生物學功能。在有些實施方案中，ALK-I “生物學活性”包括下列一項或多 項結合ALK-I配體，例如BMP9和/或BMP10或激活ALK-I下游分子信號傳導，例如Smadl、 Smad5和/或Smad8的磷酸化。"ALK-I拮抗劑”指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾ALK-I活性的分子，包 括例如降低或阻斷ALK-I受體活化、降低或阻斷ALK-I下游分子信號傳導(例如Smadl、 Smad5和/或Smad8的磷酸化)、破壞或阻斷ALK-I配體(例如BMP9或BMP10)結合ALK-I。 ALK-I拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核 酸、生物有機分子、擬肽(ρ印tidomimetics)、藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、等等。 拮抗劑還包括蛋白質的小分子抑制劑、和融合蛋白(包括免疫粘附素)、特異性結合蛋白質 由此隔絕該蛋白質結合其靶物的受體分子及其衍生物、蛋白質的拮抗性變體、針對蛋白質 的siRNA分子、針對蛋白質的反義分子、RNA適體、和針對蛋白質的核酶。在有些實施方案 中，ALK-I拮抗劑是結合ALK-I并中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾ALK-I生物學活性的 分子。
            
術語“抗腫瘤組合物”指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑， 例如“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑，在本文中也稱為“抗腫瘤劑”)的例子包括但不限于例如 化療劑、生長抑制劑、細胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發生劑、凋亡劑、抗微管 蛋白劑、毒素、和其它用于治療癌癥的藥劑例如抗VEGF中和性抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、 抗CD20、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、 erlotinib、C0X-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細胞因子、能與ErbB2、 ErbB3、ErbB4、或VEGF受體中的一種或多種結合的拮抗劑(例如中和性抗體)、血小板衍生 生長因子(PDGF)和/或干細胞因子(SCF)的受體酪氨酸激酶的抑制劑(例如甲磺酸伊馬 替尼(imatinib mesylate) (Gleevec   Novartis))、TRAIL/Apo2L、及其它生物活性和有機 化學劑等。術語“前體藥物”或“藥物前體”在用于本申請時指與母藥(parent drug)相 比對腫瘤細胞的細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉變為更具活性母藥形式的前體或 衍生物形式藥用活性物質。參見例如WiIman,“Prodrugs in CancerChemotherapy”， Biochemical Society Transactions,14, pp. 375-382,615thMeeting Belfast (1986)及 Stella等,“Prodrugs :A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery",Directed Drug Delivery, Borchardt 等編，pp. 247-267，HumanaPress (1985)。本發明的前體藥物包括但不 限于含磷酸根前體藥物、含硫代磷酸根前體藥物、含硫酸根前體藥物、含肽前體藥物、D-氨 基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的 前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉變為更具活性而無細胞毒性的藥物的 5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物。可衍生為本發明使用的前體藥物形式的細胞毒性 藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。“血管發生因子”或“血管發生劑”指刺激血管發育，例如促進血管發生 (angiogenesis)、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長 因子。例如，血管發生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、 成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ALK-I等。 它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生 長因子(EGF)、CTGF及其家族成員、及TGF-α和TGF-β。參見例如Klagsbrun和D’Amore， Annu. Rev. Physiol. 53 217-39(1991) ；Streit 和 Detmar，Oncogene 22:3172-3179(2003)； Ferrara 禾口 Alitalo，Nature Medicine 5(12)  1359-1364(1999) ；Tonini 等，0ncogene22  6549-6556 (2003)(例如列舉血管發生因子的表 1)；及 Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8  200-206(2003)。“抗血管發生劑”或“血管發生抑制劑”指或是直接或是間接抑制血管發生 (angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不希望有的血管通透性的小分子量物質、 多核苷酸(包括例如抑制性RNA，即RNAi或siRNA)、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體、 或其偶聯物或融合蛋白。例如，抗血管發生劑是上文定義的血管發生劑的抗體或其它拮抗 劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、或阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如PTK787/ ZK2284、SU6668、SUTENT   /SUl 1248 (sunitinib malate)、AMG706 或例如國際專利申請 WO 2004/113304中所記載的那些)。抗血管發生劑還包括天然血管發生抑制劑，例如血管他 T (angiostatin)、內皮他丁 (endostatin)等。參見例如 Klagsbrun 禾口 D，Amore Annu.
            
22Rev. Physiol. 53 217-39 (1991) ；Streit 和 Detmar Oncogene 22 :3172_3179 (2003)(例如 列舉惡性黑素瘤中抗血管發生療法的表3) ；Ferrara和Alitalo Nature Medicine 5(12) 1359-1364(1999) ；Tonini 等，Oncogene 22 6549-6556 (2003)(例如列舉抗血管發生因子 的表2)；及Sato，Int. J. Clin. Oncol. 8 =200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗 血管發生劑的表1)。本發明的方法和組合物本發明部分基于如下的發現，即調控ALK-I途徑的藥劑(例如ALK-I免疫粘附素 或抗ALK-I抗體)能夠影響血管發生和淋巴管發生二者。一方面，本發明提供了一種預防 內皮細胞分化成更成熟的分化階段的方法，包括使所述內皮細胞接觸ALK-I拮抗劑。所述 內皮細胞可以是任何類型的內皮細胞，例如血或淋巴內皮細胞。另一方面，本發明提供了一 種破壞周細胞組織的方法，包括使所述周細胞接觸ALK-I拮抗劑。另外，發現此類藥劑作為 單一藥劑和與VEGF拮抗劑聯合，都能夠抑制腫瘤生長。因而，ALK-I拮抗劑對于與血管發 生和淋巴管發生有關的病理學疾患和病癥是有用的。涵蓋可以使用ALK-I拮抗劑來治療或預防各種病理學疾患或病癥。本發明涵蓋一 種抑制淋巴管發生的方法，其使用有效量的ALK-I拮抗劑(諸如但不限于ALK-I免疫粘附 素或抗ALK-I抗體)，以抑制ALK-I受體途徑的激活。另一方面，本發明提供了一種抑制淋 巴管發生的方法，包括對需要此類處理的受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑。與異常淋巴管發生有關的病理學疾患或病癥的例子包括但不限于腫瘤、癌癥、腫 瘤或癌癥轉移、細胞增殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜 病和銀屑病。一方面，本發明提供了一種在受試者中抑制或預防腫瘤淋巴管發生的方法，包 括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑。還提供了一種在受試者中抑制或預防腫瘤轉 移的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑。在一些實施方案中，所述受試者 可以已經形成或有風險形成腫瘤轉移。此類轉移可以是在淋巴系統中或在遠距離器官中。本發明提供了一種在受試者中破壞周細胞組織的方法，包括對所述受試者施用有 效量的ALK-I拮抗劑。在一些實施方案中，所述受試者患有腫瘤、癌癥、腫瘤或癌癥轉移、細 胞增殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病和銀屑病。在一 些實施方案中，所述對周細胞組織的破壞在罹患贅生性疾病(諸如腫瘤或癌癥)的受試者 的腫瘤血管中發生。本發明涵蓋一種在受試者中治療腫瘤、癌癥、細胞增殖性病癥和/或贅生性病癥 的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑。一方面，本發明提供了一種在受試 者中抑制腫瘤生長的方法，包括施用有效量的ALK-I拮抗劑。要用ALK-I拮抗劑治療的贅 生性病癥的例子包括但不限于本文中術語“癌癥”和“癌性”下所描述的那些。適合于用本發明中有用的ALK-I拮抗劑治療的非贅生性疾患包括但不限于例如 不希望有的或異常的肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結節病、 動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、源自心肌梗死的水腫、糖尿病性和其它增殖性視網膜 病包括早產兒視網膜病、晶狀體后纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關黃斑變性、 糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網膜/ 脈絡膜新血管形成、眼角的新血管形成(發紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形 (AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Grave)病)、角膜和
            
23其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發性肺動脈高壓、惡性肺積液 (malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部外傷/創傷有 關的)、滑液炎癥、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關節炎(OA)、頑固性 腹水、多囊卵巢病、子宮內膜異位癥、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases) (胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterine fibroids)、早產、慢性炎癥諸如 IBD(克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎)、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合 征、不希望有的或異常的組織塊生長(非癌癥)、肥胖癥、脂肪組織塊生長、血友病性關節、 肥厚性瘢痕、毛發生長的抑制、奧-韋二氏(Osier-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖 維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心 包炎有關的)和胸腔積液。病癥的其它例子包括上皮的或心臟的病癥。聯合療法如上所述，本發明提供了聯合療法，其中ALK-I拮抗劑(諸如ALK-I免疫粘附素或 抗ALK-I抗體)與另一療法一起施用。例如，ALK-I拮抗劑與抗癌劑或抗血管發生劑聯合 使用以治療各種贅生性或非贅生性疾患。又例如，ALK-I拮抗劑與抗淋巴管發生劑(例如 VEGFC拮抗劑，諸如抗VEGFC抗體)聯合使用。在一個實施方案中，所述贅生性或非贅生性 疾患的特征在于與異常或不希望有的血管發生或淋巴管發生有關的病理學病癥。ALK-I拮 抗劑可以與對那些目的有效的另一藥劑順次或聯合施用，或是在同一組合物中或是作為分 開的組合物。或者/另外，可以施用ALK-I的多種抑制劑。ALK-I拮抗劑和其它治療劑(例如抗癌劑、抗血管發生劑)的施用可以同時進行， 例如作為單一組合物或者作為兩種或更多不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑。或 者/另外，施藥可以以任一次序順次進行。或者/另外，所述步驟可以作為順次施藥和同時 施藥二者的任何次序的組合來實施。在某些實施方案中，兩次或更多組合物施用之間可以有范圍為數分鐘、至數天、至 數周、至數月的時間間隔。例如，可以先施用抗癌劑，接著是ALK-I拮抗劑。然而，也涵蓋同 時施用或先施用ALK-I拮抗劑。因而，一方面，本發明提供了如下方法，其包括施用ALK-I 拮抗劑(諸如ALK-I免疫粘附素或抗ALK-I抗體)，接著施用抗血管發生劑(諸如VEGF拮 抗劑，例如抗VEGF抗體)。在一個實施方案中，所述抗血管發生劑是抗VEGF中和性抗體 或片段(例如人源化 A4. 6. 1、AVASTIN   (Genentech，South San Francisco, CA)、Y0317、 M4、G6、B20、2C3、等)。參見例如美國專利 6，582，959，6，884，879，6，703，020 ；W098/45332 ； WO 96/30046 ；W094/10202 ；EP 0666868B1 ；美國專利申請 20030206899, 20030190317, 20030203409，R 20050112126 ；Popkov φ, Journal of Immunological Methods 288  149-164(2004)；及 W02005012359。與ALK-I拮抗劑聯合施用的治療劑的有效量取決于醫師或獸醫的判斷。完成劑量 施用和調整以實現對待治療疾患的最大控制。此外劑量取決于諸如待使用的治療劑的類型 和所治療的特定患者等因素。抗癌劑的合適劑量就是當前所用的那些，而且可以由于抗癌 劑與ALK-I拮抗劑的聯合作用(協同)而降低。在某些實施方案中，抑制劑的組合增強單 一抑制劑的功效。術語“增強”指治療劑在其常用或批準的劑量功效得到提高。還可參見 本文中標題為“藥用組合物”的部分。典型的是，ALK-I拮抗劑和抗癌劑適于相同或相似的疾病以阻斷或降低病理學病癥，諸如腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥。在一個實施方案中，所述抗癌劑是抗血管發生劑。與癌癥有關的抗血管發生療法是致力于抑制為支持腫瘤生長而提供養分所需要 的腫瘤血管發育的癌癥治療策略。因為血管發生牽涉原發性腫瘤生長和轉移二者，所以本 發明提供的抗血管發生治療不但能夠在原發性位點抑制腫瘤的贅生性生長，而且能夠預防 腫瘤在繼發性位點的轉移，從而容許由其它治療劑攻擊腫瘤。本領域已經鑒定和知道許多抗血管發生劑，包括本文所列的那些，例如定義部 分中所列的，還可參見例如 Carmeliet 禾口 Jain，Nature 407 249-257 (2000) ； Ferrara 等，Nature Reviews =Drug Discovery, 3 391-400 (2004) ；Sato Int. J. Clin. Oncol. ,8  200-206(2003)。還可參見美國專利申請US20030055006。在一個實施方案中，ALK-I拮抗 劑與抗VEGF中和性抗體(或片段)和/或另一 VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(包括但不 限于例如可溶性 VEGF 受體(例如 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、neuropilIins (例如 NRP1、 NRP2))片段)、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶 (RTK)的低分子量抑制劑、VEGF的反義策略、針對VEGF或VEGF受體的核酶、VEGF的拮抗性 變體、及其任意組合聯合使用。或者/另外，任選的是，可以在VEGF拮抗劑和其它藥劑外對 患者共施用兩種或更多血管發生抑制劑。在某些實施方案中，可以與ALK-I拮抗劑、VEGF拮 抗劑和抗血管發生劑聯合施用一種或多種別的治療劑，例如抗癌劑。在本發明的某些方面，可用于ALK-I拮抗劑的聯合腫瘤療法的其它治療劑包括其 它癌癥療法(例如手術、放射學治療(例如牽涉照射或施用放射性物質)、化療、本文所列和 本領域知道的抗癌劑的治療、或其組合)。或者/另外，結合本文披露的相同抗原或兩種或 更多本文披露的不同抗原的兩種或更多抗體可以共施用于患者。有時，還對患者施用一種 或多種細胞因子可能是有益的。化療劑一方面，本發明提供了治療病癥(諸如腫瘤、癌癥、或細胞增殖性病癥)的方法，其 通過施用有效量的ALK-I拮抗劑(和/或血管發生抑制劑)和一種或多種化療劑來實現。 多種化療劑可用于本發明的聯合治療方法。本文在“定義”中提供了所設想的化療劑的例示 性和非限制性列表。ALK-I拮抗劑和化療劑的施用可以同時進行，例如作為單一組合物或者 作為兩種或更多不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑。或者/另外，施藥可以以任一 次序順次進行。或者/另外，所述步驟可以作為順次施藥和同時施藥二者的任何次序的組 合來實施。在某些實施方案中，兩次或更多組合物施用之間可以有范圍為數分鐘、至數天、 至數周、至數月的時間間隔。例如，可以先施用化療劑，接著是ALK-I拮抗劑。然而，也涵蓋 同時施用或在施用化療劑之前施用ALK-I拮抗劑。因而，一方面，本發明提供了如下方法， 其包括施用ALK-I拮抗劑(諸如ALK-I免疫粘附素或抗ALK-I抗體)，接著施用化療劑。正如本領域普通技術人員會理解的，化療劑的適宜劑量一般會在單獨或聯合其它 化療劑施用該化療劑的臨床療法中早就采用的那些劑量附近。根據所治療的疾患，劑量有 可能發生變化。施行治療的醫師能夠為受試者個體確定適宜的劑量。ALK-IALK-I是TGF β受體家族的一種內皮特異性類型I受體。ALK-I基因編碼503個氨 基酸的多肽，而且包括親水性的、富含半胱氨酸的配體結合域，單一疏水性的跨膜區和主要 由絲氨酸/蘇氨酸激酶域組成的C端胞內部分。人ALK-I的編號是CAA80255，而小鼠ALK-I
            
25的編號是CAA83484。已經將ALK-I中的突變與2型遺傳性出血性毛細血管擴張癥聯系起來。多年來 ALK-I是孤兒受體。雖然先前推測TGFi3 1和TGFii 3是ALK-I配體，但是最近將BMP9和 BMPlO 鑒定為 ALK-I 的生理性配體(David, L 等，Bloodl09  1953-1961 (2007))。顯示了 ALK-I的活化誘導Smadl、Smad5和Smad8的磷酸化。ALK-I 拮抗劑本文中“定義”下提供了所涵蓋的ALK-I拮抗劑(諸如抗ALK-I抗體和ALK-I免 疫粘附素)的例示性和非限制性列表。可以通過本領域已知的各種測定法對在本發明中有用的ALK-I拮抗劑表征它們 的物理/化學特性和生物學功能。在一些實施方案中，對ALK-I拮抗劑表征下列任一項或多 項結合ALK-I，結合一種或多種ALK-I配體(例如BMP9或BMP10)，降低或阻斷ALK-I受體 活化，降低或阻斷ALK-I下游分子信號傳導(例如Smadl、Smad5和/或SmadS的磷酸化)， 破壞或阻斷BMP9或BMPlO結合ALK-I，抑制血管發生，抑制淋巴管發生，治療和/或預防腫 瘤、細胞增殖性病癥或癌癥；治療或預防與ALK-I表達有關的病癥。表征ALK-I拮抗劑的方 法是本領域已知的，而且其中一些在本文中有描述和例示。ALK-I免疫粘附素免疫粘附素(包括其結構和制備)記載于例如WO 91/08298;及美國專利 No. 5，428，130和5，116，964，通過述及將其公開內容明確收入本文。免疫粘附素或嵌合異多聚體粘附素的生成下面的描述主要涉及通過培養經含有免疫粘附素核酸的載體轉化或轉染的細胞 來生成免疫粘附素。當然涵蓋可以采用本領域公知的備選方法來制備免疫粘附素。例如， 可以使用固相技術通過直接肽合成來生成免疫粘附素序列或其部分(參見例如Stewart 等，Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. , San Francisco, CA(1969)； Merrifield, J.Am. Chem. Soc. ,85 =2149-2154 (1963))   可以使用人工技術或通過自動化來 實施體外蛋白質合成。例如可以使用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City, CA)使 用制造商的指令來實現自動化合成。可以分開地化學合成免疫粘附素的各部分，并使用化 學或酶學方法組合以生成全長免疫粘附素。例如可以自已知表達ALK-I受體的細胞分離編碼天然序列ALK-I受體的核酸。人 ALK-I cDNA 的編號是 Z22533，而小鼠 ALK-1 cDNA 的編號是 Z31664. 1。編碼免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定區的DNA是已知的或易于自cDNA文庫獲得的或 合成。參見例如 Adams 等，Biochemistry 19:2711-2719(1980) ；Gough 等，Biochemistry 19:2702-2710(1980) ；Dolby 等；P. N. A. S. USA, 77 :6027_6031 (1980) ；Rice 等，P. N. A. S USA 79 7862-7865(1982) ；Falkner 等；Nature298 286-288 (1982)；及 Morrison 等；Ann-Rev. Immunol. 2 :239_256(1984)。本發明的免疫粘附素或嵌合異源粘附素優選通過在宿主細胞表達來生成并自其 分離。一般用本發明的核酸轉化宿主細胞。優選的是，將核酸摻入表達載體。適合于在本 文中克隆或表達載體的宿主細胞包括原核宿主細胞(諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、假單胞 菌屬和其它細菌的菌株)、酵母和其它真核微生物、和高等真核細胞(諸如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞和其它哺乳動物細胞)。細胞也可以存在于活的動物中(例如牛、山羊或綿羊)。
            
26也可以使用昆蟲細胞。克隆和表達方法學是本領域公知的。為了獲得免疫粘附素諸如ALK1. Fc分子(實施例1中有詳細描述)的表達，通過 轉化或轉染將一種或多種表達載體導入宿主細胞，并在為誘導啟動子、選擇重組細胞、或擴 增ALK1. Fc DNA而適當修改的常規營養培養基中培養所得重組宿主細胞。一般而言，使體 外哺乳動物細胞培養物的生產力最大化的原理、方案、和實用技術可見于Mammalian Cell Biotechnology :a PracticalApproach, Μ·Butler,編(IRL Press,1991)。編碼免疫粘附素的核酸的構建在制備本發明的免疫粘附素時，優選的是將編碼天然受體胞外域的核酸融合至編 碼免疫球蛋白恒定域序列N端的核酸的C端，然而，N端融合也是可能的。典型的是，在此 類融合中，所編碼的嵌合多肽至少會保留功能上有活性的免疫球蛋白重鏈恒定區鉸鏈、CH2 和CH3域。也進行融合至恒定域Fc部分的C端，或就在重鏈CHl或輕鏈相應區的N端。在 適宜的宿主細胞中表達所得DNA融合構建物。通過本領域已知的多種方法來制備編碼用于制備期望免疫粘附素的天然序列胞 外域(諸如來自ALK-I的胞外域)和/或抗體序列的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方 法包括但不限于自天然來源分離或通過對較早制備的變體或非變體形式的天然序列ALK-I 進行的寡核苷酸介導的(定點)誘變、PCR誘變、或盒式誘變來制備。通過將適宜的核苷酸變化引入天然胞外域DNA序列或通過體外合成期望嵌合異 源粘附素單體多肽來制備嵌合異源粘附素中所包括的天然序列胞外域氨基酸序列變體。此 類變體包括例如免疫粘附素或嵌合異源粘附素的氨基酸序列中的殘基刪除、插入或替代。可以使用保守和非保守突變的技術和指導來進行上文所述天然序列變異。在一個實施方案中，核酸編碼如下的嵌合分子，其中ALK-I受體胞外域序列融合 至包含免疫球蛋白(例如IgGl)效應器功能的抗體C端部分(特別是Fc域)的N端。有 可能將整個重鏈恒定區融合至ALK-I受體胞外域序列。然而，更優選的是，在融合中使用在 鉸鏈區中正好在木瓜蛋白酶切割位點(其在化學上限定IgG Fc ；殘基216，以重鏈恒定區的 第一個殘基為114(Kobet等，見上文)，或其它免疫球蛋白的類似位點)上游起始的序列。 在一個實施方案中，將ALK-I受體胞外域序列融合至IgGl、IgG2、或IgG3重鏈的鉸鏈區和 CH2和CH3或CH1、鉸鏈、CH2和CH3域。進行融合的精確位點不是至關重要的，而且可以通 過例行實驗來確定最佳位點。對于人免疫粘附素，使用人IgGl和IgG3免疫球蛋白序列是優選的。使用IgGl的 一個主要優點是IgGl免疫粘附素能在固定化蛋白A上高效純化。相反，IgG3的純化要求 蛋白G，一種通用性顯著降低的介質。然而，在為具體的免疫粘附素構建選擇Ig融合配偶時 應當考慮免疫球蛋白的其它結構和功能特性。例如，IgG3鉸鏈更長且更具柔性，因此它能 適應在與IgGl融合時可能不能正確折疊或發揮功能的更大的“粘附素”域。另一項考慮可 以是配價；IgG免疫粘附素是二價同二聚體，而Ig亞型像IgA和IgM分別可產生基本Ig同 二聚體單元的二聚體或五聚體結構。對于為體內應用設計的ALK-I免疫粘附素，由Fc區規定的效應器功能和藥動學特 性同樣是重要的。雖然IgGl、IgG2和IgG4都具有21天的體內半衰期，但是它們活化補體 系統的相對潛能是不同的。IgG4不活化補體，而IgG2在補體活化方面顯著弱于IgGl。此 外，與IgGl不同，IgG2不結合單個核細胞或嗜中性粒細胞上的Fc受體。雖然IgG3對于補A 體活化是最佳的，但是它的體內半衰期是其它IgG同種型的大約三分之一。為作為人類治療劑使用而設計的免疫粘附素的另一項重要考慮是具體同種型的 同種異型變體的數目。一般而言，優選血清學限定的同種異型較少的IgG同種型。例如， IgGl只有四個血清學限定的同種異型位點，其中兩個(Glm和2)位于Fc區中；而且這些位 點之一(Glml)是沒有免疫原性的。相反，IgG3有12種血清學限定的同種異型，它們都在 Fc區中，這些位點中只有三個(G3m5、ll和21)具有一種沒有免疫原性的同種異型。如此， IgG3免疫粘附素的潛在免疫原性大于IgGl免疫粘附素的。將編碼免疫粘附素的AKL-I受體序列(例如胞外域序列)和Ig部分的cDNA串 聯插入在所選宿主細胞中指導有效表達的質粒載體中。為了在哺乳動物細胞中表達，例 如可以使用基于PRK5的載體(Schall等，Cell 61，361-370 (1990))和基于CDM8的載體 (Seed, Nature 329,840(1989))。通過使用基于寡核苷酸指導的刪除誘變來消除設計接 合密碼子之間的額外序列，能創建精確的接合(Zoller和Smith，Nucleic Acids Res. 10, 6487(1982) ；Capon等，Nature 337, 525-531 (1989))  可以使用合成寡核苷酸，其中每一半 與設計接合任一側上的序列互補；理想的是，這些是36-48聚物。或者，可以使用PCR技術 來連接分子的兩部分，符合適宜載體的讀碼框。在一個實施方案中，嵌合異源粘附素多肽包含嵌合異源粘附素單體與標簽多肽 的融合物，該標簽多肽提供抗標簽抗體能選擇性結合的表位。此類帶表位標簽的形式的 嵌合異源粘附素是有用的，因為它們的存在能使用經過標記的針對該標簽多肽的抗體來 檢測。還有，表位標簽的提供使得嵌合異源粘附素能夠使用抗標簽抗體通過親和純化 來容易地純化。標簽多肽及其相應的抗體是本領域公知的。例子包括流感HA標簽多 肽及其抗體 12CA5 (Field 等，Mol. Cell. Biol. 8 :2159_2165 (1988)) ；c-myc 標簽及針對 它的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 和 9E10 抗體(Evan 等，Molecular and Cellular Biology 5(12) =3610-3616 (1985))；及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體(Paborsky等， ProteinEngineering 3(6) :547_553(1990))。對嵌合異源粘附素的另一類共價修飾包括將異多聚體的單體多肽連接至多種非 蛋白質性質的聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的 共聚物。嵌合異多聚體還可包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊(例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統 (例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或粗滴乳狀液。此類技術披 露于 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Oslo, A.,編，(1980)。宿主細胞的選擇和轉化將宿主細胞用本文所述用于免疫粘附素生成的表達或克隆載體轉染或轉化，并在 為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而恰當調整的常規營養培養基中 培養。培養條件，諸如培養基、溫度、PH等等，可以由本領域技術人員無需過多實驗就選擇。 通常，用于使細胞培養物生產力最大化的原理、方案和實用技術可參見。Mammalian Cell Biotechnology :aPractical Approach,Μ· Butler,編(IRL Press, 1991)及 Sambrook 等，見 上文。轉化或轉染后，本發明的核酸可整合入宿主基因組中，或者可作為染色體外元件 存在。真核細胞轉染和原核細胞轉化的方法是普通技術人員所知道的，例如CaCl2、CaPO4,
            
28脂質體介導的、和電穿孔。根據所用宿主細胞，轉化使用對此類細胞適宜的標準技術進行。 采用氯化鈣的鈣處理，如Sambrook等，見上文所述，或電穿孔通常用于原核細胞。用根瘤土 壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物細胞的轉化，如Shaw等，Gene 23 =315(1983)和1989年6月29日公開的WO 89/05859所述。對于沒有此類細胞壁的哺 乳動物細胞，可采用Graham和van der Eb, Virology 52 :456_457 (1978)的磷酸鈣沉淀 法。哺乳動物細胞宿主系統轉染的一般情況參見美國專利No. 4，399，216。進入酵母的轉 化通常依照 Van Solingen 等，J. Bact.，130 946(1977)及 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 =3829(1979)的方法來進行。然而，也可使用用于將DNA導入細胞的其它方法，諸 如核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞的融合或聚陽離子例如polybrene、聚鳥 氨酸。關于用于轉化哺乳動物細胞的多種技術見Keown等，Methods in Enzymology, 185  527-537 (1990)及 Mansour 等，Nature，336 :348_352 (1988)。適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括原核生物、酵母或高等真核 細胞。合適的原核生物包括但不限于真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如 腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K12菌株 MM294 (ATCC 31，446)；大腸桿菌 X1776 (ATCC 31，537)；大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27,325) 和K5 772(ATCC53，635)。其它合適的原核生物宿主細胞包括腸桿菌科，諸如埃希氏菌 屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌(大腸桿菌)(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、 歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬 (Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia) 例如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌 屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) (例如1989年4月12日出版的DD266，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、禾口鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)0 這 些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是用于重組DNA產物發酵的常用宿主菌 株。優選的是，宿主細胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修飾，在編碼 對宿主而言內源的蛋白質的基因中產生遺傳突變，此類宿主的例子包括大腸桿菌W3110 菌株1A2，其具有完整基因型tonA ；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3 ；大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55，244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT karf ；大腸桿菌 W3110 菌株 37D6，其具有完整基因型 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169degP ompT rbs7 ilvG kanr ；大腸桿菌 W3110 菌株 40B4，它是 具有非卡那霉素抗性degP刪除突變的菌株37D6 ；及具有1990年8月7日授權的美國專利 No. 4，946，783中公開的突變型周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。或者，體外克隆方法，例如PCR 或其它核酸聚合酶反應也是合適的。除了原核生物以外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母也是編碼免疫粘附素 的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的 低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 和 Nurse, Nature 290  140 (1981) ；EP139, 383，1985 年5月 2 日公開)；克魯維 酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利 No. 4，943，529 ；Fleer 等，Bio/Technology 9 968-975(1991))諸如例如乳酸克魯維酵母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J. Bacteriol. 154(2) :737_742 (1983))、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維 酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母 (K. drosophilarum) (ATCC 36, 906 ；Van den Berg φ, Bio/Technology 8:135(1990))、 耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus)；亞羅酵母屬 (Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) (EP 183, 070 ；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. 28 :265_278 (1988))；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉 (Trichoderma reesia) (EP 244, 234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa) (Case 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263(1979))；許旺酵母屬(Schwanniomyces)諸如西方許旺 酵母(Schwanniomycesoccidentalis) (EP 394，538，1990 年 10 月 31 日公開)；和絲狀真 菌諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium) (W091/00357，1991年1月10日公開)和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構巢曲霉 (A. nidulans) (Balance 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 112 :284_289 (1983) ；Tilburn 等，Gene 26:205-221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81  1470-1474 (1984)) 和黑曲霉(A.niger) (Kelly 和 Hynes，EMBO J. 4 :475_479 (1985))。甲基營養型酵母 (Methylotropic yeast)適于本發明，包括但不限于能夠在甲醇上生長的、選自以下屬的 酵母漢遜氏酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera)、 畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)和紅 酵母屬(Rhodotorula)。作為這類酵母的例子的具體物種列表可參見C. Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs,269(1982)。適用于表達糖基化免疫粘附素的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞 的例子包括昆蟲細胞諸如果蠅(Drosophila) S2和夜蛾(Spodoptera) Sf9，以及植物細胞。 有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細胞。更多具體例子包 括用SV40轉化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(293或為了在懸浮培養 中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，J. Gen Virol.，36 :59 (1977))；中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR (CHO, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216(1980))；小鼠塞托利 (sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. ,23 :243_251 (1980))；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2, HB 8065)；和小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)。認 為適宜宿主細胞的選擇在本領域技術范圍內。—般而言，用于表達ALK-I免疫粘附素的哺乳動物宿主細胞系的選擇主要取決 于表達載體。另一項考慮是要求的蛋白質量。毫克數量常常能通過瞬時轉染來生產。例 如，可以通過改良的磷酸鈣法用基于PRK5的載體轉染經腺病毒EIA轉化的293人胚腎細 胞系，以容許高效的免疫粘附素表達。可以通過DEAE-右旋糖苷法使用基于CDMA8的載體 來轉染 COS 細胞(Aruffo 等，Cell61，1303-1313(1990) ；Zettmeissl 等，DNA Cell Biol. (US) 9，347-353 (1990))。如果想要更大量的蛋白質，可以在穩定轉染宿主細胞系后表達免 疫粘附素。例如，可以在存在別的編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)和賦予對G418的抗性的質 粒的情況中將基于PRK5的載體導入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。可以在培養物中選擇對 G418有抗性的克隆；在存在漸增水平的DHFR抑制劑甲氨蝶呤的情況中培養這些克隆；編碼 DHFR和免疫粘附素序列的基因拷貝數得到共擴增的克隆被選出。如果免疫粘附素在其N
            
30端含有疏水性前導序列，那么它有可能受到經轉染細胞的加工和分泌。具有更復雜結構的 免疫粘附素的表達可能要求特別適合的宿主細胞；例如，諸如輕鏈或J鏈等構件可以由某 些骨髓瘤或雜交瘤細胞宿主來提供(Gascoigne等，1987，見上文；Martin等，J. Virol. 67， 3561-3568(1993))。復制載體的選擇和使用可以將編碼免疫粘附素的核酸插入復制載體，用于克隆(DNA擴增)或表達。多種 載體是公眾可得的。載體可以是例如質粒、粘粒、病毒顆粒或噬菌體的形式。可以通過多種 規程將適宜的核酸序列插入載體。通常，使用本領域已知的技術將DNA插入適宜的限制性 內切核酸酶位點。載體構件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復制起點、一種 或多種標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。包含一種或多種這些構件的合適載 體的構建采用技術人員已知的標準連接技術。免疫粘附素不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述 異源多肽可以是在成熟蛋白質或多肽的N-末端具有特定切割位點的信號序列或其它多 肽。通常，信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載體的編碼免疫粘附素的DNA的 一部分。信號序列可以是原核信號序列，選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩定的 腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉化酶前導序列、α因子前 導序列(包括糖酵母和克魯維酵母的α “因子前導序列，后者見美國專利No. 5，010, 182)、 或酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導序列(1990年4月4日公開的EP 362，179)、或1990年11月15日公開的WO 90/13646中描述的信號。在哺乳動物細胞表達 中，可以使用哺乳動物信號序列來指導蛋白質的分泌，諸如來自相同或相關物種的分泌型 多肽的信號序列，以及病毒分泌前導序列。表達和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細胞中復制的核 酸序列，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標志序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒 的此類序列。來自質粒PBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2 μ質粒起點適 合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克 隆載體。表達和克隆載體通常會包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如 下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四 環素；(b)補足營養缺陷；或(c)提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養物，例如用于芽孢 桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。適于哺乳動物細胞的選擇標志的一個例子是能夠鑒定有能力攝取抗免疫粘附素 編碼核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主 細胞是DHFR活性缺陷的CHO細胞系，其制備和繁殖如Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 =4216(1980)所述。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的trpl基 因(Stinchcomb 等，Nature, 282 39(1979) ；Kingsman 等，Gene, 7  141 (1979) ；Tschemper 等，Gene，10  157 (1980))。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株，例如ATCC No.44076 或 PEP4-1(Jones, Genetics,85 12 (1977))。表達和克隆載體通常包含與編碼免疫粘附素的核酸序列可操作連接的啟動子以 指導mRNA合成。受到多種潛在宿主細胞識別的啟動子是眾所周知的。適用于原核宿主的啟
            
31動子包括β -內酰胺酶和乳糖啟動子系統(Chang等，Nature，275 =615(1978) ；Goeddel等， Nature, 281 :544 (1979))、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel,Nucleic Acids Res.，8 4057 (1980) ；EP 36，776)和雜合啟動子諸如 tac 啟動子(deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80 :21_25 (1983))。用于細菌系統的啟動子還將包含與編碼免疫粘附素的 DNA可操作連接的Shine-Dalgarno序列。適用于酵母宿主的啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等， J. Biol. Chem.，255 2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess 等，J. Adv. EnzymeReg.，7  149(1968) ；Holland,Biochemistry, 17 =4900(1978))的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛_3_磷 酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸 變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有由生長條件控制轉錄的額外優點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是 醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。適用于酵母表達的載體和啟動子 進一步描述于EP 73,657。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄免疫粘附素受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、 禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2，211，504)、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤 病毒、逆轉錄病毒(諸如禽類肉瘤病毒)、巨細胞病毒、乙肝病毒和猿病毒40(SV40))基因組 獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)的或來自 熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統相容的話。可通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核細胞對編碼抗免疫粘附素的DNA 的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約10至300bp，作用于啟動子以增加其轉 錄。現在已知來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰島素)的 許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚 期一側的增強子(100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側的 增強子和腺病毒增強子。增強子可以剪接到載體中，位于免疫粘附素編碼序列的5'或3' 位置，但是優選位于啟動子的5'位點。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的 有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以 由真核或病毒DNA或cDNA的3'非翻譯區的端獲得。這些區域包含在編碼免疫粘附素的 mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。適合在改動后在重組脊椎動物細胞培養物中合成免疫粘附素的其它方法、載 體和宿主細胞見 Gething 等，Nature, 293 620-625 (1981) ；Mantei 等，Nature, 281  40-46(1979) ；EP 117，060;及 EP 117,058。免疫粘附素的純化和表征優選作為分泌多肽自培養液回收免疫粘附素或嵌合異源粘附素，但是也可以自宿 主細胞溶胞物回收。作為第一步，通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細胞或是裂 解片段；任選的是，可以用商品化蛋白質濃縮濾器來濃縮蛋白質，接著通過一種或多種選自 下組的純化規程將嵌合異源粘附素與其它雜質分開在免疫親和柱上分級；在離子交換柱 上分級；硫酸銨或乙醇沉淀；反相HPLC ；硅土上的層析；肝素Siipharose上的層析；陽離子
            
32交換樹脂上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；和凝膠過濾。一種特別有利的純化免疫粘附素的方法是親和層析。親和配體的選擇取決于嵌 合物中所使用的免疫球蛋白Fc域的物種和同種型。可以使用蛋白A來純化基于人IgGl、 IgG2、或 IgG4 重鏈的免疫粘附素(Lindmark 等，J. Immunol. Meth. 62，1_13 (1983))。蛋白 G 推薦用于所有小鼠同種型和人IgG3 (Guss等，EMBO J. 5，15671575 (1986))。親和配體所附 著的基質最常用的是瓊脂糖，但是也看使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃 或聚(苯乙烯二乙烯)苯容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。使免疫粘附素 結合至蛋白A或G親和柱的條件完全由Fc域的特征(即其物種和同種型)來規定。一般 而言，在選擇正確的配體時，自非條件化培養液直接發生高效結合。免疫粘附素的一項區別 特征是，對于人IgGl分子，對蛋白A的結合能力相對于相同Fc類型的抗體略有降低。在酸 性PH(處于或超出3. 0)中或在含有適度離液鹽的中性pH緩沖液中，能有效洗脫所結合的 免疫粘附素。此親和層析步驟能產生超過95%純的免疫粘附素制備物。可以使用本領域已知的其它方法來替換或聯合蛋白A或G上的親和層析以純化 免疫粘附素。免疫粘附素在親硫性凝膠層析(Hutchens和Porath, Anal. Biochem. 159， 217-226(1986))和固定化金屬螯合物層析(Al-Mashikhi 和 Makai，J. Dairy Sci. 71， 1756-1763(1988))中的表現與抗體相似。然而，與抗體相反，它們在離子交換柱中的表現不 僅由它們的等電點規定，而且還由由于它們的嵌合性質而可能在分子中存在的電荷偶極規 定。帶表位標簽的免疫粘附素的制備便于使用含有針對該表位的抗體(以吸附融合 多肽)的免疫親和柱來純化。在一些實施方案中，將ALK-I免疫粘附素裝配成單體、或者異或同多聚體、二聚體 或四聚體，尤其如WO 91/08298所例示的。一般而言，這些裝配好的免疫球蛋白會具有已知 的單元結構。基本的四鏈結構單元就是IgG、IgD、和IgE存在的形式。四單元結構在更高 分子量的免疫球蛋白中重復；IgM—般作為基本四單元通過二硫鍵保持在一起的五聚體存 在。IgA球蛋白和偶爾的IgG球蛋白在血清中也可以多聚體形式存在。在多聚體的情況中， 每個四單元可以是相同的或不同的。一般而言，本發明的ALK-I免疫粘附素會具有下列任一項或多項特性能夠中和、 阻斷、抑制、消除、降低或干擾ALK-I的活性，包括例如降低或阻斷ALK-I受體活化、降低或 阻斷ALK-I下游分子信號傳導(例如Smadl、Smad5和/或Smad8的磷酸化)、破壞或阻斷 ALK-I 配體(例如 BMP9 或 BMP10)結合 ALK-1。抗體在一個實施方案中，抗ALK-I抗體是單克隆的。本發明的范圍還涵蓋本文中所提 供的抗ALK-I抗體的Fab、Fab' ,Fab' -SH和F(ab' )2片段。這些抗體片段可通過傳統 手段來制備，諸如酶促消化，或者可以通過重組技術來生成。此類抗體片段可以是嵌合的或 人源化的。這些片段可用于下文所列的診斷和治療目的。單克隆抗體是由一群基本上同質的抗體獲得的，即構成群體的各個抗體相同，除 了可能以極小量存在的可能的天然存在突變。如此，修飾語“單克隆”指明抗體的特征，即 不是不同抗體的混合物。本發明的抗ALK-I單克隆抗體可使用最初由Kohler等，Nature 256 =495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No. 4,816, 567)來制備。在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠，以弓丨發生成或能夠 生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體會特異性結合用于免疫的蛋白質。ALK-I的抗體一般通 過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射ALK-I和佐劑來生成。ALK-I可以使用本領域 眾所周知的方法來制備，其中有些方法在本文中有進一步描述。例如，ALK-I的重組生產在 下文中有描述。在一個實施方案中，將動物用包含ALK-I胞外結構域(ECD)且其融合至免疫 球蛋白重鏈Fc部分的ALK-I衍生物免疫。在另一個的實施方案中，將動物用ALK-I-IgGl融 合蛋白免疫。通常將動物針對ALK-I的免疫原性偶聯物或衍生物和單磷酰脂質A(MPL)/二 棒分枝菌酸海藻糖(trehalose dicrynomycolate, TDM) Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton,MT)進行免疫，將溶液皮內注射于多個部位。2周后，對動物進行加強免疫。7_14 天后，對動物采血，并對血清測定抗ALK-I滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺 (plateaus) 0或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴 細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，MonoclonalAntibodies principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基優選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏 酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基典型的將含有 次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。優選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成 抗體、并對諸如HAT培養基的培養基敏感的。在這些細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨 髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心(Salklnstitute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤及可從美國典 型培養物保藏中心(American Type CultureCollection, Rockville, Maryland, USA)獲 得的SP-2或X63-Ag8-653細胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細胞系也已描 述用于生成人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. 133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp.51—63, Marcel Dekker, Inc., NewYork,1987)。可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養液測定針對ALK-I的單克隆抗體的生成。優 選的是，通過免疫沉淀或通過體外結合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸 附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。單克隆抗體的結合親和力可通過例如Munson等，Anal. Biochem. 107 220 (1980) 的Scatchard分析來測定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后， 該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆并通過標準方法進行培養(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress, 1986)。適于這一目 的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水 瘤進行體內培養。可通過常規免疫球蛋白純化規程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養液、腹水或血清適當分開。抗ALK-I抗體可以通過使用組合庫篩選具有期望活性的合成抗體克隆來制備。在 原理上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示融合至噬菌 體外殼蛋白的各種抗體可變區片段(Fv)的噬菌體。通過針對期望抗原的親和層析淘選此 類噬菌體文庫。表達能夠結合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫中不 結合的克隆分開。然后將結合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原吸附/洗脫 循環進一步富集。任何抗ALK-I抗體可以如下獲得，即設計合適的抗原篩選規程來選擇感 興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIH Publication91_3242, Bethesda MD (1991)，卷1-3中記載的合適的恒定區(Fe)序列構建全長抗ALK-I抗體克隆。抗體的抗原結合域由兩個約110個氨基酸的可變(V)區形成，分別來自重鏈(VL) 和輕鏈(VH)，都呈現三個高變環或互補決定區(CDR)。可變域可以功能性的展示在噬菌 體上，或是作為單鏈Fv(SCFV)片段(其中VH和VL通過短的、柔性的肽共價相連)，或者 作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價相互作用)，如Winter等，Ann. Rev. Immunol.，12 =433-455(1994)所述。在用于本文時，編碼scFv的噬菌體克隆和編碼Fab的 噬菌體克隆統稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”。VH和VL基因的全集可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)分開克隆，并在噬菌體 文庫中隨機重組，然后可以搜索抗原結合克隆，如Winter等，Ann. Rev. Immunol. ,12  433-455 (1994)所述。來自經免疫來源的文庫能提供對免疫原有高親和力的抗體，無需構建 雜交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗 體來源，無需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12 :725_734(1993)所述。最后，未免疫的 文庫還可以以合成方式來構建，即從干細胞克隆未重排的V基因片段，使用包含隨機序列 的PCR引物來編碼高度可變的CDR3區并在體外實現重排，如Hoogenboom和Winter，J. Mol. Biol.，227 381-388(1992)所述。通過與次要外殼蛋白pill融合，使用絲狀噬菌體來展示抗體片段。抗體片段可 以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結構域通過柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例 如如Marks等，J. Mol. Biol.，222 =581-597 (1991)所述，或者展示為Fab片段，其中一條鏈 與PlII融合，而另一條鏈分泌到細菌宿主細胞周質中，在此裝配Fab-外殼蛋白結構，其通 過取代一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl. Acids Res.，19 4133-4137(1991)所述。一般而言，從收獲自人或動物的免疫細胞獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果希 望文庫偏向抗ALK-I克隆，那么可以給受試者免疫ALK-I以產生抗體應答，并回收脾細胞和 /或循環B細胞或其它外周血淋巴細胞(PBL)用于文庫構建。在一個優選的實施方案中，如 下得到了偏向抗ALK-I克隆的人抗體基因片段文庫，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣 列(且缺乏功能性內源抗體生成系統)的轉基因小鼠中產生抗ALK-I抗體應答，使得ALK-I 免疫產生生成針對ALK-I的人抗體的B細胞。生成人抗體的轉基因小鼠的產生在下文中有 描述。可以如下獲得抗ALK-I反應性細胞群的進一步富集，即使用合適的篩選規程來分 離表達ALK-I特異性膜結合抗體的B細胞，例如通過用ALK-I親和層析或者細胞對熒光染料標記的ALK-I的吸附及后續的流動激活細胞分選(FACS)進行的細胞分離。或者，來自未免疫供體的脾細胞和/或B細胞或其它PBL的使用提供了可能的抗 體全集的更佳展現，而且還容許使用ALK-I在其中沒有抗原性的任何動物(人或非人的) 物種構建抗體文庫。為了體外摻入抗體基因的文庫構建，從受試者收獲干細胞以提供編碼 未重排抗體基因區段的核酸。可以從多種動物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類、luprine、 犬、貓、豬、牛、馬、和鳥類等)獲得感興趣的免疫細胞。從感興趣的細胞回收編碼抗體可變基因區段(包括VH和VL區段)的核酸并擴 增。就重排的VH和VL基因文庫而言，可以如下獲得所需DNA，即從淋巴細胞分離基因組 DNA或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物進行聚合酶鏈式反 應(PCR)，如 Orlandi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 :3833_3837 (1989)所述，由此構建 多樣性V基因全集供表達。可以從cDNA和基因組DNA擴增V基因，反向引物位于編碼成 熟V結構域的外顯子的5'末端，正向引物基于J區段內部，如Orlandi等(1989)和Ward 等，Nature, 341 =544-546(1989)所述。然而，為了從cDNA進行擴增，反向引物還可基于前 導外顯子(leader exon)內，如 Jones 等，Biotechnol.，9 =88-89(1991)所述，正向引物基 于恒定區內，如 Sastry 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86 :5728_5732 (1989)所述。為了 使互補性最大化，引物中可以摻入簡并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。 優選的是，如下將文庫多樣性最大化，即使用靶向每個V基因家族的PCR引物來擴增免疫 細胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL排列，例如如Marks等，J. Mol. Biol.，222  581-597(1991)或 Orum 等，Nucleic Acids Res. ,21 4491-4498 (1993)的方法所述。為了 將所擴增的DNA克隆到表達載體中，可以在PCR引物的一端引入罕見的限制性位點作為標 簽，如Orlandi等(1989)所述，或者用帶標簽的引物進行進一步的PCR擴增，如Clackson 等，Nature，352 :624_628 (1991)所述。人工合成的重排的V基因全集可以在體外從V基因區段衍生。大多數人VH基因 區段已經克隆和測序(Tomlinson 等，J. Mol. Biol.，227 :776_798 (1992))，并定位(Matsuda 等，Nature Genet.，3 :88_94(1993))；這些克隆的區段(包括Hl和H2環的所有主要構 型)可用于生成多樣性VH基因全集，用到編碼序列和長度多樣性的H3環的PCR引物，如 Hoogenboom 和 Winter，J. Mol. Biol. , 227 381-388 (1992)所述。VH 全集還可如下生成， 所有序列多樣性集中于單一長度的長Η3環，如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89  4457-4461(1992)所述。人Vk和νλ區段已經克隆和測序(Williams和Winter，Eur. J. Immunol. ,23  1456-1461 (1993))，而且可用于生成合成的輕鏈全集。基于一系列VH和VL 折疊及L3和H3長度的合成的V基因全集會編碼具有可觀結構多樣性的抗體。擴增編碼V 基因的 DNA 后，依照 Hoogenboom 和 Winter，J.Mol.Biol.，227 :381_388 (1992)的方法，可以 在體外重排種系V基因區段。抗體片段全集可以如下構建，即以數種方式將VH與VL基因全集聯合在一起。 可以在不同載體中創建各個全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefe等，Gene, 128  119-126(1993)所述，或者在體內通過組合感染來重組載體，例如Waterhouse等，Nucl. Acids Res. ,21 =2265-2266(1993)中記載的IoxP系統。體內重組方法利用Fab片段的雙 鏈性質來克服因大腸桿菌轉化效率施加的庫容量限制。分別克隆未免疫的VH和VL全集， 一個克隆入噬菌粒，另一個克隆入噬菌體載體。然后通過用噬菌體感染含噬菌粒的細菌使
            
36得每個細胞包含不同的組合來聯合兩種文庫，庫容量只受細胞存在數的限制(約IO12個克 隆)。兩種載體都包含體內重組信號，使得VH與VL基因重組到單一復制子上，并共包裝成 噬菌體病毒粒。這些巨型文庫提供了大量的具有優良親和力(KcT1為約I(T8M)的多樣性抗 體。或者，可以將全集依次克隆入同一載體，例如如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 =7978-7982 (1991)所述，或者通過PCR裝配到一起，然后克隆，如Clackson等， Nature, 352 =624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VL DNA與編碼柔性肽間隔物 的DNA連接以形成單鏈Fv(SCFV)全集。在另一種技術中，“細胞內PCR裝配”用于通過PCR 在淋巴細胞內聯合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embleton等，Nucl. Acids Res. ,20 3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(naive library)(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力 (KcT1為約IO6-IO7M4)，但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構建和再次選擇次生文庫， 如 Winter 等(1994)，見上文所述。例如，在 Hawkins 等，J. Mol. Biol.，226 :889_896 (1992) 的方法或 Gram 等，Proc. Natl. Acad. SciUSA，89 =3576-3580 (1992)的方法中，使用易錯聚合 酶在體外隨機引入突變(Leung等，Technique，1 :11_15(1989))。另外，可以通過隨機突變 一個或多個CDR來進行親和力成熟，例如在選定的個別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣CDR 的隨機序列的引物進行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO 96/07754 (公布于1996年3月14 日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補決定區中誘導誘變以創建輕鏈基因文庫的方法。 另一種高效方法是將通過噬菌體展示選出的VH或VL結構域與得自未免疫供體的天然存在 V結構域變體組合，并在數輪鏈重新改組中篩選更高親和力，如Marks等，Biotechnol.，10  779-783(1992)所述。此技術容許生成親和力在10_9M范圍的抗體和抗體片段。ALK-I核酸和氨基酸序列是本領域已知的而且在本文中有進一步討論。編碼 ALK-I的DNA可以通過本領域已知的多種方法來制備。這些方法包括但不限于通過Engels 等，Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. ,28 :716_734(1989)中記載的任何方法，諸如三酯、亞磷酸 酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法進行的化學合成。在一個實施方案中，編 碼ALK-I的DNA的設計中使用表達宿主細胞所優選的密碼子。或者，編碼ALK-I的DNA可 以從基因組或cDNA文庫分離。構建編碼ALK-I的DNA分子后，將該DNA分子與表達載體，諸如質粒中的表達控制 序列可操作連接，其中所述控制序列受到該載體轉化的宿主細胞的識別。一般而言，質粒載 體包含復制和控制序列，其衍生自與宿主細胞相容的物種。載體通常攜帶復制位點，以及編 碼能夠在轉化細胞中提供表型選擇的蛋白質的序列。適于在原核和真核宿主細胞中表達的 載體是本領域已知的，有些在本文中有進一步描述。可以使用真核生物體，諸如酵母或衍生 自多細胞生物體諸如哺乳動物的細胞。任選的是，編碼ALK-I的DNA與分泌前導序列可操作連接，導致表達產物被宿主細 胞分泌到培養基中。分泌前導序列的例子包括stII、eC0tin、IamB、皰疹⑶、lpp、堿性磷酸 酶、轉化酶、和α-因子。適用于此處的還有蛋白A的36個氨基酸的前導序列(Abrahmsen 等，EMBO J.，4 :3901(1985))。宿主細胞用上文所述本發明的表達或克隆載體轉染，優選轉化，并在常規營養培 養基中培養，培養基可以為了誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼期望序列的基因而適當
            
37修改。轉染指宿主細胞攝取表達載體，無論任何編碼序列事實上是否表達。本領域普通 技術人員知道許多轉染方法，例如CaPOjX淀和電穿孔。若宿主細胞內存在此載體運轉的 任何指示，則認為轉染成功。用于轉染的方法是本領域眾所周知的，有些在本文中有進一步 描述。轉化指將DNA導入生物體，使得DNA可進行復制，或是作為染色體外元件，或是通 過染色體整合。根據所用宿主細胞，使用適于所述細胞的標準技術進行轉化。用于轉化的 方法是本領域眾所周知的，有些在本文中有進一步描述。用于生成ALK-I的原核宿主細胞可以如Sambrook等，見上文一般所述進行培養。用于生成ALK-I的哺乳動物宿主細胞可以在多種培養基中培養，所述培養基是本 領域眾所周知的，有些在本文中有描述。本發明公開的宿主細胞涵蓋體外培養物中的細胞以及宿主動物體內的細胞。ALK-I的純化可以使用本領域公認的方法來實現，本文描述了其中一些。純化的ALK-I可以附著于合適的基質，諸如瓊脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纖維 素、各種丙烯酸共聚物、羥基甲基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龍、中 性和離子載體、諸如此類，用于噬菌體展示克隆的親和層析分離。ALK-I蛋白對基質的附著 可以通過Methods 1業11巧11101(^7，卷44(1976)中記載的方法來實現。將蛋白質配體附著于 多糖基質，例如瓊脂糖、右旋糖苷或纖維素的常用技術牽涉用鹵化氰活化載體，隨后將肽配 體的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶聯至活化后的基質。或者，ALK-I可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細胞上表達，或用于 細胞分選，或者偶聯至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于本領域已知的用于 淘選噬菌體展示庫的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫樣品接觸固定化 的ALK-1。正常情況下，選擇包括pH、離子強度、溫度等等的條件來模擬生理條件。對結合 至固相的噬菌體進行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci USA,88  7978-7982(1991)所述，或者用堿洗脫，例如如 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991) 所述，或者通過ALK-I抗原競爭洗脫，例如在與Clackson等，Nature，352 :624_628 (1991) 的抗原競爭法類似的規程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-1，000倍。此外，富集的噬 菌體可以在細菌培養物中進行培養，并進行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過程中解離的動力學，及單個噬菌體上的 多個抗體片段是否能同時結合抗原。具有較快解離動力學(和弱結合親和力)的抗體可以 通過使用短時間的清洗、多價噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來保留。高密度不僅 通過多價相互作用而穩定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結合。具有較慢解離 動力學(和強結合親和力)的抗體的選擇可以通過使用長時間的清洗和單價噬菌體展示 (如Bass等，Proteins, 8 :309_314 (1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如 Marks 等，Biotechnol.，10 :779_783 (1992)所述)來促進。有可能在對ALK-I具有不同親和力的噬菌體抗體之間進行選擇，甚至是親和力略 有差異的。然而，選定抗體的隨機突變(例如如有些上文所述親和力成熟技術進行)有可 能產生許多突變體，多數結合抗原，少數具有更高的親和力。通過限制ALK-I，罕見的高親和力噬菌體能競爭勝出。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素 化ALK-I —起溫育，但是生物素化ALK-I的摩爾濃度低于ALK-I的目標摩爾親和常數。然 后用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結合噬菌體。此類“平衡捕捉”容許依照結 合親和力來選擇抗體，其靈敏性容許從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只有原 值2倍的突變體克隆。還可以操作清洗結合至固相的噬菌體的條件來進行基于解離動力學 的區分。抗ALK-I克隆可以進行活性選擇。在一個實施方案中，本發明提供了降低或阻斷 ALK-I受體活化、降低或阻斷ALK-I下游分子信號傳導(例如Smadl、Smad5和Smad8的磷 酸化)、或者破壞或阻斷ALK-I配體(例如BMP9或BMP10)結合ALK-I的抗ALK-I抗體。編碼雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規規程分離 和測序(例如通過使用設計成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增感興趣的重鏈和輕鏈 編碼區的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉染到 原本不生成免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵 巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得期望單克隆抗體的合成。關于編碼 抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括Skerra等，Curr. Opinion inlmmunol.， 5 256 (1993)及 Pluckthun, Immunol. Rev.，130  151 (1992)。編碼Fv克隆的DNA可以聯合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區的已知DNA序列(例如 適宜的DNA序列可得自Kabat等，見上文)以形成編碼全長或部分重鏈和/或輕鏈的克隆。 應當領會，任何同種型的恒定區都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區，而 且此類恒定區可以得自任何人或動物物種。衍生自一種動物(諸如人)物種的可變域DNA， 然后與另一動物物種的恒定區DNA融合以形成“雜合的”全長重鏈和/或輕鏈的編碼序列 的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“雜合”抗體的定義中。在一個優選的實施方案中，衍 生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區DNA融合以形成完全人的、全長或部分重鏈和/或輕 鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自雜交瘤的抗ALK-I抗體的DNA，例如通過替代，即用人重 鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替衍生自雜交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851_6855 (1984)中的方法)。可以進一步修飾編碼雜交瘤 或Fv克隆衍生抗體或片段的DNA，通過共價接合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽 的整個或部分編碼序列。可以以該方式制備具有Fv克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結合特 異性的“嵌合”或“雜合”抗體。抗體片段本發明涵蓋抗體片段。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優勢。片 段的較小尺寸容許快速清除，而且可導致更易于接近實體瘤。已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗 體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992) ；Brennan 等，Science 229:81(1985))。然而，現在可直接由 重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達及由大腸 桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗 體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段并化學偶聯以形成F(ab' )2片段(Carter等，Bio/TechnologylO :163_167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細 胞培養物分離F(ab' )2片段。包含補救受體結合表位殘基、具有延長的體內半衰期的Fab 和F(ab' )2片段記載于美國專利No. 5，869，046。用于生成抗體片段的其它技術對于熟練 從業人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見 WO 93/16185 ；美國專利No. 5，571，894 ；及5，587，458。Fv和sFv是具有完整結合位點、缺 少恒定區的唯一類型；如此，它們適于在體內使用時降低非特異性結合。可構建sFv融合蛋 白以生成效應器蛋白質在sFv的氨基或羧基末端的融合物。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編，見上文。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利No. 5，641，870中 所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發明涵蓋人源化抗體。本領域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人 源化抗體可具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為 “輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。基本上可遵循Winter及其同事的方法進行人 源化(Jones 等，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323-327(1988)； Verhoeyen等，Science 239  1534-1536 (1988))，即用(非人)高變區序列替代人抗體的相 應序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)，其中顯著少于完 整的人可變域用非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中 有些高變區殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變域的選擇對于降低抗原性是非常重要 的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知人可變域序列 的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Sims 等，J. Immunol. 151 2296(1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 :901(1987))。另一種方法使 用由特定輕鏈或重鏈亞組(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框 架可用于數種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285(1992)； Presta 等，J. Immunol. 151 2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學特 性。為了達到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親 本序列和各種概念性人源化產物的過程來制備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模 型，這是本領域技術人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能 三維構象結構的計算機程序。通過檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列 發揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可以 從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對靶抗原的 親和力升高。一般而言，高變區殘基直接且最實質地涉及對抗原結合的影響。人抗體人抗ALK-I抗體可以通過如上所述聯合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv克隆可 變域序列與已知的人恒定域序列來構建。或者，可以通過雜交瘤方法來生成人單克隆抗 ALK-I抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細胞系已有記載，例 如 Kozbor J. Immunol. ,133 3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc.，New York，1987)；及
            
40Boerner 等，J. Immunol.，147 86 (1991).現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體 完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈 連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移 大量人種系免疫球蛋白基因會導致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) Jakobovits 等，Nature 362:255-258(1993)； Bruggermann 等，Year inlmmunol. 7 33 (1993)。基因改組也可用于自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有 與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為“表位印記”(印itope imprinting)，如上所述通過噬菌體展示技術得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區用 人V結構域基因全集替換，產生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進行的選擇導 致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈恢復了在一級噬菌體展示克隆中消除相 應的非人鏈后遭到破壞的抗原結合位點，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。 在重復該過程以替換剩余非人鏈時，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公布于1993年4 月1日)。與傳統的通過CDR移植進行的非人抗體的人源化不同，此技術提供完全人的抗 體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體，優選人抗體 或人源化抗體。在本案中，結合特異性之一針對ALK-1，另一結合特異性針對任何其它抗原。 例示性的雙特異性抗體可結合ALK-I蛋白質的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用于將細 胞毒劑定位于表達ALK-I的細胞。這些抗體擁有ALK-I結合臂和結合細胞毒劑(例如肥 皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半 抗原)的臂。可將雙特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab' )2雙特異性抗 體)。用于構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。在傳統上，雙特異性抗體的 重組生產基于兩對免疫球蛋白重鏈_輕鏈的共表達，其中兩種重鏈具有不同的特異性 (Millstein和Cuello，Nature 305 =537(1983))  由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配， 這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一 種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產 物產量低。類似的規程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等， EMBO J. 10 3655(1991)。依照一種不同且更優選的方法，將具有期望結合特異性(抗體_抗原結合位點) 的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3 區的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。優選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需 的位點的第一重鏈恒定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白 輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉染到合適的宿主生物體中。在用于構建的三種多 肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了極 大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相等比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別 意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。
            
在該方法的一個優選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈_輕鏈對(提供第二結合特 異性)構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途 徑，因此發現這種不對稱結構便于將期望的雙特異性復合物與不希望有的免疫球蛋白鏈組 合分開。該方法披露于W094/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh 等，Methodsin Enzymology 121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的 異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含至少部分抗體恒定域CH3結構域。在該方法 中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸) 替換。通過將大氨基酸側鏈用較小氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體 分子的界面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不希望有 的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。雙特異性抗體包括交聯或“異源偶聯”抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可 與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體已經建議用于將免疫系統細胞 靶向不希望有的細胞(美國專利No. 4，676，980)，及用于治療HIV感染(W0 91/00360 ；WO 92/00373 JPEP 03089)。可使用任何便利的交聯方法來制備異源偶聯抗體。合適的交聯 劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起披露于美國專利No. 4，676，980。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來 制備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗 體以生成F(ab' )2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下還原， 以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫化物的形成。然后將產生的Fab’片段轉變為硫代 硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復 成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產 生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，這些片段可化學偶聯以形 成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217_225 (1992)記載了完全人源化的雙特異 性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向化 學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達HER2受體的細胞 和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技 術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二 聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90  6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術提供了構建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段 包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上 的兩個結構域之間不能配對。因而，迫使一個片段上的VH和VL結構域與另一個片段上的互 補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二 聚體構建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol. 152 =5368(1994)。
            
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涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 60(1991)。多價抗體多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化 (和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而 生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。 多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或 由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體會包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更 多抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，但優選四個 抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含 兩個或多個可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl) n-VD2-(X2)n-FC，其中VDl是第一可變 域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是0或 1。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CHI-VH-CHI-Fc區鏈。 本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(且優選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多 價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈 可變域，且任選進一步包含CL結構域。抗體變體在有些實施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗 體的結合親和力和/或其它生物學特性。抗體的氨基酸序列變體是通過將適宜的核苷酸變 化引入抗體核酸或通過肽合成而制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內的殘基刪除 和/或插入和/或替代。可進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構建物，倘若最終 的構建物具有期望的特征。可在制備序列時將氨基酸改變引入受試抗體氨基酸序列。可用于鑒定抗體中作為優選誘變位置的某些殘基或區域的一種方法稱為“丙氨酸 掃描誘變”，如 Cunningham 和 Wells，Science 244  1081-1085 (1989)中所述。這里，鑒定一 個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨 酸)并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優選丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗 原的相互作用。然后通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲那些對替代展示出功 能敏感性的氨基酸位置。如此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突 變本身的本質不必預先決定。例如，為了分析指定位點處突變的后果，在靶密碼子或區域進 行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對所表達免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍由一個殘基至包含上 百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具 有N末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包 括將抗體的N或C端與酶(例如用于ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附 著于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中χ 是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側鏈的識別序列。 如此，多肽中這些三肽序列任一的存在產生了潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指將糖 類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，
            
43但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽 序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的序列中 添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用于0-連接的糖基化位點)。若抗體包含Fc區，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國專利申請 US 2003/0157108 (Presta, L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結構附著于 抗體 Fc 區的抗體。還可參見 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd. )。WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)和美國專利No. 6，602, 684 (Umana等人)中提到了在附著 于抗體Fc區的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO 1997/30087 (Patel 等人)中報告了在附著于抗體Fc區的寡糖中有至少一個半乳糖殘基的抗體。關于有更改碳 水化合物附著于其Fc區的抗體還可參見WO 1998/58964 (Raju, S.)和WO 99/22764 (Raju, S.)。關于具有改良糖基化的抗原結合分子還可參見US 2005/0123546 (Umana等)。本文中的優選糖基化變體包含Fc區，其中附著于Fc區的碳水化合物結構缺乏 巖藻糖。此類變體具有改進的ADCC功能。任選的是，Fc區還包含進一步改進ADCC的一 個或多個氨基酸替代，例如Fc區位置298、333和/或334處的替代(Eu殘基編號方式)。 涉及“脫巖藻糖型”或“巖藻糖缺乏型”抗體的出版物的例子包括US 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；WO 2001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US 2004/0132140 ；US2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865 ；WO 2003/085119 ； W02003/084570 ；WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742；Okazaki 等，J.Mol. Biol. 336  1239-1249 (2004) ；Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 614 (2004)。生成 脫巖藻糖化抗體的細胞系的例子包括蛋白質巖藻糖化缺陷的Lecl3 CHO細胞(Ripka等， Arch. Biochem. Biophys. 249 :533_545 (1986)；美國專利申請號 US 2003/0157108 Al, Presta, L ；及WO 2004/056312 Al，Adams等，尤其是實施例11)和敲除細胞系，諸如α -1， 6-巖藻糖轉移酶基因，FUT8，敲除的 CHO 細胞(Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87  614(2004))。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用 不同殘基替代。最有興趣進行替代誘變的位點包括高變區，但是也涵蓋FR改變。表2中 “優選替代”欄顯示了保守替代。如果此類替代導致生物學活性變化，那么可導入表2中稱 為“例示替代”的更多實質變化，或如下文參照氨基酸分類進一步所述，并篩選產物。表2  對抗體生物學特性的實質性修飾可通過選擇對維持以下方面的效果差異顯著的 替代來實現(a)替代區域中多肽主鏈的結構，例如(折疊)片或螺旋構象，(b)靶位點處分 子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積。根據共同的側鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ；(3)酸性的Asp、Glu ；(4)堿性的His、Lys、Arg ；(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro ；及
            
(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的。一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘 基。通常，選擇用于進一步開發的所得變體相對于產生它們的親本抗體會具有改良的生物 學特性。用于生成此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而 言之，將數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，在各個位點產生所有可能的氨基酸替 代。將如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內包裝的M13基因III 產物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(例如結合親 和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒定對抗原結合具 有重要貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析抗原_抗體復合物的晶體結構以鑒定抗體和 抗原之間的接觸點可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術進行替 代的候選位點。一旦產生這樣的變體，如本文所述對該組變體進行篩選，可選擇在一種或多 種相關測定法中具有優良特性的抗體用于進一步的開發。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領域知道的多種方法來制備。這些 方法包括但不限于從天然來源分離(在天然發生氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對 較早制備的變體或非變體型式的抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒 式誘變來制備。可能希望在免疫球蛋白多肽的Fc區中引入一處或多處氨基酸修飾，由此生成Fc 區變體。Fc區變體可包括在一個或多個氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾 (例如替代)的人Fc區序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。依照此描述和本領域的教導，涵蓋在有些實施方案中，方法中所使用的抗體與野 生型對應抗體相比可在例如Fc區中包含一處或多處改變。與它們的野生型對應物相比，這 些抗體仍會基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認為可在Fc區中進行將會導 致Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(即或是增強或是削弱)的某些改變， 例如W099/51642中所述。還可參見關注Fc區變體其它例子的Duncan和Winter，Nature 322 738-40(1988)；美國專利 No. 5，648，260 ；美國專利 No. 5，624，821 ；及 W094/29351。 W000/42072 (Presta)和 WO 2004/056312 (Lowman)記載了對 FcR 的結合提高或降低的抗 體變體。在此明確收入這些專利出版物的內容作為參考。還可參見Shields等，J.Biol. Chem. 9 (2) =6591-6604 (2001) 0半衰期延長且對新生兒Fc受體(FcRn)(它負責將母體IgG 轉移給胎兒)(Guyer 等，J. Immunol. 117 587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249(1994)) 的結合改良的抗體記載于US2005/0014934A1 (Hinton等)。這些抗體包含具有一處或多處 改進Fc區與FcRn結合的替代的Fc區。具有改變的Fc區氨基酸序列且Clq結合能力升高 或降低的多肽變體記載于美國專利No. 6，194，551B1，W099/51642。在此明確收入這些專利 出版物的內容作為參考。還可參見Idusogie等，J. Immunol. 164 :4178_4184(2000)。抗體衍生物可進一步修飾抗體以包含本領域知道的且易于獲得的額外非蛋白質性質模塊。優 選的是，適于抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不 限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯 吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊環、聚-1，3，6-三口惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機共聚物)、和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙 烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水 中的穩定性，聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是 分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合 物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據下列考慮來確定用于衍生化的聚 合物的數目和/或類型，包括但不限于待改進抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否會 用于指定條件下的治療等。篩選具有期望性質的抗體抗體可以用本領域已知的各種測定法對其物理/化學性質和生物學功能進行表 征。在有些實施方案中，抗體表征為如下任一項或多項結合ALK-1，降低或阻斷ALK-I受 體活化，降低或阻斷ALK-I受體下游分子信號傳導(例如Smadl、Smad5和/或SmadS的磷 酸化)，破壞或阻斷ALK-I配體(例如BMP9或BMP10)結合ALK-I，抑制血管發生，抑制淋巴 管發生，治療和/或預防腫瘤、細胞增殖性病癥或癌癥，治療或預防與ALK-I表達和/或活 性有關的病癥。純化的抗體還可以通過一系列測定法進行表征，包括但不限于N端測序、氨基酸 分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發明的某些實施方案中，對此處制備的抗體分析它們的生物學活性。在有些 實施方案中，對本發明的抗體檢驗它們的抗原結合活性。本領域已知的并且可以在本文中 使用的抗原結合測定法包括但不限于利用諸如以下技術的任何直接的或競爭性的結合測 定法=Western印跡、放射免疫測定法、ELISA (酶聯免疫吸附測定法)、“夾心式/三明治式” 免疫測定法、免測沉淀測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法。在一個實施方案中，所述抗體是具有一些但不是全部效應器功能已有變化的抗 體，這使其成為許多應用的期望候選物，其中抗體在體內的半衰期很重要但某些效應器功 能(諸如補體和ADCC)不是必需的或者是有害的。在某些實施方案中，測量所生成的免疫 球蛋白的Fc活性以確保只有期望性質得到保留。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定 法以證實CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法以 確保抗體缺失Fc γ R結合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC 的主要細胞，NK細胞，只表達Fc y RIII，而單核細胞表達Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII。在 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9 :457_92 (1991)第 464 頁的表 3 概述了造血細胞 上的FcR表達。美國專利No. 5，500，362或5，821，337描述了用于評估感興趣分子的ADCC 活性的體外測定法的一個例子。可用于這些測定法的有用效應細胞包括外周血單個核細胞 (PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可以在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如 在諸如Clynes等，PNAS(USA)95 =652-656(1998)中公開的動物模型中。也可以進行Clq結 合測定法以證實抗體不能結合Clq從而缺失CDC活性。為了評估補體激活，可以進行CDC測 定法，例如 Gazzano-Santoro 等，J. Immunol. Methods 202  163 (1996)所述。也可以利用本 領域已知的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定，例如實施例部分所描述的那些。載體、宿主細胞和重組方法為了重組生產抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復制載體，用于進一步克隆 (DNA擴增)或表達。可使用常規規程容易的分離編碼抗體的DNA并測序(例如使用能夠
            
47與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因性特異結合的寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體的選 擇部分取決于將要使用的宿主細胞。通常，優選的宿主細胞是原核或真核(通常是哺乳動 物)起源的。應當領會，任何同種型的恒定區可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE 恒定區，而且此類恒定區可以從任何人或動物物種獲得。使用原核宿主細胞生成抗體載體構建可使用標準重組技術來獲得編碼抗體多肽構件的多核苷酸序列。可從抗體生成細 胞諸如雜交瘤細胞分離期望的多核苷酸序列并測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技 術合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復制并表達異源多 核苷酸的重組載體。為了本發明，可使用本領域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的 選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉化的具體宿主細胞。根據其 功能(擴增或表達異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細胞的相 容性，每種載體含有多種構件。載體構件通常包括但不限于復制起點、選擇標志基因、啟動 子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入片段、和轉錄終止序列。—般而言，與宿主細胞一起使用的質粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復 制子和控制序列。載體通常攜帶復制位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標志序 列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒PBR322轉化大腸桿菌。PBR322包含編碼氨芐 青霉素(Amp)和四環素(Tet)抗性的基因，如此提供輕松鑒定轉化細胞的手段。pBR322、其 衍生物、或其它微生物質粒或噬菌體還可包含或經修飾而包含可被微生物生物體用于表達 內源蛋白質的啟動子。Carter等人，美國專利No. 5，648，237中詳細記載了用于表達特定抗 體的pBR322衍生物的例子。另外，可將包含與宿主微生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿 主的轉化載體。例如，可使用噬菌體諸如GEMtm-II來構建可用于轉化易感宿主細胞諸如大 腸桿菌LE392的重組載體。表達載體可包含兩種或更多啟動子-順反子對，它們編碼每一種多肽構件。啟動 子是位于順反子上游(5')的非翻譯調控序列，它調控順反子的表達。原核啟動子通常分 成兩類，誘導型的和組成性的。誘導型啟動子指響應培養條件的變化(例如營養物的存在 與否或溫度變化)而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源DNA 中的啟動子并將分離的啟動子序列插入載體，由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈或重鏈的 順反子DNA可操作連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用于指導靶基因的擴增和 /或表達。在有些實施方案中，使用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，它們通常容 許所表達靶基因的更高轉錄和更高產量。適用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β -半乳糖苷酶和乳糖啟動子系統、 色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌中有功能的 其它啟動子(諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經 發表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制性位點的接頭或銜接頭將它們與編碼 靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlist等，Cell 20 =269(1980)) 0在本發明的一個方面，重組載體內的每個順反子都包含指導所表達多肽穿膜轉運
            
48的分泌信號序列構件。一般而言，信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載體的靶 多肽DNA的一部分。為了本發明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別并加工(即被 信號肽酶切除)的信號序列。對于不識別并加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細 胞，將信號序列用選自例如下組的原核信號序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、IPP、或熱穩 定的腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發明的一個實施方案 中，表達系統的兩個順反子中都使用的信號序列是STII信號序列或其變體。在另一方面，依照本發明的免疫球蛋白的生成可在宿主細胞的細胞質中發生，因 此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那點上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細胞 質內表達、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB-菌 株)提供有利于二硫鍵形成的細胞質條件，從而容許所表達蛋白質亞基的正確折疊和裝 配。Proba 和 Pluckthun，Gene 159:203(1995))。適于表達抗體的原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)和真細菌 (Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的例子包括埃希氏菌屬 (Escherichia)(例如大腸埃希氏菌(E. coli))、芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如枯草芽孢 桿菌(B. subtilis))、腸桿菌屬(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅 綠假單胞菌(P. aeruginosa))物種、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質沙 雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus) > ；^ 賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬 (Paracoccus)。在一個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，使用大腸桿 菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的例子包括菌株W3110(BaChmann，Cellular and Molecular Biology,第 2 卷，Washington, D. C.，美國微生物學學會，1987，第 1190-1219 頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 Δ fhuA ( Δ tonA) ptr3 lac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR 的菌株 33D3 (美國專利 No. 5，639，635)。其 它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌1776 (ATCC 31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)也是合適的。這些例子只是例示而非限制。本 領域知道用于構建具有指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法，參見例如Bass等， Proteins 8 :309_314 (1990)。通常必需考慮復制子在細菌細胞中的可復制性來選擇適宜的 細菌。例如，在使用眾所周知的質粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供復制 子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細胞應當分 泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細胞培養中摻入額外的蛋白酶抑制劑。抗體生成用上述表達載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期 望序列的基因而適當改動的常規營養培養基中進行培養。轉化即將DNA導入原核宿主，使得DNA能夠進行復制，或是作為染色體外元件或 是通過染色體成分。根據所用宿主細胞，使用適于這些細胞的標準技術進行轉化。采用氯 化鈣的鈣處理通常用于具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉化方法采用聚乙二醇/ DMS0。使用的還有一種技術是電穿孔。在本領域知道的且適于培養選定宿主細胞的培養基中培養用于生成多肽的原核 細胞。合適培養基的例子包括添加了必需營養補充物的LB培養基(Luria broth)。在有些實施方案中，培養基還含有根據表達載體的構建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達 載體的原核細胞生長。例如，向用于培養表達氨芐青霉素抗性基因的細胞的培養基中添加
            
氨芐青霉素。除了碳、氮、和無機磷酸鹽來源以外，還可含有適當濃度的任何必需補充物，或是 單獨加入或是作為與另一種補充物或培養基的混合物，諸如復合氮源。任選的是，培養基可 含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二硫赤蘚 糖醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養原核宿主細胞。例如，對于培養大腸桿菌，優選的溫度范圍是約 20°C至約39°C，更優選約25°C至約37°C，甚至更優選約30°C。主要取決于宿主生物體，培 養基的PH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對于大腸桿菌，pH優選約6. 8至約7. 4，更 優選約7.0。如果表達載體中使用誘導型啟動子，那么在適于激活啟動子的條件下誘導蛋白質 表達。在本發明的一個方面，使用PhoA啟動子來控制多肽的轉錄。因而，為了誘導，在磷酸 鹽限制培養基中培養經過轉化的宿主細胞。優選地，磷酸鹽限制培養基是C. R. A. P培養基 (參見例如 Simmons 等，J. Immunol. Methods 263  133-147 (2002))。根據所采用的載體構 建物，可采用多種其它誘導物，正如本領域所知道的。在一個實施方案中，所表達的本發明多肽分泌到宿主細胞的周質中并從中回收。 蛋白質回收通常牽涉破壞微生物，通常通過諸如滲壓震擾(osmoticshock)、超聲處理或裂 解等手段。一旦細胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞。可以通過例 如親和樹脂層析進一步純化蛋白質。或者，蛋白質可能轉運到培養液中并從中分離。可從 培養液清除細胞，并將培養物上清液過濾和濃縮，用于進一步純化所生成蛋白質。可使用普 遍知道的方法諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡測定法進一步分離和鑒定 所表達多肽。在本發明的一個方面，通過發酵過程大量進行抗體生產。多種大規模補料-分 批發酵規程可用于生產重組蛋白。大規模發酵具有至少1000升的容量，優選約1，000至 100，000升的容量。這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養分，尤其是葡萄糖(優選的碳 源/能源)。小規模發酵通常指在體積容量不超過約100升的發酵罐中進行的發酵，范圍可 以是約1升至約100升。在發酵過程中，通常在將細胞在合適條件下培養至期望密度(例如0D550約 180-220，在此階段細胞處于早期穩定期)后啟動蛋白質表達的誘導。根據所采用的載體構 建物，可使用多種誘導物，正如本領域知道的和上文描述的。可在誘導前將細胞培養更短的 時間。通常將細胞誘導約12-50小時，但是可使用更長或更短的誘導時間。為了提高多肽的產量和質量，可修改多項發酵條件。例如，為了改善所分泌抗 體多肽的正確裝配和折疊，可使用過度表達伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC, DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的一種肽基脯氨酰-順式，反式-異構酶)的 額外載體來共轉化宿主原核細胞。已經證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生成的異源 蛋白質的正確折疊和溶解度。Chen 等，J. Biol. Chem. 274  19601-19605 (1999) ；Georgiou 等人，美國專利 No. 6，083, 715 ；Georgiou 等人，美國專利 No. 6，027, 888 ；Bothmann 和 Pl uckthun, J. Biol. Chem. 275  17100-17105(2000) ；Ramm 禾口 Pl uckthun, J. Biol. Chem. 275 17106-17113 (2000) ；Arie 等，Mol. Microbiol. 39 :199_210 (2001))。為了將所表達異源蛋白質(尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質)的蛋白水解降 至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發明。例如，可修飾宿主細胞菌株，在 編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT, DegP, Tsp、蛋白酶I、 蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。可以獲得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參見例 如Joly等，(1998)見上文；Georgiou等人，美國專利No. 5，264，365 ；Georgiou等人，美國 專禾Ij No. 5，508，192 ；Hara 等，Microbial Drug Resistance 2 :63_72(1996)。在一個實施方案中，在表達系統中使用蛋白水解酶缺陷且經過過度表達一種或多 種伴侶蛋白的質粒轉化的大腸桿菌菌株作為宿主細胞。抗體純化可采用本領域知道的標準蛋白質純化方法。下面的規程是合適純化規程的例示 免疫親和或離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE 上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如S印hadex G-75的凝膠過濾。在一個方面，將固定化在固相上的蛋白A用于全長抗體產物的免疫親和純化。蛋 白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細胞壁蛋白質，它以高親和 力結合抗體Fc區。Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62  1-13 (1983))。蛋白A固定化其上的 固相優選具有玻璃或石英表面的柱子，更優選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應用中，柱 子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異性粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細胞培養物的制備物施加到蛋白A固定化 固相上，使得感興趣抗體特異性結合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異性結合的污 染物。最后通過洗脫從固相回收感興趣抗體。使用真核宿主細胞生成抗體載體構件通常包括但不限于如下一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標 志基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。信號序列構件在真核宿主細胞中使用的載體還可在感興趣成熟蛋白質或多肽的N端包含信號 序列或具有特異性切割位點的其它多肽。優選受到宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切 除)的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前 導，例如單純皰疹病毒gD信號。將這些前體區的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。復制起點通常，哺乳動物表達載體不需要復制起點構件。例如，SV40起點通常可能只因包 含早期啟動子才使用。選擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋 白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環素； (b)補足相應的營養缺陷；或(c)提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養物。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。經異源基因成功轉化的那 些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，如此幸免于選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物
            
51新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個例子是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的 細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II優選靈長類金屬硫蛋白基因、腺 苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種競爭性拮抗劑) 的培養基中進行培養來鑒定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的 宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如ATCC CRL-9096)。或者，可通過在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、 新霉素或G418的培養基中培養細胞來選擇經編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標 志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包 含內源DHFR的野生型宿主)。參見美國專利No. 4，965，199。啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，且與抗體多肽核酸可操 作連接。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，它位于起 始轉錄的位點上游約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游70至80個堿基處 發現的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3'端是 AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信號。所有這些序 列合適的插入真核表達載體中。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽 痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病 毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋 白啟動子或免疫球蛋白啟動子)的、來自熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若這些啟動子 與宿主細胞系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還 包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIII E限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立 即早期啟動子。美國專利No. 4，419，446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物 宿主中表達DNA的系統。美國專利No. 4，601，978中記載了該系統的一種修改形式。或者， 可使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。增強子元件構件常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核細胞對編碼本發明抗體多肽 的DNA的轉錄。現在知道來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和 胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40 復制起點晚期側的增強子(bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起 點晚期側的增強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv， Nature297 17-18(1982).增強子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5'或3'位 置，但是優選位于啟動子的5'位點。轉錄終止構件在真核宿主細胞中使用的表達載體通常還包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序 列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'端和偶爾的3'端獲得。這
            
52些區域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯區中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種 有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見W094/11026及其中公開的表達載 體。宿主細胞的選擇和轉化適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括本文描述的高等真核細胞，包 括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中的繁殖已經成為常規規程。有用 哺乳動物宿主細胞系的例子有經SV40轉化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)、人胚腎 系(293細胞或為懸浮培養而亞克隆的293細胞，Graham等，J. Gen. Virol. 36 59 (1977))、 幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CH0，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216 (1980))、小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))、猴腎細胞(CVl，ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VER0-76， ATCC CRL 1587)、人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL2)、犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)、牛鼠 (buffalo rat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)、人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)、人肝細 胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ,TRI 細胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44_68 (1982))、MRC 5 細胞、FS4 細胞和人肝瘤 Q^patoma)系 Ofep G2)。為了生成抗體，用上文所述表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、 選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規營養培養基中進行培養。宿主細胞的培養可在多種培養基中培養用于生成本發明抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏修 改Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)適于培養宿主細胞。另外，可使用下列文獻中記載的 任何培養基作為宿主細胞的培養基:Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ； 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美國專利Re. 30，985。任何這些培養基可根據需 要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯 化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、 和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。 培養條件諸如溫度、PH等即為表達而選擇的宿主細胞先前所用的，這對于普通技術人員是 顯然的。抗體的純化在使用重組技術時，可在細胞內生成抗體，或者直接分泌到培養基中。如果在細 胞內生成抗體，那么首先通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細胞或是裂解片 段。如果抗體分泌到培養基中，那么通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器(例如Amicon或 Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自這些表達系統的上清液。可在任何上述步驟中包 括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優選的純化技術是親和 層析)來純化從細胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在 的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2、或重鏈的抗體(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62  1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠 同種型和人Y 3 (Guss等，EMBO J. 5  1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質最常用 的是瓊脂糖，但是可使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙 烯)苯容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結構域，則可使 用Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)進行純化。根據待回收的抗體， 也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層 析、肝素SEPHAR0SE 上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、 層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有感興趣抗體和污染物的混合物進行低pH疏 水相互作用層析，使用PH約2. 5-4. 5的洗脫緩沖液，優選在低鹽濃度(例如約0-0. 25M鹽) 進行。免疫偶聯物本發明涵蓋包含偶聯有細胞毒劑的抗ALK-I抗體的免疫偶聯物(可互換的稱為 “抗體-藥物偶聯物”或“ADC”)，所述細胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如 細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯物)。抗體-藥物偶聯物在癌癥治療中用于局部投遞細胞毒劑或細胞抑制劑(即用于 殺死或抑制腫瘤細胞的藥物)的用途(Syrigos和Epenetos，AnticancerResearch 19: 605-614(1999) ；Niculescu-Duvaz 和 Springer，Adv. Drug Del. Rev. 26  151-172 (1997)；美 國專利4，975，278)容許將藥物模塊靶向投遞至腫瘤，并在那兒進行細胞內積累，而系統施 用這些未經偶聯的藥物試劑可能在試圖消除的腫瘤細胞以外導致不可接受的對正常細胞 的毒性水平(Baldwin 等，Lancet 603-05 (1986 年 3 月 15 日)；Thorpe，“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy :A Review，，,在《Monoclonal Antibodies' 84: Biological And Clinical Applications》中，A. Pinchera 等人編，第 475-506 頁，1985)。 由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報導可用于這些策 略(Rowland 等，Cancer Immunol. Immunother. 21  183-87 (1986))。這些方法中所使用的 藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate) 和長春地辛(vindesine) (Rowland等，1986，見上文)。抗體-毒素偶聯物中所使用的毒 素包括細菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素諸如格爾德霉素 (geldanamycin) (Mandler 等，Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19)  1573-1581 (2000)； Mandler φ, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10  1025-1028 (2000) ；Mandler 等， Bioconjugate Chem. 13 :786_791 (2002))、美登木素生物堿類(EP 1391213 ；Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618_8623 (1996))、和加利車霉素(Lode 等，Cancer Res. 58  2928(1998) ；Hinman 等，Cancer Res. 53 :3336_3342 (1993))。毒素可通過包括微管蛋白結 合、DNA結合或拓撲異構酶抑制在內的機制發揮其細胞毒性和細胞抑制性的效果。有些細 胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質受體配體偶聯時趨于失活或活性降低。ZEVALIN   (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec)是由針對在正常和惡性 B淋巴細胞表面上發現的⑶20抗原的鼠IgGl κ單克隆抗體與通過硫脲接頭-螯合劑 所結合的IllIn或90Y放射性同位素構成的抗體-放射性同位素偶聯物(Wiseman等， Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7) :766_77 (2000) ；Wiseman 等，Blood99(12) :4336_42 (2002)；
            
54Witzig 等，J. Clin. Oncol. 20(10) :2453_63 (2002) ；Witzig 等，J. Clin. Oncol. 20(15) 3262-69(2002))。盡管ZEVALIN具有針對B細胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的 活性，然而施藥在大多數患者中導致嚴重且長時間的血細胞減少。MYLOTARGTM(gemtuZumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車霉素連接而構成的 抗體-藥物偶聯物，在2000年批準用于經注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future25 (7) 686(2000)；美國專利 No. 4970198 ；5079233 ；5585089 ；5606040 ；5693762 ； 5739116 ；5767285 ；5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogenlnc.),艮口 由 huC242 抗 體經二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物模塊DMl連接而構成的抗體_藥物偶聯 物，正在進行用于治療表達CanAg的癌癥諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期試 驗。MLN-2704(Millennium Pharm. , BZLBiologics, Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特異 性膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物模塊DMl連接而構成的抗體-藥物 偶聯物，正在進行用于前列腺腫瘤潛在治療的開發。將多拉司他汀(dolastatin)的合成 類似物auristatin肽，auristatin E(AE)和單甲基auristatin(MMAE)與嵌合單克隆抗 體cBR96 (對癌瘤上的Lewis Y特異)和cACIO (對血液學惡性腫瘤上的⑶30特異)偶聯 (Doronina 等，Nature Biotechnology 21 (7) :778_784 (2003))，且正在進行治療性開發。本文(例如見上文)描述了可用于生成免疫偶聯物的化療劑。可使用的酶活性毒 素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞 菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮 根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石 竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogel 1 in)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素 (trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多種放射性核素可 用于生成放射偶聯抗體。例子包括212Bi、mI、mIn、9°Y和186Re。抗體和細胞毒劑的偶聯物可 使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸 酯(SPDP)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如 辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對_疊氮苯甲 酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對_重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸 如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能 衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒 素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將 放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。本文還涵蓋抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美 登木素生物堿類(maytansinoids)、多拉司他汀類(dolostatins)、aurostatins、單端孢霉 素(trichothecene)和CC1065及這些毒素具有毒素活性的衍生物的偶聯物。美登素和美登木素生物堿類在有些實施方案中，免疫偶聯物包含偶聯有一個或多個美登木素生物堿分子的抗 體(全長或片段)。
            
美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發揮作用的有絲分裂抑制 劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國專利 No. 3，896，111)。隨后發現某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登 醇酯(美國專利No. 4，151，042)。例如下列美國專利公開了合成美登醇及其衍生物和類 似物4，137，230 ；4，248，870 ；4，256，746 ；4，260，608 ；4，265，814 ；4，294，757 ；4，307，016 ； 4，308，268 ；4，308，269 ；4，309，428 ；4，313，946 ；4，315，929 ；4，317，821 ；4，322，348 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，364，866 ；4，424，219 ；4，450，254 ；4，362，663 ；及 4，371，533。美登木素生物堿類藥物模塊在抗體藥物偶聯物中是有吸引力的藥物模塊，因為它 們(i)相對易于通過發酵或發酵產物的化學修飾、衍生化來制備；(ii)易于用適于通過非 二硫化物接頭的偶聯抗體的官能團衍生化；(iii)在血漿中穩定；且(iv)有效針對多種腫 瘤細胞系。例如下列專利公開了包含美登木素生物堿類的免疫偶聯物及其制備方法和治療 用途美國專利No. 5，208，020 ；5, 416，064 ；及歐洲專利EP 0 425 235B1,明確將其公開內 容收入本文作為參考。Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :8618_8623 (1996)記載了包含 與針對人結腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DMl的美登木素生物堿的免疫偶聯物。 發現該偶聯物具有針對培養的結腸癌細胞的高度細胞毒性，而且在體內腫瘤生長測定法中 顯示抗腫瘤活性。Chari等，Cancer Research 52  127-131 (1992)記載了其中美登木素生 物堿經二硫化物接頭與結合人結腸癌細胞系上抗原的鼠抗體A7或結合HER-2/neu癌基因 的另一種鼠單克隆抗體TA. 1偶聯的免疫偶聯物。在體外在人乳癌細胞系SK-BR-3上測試 了 ΤΑ. 1-美登木素生物堿偶聯物的細胞毒性，該細胞系每個細胞表達3xl05個HER-2表面 抗原。藥物偶聯物達到了與游離美登木素生物堿藥物程度相似的細胞毒性，這可通過增加 每個抗體分子偶聯的美登木素生物堿分子數目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯物在小鼠 中顯示低系統性細胞毒性。抗體-美登木素生物堿偶聯物可通過將抗體與美登木素生物堿分子化學連接 且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學活性來制備。參見例如美國專利 No. 5，208，020，明確將其公開內容收入本文作為參考。每個抗體分子偶聯平均3_4個美登 木素生物堿分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效，且對抗體的功能或溶解度沒有 負面影響，盡管預計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之裸抗體的使用增強細胞毒性。美 登木素生物堿類在本領域是眾所周知的，而且可通過已知技術合成或從天然來源分離。例 如美國專利No. 5，208，020和上文提及的其它專利及非專利發表物中公開了合適的美登木 素生物堿類。優選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環或其它位置經過修 飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領域知道許多連接基團可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯物，包括例 如美國專利 No. 5，208, 020 或歐洲專利 0 425 235 Bl ；Chari 等，CancerResearch 52  127-131 (1992) ；2004年10月8日提交的美國專利申請No. 10/960, 602中所公開的，明確 將其公開內容收入本文作為參考。包含接頭構件SMCC的抗體-美登木素生物堿類偶聯物 可以如2004年10月8日提交的美國專利申請No. 10/960, 602中所披露的來制備。連接基 團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團、或酯酶不 穩定基團，正如上文所述專利中所公開的，優選二硫化物和硫醚基團。本文中描述和例示了別的連接基團。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯物，諸如 N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨 基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸 二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物 (諸如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲酰基)_乙 二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2， 4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優選的偶聯劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基 二硫代)丙酸酯(SPDP) (Carlsson 等，Biochem. J. 173 :723_737 (1978))和 N-琥珀酰亞氨 基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物連接。根據連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個位置。例如，可使用 常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯連接。反應可發生在具有羥基的C-3位置、經羥 甲基修飾的C-14位置、經羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個優選的 實施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接。Auristatin禾口多拉司他汀在有些實施方案中，免疫偶聯物包含與多拉司他汀類(dolastatins)或多拉司他 汀肽類似物及衍生物、auristatin類偶聯的抗體(美國專利No. 5，635，483 ；5, 780，588)。 多拉司他汀類和auristatin類已經顯示出干擾微管動力學、GTP水解、及核和細胞分裂 (Woyke 等(2001)Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12) 3580-3584)且具有抗癌 (US 5，663，149)和抗真菌活性(Pettit 等(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42  2961-2965)。多拉司他汀或auristatin藥物模塊可經由肽藥物模塊的N(氨基)末端或 C(羧基)末端附著于抗體(W002/088172)。例示性的auristatin實施方案包括N-末端連接的單甲基auristatin藥物模塊 DE 禾口 DF， 皮露于 “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands", 2004年11月5日提交的美國流水號10/983，340，明確將其公開內容完整收入本文作為參考。典型的是，基于肽的藥物模塊可通過在兩個或更多氨基酸和/或肽片段之間 形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學領域眾所周知的液相合成法來制備(參 見 E. Schr5der 禾口 K. Liibke, The Peptides,卷 1, pp 76-136,1965, Academic Press)。 auristatin/多拉司他汀藥物模塊可依照以下文獻中的方法來制備US 5，635，483 ； US 5, 780, 588 ；Pettit 等(1989)J.Am. Chem. Soc. 111 5463-5465 ；Pettit 等(1998) Anti-Cancer Drug Design 13 243-277 ；Pettit φ, Synthesis,1996,719-725 ； Pettit φ (1996)J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15 859-863 ； R Doronina (2003)Nat. Biotechnol. 21(7) 778-784 ；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美國流水號10/983，340，將其完整收入本文作為參 考(披露了例如制備諸如MMAE和MMAF偶聯至接頭的單甲基纈氨酸化合物的接頭和方法)。加利車霉素在其它實施方案中，免疫偶聯物包含偶聯有一個或多個加利車霉素分子的抗體。 加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關于加利車霉素家族
            
57偶聯物的制備參見美國專利 5，712，374 ；5, 714，586 ；5, 739，116 ；5, 767，285 ；5, 770，701 ； 5，770，710 ；5, 773，001 ；5, 877，296 (都授予美國Cyanamid公司)。可用的加利車霉素結構 類似物包括但不限于Y II、α 21、α 31、N-乙酰基-γ II、PSAG和θ Il (Hinman等，Cancer Research 53:3336-3342(1993) ；Lode 等，Cancer Research 58:2925-2928(1998)；及上述 授予美國Cyanamid公司的美國專利)。可與抗體偶聯的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一 種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些試劑 經由抗體介導的內在化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒效果。其它細胞毒劑可與抗體偶聯的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星(str印tozoicin)、長春新堿 (vincristine)、5_氟尿嘧啶、美國專利5，053，394,5, 770，710中記載的統稱為LL-E33288 復合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國專利5，877，296)。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、 外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A 鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin) A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、 油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋 樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、 白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素 (phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年 10月28日公布的WO 93/21232。本發明還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核 酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生 成放射偶聯抗體。例子包括 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 和 Lu 的放 射性同位素。在將偶聯物用于檢測時，它可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如tc99m 或I123，或是包含自旋標記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如 碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以已知方式將放射性標記物或其它標記物摻入偶聯物。例如，可生物合成肽， 或是通過化學氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體。 可以經肽中的半胱氨酸殘基來附著標記物，諸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以經 賴氨酸殘基來附著釔-90。I0D0GEN 法(Fraker 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 80  49—57(1978)) "SJMf 入石典—123。 〈〈Monoclongil Antibodies in Immunoscintigraphy)) (Chatal, CRC Press, 1989)詳細記載了其它方法。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和細胞毒劑的偶聯物，諸如N-琥珀 酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲 基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲 酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸 如雙(對_疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對_重氮苯甲酰基)_乙二 胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述 制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙 酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見W094/11026。接 頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶 敏感接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52: 127-131 (1992)；美國專利 No. 5，208，020)。化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯劑制備的ADC 商品化(例如購自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford, IL, U. S. Α.)的 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS、 MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、 sulfo-SIAB、suIfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸 酯)。見 2003-2004 年度應用手冊和產品目錄(Applications Handbook and Catalog)第 467-498 頁。抗體-藥物偶聯物的制備在抗體-藥物偶聯物(ADC)中，將抗體(Ab)經接頭(L)與一個或多個藥物模塊 (D)偶聯，例如每個抗體偶聯約1個至約20個藥物模塊。可采用本領域技術人員知道的有 機化學反應、條件和試劑通過數種路徑來制備通式I的ADC，包括(1)抗體的親核基團經共 價鍵與二價接頭試劑反應，形成Ab-L，隨后與藥物模塊D反應；和(2)藥物模塊的親核基團 經共價鍵與二價接頭試劑反應，形成D-L，隨后與抗體的親核基團反應。本文中描述了用于 制備ADC的別的方法。Ab-(L-D)pI接頭可以由一種或多種接頭構件構成。例示性的接頭構件包括6-馬來酰亞氨基 己酰基("MC")、馬來酰亞氨基丙酰基(“MP")、纈氨酸-瓜氨酸(“val-cit")、丙氨 酸-苯丙氨酸(〃 ala-phe")、對氨基芐氧羰基(〃 PAB" )、N_琥珀酰亞氨基4_(2-吡啶 基硫代)戊酸酯(〃 SPP" )、N-琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1羧酸 酯(〃 SMCC')、和N-琥珀酰亞氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(〃 SIAB“)。本領域 知道別的接頭構件，本文也描述了一些。還可參見"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands，，，2004年11月5日提交的美國流水號10/983，340，將其完整 內容收入本文作為參考。在有些實施方案中，接頭可包含氨基酸殘基。例示性的氨基酸接頭構件包括二肽、 三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括纈氨酸_瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙 氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸_纈氨酸_瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨 酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構成氨基酸接頭構件的氨基酸殘基包括那些天然存 在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。氨基酸接頭構 件可以在它們的特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D，或纖溶酶蛋白酶)的 酶促切割的選擇性方面進行設計和優化。抗體的親核基團包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)側鏈氨基，如賴氨酸；(iii) 側鏈硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、硫醇基、和羥基 是親核的，能夠與接頭模塊上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性 酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烴基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵， 即半胱氨酸橋。可通過還原劑諸如DTT (二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑偶聯的反 應性。每個半胱氨酸橋理論上會如此形成兩個反應性硫醇親核體。可經由賴氨酸與2-亞 氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應，導致胺轉變為硫醇，從而將額外親核基團引入抗體。可 以通過導入一個、兩個、三個、四個、或更多個半胱氨酸殘基(例如制備包含一個或多個非 天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變型抗體)而將反應性硫醇基導入抗體(或其片段)。還可通過修飾抗體來生成抗體_藥物偶聯物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親 核取代基反應的親電子模塊。可用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可 與接頭試劑或藥物模塊的胺基團反應的醛或酮基團。所得亞胺Schiff堿基可形成穩定的 連接，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺連接。在一個實施方案中，糖基化 抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可在蛋白質中生成羰(醛和 酮)基團，它可與藥物上的適宜基團反應(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另 一個實施方案中，包含N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質可與偏高碘酸鈉反應，導致在 第一個氨基酸處生成酸(Geoghegan 和 Stroh，Bioconjugate Chem. 3  138-146 (1992) ；US 5，362，852)。此類醛可與藥物模塊或接頭親核體反應。同樣，藥物模塊上的親核基團包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰胼、肟、胼、縮氨基 硫脲、胼羧酸酯、和芳基酰胼基團，它們能夠與接頭模塊上的親電子基團反應而形成共價 鍵，而接頭試劑包括⑴活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii) 烴基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來酰亞胺基團。或者，可通過例如重組技術或肽合成來制備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA 的長度可包含各自編碼偶聯物兩個部分的區域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分 開，該接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。在又一個實施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯從而用于腫瘤 預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由循環中清除未結合的偶 聯物，然后施用與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯的“配體”(例如親合素)。 對ALK-I多肽的共價修飾本發明的多肽拮抗劑(例如多肽拮抗劑片段、ALK-I融合分子諸如ALK-I免疫粘 附素、或抗ALK-I抗體)的共價修飾包括在本發明的范圍內。如果適當，它們可通過化學合 成或者通過酶促或化學切割所述多肽來進行。將多肽的其它類型共價修飾引入分子，其通 過將所述多肽的目標氨基酸殘基與能夠與選定側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生 化試劑反應，或者通過將修飾后的氨基酸或非天然的氨基酸摻入正在增長的多肽鏈，例如 Ellman 等，Meth. Enzym. 202 :301-336 (1991) ；Noren 等，Science 244  182 (1989)；及美國 專利申請公開文本20030108885和20030082575。半胱氨酰殘基最常見的是與α-鹵代乙酸(鹽/酯)(和相應的胺)反應，諸如氯 乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰 殘基還可以通過與溴代三氟丙酮、α-溴代-i3-(5-imidOZOyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(鹽/ 酯)、N_烴基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯 甲酸(鹽/酯)、2_氯汞基-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3- 二唑反應而衍生化。組氨酰殘基通過與二乙基-焦-碳酸(鹽/酯)在PH 5. 5-7. O反應而衍生化，因
            
60為此試劑相對特異于組氨酰側鏈。對溴苯甲酰甲基溴化物(para-bromophenacyl bromide) 也是有用的；此反應通常在PH 6.0的0. IM 二甲胂酸鈉中進行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應。與這些試劑的衍生化具有 逆轉賴氨酰殘基電荷的效果。適于衍生化含α-氨基的殘基的其它試劑包括亞氨基酯，諸 如皮考啉亞氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝 基苯磺酸、0-甲基異脲、2，4_戊二酮、和與乙醛酸(glyoxylate)的轉氨酶催化反應。精氨酰殘基通過與一種或數種常規試劑反應來修飾，其中有苯甲酰甲醛 (phenylglyOXal)、2，3-丁二酮、1，2_環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由于胍官 能團的高PKa所以需要在堿性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與賴氨酸以及精氨酸 ε -氨基反應。酪氨酰殘基可以進行特異性修飾，對在酪氨酰殘基中引入光譜標記物特別感興 趣，其通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應。最常見的是，使用N-乙酰基咪唑和四 硝基甲烷分別形成0-乙酰基酪氨酰種類和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰殘基 以制備帶標記物的蛋白質供放射免疫測定法使用。羧基側鏈基團(天冬氨酰或谷氨酰)通過與碳二亞胺(R-N = C = N-R')反應而 進行選擇性修飾，碳二亞胺中的R和R’是不同的烴基，諸如1-環己基-3- (2-嗎啉基-4-乙 基)碳二亞胺或1-乙基-3_(4-氮陽離子-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，通過與銨 離子反應將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉變成天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基常常脫酰胺，分別成為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘 基。這些殘基在中性或堿性條件下脫酰胺。這些殘基的脫酰胺形式落入本發明的范圍。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基羥基的磷酸化，賴 氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈α-氨基的甲基化(Τ. Ε. Creighton，Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-末端胺 的乙酰化，及任何C末端羧基的酰胺化。另一類型的共價修飾牽涉向本發明的多肽化學或酶促偶聯糖苷。這些規程的優點 在于它們不需要在具有N-或0-連接糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生多肽。取決于 所使用的偶聯模式，可以將糖附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如 半胱氨酸的巰基，(d)游離羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基諸 如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法可參閱1987年9月 11 日公布的 W087/05330 及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981)。本發明多肽上存在的任何碳水化合物模塊的消除可通過化學或酶促方法實現。化 學的脫糖基化作用需要使多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理導致除連接 糖(linking sugar) (N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除， 而多肽保持完整。化學的脫糖基化作用參閱Hakimuddin等，Arch. Biochem. Biophys. 259  52(1987)及Edge等，Anal. Biochem. 118 =131(1981)  例如抗體上的，碳水化合物模塊的酶 促切割可通過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，參閱Thotakura等，Meth. Enzymol. 138  350(1987)。本發明多肽的另一類型的共價修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質性質聚合 物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美國專利No. 4，640, 835 ；4, 496, 689 ；
            
614，301，144 ；4，670，417 ；4，791，192 或 4，179，337 所列方式。藥物配制劑通過將具有期望純度的本發明抗體或免疫粘附素與任選的藥學可接受載體、賦形 劑或穩定劑(Remington :The Science and Practice of Pharmacy 第 20 版(2000))混合 來制備水溶液、凍干或其它干燥配制劑形式的包含抗體的治療用配制劑，供貯存。可接受 的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑，諸如 磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸 如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對 羥基苯甲酸烴基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇； 和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋 白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑， 諸如EDTA ；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復合物 (例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二 醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有所治療具體適應癥所必需的超過一種活性化合物，優選 活性互補且彼此沒有不利影響的。合適的是，此類分子以對于預定目的有效的量組合存在。活性成分還可包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊(例如分 別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統(例 如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或粗滴乳狀液。此類技術披露于 例如 Remington :The Science and Practiceof Pharmacy 第 20 片反(2000)。用于體內施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實 現。可制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適例子包括含有免疫球蛋白的固體疏水 性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的 例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美 國專利No. 3，773，919)、L_谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙 酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸 亮丙瑞林構成的可注射微球體)及聚-D-(_)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳 酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當 封裝的免疫球蛋白在體內長時間維持時，它們可能由于暴露于37°C的潮濕環境而變性或聚 集，導致生物學活性損失和免疫原性可能改變。可根據相關機制來設計合理的穩定化策略。 例如，如果發現聚集機制是經由硫醇_ 二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾 巰基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現 穩定化。還涵蓋可以通過基因療法將本發明中有用的藥劑導入受試者。基因療法指通 過給受試者施用核酸進行的療法。在基因療法的應用中，為了實現治療上有效的基因產 物的體內合成，例如為了替換缺陷基因，將基因引入細胞。“基因療法”包括通過單次處 理實現持久效果的常規基因療法及牽涉一次或重復施用治療上有效的DNA或mRNA的基因治療劑施用二者。反義RNA和DNA或siRNA可作為治療劑用于阻斷某些基因的體內 表達。早已顯示可以將短反義寡核苷酸輸入細胞，在那里它們起抑制劑的作用，盡管由 于細胞膜對它們的攝取受限制因而它們的胞內濃度低(Zamecnik等，Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 83 =4143-4146 (1986) ) 0可以修飾寡核苷酸以增強它們的攝取，例如通過用不 帶電荷的基團取代它們帶負電荷的磷酸二酯基團。關于基因療法的方法的一般性綜述參 閱例如 Goldspiel 等，Clinical Pharmacy 12:488-505(1993) ；Wu 和 Wu，Biotherapy 3  87-95(1991) ；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 573-596 (1993) ；Mulligan, Science 260:926—932(1993) ；Morgan 禾口 Anderson，Ann. Rev. Biochem. 62  191—217 (1993)； 及May，TIBTECH 11:155-215(1993)。重組DNA技術領域普遍知道的、可以使用的方法 記載于 Ausubel 等人編(1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 及 Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY。劑量和施用依照已知方法將分子施用于人類患者，諸如靜脈內施用(像推注或持續一段時間 的連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、表面、或吸入路 徑，和/或皮下施用。在某些實施方案中，本發明的治療涉及聯合施用ALK-I拮抗劑和一種或多種抗癌 劑(例如抗血管發生劑或抗淋巴管發生劑)。在一個實施方案中，存在別的抗癌劑，例如一 種或多種不同的抗血管發生劑、一種或多種化療劑等。本發明還涵蓋施用多種抑制劑，例如 針對同一抗原的多種抗體或針對不同癌活性分子的多種抗體。在一個實施方案中，與ALK-I 拮抗劑和/或一種或多種抗血管發生劑一起施用不同化療劑的混合物。聯合施用包括以 分開的配制劑形式共同施用或以單一藥物配制劑形式共同施用，和/或任一次序的順次施 用。例如，ALK-I拮抗劑可以在施用抗癌劑之前、之后、交替，或者可以同時給予。在一個實 施方案中，有一段時間所有(兩種或更多)活性劑同時發揮其生物學活性。對于疾病的預防或治療，ALK-I拮抗劑的適宜劑量取決于上文定義的待治療疾病 的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用抑制劑是用于預防還是治療目的、先前的療法、患者 的臨床史和對抑制劑的響應、及主治醫師的判斷。將抑制劑一次性或者在一系列治療中適 當地施用于患者。在聯合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或治療協同量施用。在 用于本文時，治療有效量指導致所針對疾病或疾患得到減輕或抑制的本發明組合物的施用 量和/或ALK-I拮抗劑和一種或多種其它治療劑的共施用量。藥劑組合的施用效果可以是 疊加的。在一個實施方案中，施用的效果是協同效應。治療協同量指協同地或顯著地減輕 或消除與特定疾病有關的狀況或癥狀所必需的ALK-I拮抗劑和一種或多種其它治療劑(例 如血管發生抑制劑)的量。根據疾病的類型和嚴重程度，大約1 μ g/kg到50mg/kg (例如0. l_20mg/kg) ALK-1 拮抗劑或血管發生抑制劑是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開 施用，或者是通過連續輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約lyg/kg到大約100mg/kg或 者更多，取決于上述因素。對于持續數天或更長時間的重復給藥，根據疾患，治療維持到直 至發生期望的對疾病癥狀的抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。典型的是，臨床醫 師會施用分子，直至劑量達到提供所需生物學效應。可以通過常規技術和測定法來容易地監測本發明療法的進展。例如，血管發生抑制劑(例如抗VEGF抗體，諸如AVASTIN   (Genentech))的制備 和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。根據疾病的類型和嚴重程度，大約1 μ g/kg/100mg/kg (例如0. l_20mg/kg) VEGF特 異性拮抗劑是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是 通過連續輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約lyg/kg到大約100mg/kg或者更多，取決 于上述因素。在一些實施方案中，特別想要的劑量包括例如5mg/kg、7. 5mg/kg、10mg/kg、和 15mg/kg。對于持續數天或更長時間的重復給藥，根據疾患，治療維持到直至癌癥得到治療， 如根據上文所描述的或本領域已知的方法所測量的。然而，其它劑量方案可能也是有用的。 在一個例子中，如果所述VEGF特異性拮抗劑是抗體，那么每周一次、每兩周一次、或每三周 一次以范圍為大約5mg/kg至大約15mg/kg的劑量(包括但不限于7. 5mg/kg或10mg/kg) 施用本發明抗體。可以通過常規技術和測定法來容易地監測本發明療法的進展。在一個例子中，貝伐單抗(bevacizumab)是所述VEGF特異性拮抗劑。在IOOmg和 400mg不含防腐劑的、單次使用管形瓶中供應貝伐單抗來投遞4ml或16ml貝伐單抗(25mg/ ml)，用于治療用途。在240mg脫水α，α -海藻糖(dehydrate)、23. 2mg磷酸鈉(單堿的， 單水合物)、4.8mg磷酸鈉(二堿的，無水的)、1.6mg聚山梨酯20、和注射用水，USP中配制 IOOmg產物。在960mg脫水α，α -海藻糖、92. 8mg磷酸鈉(單堿的，單水合物)、19. 2mg磷 酸鈉(二堿的，無水的)、6. 4mg聚山梨酯20、和注射用水，USP中配制400mg產物。在另一個例子中，此類化療劑的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使 用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。化療的準備和劑量給藥方案還記載于Chemotherapy Service, Μ. C. Perry H, Williams & Wilkins，Baltimore, MD(1992)。治療功效本發明治療的功效可以通過評估贅生性或非贅生性病癥中常用的多種終點來測 量。例如，癌癥治療可以通過例如但不限于腫瘤消退、腫瘤重量或大小減小、距進展的時間、 存活持續時間、無進展存活、整體響應率、響應持續時間、和生活質量來評估。因為本文所述 抗血管發生劑靶向腫瘤血管結構而不必是贅生性細胞本身，所以它們代表了一類獨特的抗 癌藥，并因此可以要求獨特的對藥物的臨床應答的測量和定義。例如，二維分析中大于50% 的腫瘤收縮是宣告響應的標準截留(cut-off)。然而，抑制劑可以引起對轉移性擴散的抑制 而沒有原發腫瘤的縮小，或者可以僅僅發揮抑制腫瘤效果。因而，可采用測定治療功效的方 法，包括例如測量血管發生的血漿或尿液標志物和通過放射學成像測量響應。提供下文實施例僅僅為了例示目的，而非解釋為限制本文中的教導。
            
實施例實施例1 :ALK1. Fc分子的生成使用標準分子生物學技術，通過將ALK-I胞外域(人ALK-I氨基酸殘基1-118)經 多肽接頭附著至人IgGl Fc區，生成了 ALK1. Fc分子。簡言之，將人ALK-I胞外片段(氨基 酸1-118)亞克隆入pRK5載體中，該載體改造成用于表達具有C端人IgG Fc的融合蛋白。 用蛋白A親和層析自條件培養基純化ALK1. Fe,該條件培養基是自經表達質粒順時轉染的 CHO細胞的無血清培養物收獲的。該ALK1. Fc分子具有如下的cDNA和氨基酸序列
            
ALK1. Fc cDNA 序列
            
ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCC
            
TTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGT
            
GACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGG
            
GGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCC
            
CAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGG
            
GCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTG
            
CAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGA
            
GCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGTCACCGACAAAGCTGCGC
            
ACTATACTCTGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
            
CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTC
            
CCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGCCGTGAGCCACGAAG
            
ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
            
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT
            
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG
            
GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA
            
GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT
            
ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC
            
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
            
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC
            
CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT
            
GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
            
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT
            
CTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO 1)
            
ALK1. Fc蛋白質序列
            
MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGA
            
WCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNH
            
NVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTGVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLF
            
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
            
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
            
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
            
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
            
LSLSPGK(SEQ ID NO 2)
            
實施例2 在體外ALK1. Fc處理增強內皮細胞萌芽
            
使用HUVEC纖維蛋白凝膠珠測定法探索了抑制ALK-I信號傳導對內皮細胞生長的影響。HUVEC纖維蛋白凝膠珠測定法的詳情先前已有記載(Nakatsu，MN, MicrovascularResearch 44:102-112(2003))。簡言之，在 2mlEGM_2 培養基(Clonetics)中用每珠
            
350-400個人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)包被Cytodex 3珠(Amersham Pharmacia Biotech)。 將約200粒用HUVEC包被的珠埋入12孔組織培養板的一個孔中的纖維蛋白凝塊。將80X103
            
65個D551人成纖維細胞鋪在凝塊頂部，并每2天更換培養基。以5ug/ml將ALK1. Fc添加至 培養液。在第9天拍攝相差顯微術圖像。在存在共培養的人成纖維細胞的情況中纖維蛋白凝膠中的HUVEC生長產生具有 獨特腔管狀結構的萌芽(Nakatsu，M. N.等，Microvasc Res 66，102-12 (2003))。添加 ALK1. Fc大大增加了萌芽的長度(圖1)，提示阻斷ALK-I信號傳導容許內皮細胞適應更探索性的 行為。這些結果指示ALK1. Fc能夠通過隔絕ALK-I配體和阻止內源ALK-I活化來影響內皮 細胞。實施例3 在體內ALKl-Fc處理影響視網膜血管發育使用來自同一窩的新生SD大鼠來研究ALK1. Fc對視網膜血管發育的影響。在出 生后第4天(P4)、P6和P9，給大鼠i.p.注射41^^((101^/1^體重)。于Pll，用異氟烷 麻醉大鼠。心臟內注射用FITC標記的番茄(LycopersiconEsculentum)凝集素(150 μ g, 在150 μ 1 0. 9% NaCl中；Vector Laboratories)，并讓其循環3分鐘。收集眼，并用含4% PFA的PBS固定過夜，接著用PBS清洗。將解剖出的視網膜用含10%山羊血清的PBST (PBS， 0. 5% Triton X-100)封閉3小時，然后與生物素化異凝集素B4(1  100, Bandeiraea simplicifolia ；Molecular Probe)或偶聯有 Cy3 的抗 α 平滑肌肌動蛋白(ASMA，1  200， Sigma-Aldrich)及含10%山羊血清的PBST —起溫育過夜。為了顯現生物素化異凝集素 Β4，然后將視網膜在PBST中清洗4次，并與Cy3-鏈霉親和素(1  200，Sigma-Aldrich) — 起溫育過夜。染色完全后，將視網膜在PBST中清洗4次。所有過夜溫育都是在4°C進行的。 通過共聚焦熒光顯微術捕捉平坦封固的視網膜的圖像。早期的出生后大鼠視網膜以規定明確的事件順序形成定型血管樣式。淺表視網 膜脈管系統發育成正在自視神經乳頭擴大的網絡，在周圍有活躍的萌芽而在中心有廣泛的 重塑。脈管發育的不同方面(例如脈管萌芽、重塑、成熟和動脈-靜脈規范)能容易地跟 蹤。在用ALK1. Fc處理的視網膜中，動脈和靜脈放射狀交替的特征性樣式大部分沒有受到 影響。然而，血管密度有清楚升高，尤其是靜脈附近的微脈管(異凝集素_Cy3;圖2)。另 外，微脈管和靜脈中的血液灌注有顯著降低(凝集素-FITC ；圖3和4)。有趣的是，視網膜 動脈明顯擴大，這讓人想起在Alkl缺陷胚胎中觀察到的血管缺陷。此外，擴大的視網膜動 脈具有無組織的血管平滑肌細胞覆蓋(ASMA ；圖3和4)。這些結果指示在體內ALK1. Fc處 理能夠通過干擾ALK-I信號傳導來影響新生大鼠視網膜中的血管發育。實施例4 在體內ALKl-Fc處理抑制腫瘤生長為了探索ALK-I信號傳導是否直接涉及腫瘤生長，我們在攜帶皮下人腫瘤異種移 植物的裸小鼠中測試了 ALK1. Fc對腫瘤血管發生和腫瘤生長的影響。依照實驗室動物護理 和使用指導來維持米色裸小鼠(Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)。在每項研究 中使用6-8周齡雌性小鼠。為了獲得皮下腫瘤，給小鼠注射0. Iml含有50% Matrigel (BD Bioscience)的腫瘤細胞懸浮液入右后體側。給每只小鼠注射5X106個人結腸癌HM7細胞、 IOXlO6個人肺癌MV-522，細胞IXlO6個大鼠成膠質細胞瘤C6細胞或IOXlO6個人肺癌Calu6 細胞。如下i. P.施用ALK1. Fc (10mg/kg)對于HM7, ALK1. Fc處理(q/2d)在接種腫瘤后3 天啟動；對于MV-522，ALK1. Fc處理(q/2d)在接種腫瘤后16天啟動；對于C6，ALK1. Fc處 理(2x/w)在接種腫瘤后3天啟動；對于Calu6，ALK1. Fc處理(q/2d)在接種腫瘤后22天 啟動。通過測徑器測量對腫瘤生長定量。通過測量長度(1)和寬度(w)并計算體積(V =lw2/2)來測定腫瘤體積(mm3)。每個組包括10-15只動物。與媒介處理相比，ALK1. Fc處理顯著抑制腫瘤生長(圖5和6)。在所有測試的異 種移植物腫瘤模型中都觀察到對腫瘤生長的影響，指示所觀察到的抗腫瘤效果不是腫瘤類 型特異性的。實施例5 =ALKl-Fc和抗VEGF的組合在上文實施例4所述HM7腫瘤研究中，在注射腫瘤細胞后三天開始ALK1. Fc處理。 當接種腫瘤細胞后九天啟動處理(10mg/kg，q/3d)時，ALK1. Fc的腫瘤生長抑制活性降低 (圖7)。在此模型中，當處理延遲時，抗VEGF抗體處理(B20-4. l，5mg/kg，q/3d)的功效也 降低。然而，當這兩種藥劑組合使用時，觀察到顯著的疊加性效應(additive effect)(圖 7)。還在LL2異種移植物模型中研究了抗VEGF抗體和ALK1. Fc的組合效果。給每只小鼠 注射5X106個小鼠Lewis肺癌LL2細胞，并在接種腫瘤后2天啟動ALK1. Fc (10mg/kg, q/2d) 和抗VEGF抗體(5mg/kg，q/2d)處理。結果顯示了組合療法在LL2腫瘤模型中導致與單一 療法相比大得多的抗腫瘤功效(圖8)。在LL3腫瘤模型中檢查了抗VEGF抗體和ALK1. Fc對腫瘤血管密度的影響(通過 ⑶31染色來評估)。在接種腫瘤細胞后第18天，取出腫瘤，并通過在含低聚甲醛(PFA) 的PBS中浸泡2小時來固定，接著在30%蔗糖中溫育過夜來防凍。將樣品埋入OCT，制備 40 μ m厚度的切片，并用抗小鼠⑶31(1  50,BD Pharmingen)染色，接著用偶聯有FITC的 山羊抗大鼠IgG染色。如預期的，單獨的抗VEGF抗體處理顯著降低受處理腫瘤中的血管密 度。然而，ALK1. Fc處理對腫瘤血管密度具有微弱效應。令人驚訝的是，用這兩種藥劑處理 導致甚至更加顯著的腫瘤血管密度降低效應(圖9)，與疊加性抗腫瘤效果一致。總之，這些 結果證明用ALK1. Fc阻斷Alkl信號傳導具有廣譜的抗腫瘤功效，尤其在與抗VEGF組合時。實施例6 在體內ALKl-Fc處理影響淋巴脈管發育使用來自同一窩的新生⑶1小鼠來研究ALKl.Fc對淋巴管發生的影響。在出生后 第1天(PI)、P3和P6，給小鼠i.p.注射41^1. (3(101^/1^體重)，并于卩9收獲組織。取 出整個小腸并用PBS漂洗。對于尾部皮膚，將真皮與表皮分開，用PBS清洗，并在后續染色 中使用。將組織用含4% PFA的PBS于室溫固定2小時。用PHTl (含5%山羊血清、0.2% BSA,0. 5% Triton X-100、NaN3的PBS)于室溫封閉2小時后，將組織與PHTl中的大鼠抗 CD31(1  50，BD Pharmingen)和家兔多克隆抗 LYVE-1 (1  500，Upstate) 一起溫育過 夜。使用 PHT2(含 2% BSA、0. 5% Triton X-100 的 PBS)中的偶聯有 AlexaFluor 488 的山 羊抗大鼠二抗(1  400，Molecular Probes)和偶聯有AlexaFluor594的山羊抗家兔二抗 (1  400,Molecular Probes)來顯現抗原-抗體復合物。染色完全后，將組織在PBST(PBS， 0.5% Triton X-100)中清洗4次，用含4% PFA的PBS于室溫后固定5_10分鐘，接著在PBS 中再清洗4次。所有過夜溫育都是在4°C進行的。通過共聚焦熒光顯微術捕捉平坦封固的 組織的圖像。在用ALK1. Fc處理的新生小鼠的小腸中，絨毛中的毛細血管(⑶31染色)表現為 正常，盡管絨毛適度地比對照短(圖10和11)。相反，毛細淋巴管(LYVE-1染色)受到嚴重 影響。它們未能充分延伸入絨毛中，而且大多在絨毛基部停止。新生小鼠尾部皮膚內的淋巴管網絡在ALKl.Fc處理后也有顯著改變(圖12)。特 征性的蜂窩狀樣式大部分遭到破壞，只有斷裂的和無組織的淋巴管。這些結果指示除了它在調節血管形成中的關鍵作用之外，Alkl信號傳導對于出生后淋巴脈管發育也是至關重要 的。實施例7 =ALKl-Fc處理影響周細胞組織檢查了 ALKl.Fc處理對腫瘤脈管中周細胞組織(pericyte organization)的影 響。給米色裸小鼠注射0. Iml含有50% Matrigel (BD Bioscience)的腫瘤細胞懸浮液入右 后體側。在每只小鼠中注射5X106個小鼠單核細胞白血病TIB68細胞(自BALB/c衍生的， 被認為是代表單核細胞-中幼粒細胞分化的早期階段)以建立皮下腫瘤。每三天i. P.施用 Alkl. Fc(10mg/kg)或對照媒介(PBS)。處理在接種細胞后次日啟動，并在第一劑后16天結 束。將腫瘤在4%低聚甲醛(PFA)中于室溫(RT)固定2小時，在PBS中漂洗，轉移至30% 蔗糖，于4°C過夜，并埋入OCT。將腫瘤組織的80 μ m切片在PBS中清洗，用PHTl (PBS/10% 山羊血清/0.5% Triton X-100)于室溫封閉2小時，并與在ΡΗΤ2 (PBS/2%山羊血清/0. 5% Triton X-100)中稀釋的一抗(大鼠抗小鼠CD31，1  50，BDPharmingen ；家兔抗結蛋白 (Desmin)，1  400,GeneTex) 一起于 4°C溫育過夜。在 PBS/0. 2% Triton X-100 中清洗四 次后，將切片與二抗(山羊抗大鼠Alexa488 ；山羊抗家兔Alexa 594，1  400, Molecular Probes) 一起于RT溫育2小時。將切片在PBS/0. 2% Triton X-100中清洗，接著在PBS中 清洗，用4% PFA于RT固定5分鐘，并最后在PBS中清洗。這些結果顯示用ALK1. Fc處理的 腫瘤脈管很差組織、脫離的周細胞(圖13)。實施例8 別的ALKl免疫粘附素分子的生成使用標準分子生物學技術來生成下列別的分子ALK1. Fe. 2cDNA 序列ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGT 
            
 GACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGTCACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA
            
68
            
CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG (SEQ ID NO 3)ALK1. Fe. 2 蛋白質序列MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTGVTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 4)ALKl. Fe. 3cDNA 序列ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGACCGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT 
            
TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGCCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG 
            
ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO 5)ALKl. Fe. 3 蛋白質序列MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGA
            
69
            
WCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQTCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ 
            
VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 6)ALK1. Fe. 4cDNA 序列ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGGGGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTG 
            
CAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO 7)ALK1. Fe. 4 蛋白質序列MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
            
LSPGK (SEQ ID NO 8)ALK1. Fe. 5cDNA 序列ATGACCTTGGGCTCCCCCAGGAAAGGCCTTCTGATGCTGCTGATGGCCTTGGTGACCCAGGGAGACCCTGTGAAGCCGTCTCGGGGCCCGCTGGTGACCTGCACGTGTGAGAGCCCACATTGCAAGGGGCCTACCTGCCGGG 
            
GGGCCTGGTGCACAGTAGTGCTGGTGCGGGAGGAGGGGAGGCACCCCCAGGAACATCGGGGCTGCGGGAACTTGCACAGGGAGCTCTGCAGGGGGCGCCCCACCGAGTTCGTCAACCACTACTGCTGCGACAGCCACCTCTGCAACCACAACGTGTCCCTGGTGCTGGAGGCCACCCAACCTCCTTCGGAGCAGCCGGGAACAGATGGCCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG(SEQ ID NO 9)ALK1. Fe. 5 蛋白質序列MTLGSPRKGLLMLLMALVTQGDPVKPSRGPLVTCTCESPHCKGPTCRGAWCTWLVREEGRHPQEHRGCGNLHRELCRGRPTEFVNHYCCDSHLCNHNVSLVLEATQPPSEQPGTDGQEPKS SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 10)實施例9 在體內ALKl免疫粘附素處理影響視網膜血管發育在出生后第4 天(P4)和 P6，給小鼠 i.p.注射 ALKl.Fc、ALKl.Fc. 2、ALKl.Fc. 4 或 ALKl.Fc. 5(10mg/kg體重)。于P8，麻醉小鼠。收集眼，并用含4% PFA的PBS固定過夜，接 著用PBS清洗。將解剖出的視網膜用含10%山羊血清的PBST(PBS，0. 5% Triton X-100)封 閉3小時，然后與含大鼠抗⑶31(1  50，BD Pharmingen)的PBST —起溫育過夜。為了顯現
            
71抗CD31，將視網膜與含偶聯有AlexaFluor 488的山羊抗大鼠(1  400,Molecular Probes) 的PBST—起溫育。染色完全后，將視網膜在PBST中清洗4次。所有過夜溫育都是在4°C C 進行的。通過共聚焦熒光顯微術捕捉平坦封固的視網膜的圖像。 早期的出生后小鼠視網膜以規定明確的事件順序形成定型血管樣式。淺表視網膜 脈管系統發育成正在自視神經乳頭擴大的網絡，在周圍有活躍的萌芽而在中心有廣泛的重 塑。脈管發育的不同方面(例如脈管萌芽、重塑、成熟和動脈-靜脈規范)能容易地跟蹤。 在用ALKl免疫粘附素(ALK1. Fe、ALK1. Fe. 2、ALK1. Fe. 4和ALK1. Fe. 5)處理的視網膜中， 動脈和靜脈放射狀交替的特征性樣式大部分沒有受到影響。然而，血管密度有清楚升高，尤 其是靜脈附近的微脈管(圖14)。這些結果指示別的ALKl免疫粘附素(ALK1. Fe. 2、ALK1. Fe. 4和ALK1. Fe. 5)處理對新生小鼠視網膜中血管發育的影響與ALK1. Fc處理相似。
            
權利要求
            
一種抑制淋巴管發生的方法，包括對需要抑制淋巴管發生的受試者施用有效量的ALK 1拮抗劑，由此所述淋巴管發生得到抑制。
            
2.權利要求1的方法，其中所述受試者患有腫瘤、癌癥、細胞增殖性病癥、黃斑變性、炎 癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑病。
            
3.一種用于在受試者中治療與淋巴管發生有關的病理學疾患的方法，包括對所述受試 者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述與淋巴管發生有關的病理學疾患得到治療。
            
4.權利要求3的方法，其中所述與淋巴管發生有關的病理學疾患是腫瘤、癌癥、細胞增 殖性病癥、黃斑變性、炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑病。
            
5.權利要求2或4的方法，其中所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥是癌瘤、淋巴瘤、母細 胞瘤、肉瘤、或白血病。
            
6.一種在受試者中抑制腫瘤淋巴管發生的方法，包括對所述受試者施用有效量的 ALK-I拮抗劑，由此所述腫瘤淋巴管發生得到抑制。
            
7.一種在受試者中抑制或預防腫瘤轉移的方法，包括對所述受試者施用有效量的 ALK-I拮抗劑，由此所述腫瘤轉移得到抑制或預防。
            
8.權利要求6或7的方法，其中所述受試者已經形成或有風險形成腫瘤轉移。
            
9.權利要求8的方法，其中所述腫瘤轉移在淋巴系統中。
            
10.權利要求8的方法，其中所述腫瘤轉移在遠距離器官中。
            
11.一種在受試者中破壞周細胞組織的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I 拮抗劑，由此所述周細胞組織得到破壞。
            
12.權利要求11的方法，其中所述受試者患有腫瘤、癌癥、細胞增殖性病癥、黃斑變性、 炎癥介導疾病、類風濕性關節炎、糖尿病視網膜病或銀屑病。
            
13.一種在受試者中抑制腫瘤生長的方法，包括對所述受試者施用有效量的ALK-I拮 抗劑，由此所述腫瘤生長得到抑制。
            
14.一種在受試者中治療腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥的方法，包括對所述受試者施用 有效量的ALK-I拮抗劑，由此所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥得到治療。
            
15.權利要求13或14的方法，其中所述腫瘤、癌癥或細胞增殖性病癥是癌瘤、淋巴瘤、 母細胞瘤、肉瘤、或白血病。
            
16.權利要求13或14的方法，進一步包括對所述受試者施用有效量的抗血管發生劑。
            
17.權利要求16的方法，其中所述抗血管發生劑是血管內皮生長因子(VEGF)的拮抗劑。
            
18.權利要求17的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
            
19.權利要求18的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
            
20.一種在具有與血管發生有關的病理學疾患的受試者中增強抗血管發生劑功效的方 法，包括與所述抗血管發生劑組合地對所述受試者施用有效量的ALK-I拮抗劑，由此增強 所述抗血管發生劑的抑制性活性。
            
21.權利要求20的方法，其中所述與血管發生有關的病理學疾患是腫瘤、癌癥或細胞 增殖性病癥。
            
22.權利要求1-21任一項的方法，其中所述ALK-I拮抗劑是ALK-I免疫粘附素。
            
23.權利要求22的方法，其中所述ALK-I免疫粘附素包含SEQID NO 2的氨基酸殘基22-352、SEQ ID NO 4 的殘基 22-349、SEQ ID NO 6 的殘基 22-347、SEQ ID NO 8 的殘基 22-350 或 SEQ ID NO 10 的殘基 22-350。
            
24.權利要求1-21任一項的方法，其中所述ALK-I拮抗劑是抗ALK-I抗體或其抗原結 合片段。
            
25.—種ALK-I拮抗劑，其用于預防、抑制或治療腫瘤轉移或者治療腫瘤、癌癥或細胞 增殖性病癥。
            
26.權利要求25的ALK-I拮抗劑，其中所述ALK-I拮抗劑是ALK-I免疫粘附素。
            
27.權利要求26的ALK-I拮抗劑，其中所述ALK-I免疫粘附素包含SEQIDNO 2的氨 基酸殘基 22-352、SEQ ID NO :4 的殘基 22-349、SEQ ID NO :6 的殘基 22-347、SEQ ID NO 8 的殘基 22-350 或 SEQ ID NO 10 的殘基 22-350。
            
28.權利要求25的ALK-I拮抗劑，其中所述ALK-I拮抗劑是抗ALK-I抗體或其抗原結 合片段。
            
全文摘要
            
本文中公開了使用ALK-1拮抗劑來治療與血管發生或淋巴管發生有關的病癥的方法和組合物。
            
文檔編號A61K38/17GK101918022SQ200880124325 
            
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月5日 優先權日2007年11月9日
            
發明者嚴民宏, 張谷 申請人:健泰科生物技術公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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