專利名稱：針對變體HnRNPG的癌相關表位的抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本申請涉及新的抗體和抗原，以及用于治療和檢測癌癥的方法和組合物。
背景技術：
在2000年，估計全世界有2200萬人患有癌癥，并且620萬死亡病例歸于該類疾 病。每年有超過1000萬新發病例，并且該估計預計在未來15年增加50% (WHO, World Cancer Report. Bernard W. Stewart 禾口 Paul Kleihues,編著，IARC Press, Lyon, 2003)。當 前的癌癥治療主要是創傷性手術、放射治療和化學治療方法，它們常常是無效的并且可能 具有潛在的嚴重副作用、非特異性毒性和/或導致對個體體像和/或生活質量有創傷性改 變。對于當前癌癥治療不足的一個原因是它們缺乏對受累組織和細胞的選擇性。使用對癌 細胞具有更大選擇性的治療將不會使正常細胞受損傷，因此改善了結果、副作用特性和生 活質量。癌癥治療的選擇性可以通過靶向對癌細胞具有特異性且在正常細胞上不存在的 分子來改善。然后這些分子可用作基于抗體的診斷或治療的靶標或者用于能夠改變它們功 能的藥物。HnRNPG或不均一性核糖核蛋白G也稱作RBMX。其主要定位在細胞核內，發現其 在細胞核內與數種蛋白質形成復合物以調節一些基因的剪接和影響P53的DNA修復功能 (Li等2003，Venables等2000 ；Na jib等2005)。這些機制中的許多與腫瘤形成有關聯 (US 6，627，405B1 ；Nandabalan 等 2003)。最近，Shin 等在 2006 和 2007 年已經報道了正常 HnRNPG具有腫瘤抑制子功能，在腫瘤細胞中HnRNPG表達降低并且已經確立了 p53調節的 DNA修復功能與正常HnRNPG表達之間的聯系。Shin等2006描述了 HnRNPG的腫瘤相關形 式，其在RNA結合結構域中第22位殘基具有單一氨基酸改變，并且報道了通過免疫組織化 學對HnRNPG的膜相關表達的檢測。PSCA是存在于細胞表面的123個氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接的糖蛋 白。其mRNA在正常細胞中表達，但是在腫瘤組織中表達上調(Gu等，CancerRes.，2005，65 9495)。已經將其過表達與前列腺癌(Zhigang 和 Wenlν，fforldj. Surg. Oncol. , 2004a, 2 13 ;Zhigang 和 Wenlv，Jpn. J. Clin. Oncol.，2004b，34 :414)、胰腺癌(Wente 等，Pancreas 2005，31 119)和膀胱癌(Amara 等，Cancer Res.，2001，61 4660)聯系起來。已經開發出 了人源化的或者從轉基因小鼠(Xenomouse)得到的抗PSCA單克隆抗體(US 6,825, 226,US 2006/0269557，W02005/118864)并且正在針對抗體的癌癥治療評價一些抗體。
發明內容
本發明人已經鑒定了新的抗體和抗原。具體而言，發明人已經鑒定了新的癌癥特 異性人抗體，其結合數種類型的癌細胞，包括肺癌、肝癌、前列腺癌、皮膚癌(包括黑素瘤)、 胰腺癌、頭頸癌和乳腺癌。重要的是，抗體沒有明顯地結合至正常組織，使得它成為癌癥治 療和診斷的適宜候選物。發明人還已經鑒定出新抗體特異性結合的抗原和表位。
發明人已經克隆了抗體并測序，并且確定了抗體輕鏈和重鏈可變區和互補決定區 1、2和3的序列。因此，本申請公開了包含氨基酸序列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO 7)的分離的 輕鏈互補決定區I(OTRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO 8)的分離的輕鏈互補 決定區2 (⑶R2)；和包含氨基酸序列QAWDNSTAV (SEQ ID NO 9)的分離的輕鏈互補決 定區3(⑶R3)；以及包含氨基酸序列SYAMS(SEQ IDNO 10)的分離的重鏈⑶Rl ；包含氨 基酸序列TISGRGVTTYYADSVKG (SEQ IDNO 11)的分離的重鏈CDR2 ；和包含氨基酸序列 DRTRYYGMDV (SEQ ID NO 12)的分離的重鏈 CDR3。本申請還公開了編碼包含氨基酸序列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO :7)的輕鏈⑶Rl; 包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 8)的輕鏈CDR2 ；包含氨基酸序列QAWDNSTAV (SEQ ID NO 9)的輕鏈⑶R3 ；包含氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO 10)的重鏈⑶Rl ；包含氨基酸序列 TISGRGVTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11)的重鏈 CDR2 ；和包含氨基酸序列 DRTRYYGMDV (SEQ ID NO 12)的重鏈⑶R3的分離的核酸序列。在本申請中公開的另外的方面是包含本文所公開輕鏈⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3 (SEQ ID NO 7-9)的分離的輕鏈可變區，和包含本文所公開重鏈⑶R1、⑶R2和/或⑶R3 (SEQ ID NO 10-12)的分離的重鏈可變區。在一個實施方案中，輕鏈可變區包含圖2所示氨基酸序列 (SEQ ID N0:16)。在另一實施方案中，重鏈可變區包含圖1所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。本申請還公開了編碼本文所公開輕鏈可變區的分離的核酸序列，和編碼本文所公 開重鏈可變區的分離的核酸序列。在一個實施方案中，編碼輕鏈可變區的核酸序列包含圖 2所示的核酸序列(SEQ ID N0:15)。在另一實施方案中，編碼重鏈可變區的核酸序列包含 圖1所示核酸序列(SEQ ID NO 13)。本申請的另一個方面是包含至少一個本文所公開輕鏈互補決定區(即SEQID NO 7-9中的一個或一個以上)和/或至少一個本文所公開重鏈互補決定區(即SEQ ID NO 10-12中的一個或一個以上)的結合蛋白，優選抗體或抗體片段。本申請還公開了包含本文 所公開輕鏈可變區和/或本文所公開重鏈可變區的結合蛋白，優選抗體或抗體片段。如上面所提到，發明人還鑒定了本文所公開結合蛋白結合的抗原。因此，本申請 公開了結合前列腺干細胞抗原(SEQ ID NO 17)和變體HnRNPG的結合蛋白。發明人還 鑒定了本文所公開結合蛋白結合的抗原上的表位。因此，本申請公開了結合包含氨基酸 YSCKAQVSNED (SEQ ID NO :23)、YSCKAQVSN(SEQ ID NO :41)、YSCKAQYSNRD (SEQ ID 111)或 YSCKAQX1SNX2D,其中X1 = Y或V并且X2 = R或E(SEQ ID 112)的多肽的結合蛋白。此外，本申請公開了包含本文所公開結合蛋白，例如抗體和抗體片段，和可藥用賦 形劑、載體、緩沖液或穩定劑的組合物。此外，本申請公開了編碼本文所公開結合蛋白的分離的核酸序列。本申請的另一個方面是包含(1)本文所公開的結合癌細胞上或癌細胞內抗原或 分子的結合蛋白，優選抗體或抗體片段，和所附著的(2)效應分子的免疫連接物。本申請的 進一步的方面是包含(1)本文所公開的結合被癌細胞內化的抗原或分子的結合蛋白，優選 抗體或抗體片段，和所附著的(2)效應分子的免疫連接物。在優選的實施方案中，效應分子 是(i)可直接或間接產生可檢測信號的標記，或(ii)癌癥治療劑，其或者是細胞毒性的、細胞抑制性的或者以另外的方式妨礙或降低癌細胞分裂和/或轉移的能力。優選地，癌癥治 療劑是毒素或細胞毒素。在一個實施方案中，免疫連接物包含SEQ ID NO :49所定義氨基酸序列。在另一實 施方案中，免疫連接物包含SEQ ID NO :51所定義氨基酸序列。本申請還提供編碼本文所公開免疫連接物的分離的核酸序列。在一個實施方案 中，分離的核酸序列編碼包含SEQ ID NO 49的氨基酸序列的免疫連接物。在另一實施方案中，分離的核酸序列包含SEQ ID NO :48。在進一步的實施方案中， 分離的核酸序列編碼包含SEQ ID NO :51的氨基酸序列的免疫連接物。在另一實施方案中，分離的核酸序列包含SEQ ID N0:50。本申請還提供包含本文所公開免疫連接物的組合物和免疫連接物在制造用于治 療或預防癌癥的藥物中的用途和用于診斷目的的用途。此外，本申請提供使用本文所公開 免疫連接物治療或預防癌癥的方法和相關的試劑盒。本申請的進一步方面是檢測或監測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)將從所述受試者取得的測試樣品與本文所公開且特異性結合癌細胞上或癌細 胞內抗原的結合蛋白或免疫連接物接觸，以產生結合蛋白-抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白_抗原復合物的量；和(3)比較測試樣品中與對照中結合蛋白_抗原復合物的量。本申請的另一方面是包含本文所公開免疫連接物的診斷試劑，其中效應分子是可 以直接或間接產生可檢測信號的標記。本申請還包括可以特異性結合本文所公開結合蛋白之一的分離的蛋白質，及其核 酸序列和用途。發明人已經鑒定了本文所公開結合蛋白結合的抗原(即前列腺干細胞抗原和變 體HnRNPG)，并且發明人已經鑒定了本文所公開結合蛋白結合的表位(即SEQID NO :23、41、 111和112)。因此，本申請提供了包含SEQ ID NO :17、71、23、41、111或112的氨基酸序列 的分離的多肽或其變體。此外，本申請提供了由SEQ ID N0:17、71、23、41、lll或112的氨 基酸序列組成的分離的多肽或其變體。本申請還提供編碼這些多肽的分離的核酸序列。本申請公開了本文所公開抗原或表位在治療和診斷癌癥中的用途。因此，本申請 公開了檢測或監測患有或懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括檢測樣品中細胞上或 細胞中的本文所公開抗原或表位，其中如果抗原或表位在細胞上或細胞內被檢測到或者過 表達，則表明患有癌癥。本申請的另一個方面是通過篩選變體HnRNPG的存在或表達來檢測或監測癌癥的 方法。在一個實施方案中，該方法包括步驟 (a)測定來自受試者的測試樣品中變體HnRNPG的表達；和(b)將變體HnRNPG的表達與對照比較；其中對照和測試樣品中變體HnRNPG表達的差異指示具有癌癥。本申請還公開了包含有效量的本文所公開抗原或表位、編碼本文所公開抗原或表 位的分離的核酸序列或者包含編碼本文所公開抗原或表位的核酸序列的重組表達載體，與 可藥用賦形劑、載體、緩沖液或穩定劑的藥物組合物。本申請的進一步方面是本文所公開抗原或表位、編碼本文所公開抗原或表位的分離的核酸序列或者包含編碼本文所公開抗原或表位的核酸序列的重組表達載體在引起受 試者中免疫反應中的用途。本申請的進一步的方面是本文所公開抗原或表位、編碼本文所公開抗原或表位的 分離的核酸序列或者包含編碼本文所公開抗原或表位的核酸序列的重組表達載體在治療 或預防癌癥中的用途。此外，本申請包括用于治療或預防受試者中癌癥的方法，包括向受試者或者來自 受試者的細胞施用有效量的本文所公開抗原或表位、編碼本文所公開抗原或表位的分離的 核酸序列或者包含編碼本文所公開抗原或表位的核酸序列的重組表達載體。本申請還包括用于誘導受試者對本文所公開抗原或表位產生免疫反應的方法，包 括向受試者或者來自受試者的細胞施用有效量的本文所公開抗原或表位、編碼本文所公開 抗原或表位的分離的核酸序列或者包含編碼本文所公開抗原或表位的核酸序列的重組表 達載體。根據下面的詳細描述，本發明的其他特征和優點將變得顯而易見。然而，應當理 解，本發明的詳細描述和具體實施例盡管指出本發明的優選實施方案，但僅以例證的方式 給出，因為根據該詳細描述，在本發明精神和范圍內的許多改變和修改對本領域技術人員 而言將變得顯而易見。
本發明現將參照附圖加以描述，其中圖1 顯示 VB1-213 的 YVH3 鏈的核苷酸(SEQ ID NO 13)和氨基酸(SEQ IDNO 14) 序列。圖2 顯示 VB1-213 的 λ VL3 鏈的核苷酸(SEQ ID NO 15)和氨基酸(SEQ IDNO 16) 序列。圖3顯示以VBI-213染色的SK-0V-3固定的細胞團；200Χ ；觀察到細胞膜、細胞質 和細胞核染色。圖4顯示(A)以VB1-213染色的肺癌組織；400Χ ；觀察到細胞膜染色(等級2+) (白色箭頭)連同一些細胞質染色。(B)以VB1-213染色的前列腺癌組織；400Χ;細胞膜染 色通過白色箭頭指出。同樣，還觀察到細胞核(黑色箭頭)和線狀細胞質染色。圖5顯示通過共焦顯微鏡評價VB1-213的內化。Α-375細胞與VB1-213于4°C孵 育，洗滌并加溫至37°C維持60分鐘。細胞被固定、透化并以熒光標記的二級抗體標記。A)， 與VB1-213于4°C孵育60分鐘之后的A-375細胞的熒光標記，顯示標記的斑點表面分布，通 過黑色箭頭指示，(60X χ 3)放大率。B)，在抗體結合的細胞于37°C孵育60分鐘之后，細胞 顯示細胞內被內化抗體染色，(60Xx 3)放大率。圖6顯示VB1-213的結合親和性A)VB1_213飽和曲線通過經流式細胞術測量增 加濃度的VB1-213對A-375癌細胞的反應性來確定；B =Lineweaver-Burk法，結合常數通過 Lineweaver-Burk 法石角定。圖7是在使用VB1-213免疫沉淀之后，VB1-213反應性蛋白質的Western印跡分 析。使用了五個陽性細胞系(即DU-145、PC-3、A549、Panc-I和SKBR-3)和一個陰性細胞 系(即CF-Pac-ΙΑ)的細胞組。
圖8是以VB1-213探測所得到的2D-PAGE的Western印跡特性。來自膠的對應的 點(加圓圈)用于鑒定目的。圖9是從DU-145提取的肽離子的質譜分析圖9A表示具有所有多重離化態肽離 子的TOFMS掃描，并且圖9B表示質量重建后具有單一離化態肽離子的去褶合譜。圖10是從2D-PAGE凝膠中VB1-213反應性蛋白質點回收的肽得到的肽質量指紋 結果大于64的蛋白質得分被認為是顯著的。圖11顯示Mr. 1481. 9584中性肽的MS/MS離子斷裂，作為雙離化態分子 (742. 00000,2+)出現。圖12A 顯示所得到肽的完全圖譜和變體HnRNPG (SEQ ID NO 71)的序列蓋度。粗 體的氨基酸表示從MS分析鑒定的氨基酸序列。加下劃線的部分表示從頭測序的肽，顯示在 第216、218、219和222位的氨基酸改變(SEQ ID NO :70)，B 顯示正常人HnRNPG的氨基酸 序列。對應于變體的區域加下劃線表示，并且取代的氨基酸以粗體表示。圖13顯示用VB1-213進行ID凝膠免疫沉淀和Western印跡從DU-145細胞系得 到的肽的TOFMS掃描，以檢測樣品中所有肽離子的存在圖13A表示具有所有多重離化態肽 離子的T0F_MS掃描，并且圖13B表示具有單一離化態肽離子的去褶合譜。圖14顯示用VB1-213進行ID凝膠免疫沉淀和Western印跡從SKBR-3細胞系得 到的肽的TOFMS掃描，以檢測樣品中所有肽離子的存在圖14A表示具有所有多重離化態肽 離子的T0F_MS掃描，并且圖14B表示具有單一離化態肽離子的去褶合譜。圖15顯示用VB1-213進行ID凝膠免疫沉淀和Western印跡從Panc-Ι得到的肽 的TOFMS掃描，以檢測樣品中所有肽離子的存在圖15A表示具有所有多重離化態肽離子的 T0F_MS掃描，并且圖15B表示具有單一離化態肽離子的去褶合譜。圖16顯示從VB1-213免疫沉淀物的膠內消化物所回收肽的肽質量指紋結果大于 64的蛋白質得分被認為是顯著的。圖17顯示從VB1-213免疫沉淀物的溶液內消化物所回收肽的肽質量指紋結果大 于64的蛋白質得分被認為是顯著的。圖18顯示所得到肽的完全圖譜和NCBI登錄號GI19367212的前列腺干細胞抗原 的序列蓋度。粗體和加下劃線的氨基酸表示從MS分析所鑒定的氨基酸序列。圖19顯示Mr. 1866. 00的中性肽的MS/MS離子斷裂，作為三重離化態分子 (623. 00000,3+)出現。肽序列精確匹配來自前列腺干細胞抗原的肽。圖20顯示Panc-I和Daudi膜制備物的Western印跡，其用抗PSCA抗體免疫沉淀 并用抗PSCA抗體和VB1-213探測。圖21顯示通過ELISA和競爭測定檢測，與無關抗體(抗EGFR抗體)和商業可得的 抗PSCA抗體相比，VB1-213對從PSCA序列所衍生合成肽的結合。在96孔板的每一孔中包 被IOmM濃度的適當的肽。在每一試驗中的肽濃度通過在該測定前測量生物素水平來證實。 VB1-213非常強地結合至HP-I，但是其它三種抗體，即4B5-IgG(同種型匹配對照)、抗EGFR 抗體(無關抗體)和商業抗PSCA抗體顯示不與肽HPl結合(A)。圖21B證明了與4B5-IgG 抗EGFR抗體和抗PSCA抗體相比，HPl競爭性抑制VB1-213結合至DU-145的能力。從IOX 至100X范圍濃度的肽與抗體混合，并且通過流式分析監測對結合DU-145的置換。C、D和 E表示不同抗體對肽PSP印1、PSP印2和PSP印3 (陰性)的結合特性，并且F、G和H顯示在增加濃度的各種肽存在下VB1-213對DU-145的結合。圖22顯示用于證實通過PCR反應所產生片段和用于將基于VB1-213的免疫 毒素工程化的瓊脂糖凝膠，以及用于證實大腸桿菌(E-coli)生產所組裝免疫毒素的 Western印跡。使用溴化乙錠在UV燈下檢測DNA。A和B) SOE-PCR VB6-213_Fab_PE。A) EcoRI-PelB-VH213、VH213_ApaI、SfiI-6xHis-VL213 和 CL_XhoI 片段的第一次 PCR 反應分 別加在泳道1、2、4和5中。1Kb梯被加載泳道3和6中。星號指示預期大小的PCR產物。 B)第一次PCR反應的片段用于產生預期大小的Ec0RI-PelB-VH213-ApaI (圖22B，泳道1 和2)和SfiI-6xHis-VL213-CLXhoI (泳道3和4)片段，如通過符號#所指示。C) SOE-PCR VB6-213-CL-de-bouganin。EcoRI-PelB-6xHis_VH213、VH213_ApaI、ApaI-Ca-PelB-SfiI 和 SfiI-VL213-CL-XhoI片段的第一次PCR反應(分別為泳道1、2、3和4)在瓊脂糖凝膠上分 析。泳道5是IkB梯。EcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaI片段從第一次PCR反應產生(圖 22C，泳道 6)。D) VB6-213-CL-de-bouganin 的 Western 印跡。VB6-213-CL-de_bouganin (泳 道2)和VB6-170克隆(泳道1)的上清液在非還原條件下加在SDS-PAGE凝膠上，并且用兔 抗bouganin抗體，然后用山羊抗兔HRP開展免疫印跡。箭頭指示遷移在大約65kDa的全長 蛋白質。L是梯。E)VB6-213-Fab-PE的Western印跡。泳道1對應于VB6-0Il-Fab-PE上 清液，泳道2對應于VB6-213-Fab-PE并且泳道3對應于VB6-213_Fab_PE。箭頭指示遷移在 大約75kDa的全長蛋白質。圖 23 顯示 VB6-213-CL-de-bouganin 的核苷酸序列(SEQ ID NO 42)。圖 24 顯示 VB6-213-Fab-PE 的核苷酸序列(SEQ ID NO 43)。圖25 顯示 Vh213-Ch 的氨基酸序列(SEQ ID NO 44)。圖26 顯示 VL213-CL-de_bouganin 的氨基酸序列(SEQ ID NO 45)。圖27 顯示 Vh213-Ch-PE 的氨基酸序列(SEQ ID NO 46)。圖28 顯示 Vl213-Cl 的氨基酸序列(SEQ ID NO 47)。圖 29 顯示 VB6-213-Cfde-bouganin 構建體。描述了核苷酸序列(SEQ ID NO 48) 并且描述了氨基酸序列(SEQ ID NO 49)。圖30顯示VB6-213-Fab-PE構建體。描述了核苷酸序列(SEQ ID NO 50)并且描 述了氨基酸序列(SEQ ID NO 51)。圖 31 顯示 VB6-213-CL-de_bouganin 的 γ 盒。圖 32 顯示 VB6-213-Fab_PE 的 Y 盒。圖33是顯示在C33-A細胞上VB1-213或對照抗體VB1-4B5的結合連同aldef Iuor 的流式細胞術結果。圖34是顯示在DU-145細胞上VB1-213或對照抗體VB1-4B5的結合連同aldefluor 的流式細胞術結果。
具體實施例方式(A)定義術語“細胞”包括單細胞以及多個或者一群細胞。向細胞施用試劑包括體外和體 內施用。術語“全身施用”，如本文所使用，意思是指免疫連接物和/或其它癌癥治療劑可以以方便的方式全身性施用，例如通過注射(皮下、靜脈內、肌內等)、口服施用、吸入施用、 經皮施用或局部應用(例如局部乳膏劑或軟膏劑等)、栓劑應用或植入方法。植入物可以是 多孔、非多孔或者凝膠材料，包括膜，例如sialastic膜或纖維。栓劑通常包含0. 5重量％ 至10重量％范圍的活性成分。術語“氨基酸”包括所有天然存在氨基酸以及修飾氨基酸。術語“抗體”，如本文所使用，旨在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體。抗體 可以是重組來源和/或在轉基因動物中產生。術語“抗體片段”，如本文所使用，旨在包括 但不限于Fab、Fab ‘、F (ab ‘ ) 2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、及其多聚 體，多特異性抗體片段和域抗體。抗體可以使用常規技術片段化。例如，F(ab' )2片段可 以通過以胃蛋白酶處理抗體產生。可以處理所得到的F(ab' )2片段以還原二硫鍵來產生 Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以導致形成Fab片段。Fab,Fab'和F(ab' )2、scFV、dsFV、 ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、雙特異性抗體片段和其它片段也可以通過重組技術合 成。術語“本文所公開的抗體或抗體片段”包含至少一個本文所公開的輕鏈互補決定 區(即SEQ ID N0:7-9中的一個或一個以上)和/或至少一個本文所公開的重鏈互補決定 區(即SEQ ID N0:10-12中的一個或一個以上)。在一個實施方案中，抗體或抗體片段包 含輕鏈CDR序列(SEQ ID NO 7-9)和/或重鏈CDR序列(SEQID NO 10-12) 在另一實施 方案中，抗體或抗體片段包含SEQ ID NO 16的氨基酸(輕鏈可變區)和/或SEQ ID NO 14的氨基酸(重鏈可變區)。該術語還包括結合本文所公開抗原或表位的抗體或抗體片 段。抗體或抗體片段還包括序列的功能變體，使得抗體或抗體片段可以結合癌細胞，而基本 上不結合正常細胞。術語“本文所公開的抗原”或“本文所公開的癌相關抗原”指前列腺干細胞抗原 (SEQ ID NO: 17)和指HnRNPG的癌相關變體，及其片段。該術語包括包含本文所公開表位 的多肽。術語“HnRNPG的癌相關變體”或“變體HnRNPG”，如本文所使用，指HnRNPG的新的 變體。在一個實施方案中，變體HnRNPG優先在癌細胞內表達。在另一實施方案中，變體HnRNPG與質膜相關。在進一步的實施方案中，變體 HnRNPG與前列腺干細胞抗原(PSCA)共表達。在另一實施方案中，變體HnRNPG具有在第 216、218、219和/或222位具有一個或一個以上氨基酸取代的HnRNPG氨基酸序列(SEQ ID N0:113)。在一個實施方案中，變體HnRNPG包含SEQ IDNO :71的氨基酸序列。在另一實施 方案中，變體HnRNPG包含SEQ ID NO :71的氨基酸序列。在另一實施方案中，變體HnRNPG 具有在第214至224位被SEQ ID NO 111或112的氨基酸序列取代的HnRNPG氨基酸序列 (SEQ ID NO :113)。“至少中等嚴格雜交條件”意思是指所選擇的促進兩個互補核酸分子在溶液中選 擇性雜交的條件。雜交可發生在核酸序列分子的全部或部分。雜交部分長度有代表性地 為至少15個(例如20、25、30、40或50個)核苷酸。本領域技術人員將認識到，核酸雙 鏈體或雜合體的穩定性由Tm決定，其在含鈉緩沖液中是鈉離子濃度和溫度的函數(Tm = 81. 5°C -16. 6 (LoglO [Na+]) +0. 41 (% (G+C) -600/1)，或相似方程)。因此，在洗滌條件中的 決定雜交穩定性的參數是鈉離子濃度和溫度。為了鑒定與已知核酸分子相似、但不相同的分子，可以假定1 %的錯配會導致Tm降低大約1V，例如，如果尋找具有> 95 %同一性的核 酸分子，則最后的洗滌溫度降低大約5°C。基于這些考慮，本領域技術人員將能夠容易地選 擇適宜的雜交條件。在優選的實施方案中，選擇嚴格雜交條件。通過實例的方式，下列條件 可以采用以實現嚴格雜交基于上述方程，在5x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5x Denhardt' s 溶液/1. 0 % SDS中于Tm-5 °C下雜交，然后以60 V的0. 2xSSC/0. 1 % SDS洗滌。中等嚴格 雜交條件包括在3x SSC中于42°C洗滌的步驟。然而，應當理解，等效的嚴格性可以使用替 代的緩沖液、鹽和溫度實現。關于雜交條件的另外的指導可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,N. Y. , 2002 禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 中 戈至Ij0術語“結合蛋白”，如本文所使用，指特異性結合另一物質(如本文所公開癌相關 抗原或表位)的蛋白質。在一個實施方案中，結合蛋白是抗體或抗體片段。“適宜體內施用的生物學相容形式”意思是指待施用物質的治療效應勝過任何毒 性效應的形式。術語“癌癥”，如本文所使用，包括可以被本文所公開結合蛋白、優選本文所公開抗 體或抗體片段結合的任何癌癥。術語“癌細胞”包括癌癥或腫瘤形成細胞、轉化細胞和易于變成癌癥或腫瘤形成細 胞的細胞。術語“互補”指核酸序列能夠根據標準Watson-Crick互補規則進行堿基配對，或 者能夠在嚴格條件下與特定核酸片段雜交。“保守氨基酸取代”，如本文所使用，是一種其中一種氨基酸殘基被另一種氨基酸 殘基置換，而沒有消除蛋白質的預期特性的取代。 術語“對照”，如本文所使用，指來自受試者或者一組受試者的樣品，其已知患有癌 癥或未患有癌癥，或者已知患有特定級別或嚴重性的癌癥。術語“控釋系統”，如所使用，意思是可以以受控的方式施用的指本文所公開的 免疫連接物和/或其它癌癥治療劑。例如，微泵可以向腫瘤區域直接遞送受控劑量，由此 精細調節藥物組合物的時限和濃度(見，例如Goodson，1984，Medical Applications of Controlled Release，第 2 卷，第 115-138 頁)。術語“肽衍生物”指具有一個或更多個通過功能性側基反應所化學衍生殘基的肽。 此類衍生分子包括例如，其中游離氨基已經被衍生以形成胺氫氯化物、對甲苯磺酰基、芐氧 羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游離羧基可以被衍生形成鹽、甲酯和乙 酯或者其他類型酯或酰胼。游離羥基可以被衍生形成0-酰基或0-烷基衍生物。組氨酸的 咪唑氮可以被衍生形成N-im-芐基組氨酸。作為衍生物還包括其中包含一個或一個以上的 二十種標準氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可以替代脯氨酸； 5_羥賴氨酸可以替代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以替代組氨酸；高絲氨酸可以替代絲氨酸； 和鳥氨酸可以替代賴氨酸。短語“檢測或監測癌癥”指確定受試者是否具有或不具有癌癥、癌癥程度、癌癥嚴 重性和/或癌癥分級的方法或過程。術語“直接施用”，如本文所使用，意思是指癌癥治療劑可以施用，但不限于瘤內、 血管內和腫瘤旁施用。例如，癌癥治療劑可以通過一次或一次以上直接向腫瘤內注射、通過連續或間斷向腫瘤內灌注、通過引入腫瘤治療劑儲存器、通過向腫瘤內引入緩慢釋放裝置、 通過向腫瘤內引入緩慢釋放制劑和/或通過向腫瘤上直接應用來施用。“向腫瘤內”施用的 模式包括向腫瘤區域或者向基本上直接流入腫瘤區域的血管或淋巴管中引入癌癥治療劑。如本文所使用，短語“有效量”意思是指在此劑量時并且在達到預期結果所必需的 時間階段內有效的量。治療有效量可以根據因素改變，例如動物的疾病狀態、年齡、性別、體 重。可以調整劑量方案以提供最佳治療反應。例如，每天可以施用數個分份劑量，或者劑量 可以按比例減少，如通過治療狀態的緊急情況所指示。術語“引起免疫反應”或者“誘導免疫反應”，如本文所使用，意思是指啟動、觸發、 引起、增強、提高或者增進免疫系統的任何反應，例如體液免疫或者細胞介導的免疫。免疫 反應的啟動或增強可以使用本領域技術人員已知的測定法評價，包括但不限于，抗體測定 法(例如ELISA測定法)、抗原特異性細胞毒性測定法和細胞因子的產生(例如ELISP0T測 定法)。優選地，本文所公開的分離的蛋白質、核酸序列或重組表達載體和本文所公開的方 法觸發或增強細胞免疫反應，更加優選T細胞反應。術語“本文所公開的表位”或“本文所公開的癌相關表位”指本文所公開的抗原上 的被本文所公開抗體識別的位點。在一個實施方案中，表位包含SEQ IDN0:23、41、111或 112的氨基酸序列。在另一實施方案中，表位由SEQ ID N0:23、41、lll或112的氨基酸序 列組成。術語“重鏈互補決定區”，如本文所使用，指抗體分子重鏈可變區內的高變區。重鏈 可變區具有三個互補決定區，從氨基末端至羧基末端稱作重鏈互補決定區1、重鏈互補決定 區2和重鏈互補決定區3。術語“重鏈可變區”，如本文所使用，指重鏈的可變區。術語“本文所公開的免疫連接物”包含(1)本文所公開的結合蛋白，優選抗體或抗 體片段，其附著至(2)效應分子。效應分子可以是人們希望遞送至癌細胞的任何分子，包 括但不限于(i)可以直接或間接產生可檢測信號的標記，或(ii)癌癥治療劑，例如毒素，其 或者是細胞毒性的、細胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細胞分裂和/或轉移能 力。術語“本文所公開的免疫毒素”指免疫連接物，其中效應分子是癌癥治療劑，例如毒素， 其或者是細胞毒性的、細胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細胞分裂和/或轉移 能力。術語“分離的核酸序列”，如本文所使用，指當通過重組DNA技術產生時基本上沒 有細胞物質或培養基或者當化學合成時基本上沒有化學前體或其它化學品的核酸。分離的 核酸還基本上沒有天然位于核酸側翼的序列(即位于核酸5'和3'端的序列)，核酸是從 這些序列衍生。術語“核酸”旨在包括DNA和RNA，并且可以是雙鏈的或者單鏈的，并且代表 有義鏈或反義鏈。此外，術語“核酸”包括互補核酸序列。術語“分離的多肽”指當通過重組DNA技術產生時基本上沒有細胞物質或者培養 基，或者當化學合成時基本上沒有化學前體或其它化學物質的多肽。術語“輕鏈互補決定區”，如本文所使用，指抗體分子的輕鏈可變區內的高變區。輕 鏈可變區具有三個互補決定區，從氨基末端至羧基末端稱作輕鏈互補決定區1、輕鏈互補決 定區2和輕鏈互補決定區3。術語“輕鏈可變區”，如本文所使用，指輕鏈的可變區。
術語“修飾的bouganin”，如本文所使用，意思是指如在PCT/CA2005/000410和以 US2005-0238642 Al公布的美國專利申請號11/084,080中所描述的具有降低的激活免疫 反應傾向的修飾的bouganin。在一個實例中，修飾的bouganin具有氨基酸序列(SEQ ID NO 52)YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK。術語“核酸序列”，如本文所使用，指由天然存在堿基、糖和糖間(主鏈)鍵組成的 核苷或核苷酸單體的序列。術語還包括包含其非天然存在單體或其部分的修飾的或取代的 序列。本申請的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以 包括天然存在堿基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列還可以包含修飾 的堿基。此類修飾堿基的實例包括氮雜和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶； 以及黃嘌呤和次黃嘌呤。術語“樣品”，如本文所使用，指來自可以被測定是否有癌癥的受試者的任何流體、 細胞或組織樣品。術語“序列同一性”，如本文所使用，指兩個多肽序列之間或兩個核酸序列之間 序列同一性的百分數。為了確定兩個氨基酸序列之間或者兩個核酸序列之間的同一性百 分數，將序列比對以便最佳比較(例如為了與第二個氨基酸或者核酸序列最佳比對，將缺 口引入到第一個氨基酸或核酸序列中)。然后比較在對應氨基酸位置或核苷酸位置上的 氨基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的位置被作為第二個序列的的對應位置上的相同 氨基酸殘基或核苷酸占據時，則在該位置分子是相同的。兩個序列之間的同一性百分數 是序列共享的相同位置數目的函數(即，％同一性=相同的重疊位置的數目/總位置數 目X100%)。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。兩個序列之間同一性百分數的 確定還可以使用數學算法實現。用于比較兩個序列的數學算法的優選、非限定性實例是 Karlin 禾Π Altschul, 1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 87 :2264_2268 的、在 Karlin 和 Altschul, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :5873_5877 中改良的算法。此種算法整合 Λ Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. 215 403 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。BLAST 核苷酸檢 索可以使用NBLAST核苷酸程序參數設置，例如對于得分=100、字長=12執行以得到與本 申請核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以使用XBLAST程序參數設置，例如 對于得分-50、字長=3執行以得到與本發明蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了得到對于 比較目的的缺口比對，如 Altschul 等，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 中所述可 以采用缺口 BLAST。可選地，PSI-BLAST可以用于執行迭代檢索，發現分子之間的遠距離關 系(Id.)。當采用BLAST、缺口 BLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各個程序(例如XBLAST 和NBLAST)的默認參數(見例如NCBI網站)。用于序列比較的數學算法的另一個優選、非 限定性實例是Myers和Miller，1988，CABI0S4 :11_17的算法。此種算法整合入ALIGN程序 (版本2. 0)，其是GCG序列比對軟件包的一部分。當為了比較氨基酸序列而采用ALIGN程
14序時，可以使用PAM120加權殘值表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。兩個序列之間的同一 性百分數可以在允許或不允許缺口的情況下，使用與上述的那些技術相似的技術確定。在 計算同一性百分數中，有代表性地僅對精確匹配計數術語“受試者”，如本文所使用，指動物界的任何成員，優選哺乳動物，更優選人。在 優選的實施方案中，受試者被懷疑具有或者具有癌癥。如本文所使用，短語“治療或預防癌癥”指抑制癌細胞復制、防止細胞向癌癥形成 細胞的轉化、抑制癌癥擴散(轉移)、抑制腫瘤生長、降低癌細胞數量或者腫瘤生長、降低癌 癥的惡性等級(例如增強的分化)或者改善癌相關癥狀。術語“變體”，如本文所使用，包括以基本上相同的方式執行與本文所公開多肽或 核酸分子基本相同功能的、本文所公開氨基酸和核酸序列的修飾物或化學等效物。例如，本 文所公開多肽的變體包括但不限于保守氨基酸取代。多肽變體還包括對本文所公開多肽序 列的添加和缺失。此外，變體和變體核苷酸序列包括其類似物和衍生物。癌相關抗原的變 體意思是指在癌細胞上或癌細胞內表達、但不在正常細胞上或正常細胞內表達的蛋白質序 列，或者在癌細胞上或癌細胞內相對于正常細胞過表達的蛋白質序列。(B)互補決定區和結合蛋白(i)輕鏈和重鏈互補決定區和輕鏈和重鏈可變區本申請公開提供了包含氨基酸序列SGNKLGDKYAC(SEQ ID NO :7)的分離的輕鏈 互補決定區I(OTRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO 8)的分離的輕鏈互補決定區 2(⑶R2)；和包含氨基酸序列QAWDNSTAV(SEQ ID NO 9)的分離的輕鏈互補決定區3 (⑶R3)。 此外，本申請提供了包含氨基酸序列SYAMS(SEQ ID NO 10)的分離的重鏈⑶Rl ；包含氨 基酸序列TISGRGVTTYYADSVKG(SEQ ID NO :11)的分離的重鏈⑶R2 ；和包含氨基酸序列 DRTRYYGMDV (SEQ ID NO: 12)的分離的重鏈 CDR3。本申請還公開了⑶R序列變體，其可以結合至與由上面所公開⑶R序列所識別表 位或抗原相同的表位或抗原。本申請的另外方面是包含本文所公開的輕鏈⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQID NO 7-9)的分離的輕鏈可變區，和包含本文所公開的重鏈⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQ ID NO 10-12)的分離的重鏈可變區。在一個實施方案中，輕鏈可變區包含圖2中所示氨基酸序列 (SEQ ID NO 16)。在另一實施方案中，重鏈可變區包含圖1中所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。本申請還公開了分離的輕鏈可變區和重鏈可變區的變體，其可以結合至與由上面 所公開分離的輕鏈可變區和分離的重鏈可變區所識別表位或抗原相同的表位或抗原。本領域技術人員將意識到，本申請包括SEQ ID NO :7_12、14和16的氨基酸序列的 變體，包括化學等效物。此類等效物包括以基本相同的方式執行與本文所公開特定蛋白質 基本上相同功能的蛋白質。例如，CDR序列的功能變體將能夠結合至天然CDR序列所識別 的抗原或表位。例如，等效物包括但不限于保守氨基酸取代。在一個實施方案中，輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3和重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的變體氨 基酸序列與SEQ ID NO 7-12分別具有至少50%、優選至少60%、更加優選至少70%、最優 選至少80 %、甚至更加優選至少90 %、并且甚至最優選95 %的序列同一性。在另一實施方案中，輕鏈可變區和重鏈可變區的變體氨基酸序列與SEQ IDNO 16和14分別具有至少50%、優選至少60%、更加優選至少70%、最優選至少80%、甚至更加 優選至少90 %并且甚至最優選95 %的序列同一性。本申請還公開了編碼本文所公開的輕鏈可變區的分離的核酸序列和編碼本文所 公開重鏈可變區的分離的核酸序列。在一個實施方案中，分離的核酸序列編碼包含圖2中 所示氨基酸序列(SEQ ID NO 16)的輕鏈可變區。在另一實施方案中，分離的核酸序列編碼 包含圖1中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 14)的重鏈可變區。在進一步的實施方案中，編碼 輕鏈可變區的核酸序列包含圖2中所示核酸序列(SEQ ID N0:15)。在又一個實施方案中， 編碼重鏈可變區的核酸序列包含圖1中所示核酸序列(SEQ ID N0:13)。本申請還公開了編碼本文所公開輕 列。在另一實施方案中，變體核酸序列與SEQ ID N0:13或15具有 至少50%、優選至少70%、最優選至少80%、甚至更加優選至少90%并且甚至最優選至少 95%的序列同一性。本申請還公開了編碼包含氨基酸序列SGNKLGDKYAC(SEQ ID NO :7)的輕鏈⑶Rl; 包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 8)的輕鏈CDR2 ；包含氨基酸序列QAWDNSTAV (SEQ ID NO 9)的輕鏈⑶R3 ；包含氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO 10)的重鏈⑶Rl ；包含氨基酸序列 TISGRGVTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11)的重鏈 CDR2 ；和包含氨基酸序列 DRTRYYGMDV (SEQ ID NO 12)的重鏈⑶R3的分離的核酸序列。本申請還提供了編碼上面所討論CDR序列和可變區序列的變體的分離的核酸序 列。變體核酸序列包括至少在中等嚴格雜交條件下與編碼SEQ ID NO :7_12、14和16 中所示氨基酸序列的核酸序列及其變體雜交的核酸序列，或者與編碼SEQ ID N0:7-12、14 和16中所示氨基酸序列的核酸序列具有至少50 %、60 %、70 %、80 %或90 %的序列同一性。(ii)結合蛋白本申請的另一個方面是包含至少一個本文所公開輕鏈互補決定區(即SEQID NO 7-9中的一個或一個以上)和/或至少一個本文所公開重鏈互補決定區(即SEQ ID NO 10-12中的一個或一個以上)的結合蛋白，優選抗體或抗體片段。在一個實施方案中，結合蛋白包含分別含有氨基酸序列SGNKLGDKYAC(SEQ ID NO: 7) ； QDSKRPS (SEQ ID NO 8)；禾口 QAWDNSTAV (SEQ ID NO 9)的輕鏈互補決定區 1、2 和 3 ; 和分別含有氨基酸序列 SYAMS (SEQ ID NO 10) ；TISGRGVTTYYADSVKG (SEQ ID NO 11)；禾口 DRTRYYGMDV (SEQ ID NO 12)的重鏈互補決定區1、2和3。本申請還公開了包含圖2中所示 輕鏈可變區(SEQ ID NO 16)和/或圖1中所示重鏈可變區(SEQ ID NO 14)的結合蛋白， 優選抗體或抗體片段。本領域技術人員會意識到，本申請包括以基本上相同的方式執行與上面所公開結 合蛋白基本相同功能的上面所公開特定結合蛋白的變體，包括上面所公開序列的化學等效 物。結合蛋白的功能變體將能夠結合至與上面所公開結合蛋白相同的抗原或表位。在一個 實施方案中，變體結合蛋白結合至前列腺干細胞抗原(SEQ ID NO :17)。在另一實施方案中， 變體結合蛋白結合至變體HnRNPG。在另一實施方案中，變體結合蛋白結合至具有SEQ ID NO :71的氨基酸序列的變體HnRNPG0在另一實施方案中，變體結合蛋白結合至變體HnRNPG，所述變體HnRNPG具有在第 216、218、219和/或222位置帶有一個或一個以上氨基酸取代的HnRNPG氨基酸序列(SEQ ID N0:113)。在進一步的實施方案中，變體結合蛋白結合至變體HnRNPG，所述變體HnRNPG 具有在第214至224位以SEQ ID NO 111或112的氨基酸序列取代的HnRNPG氨基酸序列 (SEQ ID N0:113)。在另一實施方案中，變體結合蛋白結合至具有SEQ ID NO 23、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO 111或SEQ ID NO 112的氨基酸序列的表位。
發明人已經鑒定了本文所公開結合蛋白結合的抗原。因此，本申請公開了結合至 前列腺干細胞抗原(SEQ ID NO 17)或變體HnRNPG的蛋白質。在一個實施方案中，變體 HnRNPG具有SEQ ID NO :71的氨基酸序列。發明人還鑒定了本文所公開結合蛋白所結合的 抗原上的表位。因此，本申請提供了結合至具有SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :41、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO 112的氨基酸序列的表位的結合蛋白。在某些實施方案中，抗體或抗體片段包含全部或者部分的重鏈恒定區，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE、IgM或者IgD恒定區。優選地，重鏈恒定區是IgGl重鏈 恒定區。此外，抗體或抗體片段可以包含全部或者部分的κ輕鏈恒定區或λ輕鏈恒定區。 優選地，輕鏈恒定區是λ輕鏈恒定區。為了產生人單克隆抗體，抗體產生細胞(淋巴細胞)可以從患有癌癥的人中取 得，并且通過標準體細胞融合過程與骨髓瘤細胞融合，因此使這些細胞不死并且得到雜交 瘤細胞。此類技術是本領域眾所周知的(例如最初由Kohler和Milstein(Nature 256 495-497(1975))開發的雜交瘤技術以及其他技術例如人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等， Immunol. Today 4 :72 (1983))、產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Roder等，Methods Enzymol, 121 140-67 (1986))和組合抗體文庫的篩選(Huse 等，Science 246 1275(1989)) 也是本領域眾所周知的。可免疫化學篩選產生與癌細胞特異性反應的抗體的雜交瘤細胞， 并且可以分離單克隆抗體。對特定抗原或分子(例如癌細胞上或者癌細胞內抗原或分子)具有反應性的特異 性抗體或抗體片段，也可以通過篩選與細胞表面成分一起表達于細菌中的編碼免疫球蛋白 基因或其部分的表達文庫產生。例如，完整的Fab片段、VH區和FV區可以使用噬菌體表達 文庫在細菌中表達(見例如 Ward 等，Nature 341 544~546 (1989) ；Huse 等，Science 246 1275-1281(1989)；和 McCafferty 等，Nature 348 :552_554 (1990))。本申請包括結合至與本文所公開抗體或抗體片段所結合抗原或表位相同的抗原 或表位的所有抗體和抗體片段。本領域技術人員會意識到，結合測定可以用于找出與本文 所公開抗體和抗體片段具有相同結合特異性的其它抗體和抗體片段。如下面所例證，競爭 結合測定可以用于找出此類的其它抗體。在使用流式細胞術開展競爭測定之前，確定給出對固定數量癌細胞最大結合的本 文所公開抗體(Abl)的最低濃度。從指數生長培養中收獲總計106個細胞并且與多種抗體 濃度于4°C孵育1小時。洗滌細胞并且與適宜檢測抗體在4°C下再孵育1小時。在洗滌之 后，通過流式細胞術分析細胞。對于每一測試抗體，通過中位熒光對抗體濃度作圖從數據產 生飽和曲線。對于競爭測定，如上制備癌細胞并且用固定濃度的抗體(Abl) —式兩份處理。固 定濃度是如上所確定的對固定數量的癌細胞產生最大結合的最低抗體濃度。在加入Abl之后即刻向每一管中加入不同濃度的潛在抑制性抗體(Ab2)，并且將混合物在4°C下孵育1小 時。通過從對于每一測試樣品(Abl+Ab2)讀取到的中位熒光減去背景熒光(PBS-5%F CS)， 計算出抑制百分數和相對于最大中位熒光的變化。然后將結果除以單獨Abl中位熒光(最 大結合)減去背景(見下)。通過乘以100得到抑制百分數結果。兩份試驗的平均值連同 它們各自的標準誤對抗體濃度作圖。下列公式用于計算抑制百分數PI = [ (MF (Abl+Ab2) -MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100其中PI =抑制百分數；MF(Abl+Ab2)=對于Abl+Ab2混合物測量的中位熒光；MFBgd = 具有PBS-5% FCS的背景中位熒光。因此，本申請提供能夠結合癌細胞上抗原的結合蛋白，其中結合蛋白可以通過包 括下列步驟的方法鑒定(1)將固定數量的癌細胞與對于固定數量癌細胞產生最大結合的最低濃度的文本 所公開結合蛋白、優選抗體或抗體片段(Abl)孵育，并且測量Abl的中位熒光(MFam)；(2)通過向Abl和癌細胞加入Ab2測試兩種或兩種以上濃度的測試結合蛋白 (Ab2)，并且測定中位熒光(MF(Abl+Ab2))；(3)測定背景中位熒光(MFbgd)；(4)計算PI，其中PI = [ (MF (Abl+Ab2) "MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100 ；和(5)比較PI與對照PI值;其中，與對照PI具有統計學顯著性差異的PI表明測試結合蛋白能夠結合癌細胞 上的抗原或表位。本領域技術人員會意識到，可以使用其它競爭測定，包括使用本文所公開抗原或 表位的競爭測定。例如，抗原或表位可以固定在基質上，然后允許測試結合蛋白結合至所固 定的抗原或表位。然后可以測量本文所公開結合蛋白與所固定抗原或表位的結合以確定測 試結合蛋白是否能夠競爭或者阻斷結合蛋白對抗原或表位的結合。本申請的實施例9是競 爭測定的另一個實例。一個實施方案是能夠結合癌細胞上或癌細胞內抗原的結合蛋白，其中結合蛋白通 過競爭結合測定法鑒定，包含(1)本文所公開的結合蛋白，優選抗體或抗體片段(Abl)；和(2)本文所公開抗原或表位，優選包含SEQ ID NO :17、71、23、41、111或112的氨
基酸序列的多肽；其中測試一種或一種以上濃度的測試結合蛋白與Abl競爭結合抗原或表位的能 力。本領域技術人員會意識到，親和性成熟技術通過增加對抗原或表位的親和性，可 用于改良本文所公開的結合蛋白或免疫連接物。通常使用兩個策略增強抗體的結合親和性。一個方法是利用對Ab-Ag復合 物晶體結構的解析來鑒定參與抗原結合的關鍵殘基(Davies D. R. , Cohen G. H. 1996. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc Natl. Acad. Sci. U. S A. 93， 7-12)。之后，這些殘基可以被突變以增強相互作用。另外的方法模擬體內抗原刺激，該刺 激驅動由B細胞產生的免疫球蛋白的親和性成熟。在免疫反應的成熟過程中，免疫球蛋白可變區經受體細胞突變(Mc Heyzer-Williams M. 2003. B-cell signaling mechanism and activation. Fundamental Immunology，第五版，195-225)。該方法對免疫系統具有高特異 性，其特征在于以極高的比率引入點突變。它僅存在于編碼可變區的DNA片段中，并且排除 保守結構域。然后，表達體細胞突變變體抗體的B細胞經受抗原介導的選擇，導致選擇出更 高親和性的免疫球蛋白。為了體外復制該現象，已經使用數種方法，或通過隨機或通過定向 過程來引入突變。隨機突變可以使用錯配PCR、鏈改組或增變株大腸桿菌引入(Clackson T. Hoogenboom N. R.，Griffiths A. D.禾口 Winter G.1991 Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352,624-628，Hawkins R. Ε. , Russell S. J.禾口 Winter G. 1992.Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226，889—896，Low N.，Holliger P.禾口Winter G. 1996. Mimicking somatic hypermutation :affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J Mol. Biol. 260，359-368)。 該策略導致產生大文庫，其中反應性克隆使用展示技術，如核糖體、噬菌體或酵母加以選 擇(Min L. (2000). Applications of display technology in protein analysis. Nat. Biotechnol. 18，1251-1256)。 已經顯示，⑶R(特別是輕鏈和重鏈⑶R3)的定向突變是用于增強抗體親和性的有 效技術。⑶R3的3至4個氨基酸的區段或者稱作“熱點”的特異性區域被定向誘變。Yang 等報道，通過突變四個⑶R殘基，抗HIV gpl20 Fab片段提高420倍(Yang W. P. , Green K. , Pinz-Sweeney S. , Briones Α. Τ. , Burton D. R.禾口 Barbas C. F. III. 1995. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti—HIV—l antibody into picomolar range. J. Mol. Biol. ,254,392-403)。在C6. 5 scFv的VL⑶R3中的一個突變與VH⑶R3中三個突變的組合使親 禾口 性提高 1230 倍(Schier R.，McCall A.，Adams G. P.，Marshall K. W.，Merrit H.， Yin Μ. , Crawford R. S. Weiner L. Μ. , Marks C.禾口 Marks J. D. 1996. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2single-chain Fv by molecular evolution of the complementary determining regions in the center of the antibody binding site. J. Mol. Biol. ,263,551-567)。“熱點”是在體內發生體細胞高變的序列(Neuberger M. S和Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。熱點序列可以定義為具有某 些密碼子的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C 或 T 并且 W 可以是 A 或 T(Neuberger Μ. S 和 Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。此外，相對于對應于潛在熱點序列的TCG編碼的那些，由 核苷酸AGY編碼的絲氨酸殘基大部分存在于可變結構域的⑶R區(Wagner S. D. ,Milstein C.禾口 Neuberger M. S. 1995. Codon bias targets mutation. Nature, 376, 732)。結構分析 顯示CDR環對抗原結合貢獻最大，特別是CDR3環(Giudicelli V.，Chaume D.和Lefranc M.P.2004. IMGT/V-QUEST, an integrated software programfor immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 32, 435-440)。因此，掃描每一抗體的重鏈和輕鏈⑶R的核苷酸序列，確定是否存在熱點序列 和 AGY 密碼子。使用 International ImMunoGen Tics 數據庫(IMGT,http//imRt. cines.fr/textes/vauest/)將所鑒定的輕鏈和重鏈CDR區的熱點與重鏈和輕鏈的種系序列比較 (Davies D. R. , Padlan Ε. A.禾口 Sheriff S. 1990. Antibody-antigencomplexes. Annu. Rev. Biochem. 59，439-473)。序列與種系相同，表明沒有發生體細胞突變；因此，模擬體內發生的 體細胞事件的隨機突變被引入。與之相反，不同的序列表明已經發生了一些體細胞突變。這 將仍需確定體內體細胞突變是否是最佳的。編碼埋入CDR內的氨基酸或者CDR中的保守氨 基酸的熱點沒有被誘變。這些殘基對于總體結構通常是至關重要的，并且由于她們被埋藏， 所以不大可能與抗原相互作用。此外，序列可以與種系序列中、體細胞突變主要發生于此的 預期位置比較(Tomlinson I. M.，Cox J. P. L, Gherardi E.，Lesk Α. M.和 Chotia C. 1995. The structural repertoire of the human Vldomain. EMBO J. 14,4628-4638, Tomlinson I. Μ. , Walter G. , Jones P. Τ. , Dear P. H. , Sonnhammer E. L. L.禾口 Winter G. 1996. The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of humangermline V genes. J. Mol. Biol. 256，813-817)。相似的策略應用于BL22 scFv的親和性成熟中。將點突變引 入到重鏈⑶R3中導致對多種⑶22陽性細胞系的結合活性提高5至10倍(Salvatore G.， Beers R. ,Margulies I.,Kreitman R. J.禾口PastanI. 2002. Improved cytotoxic activity toward cell lines and fresh leukemia cells of amutant anti-CD22 immunotoxin obtained by antibody phage display. Clinical Cancerresearch，8，995—1002)。同!￥， 在⑶Rl和⑶R2環中的多個氨基酸的突變也產生了親和性增加3倍至5倍的突變體(Ho M. , Kreitman J. , OndaM.禾口 Pastan I. 2005. In vitro antibody evolution targeting germline hot spots to increase activity ofan anti-CD22 immunotoxin. J.Biol. Chem. ，280，607-617)。在通過隨機過程或者定向過程引入突變之后，表達抗體并評估其功能。例如，可以 基于結合進行功能篩選。一旦評估了功能，則使用已知方法對所選擇抗體開展DNA測序在另一實施方案中，Harvey，B等(PNAS 2004 June 22 ；101 (25) :9193_8)描述的 錨定胞質表達(APEx)方法用于本文所公開結合蛋白或免疫連接物的親和性成熟。因此，本申請包括已經被親和性成熟的本文所公開結合蛋白，以增加結合蛋白對 前列腺干細胞抗原(SEQ ID N0:17)、變體HnRNPG或具有SEQ ID NO :71的氨基酸序列的變 體 HnRNPG、或者具有 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO 111 或 SEQ ID NO 112 的 氨基酸序列的表位的親和性。本申請還提供了包含所公開結合蛋白、優選抗體和抗體片段與可藥用賦形劑、載 體、緩沖液或穩定劑的組合物。此外，本申請提供了編碼本文所公開結合蛋白的分離的核酸序列。本申請還包括 這些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴格雜交條件下與編碼本文所公開結合 蛋白的核酸序列雜交的核酸序列，或者與編碼本文所公開結合蛋白的核酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%或95%序列同一性的核酸序列。(C)癌相關抗原發明人已經鑒定了本文所公開結合蛋白結合的抗原(即前列腺干細胞抗原(SEQ ID N0 17)和變體HnRNPG)。前列腺干細胞抗原表達于癌細胞表面上并且在正常細胞表面 上沒有明顯的表達。變體HnRNPG是表達于癌細胞內的細胞內蛋白質。因此，本申請包括可 特異性結合本文所公開結合蛋白之一的分離的多肽及其核酸序列和用途。
本申請包括新的癌相關抗原，即HnRNPG的癌相關變體。此外，發明人鑒定了本公開結合蛋白結合的表位(即，SEQ ID NO :23、41、111和 112)。因此，本申請包括包含SEQ ID NO :23的氨基酸序列的分離的多肽、包含SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的分離的多肽、包含SEQ ID NO :111的氨基酸序列的分離的多肽和包含 SEQ ID NO 112的氨基酸序列的分離的多肽。另一個實施方案包括由SEQ ID NO 23的氨基酸序列組成的分離的多肽、由SEQID NO :41的氨基酸序列組成的分離的多肽、由SEQ ID NO :111的氨基酸序列組成的分離的多 肽和由SEQ ID NO 112的氨基酸序列組成的分離的多肽。本領域技術人員會意識到，本申請包括SEQ ID NO 23、41、111和112的氨基酸序 列的變體，包括化學等效物。此類等效物包括以基本相同的方式執行與本文所公開的特異 性蛋白質基本相同功能的蛋白質 。例如等效物包括但不限于保守氨基酸取代。在一個實施方案中，本文所公開分離的多肽的變體氨基酸序列與SEQ IDNO :23、 41、111或112具有至少50 %、優選至少60 %、更加優選至少70 %、最優選至少80 %、甚至更 加優選至少90%、并且甚至最優選至少95%的序列同一性。本申請包括這些分離的多肽的用途。例如，多肽用于產生可以用于治療或預防癌 癥的結合蛋白和免疫連接物的用途，或者可以用于檢測或監測受試者中癌癥的用途或者用 于制造治療或預防癌癥的藥物的用途。此外，本申請提供了編碼本文所公開多肽的分離的核酸序列。本申請還包括這些 核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴格雜交條件下與編碼本文所公開多肽的核 酸序列雜交的核苷酸序列，或者與編碼本文所公開多肽的核酸序列具有至少50%、60%、 70%、80%、90%或95%序列同一性的核苷酸序列。(D)免疫連接物本申請還包括免疫連接物，包含(1)本文所公開結合蛋白，優選抗體或抗體片段， 其已經附著至(2)效應分子。在一個實施方案中，結合蛋白結合至癌細胞上或者癌細胞內 的抗原或分子。在一個實施方案中，抗原或分子包含前列腺干細胞抗原或變體HnRNPG。在 另一實施方案中，抗原或分子包含SEQ ID NO 23,SEQ ID NO :41、SEQ ID N0:111或SEQ ID NO: 112的氨基酸序列。在一個優選的實施方案中，效應分子是⑴可以直接或間接產生可檢測信號的標 記，或(ii)癌癥治療劑，其或者是細胞毒性的、細胞抑制性的或者以另外的方式妨礙或降 低癌細胞分裂和/或轉移的能力。在一個實施方案中，效應分子是癌癥治療劑。癌癥治療劑優選地是毒素，其或者是 細胞毒性的、細胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細胞分裂和/或轉移能力。因 此，本申請的一個方面是免疫連接物，其包含(1)本文所公開結合蛋白，優選抗體或抗體片 段，其附著至(2)癌癥治療劑，例如細胞毒素。在另一實施方案中，免疫連接物被內化，并且癌癥治療劑是阻斷細胞的蛋白質合 成、由此導致細胞死亡的細胞毒素。重要的是，由于大多數正常細胞沒有廣泛表達在癌細胞 上存在的抗原，它們不能結合并內化免疫連接物，并且被保護免予毒素或其他癌癥治療劑 的殺傷作用。多種效應分子可以使用，并且大量的此類效應分子是胞內活性分子。因此，在一個實施方案中，免疫連接物被癌細胞內化。 在優選的實施方案中，效應分子是癌癥治療劑，更加優選包含具有核糖體失活活 性的多肽的細胞毒素，包括但不限于白樹毒蛋白、bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖 麻毒蛋白A鏈、異株瀉根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素 A及其變體。當蛋白質是核糖體失活性蛋白質時，免疫連接物結合至癌細胞后必須被內化， 以便于蛋白質對于細胞是細胞毒性的。因此，在一個實施方案中，效應分子是細胞毒素并且 免疫連接物被癌細胞內化。在一個實施方案中，毒素是bouganin或假單胞菌屬外毒素A，及其變體。在另一 實施方案中，毒素是修飾的bouganin或者缺乏細胞結合結構域的截短形式的假單胞菌屬 外毒素A。在進一步的實施方案中，毒素是基本上無T細胞表位的bouganin，或者由氨基酸 252-608組成的截短形式的假單胞菌屬外毒素A。在其他非限定性實施方案中，癌癥治療劑包括起作用以斷裂DNA的試劑。因此，癌 癥治療劑可以選自，但不限于，烯二炔(例如加利車霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子 試劑(例如博來霉素、甲錠丙基-EDTA-Fe (II))。其他癌癥治療劑包括但不限于柔紅霉素、 多柔比星、偏端霉素A、順鉬、絲裂霉素C、海鞘素、倍癌霉素/CC-1065、和博來霉素/匹來霉
ο在其他非限定性實施方案中，癌癥治療劑包括起作用以打斷微管蛋白的試劑。 此類試劑可以包括，但不限于，根霉素/美登素、泰素、長春新堿和長春堿、秋水仙堿、 auristatin、多拉司他汀 10MMAE、禾口 peloruside A。在其他非限定性實施方案中，免疫連接物的癌癥治療部分可以包含烷化劑，包括 但不限于 Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安 NSC 750、羧 基鄰苯二甲酸鉬 NSC 271674、CBDCANSC 241240、CCNUNSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁 酸氮芥NSC 3088、氯脲霉素NSC 178248、順鉬NSC 119875、克羅米松NSC 338947、氰基嗎 啉代多柔比星NSC 357704、環戊二烯NSC 348948、二脫水半乳糖醇NSC 132313、氟多潘 NSC 73754、h印sulfam NSC 329680、海恩酮 NSC 142982、美法倉 NSC 8806、甲基 CCNUNSC 95441、絲裂霉素 C NSC 26980、米托唑酰胺 NSC 353451、氮芥 NSC 762,PCNU NSC 95466、哌 嗪NSC 344007、哌嗪雙酮NSC 135758、哌泊溴烷NSC25154、泊非霉素NSC 56410、螺妙斯定 NSC 172112、替羅昔隆 NSC 296934、四鉬 NSC 363812、噻替派 NSC 6396、曲他胺 NSC 9706、 尿嘧啶氮芥 NSC 34462 和 Yoshi-864 NSC 102627。在其他非限定性實施方案中，免疫連接物的癌癥治療劑部分可以包含抗有絲分裂 齊U，包括但不限于異秋水仙堿NSC 406042、大田軟海綿素B NSC609395、秋水仙堿NSC 757、 秋水仙堿衍生物NSC 33410、多拉司他汀10 NSC376128 (NG-auristatin衍生的)、美登素 NSC 153858、根霉素NSC 332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水 仙堿NSC 361792、三苯甲基半胱氨酸NSC 83265、硫酸長春堿NSC 49842和硫酸長春新堿 NSC67574。在其他非限定性實施方案中，免疫連接物的癌癥治療劑部分可以包含拓撲異構 酶I抑制劑，包括但不限于喜樹素NSC 94600、喜樹素鈉鹽NSC 100880、氨基喜樹素NSC 603071、喜樹素衍生物NSC 95382、喜樹素衍生物NSC 107124、喜樹素衍生物NSC 643833、 喜樹素衍生物NSC 629971、喜樹素衍生物NSC295500、喜樹素衍生物NSC 249910、喜樹素衍生物NSC 606985、喜樹素衍生物NSC 374028、喜樹素衍生物NSC 176323、喜樹素衍生物NSC 295501、喜樹素衍生物NSC 606172、喜樹素衍生物NSC 606173、喜樹素衍生物NSC 610458、 喜樹素衍生物NSC 618939、喜樹素衍生物NSC 610457、喜樹素衍生物NSC610459、喜樹素衍 生物NSC 606499、喜樹素衍生物NSC 610456、喜樹素衍生物NSC 364830、喜樹素衍生物NSC 606497和嗎啉代多柔比星NSC 354646。 在其他非限定性實施方案中，免疫連接物的癌癥治療劑部分可以包含拓撲異構 酶II抑制劑，包括但不限于多柔比星NSC 123127、氨萘非特NSC 308847、m-AMSA NSC 249992、蒽吡唑衍生物NSC 355644、吡唑啉吖啶NSC 366140、比桑郡HCL NSC 337766、柔紅 霉素NSC 82151、脫氧多柔比星NSC 267469、米托蒽醌NSC 301739、美諾立爾NSC 269148、 N，N-二節基道諾霉素 NSC268242、比散特隆 NSC 349174、佐柔比星 NSC 164011、VM-26NSC 122819 和 VP-16 NSC 141540。在其他非限定性實施方案中，免疫連接物的癌癥治療劑部分可以包含RNA或DNA 抗代謝物，包括但不限于L-丙氨菌素NSC 153353,5-氮胞苷NSC102816、5_氟尿嘧啶NSC 19893、阿西維辛NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC132483、氨基蝶呤衍生物NSC 184692、 氨基蝶呤衍生物NSC 134033、抗葉酸劑NSC 633713、抗葉酸劑NSC 623017、Baker' s可 溶性抗葉酸劑NSC 139105、二氯烯丙基指甲花醌NSC 126771、布喹那NSC 368390、替加氟 (前藥)NSC 148958、5，6_ 二氫-5-氮胞苷NSC 264880、甲氨蝶呤NSC 740、甲氨蝶呤衍生 物NSC174121、N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)NSC 224131、吡唑霉素NSC143095、 三甲曲沙 NSC 352122、3-HPNSC 95678、2 ‘-脫氧-5-氟尿苷 NSC 27640、5_HP NSC 107392、α-TGDR NSC 71851、艾菲地可寧甘氨酸酯 NSC 303812、阿糖胞苷 NSC 63878、5_ 氮 雜-2'-脫氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC 71261、環胞苷NSC 145668、胍唑NSC 1895、羥 基脲NSC 32065、肌苷乙醇二醛NSC118994、麥克菌素II NSC 330500、吡唑咪唑NSC 51143、 硫鳥嘌呤NSC 752和硫嘌呤NSC 755。在另一非限定性實施方案中，免疫連接物的治療部分可以是核酸。可以使用的核 酸包括但不限于反義RNA、基因或其他多核苷酸、核酸類似物，例如硫鳥嘌呤和硫嘌呤。本申請進一步提供了免疫連接物，包含(i)本文所公開結合蛋白，優選抗體或抗 體片段，其附著至(2)效應分子，其中效應分子是可以間接或直接產生可檢測信號的標記。 這些免疫連接物可以用于研究應用或者診斷應用，包括癌癥的體內檢測。標記優選地能夠 直接或間接產生可檢測信號。例如，標記可以是放射不透性的或者放射性同位素，例如3h、 14C、32P、35S、123I、125I、131I ；熒光(熒光團)或化學發光(生色團)化合物，例如異硫氰酸熒光 素、羅丹明或螢光素；酶，例如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；顯像劑；或 金屬罔子。在另一實施方案中，免疫連接物是間接可檢測性的。例如，對免疫連接物具有特異 性并且包含可檢測標記的二級抗體可以用于檢測免疫連接物。本文所公開結合蛋白，優選抗體或抗體片段，可以通過結合蛋白可以結合或連接 至效應分子的任何方式“附著至”效應分子。例如，結合蛋白可以通過化學或重組方式附著 至效應分子。用于制備融合物或者連接物的化學方法在本領域是眾所周知的，并且可以用 于制備免疫連接物。用于將結合蛋白和效應分子連接的方法必須能夠將結合蛋白與效應分 子接合，而不干擾結合蛋白結合至癌細胞上或癌細胞內抗原的能力。
結合蛋白可以間接連接至效應分子。例如，結合蛋白可以直接連接至包含幾種類 型之一的效應分子的脂質體。一種或多種效應分子和/或結合蛋白還可以結合至固體表 面。在一個實施方案中，結合蛋白(優選抗體或抗體片段)和效應分子均是蛋白質，并 且可以使用本領域眾所周知的技術連接。有數百種能將兩種蛋白質連接的交聯劑可利用 (見例如 “Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，，· 1991，Shans Wong， CRC Press, Ann Arbor)。交聯劑通常基于結合蛋白(優選抗體或抗體片段)和/或效應 分子上可利用的或者插入的活性功能基進行選擇。此外，如果不存在反應基，可以使用光活 化交聯劑。在某些情況下，希望在結合蛋白(優選抗體或抗體片段)與效應分子之間包含 間隔子。本領域已知的交聯劑包括同雙功能試劑戊二醛、二甲基己二亞酰胺和雙(重氮 聯苯胺)和異雙功能試劑順丁烯酰胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺和硫代順丁烯酰胺苯甲 酸-N-羥基琥珀酰亞胺。在某些情況下，結合蛋白可以用用于效應分子化學附著的特定殘基進行工程改 造。本領域已知的用于分子化學附著的特定殘基包括賴氨酸和半胱氨酸。交聯劑基于結合 蛋白上插入的活性功能基和效應分子上可利用的活性功能基來選擇。結合蛋白-效應分子蛋白質融合也可以使用重組DNA技 術制備。在此種情況下， 編碼結合蛋白的DNA序列融合至編碼效應分子的DNA序列，產生嵌合DNA分子。嵌合DNA 序列被轉染進入宿主細胞，宿主細胞表達融合蛋白。可以從細胞培養基中回收融合蛋白并 且使用本領域已知的技術純化。將作為標記的效應分子附著至結合蛋白的實例包括描述于Hunter，等，Nature 144:945(1962) ；David，等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain，等，J. Immunol. Meth. 40 219(1981) ；Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30 407(1982) ；Wensel 禾口 Meares， Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N. Y. (1983)； 禾口 Colcher 等，“Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice" ,Meth. Enzymo1. ,121 :802_16 (1986) 中的方法。在一個實施方案中，免疫連接物包含由SEQ ID NO 49定義的氨基酸序列。在另一實施方案中，免疫連接物包含由SEQ ID NO 51定義的氨基酸序列。本申請 還包括這些序列的變體。本申請還提供了編碼本文所公開免疫連接物的分離的核酸序列。在一個實施方案 中，分離的核酸序列編碼包含SEQ ID NO :49的氨基酸序列的多肽。在另一實施方案中，分 離的核酸序列包含SEQ ID N0:48。在進一步的實施方案中，分離的核酸序列編碼包含SEQ ID N0:51的氨基酸序列的多肽。在另一實施方案中，分離的核酸序列包含SEQ ID NO :50。本申請還包括這些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴格雜交條件下 與編碼本文所公開免疫連接物的核酸序列雜交的核酸序列，或者與編碼本文所公開免疫連 接物的核酸序列具有至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %序列同一性的核酸序列。(E)蛋白質的制備本領域技術人員會意識到，本文所公開的多肽，例如本文所公開的輕鏈和重鏈互 補決定區、輕鏈和重鏈可變區、抗體和抗體片段、免疫連接物、癌相關抗原和表位可以以數種方式制備，但是最優選使用重組方法制備。因此，本文所公開的核酸分子可以以已知方式整合入保證多肽良好表達的適宜表 達載體中。可能的表達載體包括，但不限于，粘粒、質粒、或修飾的病毒(例如復制缺陷型反 轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，只要載體與所使用的宿主細胞相容即可。表達載體“對 于轉化宿主細胞是適宜的”，這意味著表達載體包含核酸分子和在待用于表達的宿主細胞 基礎上選擇的、有效連接至核酸分子的調節序列。有效連接旨在指以允許核酸表達的方式 將核酸連接至調節序列。 因此，本申請包括包含本文所公開核酸分子或其片段和對于所插入蛋白質序列轉 錄和翻譯所必需的調節序列的重組表達載體。適宜調節序列可以來源于多種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物、或昆蟲基因 (例如，見Goeddel,Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述的調節序列)。適宜調節序列的選擇如下面所討論依 賴于所選擇的宿主細胞，并且可以由本領域普通技術人員容易地實現。此類調節序列的實 例包括轉錄啟動子和增強子或者RNA聚合酶結合序列、核糖體結合序列，包括翻譯起始信 號。此外，取決于所選擇的宿主細胞和所采用的載體，其它序列，例如復制起點、額外的DNA 限制位點、增強子、和賦予轉錄可誘導性的序列可以整合入表達載體中。重組表達載體還可以包含選擇標記基因，其利于選擇轉化或轉染有本文所公開重 組分子的宿主細胞。選擇標記基因的實例是編碼下列蛋白質的基因，例如賦予對某些藥物 抗性的G418和潮霉素、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢火蟲螢光素酶或者免疫球蛋 白或其部分，例如免疫球蛋白、優選IgG的Fc部分。選擇標記基因的轉錄通過選擇標記蛋 白例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶或螢火蟲螢光素酶濃度的變化來監測。如果選 擇標記基因編碼賦予抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白質，則轉化體細胞可以用G418篩選。 已經整合有選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞死亡。這使得可以顯現和測定本文所 公開重組表達載體的表達，并且具體而言可以確定突變對表達和表型的效應。應當意識到， 選擇標記可以在與目的核酸分開的載體上引入。重組表達載體還可以包含編碼融合部分的基因，所述融合部分提供了增強的重組 蛋白表達；增強的重組蛋白溶解度；和通過充當親和純化中的配體來幫助靶重組蛋白的純 化。例如，蛋白酶水解位點可以加入至靶重組蛋白中以允許在融合蛋白純化之后將重組蛋 白與融合部分分離。代表性的融合表達載體包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，澳大利 亞)、pMal(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ),它 們分別將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A與重組蛋白融合。重組表達載體可以引入至宿主細胞中，以產生轉化的宿主細胞。術語“轉化有”、 “轉染有”、“轉化”和“轉染”旨在包括通過本領域已知的多種可能技術之一將核酸(例如載 體)引入細胞內。術語“轉化的宿主細胞”，如本文所使用，旨在還包括已經以本文所公開重 組表達載體轉化了的、能夠糖基化的細胞。原核細胞可以通過例如電穿孔或氯化鈣介導的 轉化以核酸轉化。例如，核酸可以通過常規技術，例如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚 糖介導的轉染、Iipofectin (脂轉染試劑)、電穿孔或微注射引入至哺乳動物細胞中。用于 轉化和轉染宿主細胞的適宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning =A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)和其它實驗室教科書中找到。適宜宿主細胞包括廣泛多種的真核宿主細胞和原核細胞。例如，本文所公開的 多肽可以在酵母細胞或者哺乳動物細胞中表達。其它適宜宿主細胞可以在Goeddel，Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, CA(1990)中找到。此外，本文所公開的多肽可以在原核細胞，例如大腸桿菌中表達(Zhang 等，Science 303(5656) :371_3 (2004))。此外，可以使用基于假單胞菌屬的表達系統，例 如熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)(美國專利申請公布號US 2005/0186666, Schneider, Jane C 等)。適宜開展本文所公開方法的酵母和真菌宿主細胞包括，但不限于釀酒酵母 (Sacharomyces cerevisiae)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces) 和曲霉屬(Aspergillus)的多個種。用于在釀酒酵母中表達的載體實例包括 pYepSecKBaldari.等，Embo J. 6 229-234(1987)), pMFa(Kurjan 和 Herskowitz，Cell 30 933-943(1982)),pJRY88(Schultz 等，Gene 54 113-123(1987))和 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 0用于酵母和真菌轉化的方法是本領域普通技術人員眾所周 知的(見 Hinnen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA75 1929 (1978) ；Ito 等，J. Bacteriology 153 163 (1983)，和 Cullen 等(Nat BiolTech5 :369 (1987))。除了其它，適宜哺乳動物細胞包括COS (例如ATCC號CRL 1650或1651)、BHK(例 如 ATCC 號 CRL 6281)、CH0(ATCC 號 CCL 61)、HeLa (例如 ATCC 號 CCL 2)、293 (ATCC 號 1573) 和NS-I細胞。用于指引在哺乳動物細胞中表達的適宜表達載體通常包括啟動子(例如 衍生自病毒物質，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40)以及其它轉錄和翻 譯控制序列。哺乳動物表達載體的實例包括PCDM8 (Seed，B.，Nature 329 =840(1987))和 pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J. 6 187-195 (1987))。按照本文提供的教導，啟動子、終止子和用于將適宜類型表達載體引入植物、禽類 和昆蟲細胞內的方法也可以容易實現。例如，在一個實施方案中，本文所公開多肽可以從 植物細胞表達(見Sinkar等，J. Biosci (Bangalore) 11 :47_58 (1987)，其綜述了毛根農桿 菌(Agrobacterium rhizogenes)載體的應用；還見 Zambryski 等，Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender 和 Setlow(編者)，第 VI 卷，第 253-278 頁，Plenum Press, New York (1984)，其描述了表達載體用于植物細胞的用途，包括PAPS2022、PAPS2023 和 PAPS2OiM 等)。適宜昆蟲細胞包括來自蠶(Bombyx)、夜蛾(Trichoplusia)或夜蛾(Spodotera)物 種的細胞和細胞系。可利用的用于在培養的昆蟲細胞(SF 9細胞)中表達蛋白質的桿狀病 毒載體包括pAc 系列(Smith 等，Mol. Cell Biol. 3 :2156_2165 (1983))和 pVL系列(Luckow， V. Α.，和 Summers, Μ. D.，Virology 170 :31_39 (1989)。可選地，本文所公開的多肽還可以在非人轉基因動物中表達，例如大鼠、兔、 綿羊和豬(Hammer 等.Nature 315:680-683(1985) ；Palmiter 等.Science 222 809-814(1983) ；Brinster 等· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442(1985) ；Palmiter 和 Brinster Cell 41:343-345(1985)和美國專利號 4，736，866)。本文所公開的多肽還可以通過使用蛋白質化學領域眾所周知的技術，例如固相合 成(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85 2149-2154 (1964) ；Frische 等，J. Pept. Sci. 2(4)
26212-22(1996)) g 同MiMrtAi^ (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, H# Ε. Wansch，第 151 和 II 卷，Thieme, Stuttgart (1987))的化學合成來制備。包含與其它分子例如蛋白質連接的本文所公開多肽的N末端或C末端融合蛋白 質，可以通過重組技術的融合加以制備。所得到的融合蛋白質包含融合至如本文所述的所 選擇蛋白質或標記蛋白質的本文所公開多肽。本文所公開的重組多肽還可以通過已知技術 連接至其它蛋白質。例如，可以使用如WO 90/10457中所述的異雙功能含巰基連接體N-琥 珀酰亞胺基-3_(2-吡啶基二硫代丙酸酯)或N-琥珀酰亞胺基_5硫代乙酸酯將蛋白質偶 聯。可以用于制備融合蛋白質或連接物的蛋白質的實例包括細胞結合蛋白，例如免疫球蛋 白、激素、生長因子、凝集素、胰島素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、內啡肽類、轉鐵蛋白、鈴蟾 肽、脫唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。因此，本申請提供了包含編碼本文所公開多肽，例如本文所公開的輕鏈和重鏈互 補決定區、輕鏈和重鏈可變區、結合蛋白例如抗體和抗體片段、免疫連接物、抗原和表位的 核酸序列的重組表達載體。此外，本申請提供了包含本文所公開核酸序列或重組表達載體 的宿主細胞。(F) ^^ma^m&^^mmmmm^^發明人已經證明了本文所公開結合蛋白顯示對癌細胞具有特異性。此外，發明人 還證明了本文所公開結合蛋白被癌細胞內化。因此，本文所公開結合蛋白可以用于靶向遞 送生物活性或者醫學相關試劑，例如成像劑、放射活性劑或細胞毒性劑。一個實施方案是治療或預防癌癥的方法，包括向患有或者懷疑患有癌癥的受試者 施用有效量的本文所公開免疫連接物。另一實施方案是有效量的本文所公開免疫連接物在 制造用于治療或預防癌癥的藥物中的用途。此外，本申請提供了有效量的本文所公開免疫 連接物的用途，還包括附加的癌癥治療劑在制造用于同時、單獨或者相繼治療或預防癌癥 的藥物中的用途。本申請還提供了有效量的本文所公開免疫連接物用于治療或預防癌癥的 用途。此外，本申請提供了有效量的本文所公開免疫連接物的用途，還包括額外的癌癥治療 劑用于同時、單獨或相繼治療或預防癌癥的用途。在一個實施方案中，癌癥包括，但不限于，胃癌、結腸癌、前列腺癌，以及宮頸癌、子 宮癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、胃腸癌、乳腺癌(例如導管癌、小葉 癌和乳頭癌)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴細胞性白血 病、慢性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、和慢性髓性白血病)、腦癌、神經母細胞瘤、肉 瘤、直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內膜癌、漿細胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在另一實施方案中， 癌癥是上皮癌。在進一步的實施方案中，癌癥是肺癌、肝癌、前列腺癌、皮膚癌(包括黑素 瘤)、卵巢癌、胰腺癌、和頭頸癌或乳腺癌。在又一個實施方案中，癌癥是肺癌、肝癌、皮膚癌 (包括黑素瘤)或前列腺癌。本文所公開免疫連接物選擇性抑制或破壞癌性細胞的能力可以使用癌細胞系在 體外容易地試驗。本文所公開的免疫連接物的選擇性抑制作用可以通過例如證明癌細胞的 細胞增殖被選擇性地抑制來確定。毒性也可以基于細胞生存力，例如癌癥的生存力測量，并且可以與暴露于免疫連 接物的正常細胞培養相比較。細胞生存力可以通過已知技術，例如臺盼蘭排斥試驗評價。在另一實例中，可以使用許多模型以測試本文所公開免疫連接物的有效性。Thompson, Ε. W.等(Breast Cancer Res. Treatment 31:357—370(1994))已經描述了用 于通過測量腫瘤細胞介導的對細胞外基質的蛋白酶解和腫瘤細胞對重建基膜(膠原、層 粘連蛋白、纖連蛋白、Matrigel或明膠)的侵襲來確定人乳腺癌細胞體外侵襲的模型。其 它可應用的癌細胞模型包括培養的卵巢腺瘤細胞(Young，T.N.等.Gynecol. Oncol. 62 89-99(1996) ；Moore, D. H.等.Gynecol. Oncol. 65 :78_82 (1997))、人濾泡性甲狀腺癌細胞 (Demeure, M. J.等，World J. Surg. 16 :770_776 (1992))、人黑素瘤(A-2058)和纖維肉瘤 (HT-1080)細胞系(Mackay，A. R.等· Lab. Invest. 70 781783 (1994))和肺鱗狀(HS-24)和 腺癌(SB-3)細胞系(Spiess，E.等.J. Histochem. Cytochem. 42 :917_929 (1994))。也已經 描述了涉及腫瘤植入和測定在無胸腺裸鼠中腫瘤生長和轉移的體內試驗系統(Thompson， Ε. W.等，Breast Cancer Res. Treatment 31:357_370(1994) ；Shi,Y. E.等，Cancer Res. 53 1409-1415(1993))。免疫連接物可以配制成用于向受試者施用的、適宜體內施用的生物相容形式的藥 物組合物。物質可以施用至活有機體，包括人和動物。治療有效量的藥物組合物的施用定 義為，在此劑量下和達到預期結果所必需的時間階段內有效的量。例如，物質的治療有效量 可以根據多種因素而變化，如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及重組蛋白在個體內 引起所希望的反應的能力。可以調整劑量方案以提供最佳的治療反應。例如，可以每日施 用數個分開的劑量，或者如治療狀況的急迫性所指示，劑量可以按比例減少。因此，本申請提供用于治療或預防癌癥的藥物組合物，包含本文所公開免疫連接 物和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。在優選的實施方案中，藥物組合物中免疫連接物的效應 分子是癌癥治療劑，更加優選毒素。包含免疫連接物的藥物制劑可以全身施用。藥物制劑可以直接向癌癥部位施用。 取決于施用途徑，免疫連接物可以包裹在材料中以保護化合物不受酶、酸和可能使化合物 失活的其它天然條件作用。根據本申請的一個方面，免疫連接物通過直接施用遞送至患者。本申請考慮了藥 物組合物以至少足以達到終點的量施用，并且必要時包含可藥用載體。本申請還提供用于降低術后并發癥危險的方法，包括在手術治療癌癥之前、之中 或之后施用有效量的免疫連接物。本文所述的組合物可以通過用于制備可向受試者施用的可藥用組合物的本身已 知的方法來制備，以致于有效量的活性物質與可藥用賦形劑組合在混合物中。適宜賦形劑 描述于，例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 20 版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA，2000)。在此基礎上，組合 物包括，然而非排他性地包括，物質與一種或一種以上可藥用賦形劑或稀釋劑結合的溶液， 并且包含在具有適宜PH和與生理流體等滲的緩沖溶液中。藥物組合物包括但不限于，凍干粉末或者水性或非水性無菌注射溶液或混懸液， 其還可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得組合物基本上與預期接收者的組織或血液 相容的溶質。可以存在于此類組合物中的其它成分包括例如水、表面活性劑(例如Tween)、 醇類、多元醇類、甘油和植物油類。臨時注射溶液和混懸液可以從無菌粉末、顆粒、片劑、或 濃溶液或混懸液制備。免疫連接物可以作為在向患者施用之前用無菌水重溶的凍干粉末加 以提供，但不限于此方式。
藥物組合物可以包含可藥用載體。適宜可藥用載體包括基本上化學惰性的和無毒 的不干擾藥物組合物生物活性有效性的組分。適宜藥物載體的實例包括但不限于水、鹽溶 液、甘油溶液、乙醇、N-(l(2，3-二油酰基)丙基)N，N，N-三甲基氯化銨(D0TMA)、二油酰基 磷酰乙醇胺(DOPE)和脂質體。此類組合物應包含治療有效量的化合物以及適宜量的載體 以便提供用于向患者直接施用的形式。組合物可以是可藥用鹽的形式，其包括但不限于與游離氨基形成的那些，例如從 鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的那些，和與游離羧基形成的那些，例如從氫氧化鈉、 氫氧化鉀、氫氧化胺、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡 因等衍生的那些。在多個實施方案中，藥物組合物直接全身施用，或者直接向一個或多個腫瘤區施用。藥物組合物可以用于治療患有癌癥的動物(包括哺乳動物，優選人)的方法中。待 施用的免疫連接物的劑量和類型將取決于多種因素，其可以在人受試者中容易地監測。此 類因素包括癌癥的病原學和嚴重性(級別和階段)。使用本文所公開免疫連接物治療癌癥的臨床結果可由相關領域的技術人員，如醫 生容易地辨別。例如，測量癌癥的臨床標志的標準醫學試驗可以是治療有效性的強指示劑。 此類試驗可包括，但不限于，身體檢查、性能尺度、疾病標志物、12導聯心電圖、腫瘤測量、組 織活檢、細胞檢查、細胞學、最長直徑的腫瘤計算、放射攝影術、腫瘤的數字成像、生命體征、 體重、不良事件記錄、感染發作的評估、伴行用藥的評估、疼痛評估、血液或血清化學、尿液 分析、CT掃描、和藥物代謝動力學分析。此外，包括免疫連接物和另一癌癥治療劑的聯合治 療的協同效應可通過與經受單一療法的患者進行比較研究來確定。在大多數許可的癌癥治療法中，癌癥治療法用于與其它癌癥治療法聯合。因此，本 申請提供使用本文所公開免疫連接物與至少一種另外癌癥治療法聯合預防或治療癌癥的 方法。其它癌癥治療法可以在免疫連接物施用之前施用、交叉重疊施用、并行施用和/或 之后施用。當并行施用時，免疫連接物和其它癌癥治療法可以在單一制劑中施用或者在分 開的制劑中施用，并且，如果分開施用，則任選通過不同施用模式施用。一種或一種以上免 疫連接物和一種或一種以上其它癌癥治療法的組合將協同作用以對抗腫瘤或癌癥。其它 癌癥治療法包括但不限于其它癌癥治療劑，包括但不限于2，2，2三氯三乙胺、3-HP、5，6- 二 氫-5-5-氮胞苷、5-氮雜-2'-脫氧胞苷、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、5-HP、5-丙帕鍺、6-氮 雜尿苷、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、相思豆毒蛋白、醋葡醛 內酯、阿西維辛、阿克拉霉素、放線菌素、放線菌素D、阿地白介素、異秋水仙堿、allutamine、 甲胎蛋白、α-TGDR、六甲蜜胺、氨基喜樹素、氨基格魯米特、氨基蝶呤衍生物、氨萘非特、安 吖啶、抗葉酸劑、阿那曲唑、安西他濱、血管生成素反義寡核苷酸、制管張素、安曲霉素、蒽吡 唑衍生物、抗凝血酶、艾菲地可寧甘氨酸酯、阿糖胞苷、門冬酰胺酶、auristatin,自體細胞 或組織、阿瓦斯汀、阿扎胞苷、偶氮絲氨酸、氮丙啶、AZQ、芽胞桿菌、baker' s可溶性抗葉酸 劑、巴馬司他、BCG活疫苗、bcl-2反義寡核苷酸、BCNU、苯佐替派、β倍他米松、β -TCDR、 biaomycin、比卡魯胺、比桑郡、博來霉素、布喹那、布舍瑞林、白消安、放線菌素c、加利車霉 素、卡普睪酮、人源化抗淋巴細胞單克隆抗體-1、喜樹素、喜樹素鈉鹽、卡培他濱、卡鉬、碳 鉬、卡波醌、羧基鄰苯二甲酸鉬(carboxyphthalatoplatinum)、癌胚抗原、卡莫氟、卡莫司汀、喜樹素衍生物、卡柔比星、嗜癌素、CBDCA、CCNU、CHIP、chlorabusin、苯丁酸氮芥、醋酸 氯地孕酮、萘氮芥、氯脲菌素、色霉素、順鉬、順氯氨鉬、克拉屈濱、氯乙礬、秋水仙堿、秋水 仙堿衍生物、膠原14-氨基酸肽、皮質醇、可的松、氰基嗎啉代多柔比星、cyclarabine、環 胞苷、環戊二烯、環磷酰胺、cyclothosphamide、阿糖胞苷、細胞松弛素B、阿糖胞苷、達卡巴 嗪、daclinomycin、更生霉素、達沙替尼、柔紅霉素、地磷酰胺、去氫睪酮、秋水仙胺、二甲葉 酸、脫氧多柔比星、地塞米松、二脫水半乳糖醇、地吖醌、二氯烯丙基指甲花醌、白喉毒素、偏 端霉素A、多西他塞、多拉司他汀10、去氧氟尿苷、多柔比星、屈洛昔芬、屈他雄酮、倍癌霉 素/CC-1065、海鞘素、依達曲沙、依洛尼塞、依利醋銨、依米丁、乙嘧替氟、內皮抑制素、依諾 他濱、表鬼白毒素、表柔比星、環硫雄醇、愛必妥、埃羅替尼、埃斯波霉素、雌莫司汀、雌激素、 溴化乙錠、依托格魯、表鬼白毒素、法倔唑、芬維A胺、纖連蛋白29kDaN末端蛋白水解片段、 纖連蛋白40kDa C末端N末端蛋白水解片段、fIorafbr (前藥)、floxuridhe、氟尿苷、氟 達拉濱、氟多潘、氟他胺、亞葉酸、福美坦、磷雌酚、福莫司汀、硝酸鎵、吉非替尼、吉西他濱、 gemcitibine、吉妥單抗、糖皮質激素、戈舍瑞林、短桿菌肽D、單核細胞集落刺激因子、胍唑 NSC 1895、guerin、大田軟海綿素B、h印sulfam、六甲蜜胺、己烷雌酚、人絨毛膜促性腺激 素、海蒽酮、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、伊馬替尼、英丙舒凡、肌苷乙醇二醛(inosine glycodialdehyde)、干擾素、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-、、白細胞介素_12、白細胞 介素-15、白細胞介素-18、白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-2、白細胞介素-6、 白細胞介素類、伊立替康、iubidaazone, kringle 5、L-阿拉諾新、拉帕替尼、L-門冬酰胺 酶、醋酸亮丙瑞林(lauprolide acetate)、香菇多糖、來曲唑、利普安、醋酸亮丙瑞林(抑 那通)、左旋咪唑、利多卡因、脂質體二羥基蒽二酮、lomusline、羅莫司丁、氯尼達明、淋巴 因子、淋巴毒素、米托坦、麥克菌素、巨噬細胞炎性蛋白、m-AMSA、甘露醇氮芥、美登素、氮 芥、鹽酸甲氧氮芥、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、黑素細胞譜系蛋白、美侖孕酮、美法侖、美洛格 瑞、甲環硫甾烷、巰基嘌呤、美司鈉、甲錠丙基-EDTA-Fe (Il))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物、 四甲尿浣亞胺、米帕、米替福星、鹽皮質激素、光輝霉素、二溴甘露醇、丙米腙、二溴衛矛醇、 mitolanc、絲裂霉素C、曼托坦、米托蒽醌、米托唑酰胺、蒙匹胺醇、嗎啉代多柔比星、突變的 腫瘤特異性抗原、霉酚酸、N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)、N、N- 二芐基柔紅霉素、神 經生長因子、尼羅替尼、尼魯米特、尼莫司汀、二胺硝吖啶、氮芥、諾加拉霉素、非自體細胞或 組織、新氮芥、橄欖霉素類、ontaKonyx-015、草酸鉬、必散特隆、泰素、PCNU、天門冬酰胺酶、 pelomside A、pentoslatin、派來霉素、哌磷酰胺、蛋氨氮芥、苯芥膽留醇、普卡霉素、哌嗪、 哌嗪雙酮、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、吡曲克辛、血小板衍生生長因子、血小板因子-4 的7. 8 kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的13個氨基酸的肽、普卡霉素、鬼臼酰乙胼、鬼臼 毒素、聚磷酸雌二醇、嚇吩姆、泊非霉素、松龍苯芥、潑尼松、甲基芐胼、普魯卡因、黃體酮、促 乳素16 kDa蛋白水解片段、普萘洛爾、假單胞菌屬外毒素、PSK、蝶酰三谷氨酸、嘌呤霉素、 吡唑霉素、吡唑啉吖啶、吡唑咪唑、雷諾氮芥、丙亞胺、類視黃醇、根霉素、根霉素、美登素、蓖 麻毒蛋白A、rituxan、利妥昔單抗、利妥希瑪、羅喹美克、Serpin(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、 西索菲蘭、索布佐山、索拉非尼、SPARC,20-氨基酸的肽、鍺螺胺、螺妙斯定、straplozocin, 鏈黑霉素、鏈脲霉素、舒尼替尼、他莫昔芬、紫杉醇、紫杉醇衍生物、替加氟、temozoamide、替 尼泊苷、細交鏈孢菌酮酸、臺羅西隆、睪內脂、丁卡因、四氯己鉬胺、沙立度胺、硫咪嘌呤、硫 代秋水仙堿、thioepa、硫嘌呤、噻替派、血小板反應蛋白I的19個氨基酸的肽、組織纖維蛋
30白溶酶原激活劑、拓優得(tomudex)、拓撲替康、托瑞米芬、trastuzutmaban、維甲酸、三亞 胺醌、曲他胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺、曲洛司坦、曲美沙特、曲普瑞林、三苯 甲基半胱氨酸、氯乙環磷酰胺、trontecan、殺結核菌素、腫瘤壞死因子樣細胞因子、腫瘤壞 死因子、烏苯美司、尿嘧啶芥子、尿嘧啶氮芥、烏瑞替哌、烏拉坦、凡德他尼(ZD6474)、VEGF 反義寡核苷酸、長春堿、硫酸長春堿、長春新堿、硫酸長春新堿、長春地辛、維諾利賓、VM-26、 VP-16、吉雄-864(yoshi-864)、凈司他丁和/或佐柔比星。在另一實施方案中，一種或一種以上的本文所公開免疫連接物可以與一種或一種 以上的下列癌癥治療法或者下列類別治療劑組合施用，包括但不限于放射治療、手術治療、 基因治療、控制副作用的試劑(例如抗組胺劑、抗惡心劑)、癌癥疫苗、血管發生抑制劑、免 疫調節劑、抗炎劑、免疫抑制劑、提高抗原表達的試劑、與癌癥治療相關的其它試劑、化學治 療劑、免疫治療劑、光敏劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生素、抗代謝物劑、用于斷裂DNA的試劑、 用于斷裂微管蛋白的試劑、烷化劑、拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、細胞因子、 生長因子、激素治療、長春花生物堿、植物生物堿和/或抗有絲分裂劑。的確，向需要此類治療的患者施用有效量的免疫連接物將導致具有顯著臨床功效 的另一癌癥治療劑的劑量減少。降低其它癌癥治療劑劑量的此種功效在不施用免疫連接物 時觀察不到。因此，本申請提供了治療腫瘤或癌癥的方法，包括施用減少劑量的一種或一種 以上其它癌癥治療劑。此外，向需要此種治療的患者進行包含免疫連接物的聯合治療與標準治療方案的 持續期間和周期數相比治療時間相對縮短。因此，本申請提供治療腫瘤或癌癥的方法，包括 在相對短的持續時間內和/或在較少的治療周期中施用一種或一種以上其它癌癥治療劑。因此，根據本申請，包含免疫連接物和另一癌癥治療劑的聯合治療可以降低總體 癌癥治療的毒性(即副作用)。例如，與單一治療或者另一種聯合治療相比，當遞送減少劑 量的免疫連接物和/或其它癌癥治療劑和/或當減少周期的持續時間(即單一施用的周期 或一系列此類施用的周期)和/或當減少周期數時，可以觀察到毒性降低。因此，本申請提供藥物組合物，其包含任選地在可藥用載體中的免疫連接物和一 種或一種以上另外的抗癌治療劑。本申請還提供試劑盒，包含任選地與一種或一種以上其它癌癥治療劑組合的有效 量的免疫連接物，以及其用于治療癌癥的使用說明書。試劑盒還可以包括輔助試劑。例如， 試劑盒可以包括用于將免疫連接物注射入受試者的器械，如注射器；儲藏或運輸免疫連接 物的容器；和/或可藥用賦形劑、載體、緩沖液或穩定劑。如上所述，使用免疫連接物的聯合治療可以使癌癥或腫瘤對另一癌癥治療劑的施 用敏感。因此，本申請考慮了用于預防、治療癌癥和/或防止癌癥復發的聯合治療，包括在 施用減少劑量的癌癥治療劑之前、之后或者同時施用有效量的免疫連接物。例如，使用免疫 連接物的最初治療將增加癌癥或腫瘤對隨后的癌治療劑劑量的敏感性。該劑量接近或低于 當癌癥治療劑單獨施用時或者在缺乏免疫連接物的情況下施用時標準劑量的低值。當并行 施用時，免疫連接物可以與癌癥治療劑分開施用，并且任選地通過不同的施用模式施用。在可選實施方案中，另一癌癥治療劑的施用將使癌癥或腫瘤對免疫連接物或結合 蛋白敏感。在此種實施方案中，另一癌癥治療劑可以在免疫連接物或結合蛋白施用之前給 與。
因此，聯合治療可以增加癌癥或腫瘤對所施用免疫連接物和/或另一癌癥治療劑 的敏感性。以該種方式，更短的治療周期是可能的，由此減少了毒性事件。周期持續時間 可以根據使用的特定癌癥治療劑而變化。本申請還考慮了連續或者間斷施用，或者日劑量 分成數個部分施用。對于特定癌癥治療劑的適宜周期持續時間將由本領域技術人員確定， 并且本申請考慮了對于每一癌癥治療劑的最佳治療方案的連續評估。對于技術人員的具體 指導在本領域是已知的。見例如Therasse等，2000，“New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors。 European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada,，，J Natl Cancer Inst. Feb 2 ；92 (3) :205_16o考慮了免疫連接物可以通過任何適宜方法施用，例如注射、口服施用、吸入、經皮 或者瘤內施用，而任何其它癌癥治療劑可以通過相同施用模式或者另一施用模式遞送至患 者。此外，當打算將多重癌癥治療劑遞送至患者時，免疫連接物和一種或一種以上其它癌癥 治療劑可以通過一種方法遞送，而其它癌癥治療劑可以通過另一種施用方式遞送。(G) ■齢舶_賭麵腦誠禾口i·所公開的結合蛋白選擇性地結合至癌細胞上或癌細胞內或者結合至由癌細胞內 化的分子，但是沒有明顯地結合至正常細胞。因此，結合蛋白可以用于癌癥診斷。如上所述， 發明人已經證明，本發明的結合蛋白結合至癌細胞。因此，本申請包括診斷方法、試劑和試劑盒，其本身可以使用，或者在治療方法之 前、之中或者之后使用以確定是否存在癌細胞在一個實施方案中，本申請提供檢測或監測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)將來自所述受試者的測試樣品與本文所公開且特異性結合至癌細胞上或癌細 胞內抗原的結合蛋白或免疫連接物接觸，以產生結合蛋白-抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白_抗原復合物的量；和(3)比較測試樣品和對照中結合蛋白_抗原復合物的量。在一個實施方案中，抗原是前列腺干細胞抗原。在另一實施方案中，前列腺干細胞 抗原定位于細胞表面上。在另一實施方案中，抗原是變體HnRNPG。在進一步的實施方案中，變體HnRNPG定位于細胞內的質膜上。在另一實施方案 中，細胞表達前列腺干細胞抗原和變體HnRNPG兩者。在另一實施方案中，抗原包含表位SEQ ID NO :23、41、111 或 112。本申請還包括用于診斷癌癥的試劑盒，包含任何一種本文所公開的結合蛋白或免 疫連接物和用于診斷癌癥的使用說明書。試劑盒還可包括輔助試劑。例如，試劑盒可以包 括額外的試劑，例如直接或間接檢測本文所公開結合蛋白或免疫連接物的試劑；用于儲存 或運輸結合蛋白或免疫連接物的容器；陽性和/或陰性對照或參照標準；和/或其他緩沖 液或穩定劑。對于在診斷應用中的使用，結合蛋白、優選抗體或抗體片段可以以可檢測標記來 標記，例如放射不透性的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I ；熒光化合物 (熒光團)或化學發光化合物(生色團)，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或螢光素；酶，例如 堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；顯影劑；或金屬離子。如上所述，將標記附 著至結合蛋白(例如抗體或抗體片段)的方法是本領域已知的。
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本申請的另一個方面是檢測或監測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)測量從所述受試者取得的測試樣品中本文所公開抗體的量；和(2)比較測試樣品和對照中本文所公開抗體的量。在一個實施方案中，通過例如ELISA測量測試樣品中抗體的量來測量抗體的量。 在另一實施方案中，通過例如RT-PCR測量測試樣品中編碼本文所公開抗體的核酸的表達 水平來測量抗體的量。(H) _會目勁勿、誠禾_碰晚表__本申請提供在癌細胞上或癌細胞內表達，但是在正常細胞上或正常細胞內沒有明 顯表達的新的癌相關表位或抗原。因此，表位或抗原可以用于治療和預防癌癥的治療中，包 括使用表位或抗原在體內引起免疫反應。此外，本申請包括使用抗原或表位以檢測或監測癌癥。⑴藥物組合物—個實施方案是藥物組合物，包含與適宜稀釋劑或載體混合的、有效量的本文所 公開表位或抗原。另一個實施方案是藥物組合物，包含與適宜稀釋劑或載體混合的、有效量 的分離的核酸，所述分離的核酸編碼本文所公開表位或抗原。本申請的進一步的方面是藥 物組合物，包含與適宜稀釋劑或載體混合的、有效量的重組表達載體，所述重組表達載體包 含編碼本文所公開表位或抗原的核酸序列。例如，藥物組合物可以用于治療或預防癌癥。此外，藥物組合物可以用于在受試者 中引起針對表達本文所公開表位或抗原的癌細胞的免疫反應。藥物組合物可以如上制備和施用。藥物組合物可以用于與如上所述的其它抗癌癥 治療劑聯合使用。如果免疫試劑(即包含本文所公開表位或抗原或其變體、和/或其編碼核酸序列、 和/或重組表達載體的試劑)和/或組合物與佐劑共同免疫，而不管施用形式如何，可以顯 著改善免疫原性。通常，佐劑作為磷酸緩沖鹽水中的0.05%至1.0%溶液使用。佐劑增強 免疫原的免疫原性，但是本身不必然是免疫原性的。佐劑可通過將免疫原保留在施用部位 的局部附近而發揮作用，以產生儲存效應，利于免疫原向免疫系統的細胞緩慢持續釋放。佐 劑也可以將免疫系統的細胞吸引至免疫原庫，并且刺激此類細胞以引起免疫反應。照這樣， 實施方案包括還包含佐劑的藥物組合物。多年來已經使用佐劑改善宿主對例如疫苗的免疫反應。內部佐劑(例如脂多糖 類)正常情況下是用作疫苗的滅活或減毒細菌的成分。外部佐劑是免疫調節劑，其有代表 性地非共價連接至抗原并且被配制以增強宿主免疫反應。因此，已經鑒定了佐劑增強對胃 腸外遞送的抗原的免疫反應。這些佐劑中的一些是毒性的，并且會產生不良副作用，使得它 們不適宜在人和多種動物中使用。實際上，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(通稱明礬)是常規用作 人疫苗和獸疫苗中的佐劑。已經良好確立了明礬在增強對白喉毒素和破傷風毒素的抗體反 應中的有效性。盡管如此，它確實具有局限性。例如，明礬對于流感疫苗接種是無效的，并 且與其它免疫原一起不一致地引起細胞介導的免疫反應。由使用明礬作為佐劑的抗原在小 鼠中引出的抗體主要是IgGl同種型，其對于由一些疫苗試劑提供的保護而言不是最佳的。廣泛的外部佐劑可刺激針對免疫原的有效免疫反應。這些佐劑包括與膜蛋白抗原 復合的皂苷類(免疫刺激復合物)、帶有礦物油的普盧蘭尼克聚合物、滅活的分枝桿菌和礦物油、弗氏完全佐劑、細菌產物如胞壁酰基二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、以及脂質A、和脂質 體。在本申請的一個方面中，在任何本文所述實施方案中可用的佐劑如下。對于腸胃 外免疫的佐劑包括鋁化合物(例如氫氧化鋁、磷酸鋁和氫氧化鋁磷酸鹽(aluminum hydroxy phosphate))0根據標準方法，抗原可以與鋁化合物沉淀或者被吸附至鋁化合物上。其他佐 劑例如RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)也可以在腸胃外施用中使用。對于黏膜免疫的佐劑包括細菌毒素(例如霍亂毒素(CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒 素(LT)、艱難梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)、或其組合、亞基、類毒素或突變體。例如， 天然霍亂毒素亞基B(CTB)的純化制劑是可以使用的。這些毒素中任何毒素的片段、同 系物、衍生物和融合物也是適宜的，只要它們保留了佐劑活性即可。優選地，使用具有降 低毒性的突變體。適宜突變體已經描述(例如在WO 95/17211 (Arg-7-Lys CT突變體)、 W09606627(Arg-192-Gly LT 突變體)、和 WO 95/34323 (Arg-9-Lys 和 Glu-129-Gly PT 突變體)中)。可以在本文所公開方法和組合物中使用的另外的LT突變體包括例如 Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-lIO-Asp 和 Glu-112-Asp 突變體。其它佐劑(例如多種來源 (如大腸桿菌、明尼蘇達沙氏桿菌(Salmonella minnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或福氏志賀菌(Shigellaflexneri))的細菌單磷酸類脂A(MPLA)、皂苷類、或 丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)微球)也可以用于粘膜施用中。對于黏膜免疫和腸胃外免疫兩者有用的佐劑包括聚磷腈(例如W09502415)、 DC-chol (3b-(N-(N' , N' - 二甲氨基甲叉)_氨甲酰基)膽固醇)(例如美國專利號 5，283，185 和 WO 96/14831)和 QS-21 (例如，W08809336)。可以通過本領域技術人員已知的任何常規途徑用藥物組合物免疫受試者，所述藥 物組合物包含一個或數個本文所公開的表位或抗原、編碼其的分離的核酸序列和/或重組 表達載體。這可以包括，例如經過黏膜(例如眼睛的、鼻內的、口腔的、胃的、肺的、腸的、直 腸的、陰道的或泌尿道的)表面的免疫、經過腸胃外(例如皮下、真皮內、肌內、靜脈內或腹 膜內)途徑的免疫或者結節內免疫。優選的途徑依賴于所選擇的免疫原，并且這對于本領 域技術人員是顯而易見的。施用可以以單一劑量完成或者間隔重復。合適的劑量依賴于技 術人員能理解的多種參數，例如免疫原本身(即是肽還是核酸(并且更加具體而言是其類 型))、施用途徑和待免疫的動物的狀況(體重、年齡等等)。本申請還提供試劑盒，包含任選地與一種或一種以上其它癌癥治療劑組合的、有 效量的本文所公開表位或抗原，以及其使用說明書。試劑盒還可以包含輔助試劑。例如，試 劑盒可以包括用于向受試者注射本文所公開表位或抗原的器械，例如注射器；用于儲存或 運輸本文所公開表位或抗原的容器；佐劑；和/或可藥用賦形劑、載體、緩沖液或穩定劑。(ii)治療方法如上面所提到，本文所公開表位或抗原存在于癌細胞上或癌細胞內，但是不明顯 存在于正常細胞上或正常細胞內。因此，本文所公開表位或抗原可以用于預防或治療癌癥 的治療方法中。此外，表位或抗原可以用于引起受試者中免疫反應，例如在疫苗中。一個實施方案是本文所公開表位或抗原在制造治療或預防癌癥的藥物中的用途。 另一實施方案是表位或抗原在制造引起受試者中免疫反應的藥物中的用途。本申請還包括編碼本文所公開表位或抗原的分離的核酸序列在制造治療或預防，本申請包括編碼表位或抗原的分離的核酸序列在制造引起受 試者中免疫反應的藥物中的用途。進一步的實施方案是重組表達載體在制造治療或預防癌癥的藥物中的用途，所述 重組表達載體包含編碼本文所公開表位或抗原的分離的核酸序列。同樣，本申請包括重組 表達載體在制造引起受試者中免疫反應的藥物中的用途，所述重組表達載體包含編碼本文 所公開表位或抗原的分離的核酸序列。另外的實施方案是治療或預防患有或者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包 括向所述受試者施用有效量的本文所公開表位或抗原。此外，本申請包括治療或預防患有 或懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的分離的核酸序 列，所述分離的核酸序列編碼本文所公開表位或抗原。此外，本申請包括治療或預防患有或 者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的重組表達載體， 所述重組表達載體包含編碼本文所公開表位或抗原的分離的核酸序列。另一實施方案是誘導受試者中針對癌癥的免疫反應的方法，包括向所述受試者施 用有效量的本文所公開表位或抗原。此外，本申請包括誘導受試者中針對癌癥的免疫反應 的方法，包括向所述受試者施用有效量的分離的核酸序列，所述分離的核酸序列編碼本文 所公開表位或抗原。此外，本申請包括誘導受試者中針對癌癥的免疫反應的方法，包括向受 試者施用有效量的重組表達載體，所述重組表達載體包含編碼本文所公開表位或抗原的分 離的核酸序列。(iii)診斷方法本文所公開表位或抗原表達于癌細胞上或者癌細胞內，并且沒有明顯地表達于正 常細胞上或者正常細胞內，因此對本文所公開抗原或表位的檢測可以用作癌癥的診斷方法。一個實施方案是檢測或監測患有或者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括 檢測樣品中細胞上或者細胞內的本文所公開抗原或表位，其中如果在細胞上或者細胞內檢 測到一種或一種以上所公開的抗原或表位，則表明具有癌癥。多種技術可以用于檢測細胞上或者細胞內的本文所公開抗原或表位。例如，本文 所公開結合蛋白可以用于免疫測定中以檢測本文所公開抗原或表位的細胞表面表達。本領 域技術人員會意識到，多種技術可以用于檢測和/或定量表位或抗原的細胞表面表達，包 括Western印跡、免疫沉淀之后的SDS-PAGE、免疫細胞化學、FACS、蛋白質陣列等。本申請一個方面是檢測或監測患有或者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包 括檢測樣品中細胞內本文所公開抗原或表位的表達，其中如果在細胞內檢測到本文所公開 抗原或表位的表達，則表明具有癌癥。在一個實施方案中，編碼本文所公開抗原或表位的 RNA表達產物用于檢測細胞內本文所公開抗原或表位的表達。本領域技術人員會意識到，可 以通過檢測編碼本文所公開抗原或表位的mRNA、或者特異性和/或選擇性雜交至編碼本文 所公開抗原或表位的mRNA的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產物、合成DNA、合成RNA或者 天然存在的或修飾的核苷酸的其它組合來檢測或定量RNA表達產物。多種方法可以用于檢測和/或定量細胞內本文所公開抗原或表位的RNA表達，包 括RT-PCR、核酸酶保護試驗如核糖核酸酶保護試驗和Sl核酸酶試驗、和Northern印跡等。一個實施方案是通過篩選變體HnRNPG存在或表達來檢測或監測癌癥的方法。在
35一個實施方案中，方法包括步驟(a)確定來自受試者的測試樣品中變體HNRNPG的表達；和(b)將變體HnRNPG的表達與對照比較；其中對照和測試樣品之間變體HnRNPG表達的差異指示著患有癌癥。上面的公開一般性地描述了本發明。通過參照下面的具體實施例可以得到更加完 全的理解。這些實施例僅以例證的目的描述并且不旨在限制本發明的范圍。考慮了形式改 變和等效替代物，因為環境將建議或賦予臨時手段。雖然在本文中已經采用了特定術語，但 是此類術語旨在是描述意義的，而不是限制的目的。下列非限定性實施例用于說明本發明實施例實施例1 :VB1_213單克降抗體的產牛VB1-213單克隆抗體從卵巢癌患者的淋巴結產生。MFP-2用作融合融合伴侶以產 生單克隆抗體(US7，220，559 ;US6，197，582)。VB1-213 是 IgGl，λ 單克隆抗體。信使RNA(mRNA)從雜交瘤細胞分離并且使用逆轉錄酶合成第一鏈互補 DNA(cDNA)。然后cDNA用于通過PCR分離抗體H和L鏈基因。根據Η( γ )和L( λ )鏈同種 型的共有序列框架區設計PCR引物(見注釋)。PCR產物分別克隆入TOPO-pCR 2. 1載體中， 并且轉化入大腸桿菌細胞中。分離在TOPO-pCR 2. 1中包含插入物的各個克隆并培養。純 化質粒DNA并測序。
Y引物
1)5，CTCACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT 3，(SEQ ID NO 1)
2)5，CAGGCA GCC CAG GGC CGC TGT GCC CCC AGA GGT GCT3’ (SEQ ID NO 2) λ引物
(1)5，ATGRCC TGS WCY CCT CTC YTY CTS WYC 3，(SEQ ID NO 3)
(2)5，ATGRCC TGS WCY CCT CTC YTY CTS WYC 3，(SEQ ID NO 4)
(3)5，ATGRCC TGS WCY CCT CTC YTY CTS WYC 3，(SEQ ID NO 5)
(4)5，GGT GGT CTC CAC TCC CGC CTT GAC GGG GCT GCC ATC TGC3’ (SEQ ID NO 6)注釋為了分離λ鏈，對于某些共有序列，5’引物混合物使用混合的堿基R = A+G, S = C+G, W = A+T, Y = C+ToPCR反應包括50 μ L反應體積，其包含10 X PCR 緩沖液5yL2mM dNTP5 μ L引物 5，20pmol引物 3，20pmolTaq DNA 聚合酶2. 5UDNA 模板50ngPCR循環條件是94 °C下1分鐘，62 °C下1分鐘，72 °C下1分鐘，30個循環，并 且最后在72°C延伸10分鐘。擴增的PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳分離、切膠、使 用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化、克隆入TOPO pCR 2. 1克隆載體中，然后使用373 DNASequencer Stretch 對 DNA 測序(Griffin G. H.和 Griffin Μ. A. :PCR technology, Current innovations. CRC Press, Boca. Raton. Florida3431. USA ；(克隆載體 pCR 2· 1,目 錄號 205184. Invitrogen,Carlsbad,CA ；Qiagen，Qiaquick凝膠提取試劑盒，目錄號 28706. Qiagen Inc.，Mississauga，ON ；禾口373DNA Stretch.PE Applied Biosystems,Mississauga ΟΝ.)。對于VB1-213的CDR序列(SEQ ID NO :7_12)示于表1。重鏈可變區和輕鏈可變 區分別示于圖1禾P 2 (SEQ IDNO 13-16)。實施例2 通過測量腫瘤細胞反應件的抗體特件通過流式細胞術測試VB1-213對基于實施例4中所示腫瘤微陣列結果所選擇的四 種不同類型上皮細胞癌的腫瘤細胞反應性。VB1-213結果總結于表2中。MF值表示從每一 指征中所有細胞系的、相對于對照抗體的中位熒光的平均增加倍數的和計算的平均值。對 肺(A-549、NCI-H460)的結合最強，其次為前列腺(DU-145、PC_3、LNCap)、黑素瘤(A-375、 SK-MEL-28)和乳腺(MDA-MB-231、MDA-MB-435S、SK-BR3)。實施例3 :ιΗ常對于染色的最佳條件通過測試VB1-213結合至SK_0V_3腫瘤細胞系定義。SK-0V-3 是卵巢腫瘤細胞系并且染色優化通常使用代表抗體所來源腫瘤類型的細胞系開展(在該 例中為卵巢癌患者的淋巴結)。在這些細胞的細胞膜、細胞質和細胞核中檢測到VB1-213染 色。福爾馬林固定細胞團核心的細胞膜染色的代表性圖片示于圖3。一旦鑒定出最佳染色條件，在低密度(LD)臨界正常組織陣列上與同種型對照 (IgG骨髓瘤)相比較測試抗體的正常組織反應性。對于VB1-213的組織微陣列結果總結于 表3中。除了肺以外，沒有在任何正常臨界組織中觀察到明顯的膜染色。對于膜染色的最 大得分不大于陽性細胞的20%。實施例4 腫瘤在HD福爾馬林固定的腫瘤組織微陣列中測試VB1-213的腫瘤組織反應性(表4)。 對肺癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌組織檢測到最高的VB1-213反應性。對乳腺癌、胰腺癌和 頭頸癌觀察到中等至低的結合。說明VB1-213結合至一些癌癥的代表性圖片示于圖4A和B。在皮膚腫瘤組織上觀 察到的膜染色被認為是非特異性結合，因為使用對照同種型抗體也觀察到膜染色。實施例5 通過流式細胞術和共焦顯微鏡評估VB1-213結合和內化VB1-213和已證明對腫瘤細胞系A-375具有強反應性的對照抗體5E9用于通過借 助于激光掃描共焦顯微鏡直接觀察熒光分布和細胞內染色來評估VB1-213的內化。A-375 細胞與VBl-213(100mg/mL)在4°C下孵育。在洗滌細胞之后，一半樣品于37°C加溫1小時， 另一半維持在4°C。細胞不固定或被固定(使用甲醛溶液)，并且以熒光素標記的二級抗體 標記。與5E9 —樣，A-375細胞與VB1-213在4°C下孵育60分鐘證明了熒光標記的斑點表 面分布(圖5A)。如圖5B所示，加溫VB1-213抗體所結合細胞至37°C，顯示在60分鐘內由 內化抗體產生的細胞內斑點染色方式。實施例6 結合親和性流式細胞術用于評估結合親和性(C.A. Benedict, A. J. MacKrel 1, W. F. Anderson, J Immunol. Methods 201,223(1997))。針對固定數量的腫瘤細胞(A-375)測試一定范圍
37的抗體濃度2小時以得到飽和曲線。使用Sigma Plot(Jandel Scientific, San Rafael, CA)進行數值和圖形分析。所確定中位熒光的倒數作為抗體濃度的倒數的函數作圖，以通過 Lineweaver-Burk方法確定KD。產生一直線，并且從曲線的斜率計算出KD (圖6A和6B)。 通過下列公式確定解離常數KD值1/F = 1/Fmax+(KD/Fmax) (1/IgG)，其中F =扣除背景的 中位熒光，Fmax從圖中計算。對于VB1-213的解離常數顯示為6. 27X 10_7M。實施例7 :VB1_213抗原鑒定關于該方法的更加詳細的信息可以在W02006/105653中找到。細胞前列腺腫瘤細胞系DU-145、乳腺癌細胞系MDA-MB 435S和SKBR-3、胰細胞系 PANC-I和CFPac-I以及T-細胞系Daudi用于該研究中(表5)。這些細胞系通過流式細胞 術基于腫瘤細胞系特性加以選擇。腫瘤細胞系的生長和維持在該研究中的細胞系購自ATCC并且按照ATCC的指導和建議培養。細胞在90%匯 合時收獲，生存力>90%。結合至VB1-213的抗原的初步表征初步表征數據從設計為通過點印跡試驗評估基于凝膠的方法的可行性的實驗得 到；和從為確定與抗原結合的表位的性質而開展的實驗得到。來自這些實驗的數據將VB1-213抗原分類為具有肽表位的“可印跡”抗原。應當 注意的是，抗原應該是在除結合位點之外也被糖基化。免疫沉淀最少500 μ g的膜蛋白用于免疫親和沉淀。僅使用蛋白G瓊脂糖的預清除步驟是加 入抗體前的抗原純化中的第一個步驟。在某些情況下，預清除開展兩次以使試驗更加嚴格。 總共50 μ g的抗體用作混合物中的沉淀劑。使用模擬生理條件的緩沖條件于4°C過夜沉淀 抗原_抗體混合物。小心操作保證在抗原分離過程的每一個步驟中使用蛋白酶抑制劑。免疫復合物離心，以RIP-A裂解緩沖液洗滌并以0. 2M甘氨酸pH 2. 5洗脫。代表 未結合級分的上清液被儲存，以測驗通過親和純化未分離的蛋白質。免疫沉淀在一種強陽 性細胞系(DU-145)、兩種中等陽性細胞系(MDA-MB-435S和Panc-I)、一種弱陽性細胞系 (SKBR-3)和兩種陰性細胞系(CFPAC-1和Daudi)上開展，使用VB1-213和一直平行處理的 等量4B5(同種型匹配對照)。基于凝膠的分析和Western印跡免疫沉淀的蛋白質在還原條件下進行樣品制備，隨后通過SDS-PAGE/Western印 跡分析。免疫沉淀的蛋白質以包含β-巰基乙醇的樣品緩沖液于65°C處理15分鐘。所 得到的印跡以相關抗體和偶聯至HRP的相應二級抗體探測，以便通過化學發光顯現出免疫 沉淀的蛋白質。在DU-145、PC-3、A549、SKBR-3和Panc-I中檢測到一個 56kDa的特異性 條帶(圖7)。同一條帶在VB1-213非反應性細胞系CFPAC-I中表達不足。使用4B5顯示沒 有一個細胞系為陽性免疫沉淀。為了確定等電點(pi)和評價在ID-PAGE分析中蛋白質堆疊的可能性，用VB1-213 免疫沉淀的蛋白質在二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)上分離、轉移至PVDF膜、用 VB1-213探測并通過ECL (化學發光)檢測。如圖8中所示，在 42kDa/pI = 10. 02檢測到一個斑點。來自ID和2D考馬斯染色膠的對應的蛋白質條帶或斑點被切下并處理以提取肽。肽提取和抗原ID:ID凝膠條帶和2D斑點的蛋白質用胰蛋白酶消化以從膠中釋放它們，并在反向 LC-MS/MS系統和的靜態納米噴霧器上分析，以獲得更佳蓋度。蛋白質特性通過使用標 準生物信息學工具的數據庫分析來揭示。原始數據包含如在TOFMS譜中所列獲得的肽、 MS/MS斷裂數據和一列推薦的蛋白質，包括與分離的蛋白質的pi或分子量不匹配的污染 物。為了得到完全的分析，MS/MS譜盲接提交至通過w驟.Matrixscience. com可講入的 Mascot搜索引擎入口。胰蛋白酶消化用測序級胰蛋白酶在20小時肽提取過程中進行， 最終導致提取肽，其在裝備有工作流速為20-50nL/min的納米源(nanosource)的QSTAR Pulsar-I (ESI-qTOF-MS/MS)上使用靜態納米噴霧器和在LC模式下分析。離子化肽檢測為 二重、三重或四重離化態分子，然后它們被精修至它們各自的質量。可能的情況下還開展 了所鑒定蛋白質的從頭測序。肽從陽性和陰性兩種細胞系中提取以保證對正確抗原的鑒 定。從質譜得出的肽質量直接用于根據MOWSE得分鑒定抗原，所述得分從通過搜索引擎如 MASCOT、SEQUEST和Prospector可進入的蛋白質數據庫得到。從DU-145膜級分的2D膠切下的蛋白質斑點經鑒定為HnRNPG (圖9和10)。pi和 分子量顯然與HnRNPG的pi和分子量匹配。得到了具有18個匹配肽的總共38%的序列蓋 度(表6) (SEQ ID NO 53-70)，其中顯示17個與最初蛋白質100%同源。安裝在納米源上 的離散納米噴霧器頭用于肽1481. 9584 (SEQ ID NO 70)的MS/MS斷裂碰撞能量為48V，簾 氣和CAD氣分別維持在25和6，并且樣品允許循環達1. 667分鐘(100個循環)以得到穩 定的質量離子斷裂。肽(1481. 9584,742. 000000,2+) (SEQ ID NO 70)的MS/MS斷裂產生圖 11中所示的碎片離子。肽DGYSCKAQYSNRD (SEQ ID NO 70)顯示與HnRNPG側翼序列100% 同源，而不與中間的序列同源，表明是新的序列。所回收的肽的列表和它們在HnRNPG序列 上的圖位在圖12和表6中給出。所表示的所有肽通過從頭測序得到。從ID膠純化的56士2kDa條帶的分析從全部三種細胞系(即DU-145、SKBR-3和Panc-I)的質譜得到的數據表明HnRNPG 作為結合VB1-213的抗原(圖13、14、15和16)。在所有篩選的細胞系當中，前列腺細胞系 DU-145顯示具有最高的得分特性。乳腺癌細胞系SKBR-3和胰腺細胞系Panc-I也顯示抗 原過表達。來自這些細胞系的每一種細胞系的膜制備物用于VB1-213抗原的親和純化。獲 得TOF-MS掃描結果。該數據支持了在使用VB1-213抗體得到的免疫沉淀物中存在HnRNPG。 然而，在HnRNPG的預期分子量(42kDa)和在ID膠上觀察到的條帶的分子量(56kDa)之間 存在差異。開展溶液內液相分析以闡明該表觀差異。從溶液內消化物提取的肽的分析來自三種陽性細胞系(即DU-145、SKBR_3和Panc-I)的免疫沉淀物直接經受溶液 內肽提取。所提取的肽用μ-C18柱濃縮并脫鹽，并用于MS分析。在全部三種細胞系中鑒定 了兩種不同的蛋白質，為由HnRNPG+前列腺干細胞抗原(PSCA)組成的“混合物1”。所鑒定 的蛋白質部分以及它們各自的得分也示于圖17中。HnRNPG和PSCA被鑒定為“混合物1”， 各自具有76%和95%的序列蓋度并且具有413的高顯著性組合得分。序列蓋度和對應于 PSCA的肽示于圖18和19以及表7 (SEQ ID NO 18-22)。通過該方法分離的對應于HnRNPG的肽示于表8中(SEQ ID NO 72-110)。MS/MS斷裂和肽特性證實了 HnRNPG和PSCA存在于 用VB1-213得到的免疫沉淀物中。豐富肽的MS/MS斷裂四種肽(來自(623. 000. 000000，3+)的 1866. 000 (SEQ ID NO 21)；來自 (742. 000000,2+)的 1481. 985448 (SEQ ID NO 70)；來自(698. 000000,3+)的 2089. 96 (SEQ ID NO 84)；來自(744. 600000,2+)的 I486. 6418 (SEQ ID NO 75))的 MS/MS 斷裂產生了碎 片離子，其經作圖為分別來自PSCA和HnRNPG的肽。由于在TOF-MS中良好地檢測到這四種 肽，所以除了從質量指紋衍生的肽之外，這些肽被用于MS/MS離子斷裂。安裝在納米源上的 離散的納米噴霧器用于此目的。碰撞能量為48V，簾氣和CAD氣分別維持在25和6，并且允 許樣品循環1.667分鐘(100個循環)以得到穩定的質量離子斷裂。來源于該譜的肽，除了 肽 1481. 95，742. 00000，2+(SEQ ID NO 70)之外，明顯匹配 HnRNPG 和 PSCA 的序列。所回收 肽的側翼區精確匹配HnRNPG ；然而，剩余序列顯示在序列信息上僅69. 6%同源。這證明為 在HnRNPG的第216、218、219和222位具有四個氨基酸置換的新的序列。這四處變化還產 生HnRNPG中的肽序列YSCKAQYSNRD(SEQ IDNO 111)，其與PSCA中的肽81 %同源。離子斷 裂數據進一步證實了變體HnRNPG和PSCA作為VB1-213的同族抗原的身份。PSCA作為細胞表面抗原和HnRNPG作為細胞內蛋白質上述數據表明PSCA是VB1-213識別的抗原。由于基于凝膠純化的局限性，在 除了液相提取之外的任何制備物中沒有鑒定出PSCA。因此，為了進一步證實PSCA是 VB1-213抗原，購買抗PSCA抗體(一種商業可得的抗PSCA抗體)用于驗證試驗。兩個細 胞系Daudi (T-細胞系)和Panc-I (VBl-213+ve)以抗PSCA抗體免疫沉淀，并且洗脫物在 SDS-PAGE和Western印跡上解析。印跡以抗PSCA抗體和VB1-213探測。如圖20中可見， 在同一位置(56kDa)的陽性條帶與兩種抗體均反應。與在 13kDa或 42kDa的兩個條帶 相反，當用VB1-213或抗PSCA抗體探測時檢測到在56kDa處的單一條帶，表明HnRNPG和 PSCA —起形成了復合物，而不是彼此獨立地結合VB1-213。Daudi (先前顯示對213陰性) 使用兩種抗體均顯示在 56kDa處有反應條帶。來自Daudi的蛋白質條帶的MS分析沒有 得到有用的結果，僅抗體的殘留物被鑒定出來。設計實驗以測試細胞表面上HnRNPG的存在。DU-145細胞以胰蛋白酶處理30分 鐘，并且包含從細胞表面所釋放蛋白質的上清液被濃縮并用于MS分析。僅PSCA和其他細 胞外基質蛋白質和血清蛋白質被檢測到。在上清液中沒有屬于HnRNPG的肽。因此，在細胞 膜制備物種發現了突變體HnRNPG，但是定位在細胞質側。數據表明HnRNPG和PSCA在腫瘤 中共表達并且它們可以在細胞膜水平結合和/或在免疫沉淀之后的凝膠中共遷移。實施例8 表位作圖_結合實驗方法和試劑月太合成肽由Global Peptides LLC (Fort Collins, Colorado,美國)定制合 成。HPl 的氨基酸序列(生物素 YSCKAQVSNED-1467. 76amu ；SEQ ID NO 23)衍生 自PSCA并且被合成為在PSCA上VB1-213所結合的肽，因為該肽與變體HnRNPG上的 肽(SEQ ID NO 111)81%同源(僅2個氨基酸不同)，該變體HnRNPG上的肽是一種也 結合 VB1-213 的抗原。另一個肽，PSp印3 (生物素 LCNASGAHALQ-1306. 59amu ；SEQ ID
40NO :24)，衍生自PSCA ；并且作為商品化抗PSCA抗體的免疫原一部分的兩個其他的肽， 即 PSp印 1(生物素 TARIRAVGLLTVISK-1823. 9amu ；SEQ ID NO 25)和 PSp印2 (生物素 LCNASGAHALQ-1306. 59amu ；SEQ ID NO 26)，也被合成并用于表位研究(表 9)。增溶肽所有肽溶解于PBS中。如果觀察到溶解上的任何困難，則用0. OlN HCl或0. OlN NaOH調節溶液的pH。肽于_20°C下以母液(1000 nM)儲存。在ELISA板上包被肽肽溶液用包含0.5%甲醛的Hank緩沖鹽溶液(HBSS)以1 100稀釋。向96孔板 中的每一孔中加入100 μ L稀釋的肽溶液。將板在室溫下溫育1小時。去除上清液并且將 不蓋蓋子的板置于37°C培養箱16-18小時。將肽包被板置于塑料袋中并儲存于2-8°C下直 至需要時。可選地，肽在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液pH 9. 6中稀釋，并且包被在板上。除了包 被緩沖液改變以外，其他所有步驟是相同的。在過夜溫育肽包被板之后，借助于配備有8通道適配器的Itepeator移液器，向每 一板中人工加入300 μ L洗滌緩沖液(包含0. 5% Tween20的PBS)。棄去板的內容物；將板 倒置并在3-4英寸紙巾上輕拍以去除多余的液體。上面的步驟再重復兩次。封閉用封閉緩沖液(包含1 % BSA的PBS)以300 μ L/孔封閉肽包被板。將板在室溫溫 育30-60分鐘。在溫育之后棄去封閉緩沖液。VB1-213與肽包被ELISA板的結合相當于75μ g/mL VB1-213的等分試樣被加入至每一孔中并且在37°C溫育兩小 時。如先前所述，用洗滌緩沖液(包含0.5% Tween 20的PBS)洗滌板。板用1 6000稀 釋的抗人IgG-HRP室溫溫育一小時。如前所述洗滌板。將100 μ L TMB底物(TMB過氧化物 酶底物KPL目錄號50-76-00)加入至每一孔中，并在黑暗條件下溫育5-10分鐘。通過向每 一孔內加入100 μ L IM磷酸終止反應。使用ELISA板讀數器在450nm下測量光密度。結果除了 VB1-213以1. 8的OD極強地結合至HPl (在10 μ g/mL時)之外，沒有其他抗 體顯示與HPl具有任何結合(圖21A)。此外，證明VB1-213沒有明顯地結合PSP印1、PSP印2 或PSP印3(圖21C、D和E)。結果總結于表9。同種型匹配對照4B5_IgG和無關抗體抗EGFR 抗體均顯示有極高水平的背景結合。4B5-IgG顯示優先結合除了 HPl之外的所有肽。實施例9 表位作圖_競爭試驗方法和試劑腫瘤細胞系的生長和維持VB1-213陽性的細胞系，即DU-145，根據ATCC指導進行培養和維持。合成肽所有肽溶解于PBS中并且以1. 428mM(2mg/mL)和100 μ M溶液儲存于_20°C。競爭試驗0. 5μΜ濃度的VBl-213(75mg/mL)用作非競爭對照。摩爾過量，即20X、40X、100X 和200X的肽用于與VB1-213競爭。在通過流動結合之前，肽/VB1-213混合物在冰上溫育10分鐘。抗PSCA抗體用作抗原匹配對照，4B5-IgG用作同種型匹配對照并且抗EGFR抗體 用作無關抗體。這三種抗體與VB1-213完全一樣處理。VB1-213 結合VB1-213連同抗PSCA抗體、抗EGFR抗體和4B5_IgG抗體與DU-145細胞的結合通 過流式細胞術評估；并且根據前面實施例5中所述最佳方案開展。用肽處理的細胞和未處 理的細胞相似處理。結果如圖21B中所示，HPl競爭92%的VB1-213結合。使用陰性肽PSP印3沒有觀察到 明顯的對結合的置換。HPl不能抑制抗EGFR抗體、4B5-IgG或抗PSCA抗體的結合。圖21F、 21G和21H證明，PSP印1、PSP印2和PSp印3不能抑制在本研究中篩選的所有抗體的結合。來自對于VB1-213、抗EGFR抗體(無關抗體)、4B5_IgG(同種型匹配對照)和抗 PSCA抗體(商業可得的抗體)的合成肽研究結果總結于表10中。結果清楚地表明PSCA為 細胞表面抗原并且HPl (YSCKAQVSNED)為針對VB1-213的表位。PSP印1、PSP印2和PSP印3 的結合和競爭譜的特征是非特異性結合。實施例10 :VB6-213免疫毒素的細胞毒件VB6-213-Fab-PE 的分子工程通過產生EcoRI-PelB-VH213_ApaI 和 SfiI-6xHis-VL213_Cf XhoI 片段，并將其插 入 EcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/pING3302 質粒中來工程化改造 VB6_213-Fab_PE 構 建體。工程化片段被直接克隆入PING3302 Xoma載體中，處于阿拉伯糖可誘導araBAD啟動 子控制下。當通過L-⑴阿拉伯糖誘導時，目的基因鄰近的PelB前導序列的存在導致蛋白 質分泌至培養上清液中。置于V^Q結構域N末端的組氨酸親和標簽允許使用Ni2+-螯合捕 獲方法純化。通過剪接重疊延伸聚合酶鏈式反應(Splice Overlapping Extension Polymerase Chain Reaction)方法，使用PelB和VB1_213_VHDNA質粒作為模板和下列引物，產生 EcoRI-PelB-VH213-ApaI 片段5，PelB :5，GAA TTC CCT GCA GGT CTA TGG AAC GAT AAA TGC(SEQID NO 27)3，PelB-VH213 :5，CCC AGA CTC CAA CAG CTG CAC CTC CGC CATGGC TGG TTG GGC AGC GAG(SEQ ID NO 28)5，PelB-VH213 :5，ATG GCG GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGGGGA GGC(SEQ ID NO 29)3’ VH213-ApaI :5’ CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC GGA GACGGT GAC CGT GGT(SEQ ID NO 30)使用上面所列的所有4個引物開展兩步剪接重疊延伸PCR方法以構建和擴增 EcoRI-PelB-VH213-ApaI。加入EcoRI和ApaI限制性位點(粗體)以利于將PelB_VH213克 隆入 EcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302 載體中。PCR 反應包括 50 μ L 反應體積，其 包含10 X PCR 緩沖液5yL2mM dNTP5μ L50mMMgCl22 μ L
5，引物20pmol3，引物20pmolTaq DNA 聚合酶2. 5UDNA 模板50ngPCR循環條件為94°C下1分鐘，62°C下1分鐘，72°C下1. 5分鐘，總共20個循環， 然后在72°C下最后延伸10分鐘。步驟1第一次PCR反應包括引物1和2以及PelB模板。這得到這樣的片段，其在5’末 端包含具有EcoRI限制位點的PelB區，并且在3，末端包含PelB前導信號。在單獨的PCR反應中，引物3和4連同213Vh模板用于擴增VH213，其5’端側翼為 PelB前導信號和Vh結構域的開始并且3’端側翼是帶有ApaI位點的Ch結構域的21個核 苷酸(圖22A)。步驟2在下一個PCR反應中，引物1和4與IyL的每一PCR產物一起用于產生 EcoRI-PelB-VH213-ApaI (圖 22B)。通過剪接重疊延伸聚合酶鏈式反應方法，使用VB6-213和VB1-213輕鏈DNA質粒 作為模板和下列引物，產生SfiI-6XHis-\213-Q片段5’ SfiI-6xHis-VL-213 :5’ CTC GCG GCC CAA CCG GCC ATG GCG CATCAC CAT CAC CAT CAC TCC TAT GAG CTG ACT CAG CCA CCC(SEQ IDNO 31)3，Vl-Cl :5，GAC CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACT TAG GACGGT CAG CTT GGT CCC(SEQ ID NO 32)5，λ 恒定區5，CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTGTTC(SEQ ID NO 33)3'End-XhoI λ 恒定區5，CTC GAG TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGGGGC CAC TGT(SEQ ID NO 34)使用上面所列的所有4個引物開展兩步剪接重疊延伸PCR方法以構建和 擴增SfiI-6xHis-VL213-CLXhoL·加Λ SfiI和XhoI限制位點(粗體)以利于將 SfiI-6xHis-Vl2 13-CL-XhoI 克隆入 EcoRI-ApaI-CH-PE-PelB_SfiI-XhoI/3302 載體中。步驟1在第一次PCR反應中，引物1和2連同VB1-213輕鏈模板用于擴增 SfiI-6xHis-VL213，其5，端側翼為SfiI限制位點和6xHis并且3，端側翼為Cl結構域的前 21個核苷酸的(圖22A)。使用引物3和4連同Q模板開展第二次PCR反應并且得到在3'端包含XhoI限 制位點的λ恒定區輕鏈。步驟2在接下來的PCR反應中，引物1和4與1 μ L每一 PCR產物一起使用以產生 Sf iI-6xHis-Vl2 13-CLXhoI 片段(圖 22B)。一旦證實了序列之后，以EcoRI和ApaI限制酶消化PelB_VH213片段，并連接入以 相同的酶預消化的EcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302載體中。以連接反應轉化IOF 感受態細胞并鋪于補充有四環素的LB瓊脂板上。插入物的存在通過對質粒PelB-VH213-C
43H-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302 進行限制酶作圖加以證實。然后，SfiI-6xHis-VL213- ClXhoI
片段以SfiI和XhoI限制酶消化并連接入以相同的酶預消化的Pe 1B-VH213-CH-PE-PeIB-Sf iI-XhoI/3302 載體中，以工程化改造 VB6_213-Fab_PE(圖 24，SEQ ID NO 43 和圖 30，SEQ ID NO 50和51)。一旦通過限制酶作圖證實了正確插入物的存在，則將構建體轉化入大腸 桿菌E104細胞中，用于小規模的表達研究。VB6-213-CL-be-bouganin 的分子工程通過產生三個片段，即EcoRI-PelB-6xHis-VH213_ApaI、ApaI-Ca-PelB-SfiI 和 SfiI-VL213-CL-XhoI 片段，并將其插入至 VB6-213-CL_de-bouganin/pING3302 質粒中，工程 改造 VB6-213-Cf de-bouganin 構建體。在 VB6-213-Cf de-bonganin 恒定輕鏈中的保守 SmaI 限制位點用于亞克隆。通過前述的SOE-PCR裝配EcoRI-PelB-6xHis-VH213_ApaI，只是引物2和3被替換 以導入6xHis標簽3' PelB6xHiS-Vh213 5' GTG ATG GTG ATG GTG ATG CGC CAT GGCTGG TTG GGC AGC GAG(SEQ ID NO 35)5，PelB-V11213 :5，CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAG GTG CAG CTG TTGGAG TCT GGG(SEQ ID NO 36)使用下列引物通過一步PCR產生ApaI-C11-PelB-SfiI 5，ApaI-Ca :5’ GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC(SEQID NO 37)3’ PelB-SfiI :5’ CGC CAT GGC CGG TTG GGC CGC GAG TAA TAACAA(SEQ ID NO 38)使用下列引物利用一步PCR還產生SfiI-VL213_CL-XhoI片段5，SfiI-VL213 :5，GCG GCC CAA CCG GCC ATG GCG TCC TAT GAG CTGACT CAG CCA CCCTCA GTG(SEQ ID NO 39)3，End-XhoI λ 恒定區5，CTC GAG TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGGGGC CAC TGT (SEQ ID NO 40)一旦證實了序列，(圖 22C)SfiI-VL213-CL_XhoI 片段以 EcoRI (來自 pcR2. 1 載體) 和SmaI限制酶消化并連接至以相同的酶預消化的VB6-213-CL-de-bOuganin/3302載體中。 以連接反應轉化IOF感受態細胞并鋪于補充有四環素的LB瓊脂板上。該步驟產生3302載 體中的下列插入物 EcoRI-SfiI-VL213-CL_de-bouganin。然后 3302 載體以 EcoRI 和 SfiI 限制酶消化并且同時與EcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaI連接，并且ApaI-C11-PelB-SfΠ插入 物分別以 EcoRI/Apal 和 Apal/Sfil 消化以產生 VB6-213-CL_de-bouganin。(圖 23，SEQID NO 42 和圖 29 SEQ ID NO 48 和 49)。VB6-213-Fab-PE 和 VB6-213-CL-de_bouganin 的小規模表達VB6-213-Fab-PE/E104 和 VB6-213-CL-de_bouganin/E104 細胞的過夜培養物(1 % 接種物，OD600 = 3時)用于向250mL藥瓶中接種30mL TB培養基。培養物在37°C下培養， 并以225rpm振蕩直至達到光密度(OD6tltl)為2。然后以0. 1% L_(+)阿拉伯糖誘導表達并 且培養物在25°C下繼續培養。在誘導后16小時，通過在14，OOOrpm下離心5分鐘來分離培 養上清液和沉淀塊。16mL的VB6-213-Fab-PE和VB6-213-CL_de-bouganin上清液等分試樣 加載在非還原條件下的SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠中，并且通過分別使用兔抗PE抗體和兔抗bouganin抗體然后使用HRP偶聯的山羊抗兔抗體的Western印跡分析，以證實重組蛋白的 特性和大小。使用相同的條件還誘導帶有VB6-213-Fab-PE/3302質粒或VB6-0Il-Fab-PE 或VB6-170-CL_de-bouganin的E104細胞，并且包含可溶蛋白質的上清液用作Western印跡 上的陽性對照。見圖22D和E。VB6-213-CL-de-bouganin 的純化來自原始細胞庫的一個瓶被解凍并用于接種至2. OL錐形瓶內的補充有25mg/L四 環素的250 mL 2 X YT培養基中。該培養物在37. 0°C下培養并且以225rpm振蕩6_7小時， 以達到OD600為2. 0+/-0. 5。接著，包含13L TB培養基的15L發酵罐以的種子接種物接 種。培養物在25°C下生長，并且當達到OD6tltl 20時，以L-(+)阿拉伯糖連續脈沖引導表達。 在誘導后30小時，離心細菌培養物，收集上清液，并使用30kDa mwco膜濃縮20至30倍。 包含VB6-213的濃縮上清液對20mM NaPO4 pH 6. 9溶液滲濾。然后將樣品加載在以20mM NaPO4 pH6. 9平衡的CM-瓊脂糖柱上。用2OmM NaPO4, 25mM NaCl pH 6. 9洗滌柱，并且結合 的蛋白質用20mM NaPO4,150mM NaCl pH 7. 5洗脫。然后將CM-瓊脂糖柱洗脫物應用施加在 用水中的0. IM NiCl2預填充的鎳螯合親和柱上。然后，該柱用三次連續的緩沖液洗滌，所 述三次連續的緩沖液起初是20mM NaPO4,150mM NaCl,0. 25% triton-X100 pH 7. 5，接著是 20mM NaPO4,150mM NaCl pH7. 5，最后是 20mM NaPO4,150mM NaCl, IOmM 咪唑pH 7. 5。結合的 物質使用20mM NaPO4, 250mM咪唑，pH 7. 2從柱中洗脫。洗脫物施加至以20mMNaP04，150mM NaCl pH 7. 5平衡的SEC柱上并且收集IOmL的級分。所有級分在SDA-PAGE膠上分析并用 考馬斯藍染色。包含完整產物的級分混合在一起，并且使用centriplus濃縮器濃縮、無菌 過濾、分裝并儲存在-20°C。通過流式細胞術檢測VB6-213-CL_de-bouganin的結合人前列腺DU-145和人T細胞Daudi細胞系分別生長在根據ATCC的方案的培養基 中。在30至40%匯合時收獲細胞，生存力大于90%。DU-145和Daudi分別用作陽性和陰 性細胞系。通過流式細胞術確定VB6-213的生物學活性，并且VB1-213用作陽性對照。簡言 之，VB6-213和VB1-213與0. 45X IO6個腫瘤細胞在冰上孵育1. 5小時。在洗滌之后，分別 使用兔抗de-bouganin抗體和生物素化山羊抗人H&L鏈抗體在冰上孵育一小時來檢測細胞 表面結合的VB6-213和VB1-213。洗滌細胞并用FITC-偶聯的抗兔IgG或鏈親和素-FITC 在冰上孵育30分鐘。接著，洗滌細胞，重懸于包含碘化丙啶的PBS 5% FCS中，以通過流式 細胞術評估Fab結合。VB6-213-CL-de-bouganin 的細胞毒性VB6-213的細胞毒性通過MTS測定測量。簡言之，DU-145和Daudi細胞以每孔1000 個細胞接種并在37°C下孵育3小時。接著，等摩爾濃度的VB6-213和bouganin加入至細胞 中并且在5天之后確定細胞生存力。實施例11 血清中抗表位_肽抗體的測量抗本文所公開抗原的抗體可存在于受試者的血清/血漿中，表明本發明的一種或 一種以上抗原有表達或過表達的可能，并且因此癌細胞有存在的可能。在一個實例中，來 自受試者血清/血漿樣品通過如下面所述并根據先前描述(MTanaka等，Oncol Rep 18， 161(2007)修改的ELISA技術進行試驗，以確定受試者血清中抗肽-表位抗體的存在以及滴度。在另一個實例中，血清樣品可以通過流式細胞術，使用例如肽加載珠加以試驗。肽加載 羧化物珠可如下制備可包含本文所公開表位YSCKAQVSN(SEQ ID NO :41)、YSCKAQYSNRD (SEQ ID NO: 111)和YSCKAQVSNED(SEQ ID NO 23)的目的肽使用已知方法合成。肽溶解于二甲基亞砜 (DMSO)中，儲存在-80°C下，僅在使用前用鹽水稀釋。根據改良的制造商的說明書，將肽與 羧化物珠(xMAP ；Luminex Corporation, Austin, TX，美國)偶聯。100ml χΜΑΡ 珠用 0. IM MES緩沖液，ρΗ 7. 0洗滌，然后與100 μ 1肽(0. IM MES緩沖液中lmg/ml. pH 7. 0)混合。然 后肽加載珠與EDC(lmg/ml)于室溫黑暗條件下孵育30分鐘，然后再在相同條件下又孵育兩 次以上，并且珠用0. 05% Tween-20PBS (PBST)洗滌。最后，珠用2-氨基乙醇于室溫黑暗下 處理15分鐘，然后洗滌2次并重懸于Block Ace中的Iml 0.05% NaN3中。可以制備珠以 呈現僅一種類型(序列)的肽或者兩種或兩種以上類型的肽。例如，可以制備使用僅本發 明的僅一個肽表位或者本發明的多個肽表位的制備一批珠。同樣，對于非結合肽，可以制備 采用僅此種肽序列或數種不同非結合序列的制備珠。然后通過流式細胞術測量樣品中肽_特異性免疫球蛋白的存在水平。等分的受試 者樣品與170 μ 1的肽包被珠于室溫下在板振蕩器上的96孔濾板中孵育。在孵育之后，使 用真空多管裝置洗滌板，并且用100μ1生物素化山羊抗人IgG(Y鏈特異性的)于室溫在 板振蕩器上孵育1小時。然后洗滌板，向孔內加入100 μ 1鏈親和素-ΡΕ，并且板于室溫下在 板振蕩器上孵育40分鐘。所結合的珠洗滌三次，然后向每一孔內加入100 μ 1 PBST，然后將 板置于板振蕩器上3分鐘。使用ELISA板閱讀器以488nm的激發波長和575nm的發射波長 測量PE熒光。可選地，受試者血漿或血清樣品可以使用其上已經固定有肽的ELISA板測試。對 于用于抗體吸收測試的肽固定化ELISA板的制備，肽(SEQ ID NO :23，41和111)在包含化 學交聯劑二琥珀酰亞胺底物(Pierce)的0. IM碳酸鹽緩沖液稀釋。ELISA板以靶肽(20 μ g/ 孔)于4°C下包被過夜。孔以0.05% PEST洗滌三次。板用Block Ace于4°C封閉過夜。為 了測試抗肽IgG的特異性，100 μ 1/孔的血漿樣品(以0. 05% PBST 1 1000稀釋)用孔 內的固定化肽(20 μ g/孔)在室溫下吸收2小時。吸收重復三次，然后測量所得到的上清 液中肽特異性免疫球蛋白的水平。實施例12 包含表位的肽誘導細胞毒性T淋巴細胞的能力包含不同表位的衍生至PSCA的肽先前已經顯示是免疫原性的并且從外周血單核 細胞(PBMC)誘導細胞毒性T淋巴細胞(US2002000498075)。對應于來自野生型HnRNPG的 不同免疫原性肽的抗體已經從患有系統性紅斑狼瘡的狗中分離(Soulard等，2002)。包含表位的肽(SEQ ID NO :23、41和111)與來自健康供體的PBMC (外周血單核細 胞)用于T細胞增殖測定中。來自大約20名供體的PBMC樣品用于得到MHC II類異型的 足夠蓋度。儲存小于12小時的來自人血的血沉棕黃層從National BloodService (Addenbrooks Hospital, Cambridge,英國)得至丨J。Ficol 1-paque 從Amersham Pharmacia Biotech (Amersham，英國)得到。用于培養原代人淋巴細胞并包含L-谷氨酰 胺、50ug/ml鏈霉素、10ug/ml慶大霉素和0. 人血清白蛋白的無血清AIM V培養基來自 Gibco-BRL(Paisley，英國)。
46
通過溫和離心血沉棕黃層，將紅細胞和白細胞與血漿和血小板分離。取出上面的 相(包含血菜禾口血小板)并棄去。在鋪于 15ml ficollpaque (AmershamPharmacia7Amersham 英國)上之前，將紅細胞和白細胞在磷酸緩沖鹽(PBS)中以1 1稀釋。根據廠商推薦的 條件離心，并且從血清+PBS/ficoll paque界面收獲PBMC。PBMC與PBS(1 1)混合并通 過離心收集。取出上清液并棄去，并將PBMC沉淀塊重懸于50ml PBS中。再次通過離心沉 淀細胞并且棄去PBS上清液。使用50ml AIM V培養基重懸細胞，并且在該點使用臺盼蘭 染料排除進行計數并評價生存力。再次通過離心收集細胞并且棄去上清液。對于低溫儲 存，將細胞以3X107個細胞/ml的密度重懸。儲存培養基是90% (ν/ν)熱滅活AB人血清 (Sigma，Poole，英國)和10% (v/v)DMSO(Sigma,Poole,英國)。細胞轉移至調節的冷凍容 器(Sigma)中并放置在-70°C下過夜。當需要使用時，在轉移至IOml預溫的AIM V培養基 中之前，于37°C水浴中快速解凍細胞。制備了合成肽，例如對于表位YSCKAQVSN(SEQ ID NO :41)、YSCKAQYSNRD (SEQ ID NO: 111)和YSCKAQVSNED (SEQ ID NO 23)的那些合成肽。肽溶解于DMSO中，至IOmM的終 濃度，然后將這些母液在AIM V培養基中以1/500稀釋(終濃度為20uM)。將肽加入至平底 96孔板中，得到的終濃度為100 μ 1中1 μ M禾口 5 μ M。所解凍PBMC的生存力通過臺盼蘭染料排除進行評價，然后細胞以2 X IO6個細胞/ ml的密度重懸，并且將100 μ 1(2 X IO5個PBMC/孔)轉移至包含肽的每一孔中。對于每一 肽濃度測定三份孔培養物。板在增濕的5% CO2大氣下于37°C孵育7天。通過3H-胸腺嘧 啶核苷(3H-Thy ；Amersham-Pharmacia，Amersham，英國)摻入評價增殖。在收獲至濾墊上之 前，將細胞以IuCi3H-Thy/孔脈沖18-21小時。使用Wallac微孔板β頂板計數器(Perkin Elmer)確定CPM值。刺激指數(S. I.)計算為所摻入3H的量除以mock刺激的對照細胞中 所摻入的3H的量。實施例13 :VB1_213誘導抗體依賴性細胞介導的細毒性(ADCC)的能力通過FicolΙ-hypaque梯度離心富集PBMC，在IXPBS中洗滌并計數。兩種方法可 以用于測量細胞毒性流式細胞術和ELISA測定。簡言之，使用流式細胞術方法時，靶腫瘤 細胞DU-145與0. 2 μ M鈣黃綠素在37°C下孵育25分鐘。在洗滌一次之后，在10至100 μ g/ mL的多種濃度抗體存在下將DU-145細胞與PMBC以1 20的比率于37°C下混合3. 5小 時。碘化丙啶溶液以1 μ g/mL的終濃度加入并且使用FACSCalibur分析。以0. Triton X-100處理DU-145細胞，并且因為該處理而釋放的鈣黃綠素的量認為代表裂解的最大百分 數。細胞毒性百分數通過無鈣黃綠素靶腫瘤細胞(無綠色)和PI染色的比率除最大裂解 (triton-X處理的)而確定。對于ELISA測定，靶腫瘤細胞接種在存在與如前所述相同比率 的PBMC和抗體的96孔板內。通過ELISA對上清液中從損傷細胞釋放釋放的乳酸脫氫酶蛋 白的測量來定量抗體的細胞毒性活性。不結合DU-145的IgG 4B5用作陰性對照。實施例14 =HnRNPG的腫瘤相關表達和作為腫瘤診斷的定位野生型HnRNPG表達于細胞核中。然而，如實施例1中所述，發明人已經從腫瘤細 胞的膜級分中分離出該蛋白質的變體，并且其定位為與膜的細胞內側結合。因此，變體的這 種異常細胞定位可用作癌癥的診斷方法。本領域已知有數種方法可用于檢測HnRNPG或變 體HnRNPG的細胞定位，包括western印跡、免疫組織化學或流式細胞術。實施例15 作為癌癥指征的基因組DNA序列的檢測
編碼人哺乳動物HnRNPG蛋白的基因已經定位于染色體X q26. 3。癌相關變體的基 因序列可以使用本領域已知的基因測序技術確定，例如外顯子特異性PCR擴增或者從已知 序列的引物啟動的直接DNA測序。一旦鑒定出突變基因的序列，則基于其檢測的診斷試驗可以用于評價患者。例如， 通過將對應于野生型和突變基因兩者的有義序列和反義序列的寡核苷酸附著而制造DNA 芯片陣列。基因組DNA可以從外周全血或者腫瘤組織分離。然后使用對應于野生型序列和對應于預期突變的、并且用合適的探針(通常為發 光的)標記的引物，通過PCR擴增目的基因。然后將DNA雜交至芯片上的寡核苷酸，并且熒 光模式用熒光閱讀器確定。通過將熒光模式與已知位置的寡核苷酸序列的圖比較，可以確 定患者基因的序列是野生型還是變體。(Cooper等2004)尤其是對于p53基因中通常突變 的陣列(Affymetrix)已經是商業可得的，并且定制陣列服務也是可以得到的。實施例16VB1-213的結合與aldefluor (ALDHl)染色結合起來用于評價癌干細胞反應性。通 常，具有高ALDH染色的腫瘤細胞代表著癌干細胞級分，其能夠自我更新并且在異種移植植 入物中產生腫瘤。認為高ALDHl活性賦予對化學治療的抗性，導致產生新腫瘤和患者的隨 后復發(120，121)。雙色流式細胞術用于測量VB1-213對卵巢細胞系C-33-A和前列腺腫瘤 細胞系DU-145的ALDHl+細胞的結合。VB1-213結合至ALDH1+C-33-A和DU-145亞群，突出 了其在抗癌干細胞中的潛在實用性。試驗設計簡言之，2 X IO5個細胞與aldef Iuor試劑于37°C下孵育30分鐘。然后， 洗滌細胞并在25 μ g/mL VB1-213存在下于4°C下孵育2小時。使用生物素化山羊抗人H&L 抗體，然后使用鏈親和素Cy5，檢測結合至細胞的VB1-213。人IgG抗獨特型抗體VB1-4B5 用作陰性對照。同樣，aldefluor染色的特異性證明在DEAB存在下為反應的抑制劑。結果數據分析顯示，在C-33_A(圖33)和DU_145(圖33)中分別檢測到2.8% 和3. 1 %的癌干細胞(右下，圖33B和34B)。同樣，VB1-213結合C-33-A和DU-145細胞， 分別有90%和75%的細胞移至左上四分之一框內(圖33C和34C)。圖33D和34D顯示在 VB1-213存在下C33-A(2. 1% )和DU-145 (1. 6% )的ALDHl+癌干細胞移至右上四分之一框 內。該數據表明VB1-213結合癌干細胞級分。雖然本發明已經參照當前考慮作為優選實施例進行了描述，但是應當理解，本發 明不限于所公開的實施例。恰恰相反，本發明旨在涵蓋處于后附權利要求書精神和范圍內 的多種修改和等同排列。所有出版物、專利和專利申請以似乎各個出版物、專利、專利申請明確且個別標明 其全文通過引用并入本文的相同程度以其全文通過引用并入本文。表1:CDR 序列
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權利要求
分離的互補決定區(CDR)，選自包含SEQ ID NO7氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 1或其變體；包含SEQ ID NO8氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 2或其變體；包含SEQ ID NO9氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 3或其變體；包含SEQ ID NO10氨基酸序列的分離的重鏈CDR 1或其變體；包含SEQ ID NO11氨基酸序列的分離的重鏈CDR 2或其變體；包含SEQ ID NO12氨基酸序列的分離的重鏈CDR 3或其變體。
2.編碼權利要求1互補決定區的分離的核酸序列。
3.分離的可變區，選自包含SEQ ID NO :7、8和/或9的輕鏈互補決定區的分離的輕鏈可變區或其變體，和包 含SEQ ID NO =IOUl和/或12的重鏈互補決定區的分離的重鏈可變區或其變體。
4.根據權利要求3的可變區，其中分離的輕鏈可變區包含SEQID N0:16的氨基酸序 列或其變體。
5.根據權利要求3的可變區，其中分離的重鏈可變區包含SEQID N0:14的氨基酸序 列或其變體。
6.編碼權利要求3的可變區的分離的核酸序列。
7.權利要求6的核酸序列，包含SEQID NO :15的輕鏈可變區，或其變體。
8.權利要求6的核酸序列，包含SEQID NO :13的重鏈可變區，或其變體。
9.包含權利要求3至5的一種或一種以上可變區的結合蛋白。
10.根據權利要求9的結合蛋白，包含含有通過SEQID N0:7、8和/或9所定義氨基 酸序列的輕鏈互補決定區和含有通過SEQ ID N0:10、ll和/或12所定義氨基酸序列的重 鏈互補決定區，或其變體。
11.權利要求9的結合蛋白，包含SEQID NO 16的輕鏈可變區，或其變體。
12.權利要求9的結合蛋白，包含SEQID NO 14的重鏈可變區，或其變體。
13.權利要求9的結合蛋白，包含SEQID NO 16的輕鏈可變區和SEQ IDNO :14的重鏈 可變區，或其變體。
14.權利要求9至13任一項的結合蛋白，其中結合蛋白結合至前列腺干細胞抗原(SEQ ID NO 17)、變體HnRNPG、具有SEQ ID NO :71的氨基酸序列的變體HnRNPG、具有在第216、 218、219和/或222位帶有一個或一個以上氨基酸取代的SEQ ID NO 113的氨基酸序列的 變體 HnRNPG、或者包含 SEQ IDNO 23、SEQ ID NO :41、SEQ ID N0:111 或 SEQ ID N0:112 的氨基酸序列的多肽。
15.權利要求14的結合蛋白，其中結合蛋白對包含SEQID NO :23、SEQ IDNO :41、SEQ ID NO 111或SEQ ID NO 112的氨基酸序列的多肽是特異性的。
16.能夠結合癌細胞上或者癌細胞內抗原的結合蛋白，其中結合蛋白可以通過競爭結 合測定進行鑒定，包含(1)根據權利要求9至15中任一項的結合蛋白，優選抗體或抗體片段(Abl)；和(2)包含SEQID NO :17、71、23、41、111或112的氨基酸序列的抗原或表位；其中一種或一種以上濃度的測試結合蛋白被測試其與Abl競爭結合所述抗原或表位 的能力。
17.權利要求9至16任一項的結合蛋白，其中結合蛋白是抗體。
18.權利要求17的結合蛋白，其中抗體是抗體片段。
19.權利要求18的結合蛋白，其中抗體片段是Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、 ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、或其多聚體或者雙特異性的抗體片段。
20.分離的核酸序列，其編碼根據權利要求9至19任一項的結合蛋白。
21.組合物，包含根據權利要求9至19任一項的結合蛋白和可藥用賦形劑、載體、緩沖 液或穩定劑。
22.免疫連接物，包含(1)結合至癌細胞上抗原的根據權利要求9至19中任一項的結 合蛋白，其附著至(2)癌癥治療劑。
23.權利要求22的免疫連接物，其中癌癥治療劑是細胞毒素。
24.權利要求23的免疫連接物，其中細胞毒素是核糖體滅活多肽。
25.根據權利要求23的免疫連接物，其中細胞毒素選自白樹毒蛋白、bouganin、肥皂草 毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈、異株瀉根毒蛋白、白喉、局限曲菌素和假單胞菌屬外 毒素A或其變體。
26.權利要求23的免疫連接物，其中細胞毒素是修飾的bouganin或其變體。
27.權利要求23的免疫連接物，其中細胞毒素是由氨基酸252-608組成的截短形式的 假單胞菌屬外毒素A或其變體。
28.根據權利要求22至27任一項的免疫連接物，其中免疫毒素被所述癌細胞內化。
29.根據權利要求22的免疫連接物，包含SEQID NO 49的氨基酸序列。
30.根據權利要求21的免疫連接物，包含SEQID NO 51的氨基酸序列。
31.分離的核酸序列，編碼根據權利要求22至30任一項的免疫連接物。
32.根據權利要求31的分離的核酸序列，包含SEQID NO 48的核酸序列。
33.根據權利要求31的分離的核酸序列，包含SEQID NO 50的核酸序列。
34.組合物，包含根據權利要求22至30任一項的免疫連接物以及可藥用賦形劑、載體、 緩沖液或穩定劑。
35.有效量的根據權利要求22至30任一項的免疫連接物在治療或預防癌癥中的用途。
36.根據權利要求35的用途，還包括一種或一種以上另外的癌癥治療劑在制造同時、 分開或相繼治療或預防癌癥的藥物中的用途。
37.用于治療或預防癌癥的試劑盒，包含有效量的權利要求22至30任一項的免疫連接 物，和其用于治療或預防癌癥的使用說明。
38.檢測或監測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)將從所述受試者取得的測試樣品與權利要求9至19任一項的并且特異性結合癌細 胞上或癌細胞內抗原的結合蛋白接觸，以產生結合蛋白-抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白-抗原復合物的量；和(3)比較測試樣品和對照中結合蛋白-抗原復合物的量。
39.用于診斷癌癥的試劑盒，包含結合癌細胞上或癌細胞內抗原的權利要求9至19的 任一種結合蛋白，和其使用說明書。
40.診斷試劑，包含(1)結合癌細胞上或者癌細胞內抗原的根據權利要求9至19任一 項的結合蛋白，其附著至(2)直接或間接產生可檢測信號的標記。
41.權利要求60的診斷試劑，其中標記是放射性同位素、熒光化合物、化學發光化合 物、酶、顯影劑或金屬離子。
42.試劑盒，包含權利要求40或41的診斷試劑和其使用說明書。
43.重組表達載體，包含權利要求2、6、7、8、20、31、32或33任一項的核酸分子。
44.宿主細胞，包含權利要求43的重組表達載體。
45.分離的多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :41、SEQID NO 111、SEQ ID N0:112、第216、218、219和/或222位帶有一個或一個以上氨基酸取代的SEQ ID NO: 113、或 SEQ ID N0:71，或其變體。
46.分離的多肽，由氨基酸序列SEQ ID NO 23, SEQ ID N0:41、SEQ IDNO =IlUSEQ ID N0:112、第216、218、219和/或222位帶有一個或一個以上氨基酸取代的SEQ ID N0:113、 或SEQ ID NO 71或其變體組成。
47.分離的核酸序列，編碼權利要求45或46的分離的多肽。
48.重組表達載體，包含權利要求47的核酸序列。
49.檢測或監測患有或者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括檢測樣品中細胞 上或細胞內根據權利要求45或46的分離的多肽，其中如果在細胞上或者細胞內檢測到所 述分離的多肽，則表明具有癌癥。
50.藥物組合物，包含有效量的根據權利要求45或46的分離的多肽或其片段、權利要 求47的分離的核酸序列或權利要求48的重組表達載體和與其混合的適宜稀釋劑或載體。
51.權利要求50的藥物組合物，還包含佐劑。
52.根據權利要求50或51的組合物在治療或預防癌癥或者引起受試者中免疫反應中 的用途。
全文摘要
本申請提供癌特異性抗體重鏈和輕鏈互補決定區的氨基酸和核酸序列，所述癌特異性抗體針對變體不均一性核糖核蛋白G(HnRNPG)的表位。此外，本申請提供癌特異性抗體和包含附著至毒素或標記的癌特異性抗體的免疫連接物，及其方法和用途。本申請還涉及使用本文所公開癌特異性抗體的診斷方法和試劑盒。此外，本申請提供變體HnRNPG的新的癌相關表位和抗原，及其用途。
文檔編號A61K47/48GK101970498SQ200880122991
公開日2011年2月9日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年10月25日
發明者吉恩尼克·西茲爾尤, 弗蘭西娜·C·查海爾 申請人:維文蒂阿生物技術公司