專利名稱：皮膚免疫用方法和組合物的制作方法
皮膚免疫用方法和組合物本發明涉及通過皮膚途徑遞送疫苗的方法和系統的開發。本發明更特別地涉及包 含用于表皮(epicutaneou)接種的冷凝隔室的裝置的應用。本發明還涉及可以在無需任何 皮膚處理的條件下即獲得有效的免疫應答的表皮接種方案。本發明還可用于任何哺乳動物 中，優選用于人類，以誘導抗任何類型的抗原的治療性或預防性免疫應答。大多數病原體通過粘膜或皮膚進入體內。皮膚，如粘膜，因此具有發覺病原體 和自身防護所需的所有工具。這道防線特別地包括一支專職性的、駐留的抗原遞呈細胞 (Langerhans cells，APCs)隊伍。在正常情況下存在于表皮中的唯一的APCs是郎格罕氏 細胞(LC)，其是來自骨髓的樹突狀細胞(DC)。在捕捉抗原后，活化的LCs移動到引流淋巴 結中，在那里它們啟動強大的全身免疫應答。因此，對于通過傳統注射給藥途徑來開發更有 效的疫苗而言，皮膚代表了潛在的替代方法。另外，皮膚免疫系統還可以是用于誘導在不同 病變諸如自身免疫疾病、過敏性和可能還有癌癥中的耐受性的理想靶標。然而，角質層(SC)，即皮膚的最頂層，是對抗流體、大分子(多肽和蛋白質)、或粒 子乃至微生物進入的有效的物化屏障。已經測試了許多技術以致力于經由表皮途徑、即通 過向皮膚施用抗原獲得有效的免疫應答。這些技術全部都涉及角質層的物理破壞，例如，輕 度或中度磨損(在敷用膠條或使用砂紙后)，通過應用超聲或微針。這些不同的技術在或 大或小的程度上都表現出作為抗原施用前的先行步驟的效力，用于促進抗原進入包含免疫 細胞的皮膚表層(表皮)，和誘導免疫應答。例如，已顯示向先前已經過磨損的皮膚共同施 加抗原和佐劑諸如霍亂毒素(CT)或大腸桿菌的不穩定毒素(LT)有效產生免疫抗體應答 (Glenn GM，Rao M，Matyas GR,Alving CR. Skin immunization madepossible by cholera toxin. Nature. 1998. 391 :851 ；Glenn GM, Scharton-Kersten T，Vassell R，Matyas GR, Alving CR. Transcutaneousimmunization with bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens andadjuvants. Infect Immun. 1999. 67 1100-6.)。另一方面，在施力口抗原之 前皮膚僅僅水合，無論是否隨后進行封閉性處理，都決不引起特異性抗體應答。其僅能在皮 膚先前經處理，導致角質層的物理擾動，或者如果抗原與強力的佐劑(CT或LT)共同給藥下 獲得。其它工作后來顯示出，使用封閉系統將疫苗制劑保持就位，以液體形式在動物皮 膚上沉積1-24小時的時段，使得只有在皮膚處理后方可在動物或在人中誘導免疫應答。然 而，使用0-24小時的接觸時間誘導的應答，在質和/或量上沒有變化。在WO 2004/03069申請中，其設想了借助于包含抗原和免疫刺激化合物的干形式 的組合物，使用PosIntro或ISCOM系統誘導免疫應答。在國際申請WO 2007/122226中還提議使用皮膚貼片以獲得免疫應答。然而，該文 獻中所述的方法采用佐劑。因此，如果沒有任何先行的物理或物化處理(砂紙，乙醇，丙酮，膠條，甘油)或使 用強力的佐劑(LT或CT)或其它促進性賦形劑的話，不能檢測到抗原特異性抗體應答。本發明首次描述了能夠通過皮膚途徑誘導抗原特異性免疫應答而無需使用佐劑 (CT或LT)或預處理或穿刺皮膚的方法。更具體地說，本發明描述了即使在缺乏任何佐劑下
4也是有效的表皮接種方法，該方法基于在允許形成冷凝隔室的條件下被施用于皮膚的干疫 苗制劑的應用。本發明表明了產生和維持皮膚水合導致SC擾動，允許抗原通過。另外，水 積聚在遞送系統下，允許了干疫苗制劑再水合和溶解并開始與接觸皮膚。我們在臨床前試 驗中已顯示了，與目前為止所述的不同的皮膚系統相反，本發明允許在沒有共同給藥任何 佐劑(CT或LT類型)和無任何皮膚準備(磨損或穿刺)的條件下，誘導免疫原特異性抗體 應答。在特別值得注意的方式中，本發明能夠在無任何積極處理的條件下進行大分子(主 要是多肽和蛋白質)的皮膚轉運，這是現有技術所從未描述過的。如實施例中所闡述的，在 使用本發明的方法三次施用疫苗之后，觀察到特別強的免疫應答。因此，本發明的一個目的在于疫苗制劑在制備哺乳動物、優選人的表皮接種用組 合物中的應用，特征在于所述疫苗制劑為干形式并且不含任何佐劑，以及特征在于所述疫 苗制劑借助于在接觸皮膚時形成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室的皮膚裝置而被施用于哺 乳動物的皮膚上進行給藥。本發明的另一個目的在于皮膚給藥裝置在制備計劃用于在沒有任何先前皮膚處 理或沒有任何佐劑的共同給藥的條件下將包含抗原的疫苗制劑進行給藥的組合物中的應 用，所述皮膚給藥裝置包含干形式的疫苗制劑并且不含佐劑化合物，并且在接觸皮膚時形 成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室，從而允許在沒有任何佐劑或先前皮膚處理的條件下所述 抗原進入表皮并誘導免疫應答。本發明的另一個目的在于在沒有任何的先前皮膚處理或佐劑的共同給藥的條件 下將包含抗原的疫苗制劑進行給藥的皮膚給藥裝置的應用，所述皮膚給藥裝置包含干形式 的疫苗制劑并且不含佐劑化合物，并且在接觸皮膚時形成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室， 從而允許在沒有佐劑或任何先前皮膚處理的條件下所述抗原進入表皮并誘導免疫應答。本發明的另一個目的在于在哺乳動物中誘導抗原特異性免疫應答的方法，該方法 包括，在無任何的先前皮膚處理的條件下，對所述哺乳動物的皮膚施用包含干形式的疫苗 制劑的皮膚給藥裝置，該疫苗制劑包含抗原但不含任何的佐劑化合物，所述裝置接觸皮膚 時形成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室，施用時間足以允許所述抗原在無佐劑或先前皮膚處 理的條件下進入表皮并誘導免疫應答。本發明的另一個目的在于通過皮膚途徑誘導抗原特異性免疫應答的方法，該方法 包括產生和維持局部的皮膚水合并使所述水合的皮膚接觸不含佐劑的干疫苗制劑歷時足 夠使抗原進入并誘導免疫應答的時間。本發明的另一個目的涉及在對象中誘導抗蛋白質抗原的全身免疫應答的方法，該 方法包括借助于皮膚裝置經表皮途徑對所述對象給藥所述抗原，所述皮膚裝置包括背襯， 所述背襯的周邊部分適于與皮膚形成密封室，其中所述背襯保持所述抗原位于所述背襯在 所述室內與皮膚接觸的面上，在所述裝置施用于所述皮膚上之后，所述抗原從所述背襯上 移去，然后經由表皮途徑被遞送至對象，所述給藥導致在對象中誘導全身免疫應答。在一個具體的實施方案中，所述皮膚裝置的背襯的周邊部分對濕皮膚具有粘附性 質。在本發明的另一個實施方案中，在借助于皮膚裝置給藥抗原之后誘導的全身免疫 應答包括體液應答。在一個優選實施方案中，在將所述皮膚裝置施用于皮膚之后在所述室內形成濃縮物，所述濃縮物引起或增加所述抗原的動作和表皮遞送。特別地，該濃縮物可以通過出汗形 成。本發明的另一個目的涉及在對象中誘導抗蛋白質抗原的全身免疫應答的方法，其 中所述抗原為干形式或粒子形式。更特別地，所述抗原可以無需粘合劑地借助于靜電力和 /或范德華力附著于載體，或借助于載體上的粘合涂層附著于載體。所述抗原優選可以借助于噴霧法/干燥法被施加于載體。所述抗原還可被溶解或 分散在液體中，在這種情況下，其被保持在所述載體上的吸附材料儲庫中。本發明的另一個目的涉及干形式的疫苗制劑在制備用于在哺乳動物中誘導免疫 應答的醫藥產品中的應用，特征在于所述疫苗制劑在沒有任何佐劑化合物的條件下借助于 皮膚裝置被施用于哺乳動物的未經處理的皮膚上，歷時約48小時。本發明的另一個目的涉及干形式的疫苗制劑在哺乳動物中誘導免疫應答的應用， 特征在于所述疫苗制劑在沒有佐劑化合物的條件下借助于皮膚裝置被施用于哺乳動物的 未經處理的皮膚上，歷時約48小時。本發明的另一個目的涉及在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，該方法包括借助于 不含佐劑化合物的皮膚裝置向哺乳動物的未經處理的皮膚施用干形式的疫苗制劑，歷時約 48小時。本發明的另一個目的涉及皮膚裝置，其包括背襯，所述背襯的周邊部分適于與皮 膚形成密封室，其中所述背襯保持所述抗原位于所述背襯在所述室內接觸皮膚的面上，在 所述裝置施用于皮膚之后，所述抗原從所述背襯被移去，然后經由表皮途徑被遞送至對象。本發明的另一個目的涉及疫苗組合物，特征在于所述疫苗組合物包括皮膚給藥裝 置，該皮膚給藥裝置在施用于對象的皮膚上之后形成冷凝隔室，所述隔室包含不含任何佐 劑化合物的干形式的疫苗制劑。本發明由這樣的意想不到的發現得出，即可以在完好無損的皮膚上(即，未經先 前穿刺或物理和/或化學磨損)和在不使用佐劑的條件下經由皮膚途徑誘導免疫應答。使 用干形式的疫苗制劑并借助于當接觸皮膚時和/或歷時適合的時段形成冷凝隔室的裝置 施用該疫苗制劑，獲得了這一效果。不受任何特定作用機理的約束，提出了皮膚的水合允許角質層的角化細胞發生溶 脹以及水分子在細胞間隙的脂質區域之間結合。這一水合還將誘導皮膚穩態的紊亂，尤其 導致產生的細胞因子在形態學方面的特性的改變，以及郎格罕氏細胞的表型改變或表皮單 核細胞數目的增加。盡管存在皮膚的屏障作用，但在生理條件下，在身體和大氣之間，通過皮膚建立了 水朝向大氣的流動。這一流動已知屬于所謂的不顯性水丟失(Insensible Water Loss, IWL)。本發明的方法使用冷凝隔室，有助于使一部分皮膚與周圍介質隔離。在該現象期間， 在身體和大氣之間的水蒸汽交換被干擾，這將導致水累積在所述隔室中以及整個表皮、特 別是形成抗物質吸收的主要屏障的角質層的皮膚水合增加。我們的結果表明，在人類中，在 除去冷凝隔室之后測量到的非常強的水流動反映了在所述皮膚表面上積聚的水的蒸發。所 述裝置的冷凝隔室隨著時間導致所述隔室體積的水蒸汽飽和(來自IWL)，然后導致冷凝， 達到平衡狀態。在施用開始時，該體積因其包含環境氣體，未被水蒸汽所飽和。一旦達到氣 氛的飽和，水蒸氣狀態的水則冷凝成液態水形式。這一冷凝可由來自皮膚的殘余水的流動提供。在這些條件下，達到平衡狀態，這導致水累積在所述不透水裝置的下方(參見圖1B)。本發明因此通過提供這樣一種方法可解決現有表皮接種方法的缺點，S卩，該方法 可使用任何類型的抗原、與即用型(ready-to-use)裝置的生產相容并且不要求任何的皮 膚處理。在表皮中被誘導的強水合，水在角質層內和表面上的累積，使得有可能在水的存在 下調節疫苗分子和皮膚之間的分配系數，使角化細胞溶脹，以及破壞細胞間脂質相的組織。 這一調節使得活性成分溶解在皮膚表面上存在的液體中并透皮進入(經由被動擴散)，而 無需對皮膚進行穿刺或磨損。本發明可以采用任何的形成冷凝隔室的皮膚給藥裝置來實施。其優選是貼片或敷 料類型的裝置，優選貼片。本發明的裝置一般是采用被動擴散的皮膚類型，即，其不包含使 皮膚穿孔或磨損的機構。封閉貼片類型的裝置，諸如使用專利申請WO 02/071950中所述的 VIASKINe技術生產的靜電貼片，是有利的。在本發明的意義中，術語“隔室”是指在將裝置施用于皮膚上之后在皮膚和所述裝 置的背襯之間留下的空間，所述背襯不粘附于皮膚，從而留下用于在皮膚上積聚少量水的 空間(例如，參見圖IA和1B)。所獲得的結果表明了冷凝隔室在施用時期，由于皮膚在所述 隔室的方向中天然傳遞液體所致，維持了一定程度的水合，使用所述冷凝隔室允許大分子 抗原通過和誘導特異性應答。這些結果就現有技術數據而言特別令人意外，現有技術數據 強調需要求助于特定的佐劑和處理皮膚以獲得滿意的應答。在一個優選實施方案中，所述裝置是這樣的，其與皮膚接觸形成體積為1到 300mm3/平方厘米裝置表面的冷凝隔室。所述體積對應于約0. Olmm到3mm的隔室高度。在 一個優選實施方案中，對應于約0. 02到Imm的高度，所述隔室的體積為2到200mm7cm2裝 置表面，或更優選2到100mm7cm2裝置表面。所述裝置在皮膚上的布及表面可由本領域技 術人員調節，并且通常為約0. 2到5cm2，更通常為0. 5到3cm2。冷凝隔室的壁(所述裝置的背襯)不必完全是不可滲透的。反而，在常溫和常壓 的條件下一定程度的水蒸汽滲透性是可接受的，聚乙烯就是這樣，條件是這種蒸發不阻止 所述隔室內通過存在的液態水對飽和水蒸汽氣氛的維持。在一個具體實施方案中，所述冷凝隔室的壁包含滲透率小于15g/m2/24h，優選小 于10g/m2/24h，例如約9g/m2/24h左右的材料。所述材料可以選自例如聚合物，共聚物，塑料，陶瓷，任何生物相容的材料(如石 墨)等等。生物相容的聚合物的實例特別是聚乙烯(PE)，聚碳酸酯，聚酯(PET)，纖維素塑料 (CA，CP)，聚氯乙烯(PVC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚氨酯(PUR)，有機硅(PTFE)或聚偏 二氟乙烯(PVDF)。生物相容的共聚物的一個實例特別是乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)。具有與本發明相容的濕氣透過率(MVTRs)的聚合物的實例，可特別提及的有 CoTran 9706 (MVTR = 26. 4g/m2/24h)，CoTran 9720 (MVTR = 9. 4g/m2/24h)禾Π CoTran 9722 (MVTR = 7. 9g/m2/24h)。在一個優選實施方案中，所述冷凝隔室由例如基本上圓形(所述背襯)且直徑約2 到100mm、優選約5到70mm的聚乙烯聚合物圓盤形成，其被固定在(例如，膠粘在)例如聚 乙烯的生物相容材料環上，該環具有與所述圓盤的外徑基本上相同的外徑并且內徑為1到 50mm，優選約2到20mm。所述圓盤和所述環的厚度為例如約0. 01到2mm，其限定了 0. 01到 2mm的隔室高度，所述隔室的體積雖小但決不為零，即便是所述背襯在某些點的撓性限定了其與皮膚的接觸。所述圓盤可通過任何合適的方法被固定在所述環上。一般地，所述環具 有粘附性或被制成粘性以使其粘著于所述圓盤。如圖IA所示，本發明裝置的一種具體樣式的組成如下-根據所述冷凝隔室體積/平方厘米表面的不同而異，具有可變直徑和約0.01到 2mm高度的生物相容材料的環[1]。在如圖IA所示的實施方案中，所述環至少在其外面具 有準備與皮膚接觸的粘附性；_生物相容材料的圓盤[2]，其擔當所述隔室的頂(包含干形式的活性成分)，附 著于所述環(例如借助于粘合劑)。所述圓盤表面的直徑一般為至少5mm。所述圓盤(背 襯)的MVTR(濕氣透過率)優選小于lOg/m2/^^。_保護所述環的粘合表面的剝離襯里[3]，其將在施用于皮膚上前被剝去。該襯里 有利地是圓盤，覆蓋所述隔室從而使得在施用所述裝置之前所述隔室是密封的。由所述裝置形成的隔室是具有水合性質的冷凝隔室。水合性質產生這樣的能力， 即作用于位于所述裝置的冷凝隔室下面的整個表皮，有利地從施用于皮膚上正好第一個小 時開始，引起表皮水合率增加30% 100%，更精確地增加50%到70%。優選地，所述冷凝 隔室的水合性質必須使得在所述表皮的外表面上以及在所述裝置的冷凝隔室內，其從施用 的第一個小時開始可以引起水的相對量增加40%到100%以上，并且進一步優選增加超過 50%。在一個優選實施方案中，所述裝置通過確保所述冷凝隔室不透水的機構被保持于 皮膚上。任何粘合機構可用于這一目的，包括具有強粘合性質的膠、聚合物或塑料類型的材 料。本發明的優點是允許在即使完好無損的皮膚上進行接種，S卩，所述皮膚先前未經 歷任何特殊處理。在本發明的意義下，“皮膚的處理”是指任何磨損或穿刺處理，導致皮膚的 至少表面層的至少部分破壞。另外，本發明的另一個優點是即使沒有佐劑的共同給藥也可獲得主要的免疫應 答。在本發明的意義下，術語“佐劑”是指任何對皮膚具有物化和/或生物作用、促進抗原進 入皮膚、并且其增加對抗原的免疫應答的化合物。通過物化和/或生物作用，諸如本文定義 的所述佐劑是通過擾動角質層而使表皮滲透性變差的化合物，從而使得抗原能夠通過所述 表皮并接觸表皮的免疫活性細胞。佐劑化合物的實例特別是霍亂毒素(CT)或LT毒素(大 腸桿菌(E-coli)的不耐熱毒素)。其它實例是由Paul等人描述的傳遞體(transfersomes) (Paul A， Cevc G， Bachhawat BK.Transdermal immunization with large proteins byultradeformable drug carriers. Eur J Immunol. 1995, 25 (12) :3521_4)，其使得抗原會巨 夠轉運進入膜。本發明可以采用任何干形式的疫苗制劑實施。術語“疫苗制劑”是指任何包含抗 原成分的制劑。其一般是包含一種或多種例如肽、多肽(或蛋白質)、脂質和/或糖類類型 或這些化合物的簡單混合物或化學結合物的的抗原的制劑。一種優選的疫苗制劑包含一種 或多種抗原分子；分子量超過500Da的分子，最通常是超過1，500Da并具有預防性或治療 性疫苗活性或意圖的多肽和蛋白質，或分子量超過500Da并計劃用于局部(治療性)作用 于表皮的分子。一般地，所述疫苗制劑包含肽或多肽類型的至少一種抗原。例如，其可以 是細菌抗原，病毒抗原，腫瘤抗原等，諸如流感病毒的抗原，肝炎病毒(/或丙型肝炎)的抗原，流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenzae)的抗原，呼吸道合胞病毒的抗原，沙門氏菌 (Salmonella)(志賀氏菌(Shigella))的抗原，或肺結核(Tiphy)的抗原，或自身免疫疾病、 癌、阿爾茨海默氏病、過敏癥等等的特征性抗原。所述疫苗制劑還可包含適于藥學應用的賦 形劑或介質，或任何具有免疫調節活性的化合物諸如細胞因子，Toll受體的配體化合物等寸。所述疫苗制劑以“干形式”使用，S卩，以脫水形式，特別是以粉末、顆粒、團塊、餅、干 燥形式等施用。所述干形式可以通過冷凍干燥或由簡單蒸發而獲得。在一個具體實施方案中，所述疫苗制劑為粉末形式。在另一個具體實施方案中，所述疫苗制劑被保持在所述裝置的表面上，一般被保 持在所述隔室的背襯上，如果在該表面上沒有粘合材料時，通過化學力或物化力保持。所述 疫苗制劑優選通過靜電力或通過范德華力被保持在所述裝置的表面上，一般被保持在所述 隔室的背襯上。在一個正常的實施方案中，所述裝置包含0. 1μ g/cm2到500μ g/cm2、優選20μ g到 300 μ g/cm2、進一步優選20 μ g到100 μ g/cm2的疫苗制劑量。要理解，該量可由本領域技術 人員相對于目的、病變、治療持續時間、對象等等進行調整。本發明使得能夠誘導重要的免疫應答，即使是在沒有佐劑和皮膚處理的條件下。 本發明可被用于抗任何類型的病原體(病毒、寄生蟲、細菌、蛋白質等等)、抗腫瘤細胞或抗 自體抗原的預防性或治療性接種，或用于治療過敏性個體。給出的結果顯示了抗原特異性 應答的誘導，特別是IgG類型抗體的應答。免疫應答的幅度可以通過改變所述裝置的施用時間和/或通過進行反復施用進 行調適。如實施例所示的，在三次施用疫苗歷時僅6小時后誘導的免疫應答，與施用時間為 24小時所觀察到的免疫應答相等(實施例2)。我們已顯示，例如，保持約6小時到24小時 時段的水合足以形成免疫應答，即使沒有先前的皮膚處理和沒有佐劑的共同給藥。另外，我們還將施用時段延長到48小時和72小時(實施例5)。獲得的結果顯示 出，48小時時間給出了令人驚訝的結果，因為抗體特異性應答與24小時的施用時間相比增 加了幾乎一個量級。繼續施用超過48小時，例如72小時的施用時間，不再出現進一步促進 所述抗體應答的增加。在一個優選實施方案中，本發明包括對對象連續施用至少兩個裝置、優選至少三 個裝置，每次施用間隔約7到30天，優選間隔10到20天，一般間隔約15天。對于每次施用，優選所述裝置被保持在皮膚上歷時約6到72小時、優選約6到48 小時、更優選約48小時的時段。一個特別優選的誘導免疫應答的方案包括至少三次連續施用裝置歷時約48小 時，每次施用間隔約15天。在上文中，表述“約”是指與給定值相比有士 10%的變化。本發明還表明，當所述疫苗制劑是干形式并且被施用歷時一個或多個約48小時 的時段、優選反復施用約48小時的時段時，通過在完好無損的皮膚上表皮接種獲得了主要 抗體應答。本發明可用于在任何哺乳動物中進行抗任何抗原的接種。其可用在兒童或成人中 并且基本上是無創的，且不要求使用佐劑。
本發明的其它方面和優點將通過閱讀以下的實施例而變得顯而易見，所述實施例 被視為是示例性的而非限制性的。
圖1 :A-具有冷凝隔室的皮膚裝置的示意圖[1]生物相容材料環[2]通過雙面粘 合劑粘附于所述圓盤上的“背襯”圓盤，[3]在施用之前被剝離并保護粘合劑的剝離襯里。 B-在冷凝隔室內的水蒸汽流動示意圖。圖2 使用包括冷凝隔室的裝置，在沒有佐劑的共同給藥的條件下，在完好無損的 皮膚上經由表皮途徑誘導抗原特異性抗體免疫應答。圖3 包括冷凝隔室的裝置在施用于皮膚上6小時或24小時后，經由表皮途徑誘 導抗卵清蛋白抗體免疫應答。圖4 進入所述隔室的水蒸汽的量與冷凝水的量之間的比率作為時間的函數■ 在所述隔室內積聚的水量，和 在所述隔室內冷凝的水量。O在20小時之后在水蒸氣狀態下的水量。20小時之后冷凝的水蒸氣的量。圖5 相對于包含冷凝隔室的裝置的施用時間，表皮的不同層(上層表皮、上層和 中層表皮、整個表皮)的水合百分率的增加。圖6 相對于包括冷凝隔室的裝置的施用時間，在皮膚表面上積聚的水量的增加。圖7 通過延長具有冷凝隔室的裝置的皮膚施用時間，通過表皮途徑誘導的抗卵 清蛋白抗體免疫應答的增強。圖8 在沒有任何佐劑或任何皮膚穿刺或磨損處理的條件下，通過與貼片類型的 系統相比較，經由表皮途徑誘導的強大的免疫原特異性抗體免疫應答。圖9 在沒有任何佐劑的條件下，采用低劑量的抗原，經由表皮途徑誘導的抗TT抗 體免疫應答。圖10 與破壞皮膚穩態有關的表皮的誘導變厚，其與具有冷凝隔室的裝置的皮膚 施用時間的延長成比例。圖11 誘導抗原進入皮膚以及其由樹突狀細胞進行的處理，其與具有冷凝隔室的 裝置的皮膚施用時間的延長成比例。圖12 表皮郎格罕氏細胞網絡中所誘導的變化，與這些細胞的活化有關，其與具 有冷凝隔室的裝置的皮膚施用時間的延長成比例。圖13 在將具有含腫瘤抗原的冷凝隔室的裝置施用于皮膚24小時之后，誘導產生 對腫瘤抗原特異的抗體，能夠在體外靶定表達該抗原的細胞。圖14 在將具有含RSV抗原的冷凝隔室的裝置施用于皮膚48小時之后，在幼年小 鼠中誘導的抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的部分防護。實施例實施例1包括冷凝隔室的皮膚裝置的制備使用涂有泡沫環從而賦予隔室以所需高度的聚乙烯薄膜(3M)作為背襯，環的兩 面制成粘合性，制備具有冷凝隔室的皮膚施用裝置(厚度=0.7mm)。該裝置因此具有在Icm2皮膚上的布及面積和用于空氣擴散通過皮膚的70mm3的擴張隔室(參見圖1A)。采用了幾種具有不同濕氣透過率(MVTRs)的聚合物，特別是COTran 9706(MVTR =26. 4g/m2/24h)，CoTran 9720 (MVTR = 9. 4g/m2/24h)和 CoTran 9722 (MVTR = 7. 9g/ m2/24h)。實施例2在沒有任何佐劑化合物，也沒有任何穿刺或磨損皮膚處理的條件下，經由表皮途 徑誘導抗原特異性抗體免疫應答。根據實施例1制備了包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的卵 清蛋白模型抗原(OVA)，破傷風毒素(TT)，腫瘤抗原或市售的抗流行性感冒疫苗的IOmm3/ cm2體積，將所述裝置施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6_10)的后背24小時，小鼠后背在施用 前一天經過剃毛和脫毛。在首次施用之后第2和4周重新施用。通過對最后一次施用之后 2周取樣的動物血清進行ELISA，檢測抗-抗原總IgG類型抗體。圖2給出的結果用抗原特 異性抗體滴度表示。對于每只動物的血清，其是在450nm測量的吸光度等于對未試驗過的 小鼠的血清測定截止值時的稀釋度的倒數。獲得的結果顯示了即使不使用佐劑，所誘導的 強抗原特異性免疫應答。實施例3在沒有佐劑化合物的條件下，在施用于完好無損的皮膚6或24小時之后，經由表 皮途徑誘導抗卵清蛋白抗體免疫應答。根據實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 OVAdOO μ g)的IOmmVcm2體積，將所述裝置施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背6或 24小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。在首次施用之后2和4周重新施用。對 最后一次施用之后2周取樣的動物血清使用ELISA，檢測抗-抗原總IgG類型抗體。圖3中 示出的結果表示為抗原特異性抗體滴度。對于每只動物的血清，其是在450nm測量的吸光 度等于在未試驗過的小鼠血清上測定的截止值時的稀釋度的倒數。獲得結果的顯示了施用 時間為6或24小時誘導強的抗原特異性免疫應答。實施例4研究在冷凝隔室中可獲得的水的量和物理狀態。皮膚允許生理量的水蒸氣蒸發。該蒸發表示為不顯性水丟失-IWL。其引起在冷 凝隔室內的水蒸汽的量增加。水蒸氣量的增加又引起在隔室內部的水蒸氣分壓增加。從在 35°C下的53. 75毫巴的壓力開始，隔室處于飽和狀況。超過這一壓力，水蒸氣冷凝成液態 水，其沉積到皮膚的表面上并能夠填充冷凝隔室。另外，在冷凝隔室的組合物中，在該實施 例中所用的背襯的聚合物不是完全不能滲透的，并允許被濕氣透過率(MVTR)限定的一定 量水蒸氣逃逸。因此，在該系統中，在以水蒸汽形式進入隔室內的第一水量和在通過聚合物膜傳 遞或通過冷凝離開所述隔室的第二水量之間存在平衡。這些不同的量如下評價Q1 = IWL*S*tQ2 = MVTR*S，*tQ = Q1-Q2P = nRT/V
其中Q1 =任何時候進入隔室的水蒸氣的質量；Q2 =從聚合物逃逸的水蒸氣的量；Q =殘留在所述隔室內的水蒸汽的量；P =所述隔室內的壓力；S =水蒸汽穿過皮膚的釋放表 面；S’ =水蒸汽穿過聚合物的釋放表面；t =時間。在從無毛發大鼠后背取得的皮膚樣品上通過進行IWL測量來評價在施用冷凝隔 室之前和施用20小時之后的水的量。通過與未經受過所述裝置的皮膚區域相比較來測定。 將皮膚片安裝在Franz擴散池上。在接收器隔室中，用pH = 7. 4的PBS緩沖劑來維持皮膚 處于可與生理狀態相比擬的水合狀態下。當Franz池準備好時，將它們置于37°C的熱水浴 中并在其中保持2小時，然后進行任何其它的操作，從而使得所述溫度與生理流動溫度平圖4給出的結果表明以水蒸氣形式被加到隔室的水在施用裝置之后相當迅速地 開始冷凝。根據這些結果，其表示系統的最初數據和最后數據，在20小時之后計算的水蒸 汽和液態水的量分別是1. 08mg/cm2的液態水和0. 3mg/cm2的水蒸汽形式。在實驗期間進行 肉眼檢驗時，水呈現以液態積聚在皮膚表面上。實施例5在施用具有冷凝隔室的裝置之后，表皮的不同層(上層表皮、上層和中層表皮、整 個整體)隨時間的水合百分率的增加。Hydrascan⑧是由Dermscan 開發的測量表皮水合的裝置。測量原理是基于 瞬時傳熱(TTT)通過靠近熱探測器的刺激器產生恒定熱脈沖并通過表皮傳播。皮膚 溫度的每一變化與皮膚中水的量成比例(GirardP.，Beraud A.和Sirvent A. -Study of three complementary techniques formeasuring cutaneous hydration in vivo in human subjects NMRspectroscopy, transient thermal transfer and corneometry-application toxerotic skin and cosmetics.-Skin Research and Technology, 2000,6 :205_213)。測量值用mW/°C表示(其是導熱率，測量在兩個點之間的導熱能力，與這兩個點之 間的t°的差異有關)。該設備能夠通過在三層即表皮的上層、中層和深層之間制造差別而測量表皮中的 水合。該研究在15名志愿者的組中進行年齡18-50歲的婦女，高加索人，正常皮膚，具 有70mm3的冷凝隔室的裝置在28°C被施用于前臂。用Hydrascan測量方法在0小時、1小 時、2小時、3小時和4小時處進行水合動力學。在這些時間的每個時間點處測定在冷凝隔 室下面的表皮的水合并與在未經受過施用冷凝隔室的皮膚區域上的測定結果相比較。圖5 中示出了獲得的結果并表明從施用第1個小時開始，冷凝隔室內的水合率增加，該水合隨 著時間得以維持。實施例6在施用具有冷凝隔室的裝置之后，皮膚表面的水合隨時間增加。該研究在15名志愿者的組中進行年齡18-50歲的婦女，高加索人，正常皮膚， 具有70mm3冷凝隔室的裝置在26°C下被施用于前臂。不顯性水丟失(IWL)的測定使用 Tewameter 210 (Courage and KhazakaElectronic Gmbh.，Κδ η, Germany)進行。一旦除去裝置后，就使用在90秒內記錄的每一秒IWL測量值來計算在冷凝隔室下方、因此是在皮膚上積聚的水量的測定值。計算每個測量時間的曲線下面積。在施用冷凝 隔室之后0小時、1小時、2小時、3小時和4小時處進行測量。圖6示出了獲得的結果并表明在處理期間皮膚表面上積聚的水量增加。實施例7通過延長皮膚施用時間，經由表皮途徑誘導的抗卵清蛋白抗體免疫應答的增強。按照實施例1制備包括冷凝隔室的裝置，但是其具有包含干形式的OVA(IOOyg) 或TT (100 μ g)的IOmmVcm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6圖7A，η = 10圖7Β) 的后背24或48小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。根據兩種不同的方案重新 施用-方案1在首次施用之后2和4周(圖7Α和7Β)，-方案2:在首次施用之后第2、7、9、14、21和28天(圖7Β)。通過對最后一次施用之后第2周取樣的動物血清進行ELISA，測試抗OVA總IgG類 型抗體。圖7Α和7Β示出的結果用抗原特異性抗體滴度表示。對于每只動物的血清，其是 在450nm測量的吸光度等于在未試驗過的小鼠血清上測定的截止值時的稀釋度的倒數。結 果表明施用時間為48小時具有特別顯著的抗體特異性應答。實施例8在沒有任何佐劑化合物、也沒有任何皮膚的穿孔或磨損處理的條件下，與貼片類 型的系統相比較，經由表皮途徑誘導的強大的對免疫原特異的抗體免疫應答。按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的模型 免疫原霍亂毒素(CT)的10mm7cm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背24 小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。在首次施用之后2和4周重新施用。另外， 將用普通的橡皮膏覆蓋的、由其上吸附有液態免疫原的紗布構成的貼片類型的系統，在與 先前所述裝置相同的條件下施用于雌性BALB/c小鼠的后背上。對最后一次施用之后2周 取樣的動物血清采用ELISA，檢測抗-抗原總IgG類型抗體。圖8中示出的結果用抗原特異 性抗體滴度表示。對于每只動物的血清，其是在450nm測量的吸光度等于在未試驗過的小 鼠血清上測定的截止值時的稀釋度的倒數。結果表明當采用以冷凝隔室皮膚給藥時，與貼片類型的系統相比較，誘導了對免 疫原特異的強免疫應答。實施例9在沒有佐劑化合物的條件下，使用低劑量抗原，經由表皮途徑誘導抗TT抗體免疫應答。按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 TT (10或100 μ g)的10mm7cm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 10)的后背24或 48小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。在首次施用之后2和4周重新施用。對 最后一次施用之后2周取樣的動物血清采用ELISA檢測抗-抗原總IgG類型抗體。圖9中 示出的結果用抗原特異性抗體滴度表示。對于每只動物的血清，其是在450nm測量的吸光 度等于在未試驗過的小鼠血清上測定的截止值時的稀釋度的倒數。結果表明誘導的抗原特異性抗體滴度，其相當于具有包含IOOiLg的冷凝隔室的 皮膚給藥裝置施用24小時，和相當于包含IOiLg的冷凝隔室的皮膚給藥裝置施用48小時。
實施例10表皮被誘導的變厚與具有冷凝隔室的裝置的皮膚施用時間的延長成比例。按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的 OVAdOO μ g/cm2)的IOmmVcm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 8-16)的后背0、24 或48小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。對冷凝隔室下方的皮膚區域進行取樣 并冷卻。將得自樣品的皮膚切片用Hemalim-曙紅染色。圖10中的結果顯示在χ200放大 倍數的顯微鏡下看到的觀測結果。結果表明，施用具有包含OVA的冷凝隔室的皮膚給藥裝置，誘導表皮變厚，這在施 用24小時后可見，并且在施用48小時后顯著。實施例11誘導抗原進入皮膚以及其由樹突狀細胞進行的處理，與具有冷凝隔室的裝置的皮 膚施用時間的延長成比例。-按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 OVAdOO μ g/cm2)偶聯 Alexa 488 (A488)的 IOmmVcm2 體積施用于雌性 BALB/c 小鼠(η = 10-20)的后背6、24或48小時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。將冷凝隔室下的 皮膚區域取樣。在從真皮分離表皮后(0.5%胰蛋白酶)，通過機械再懸浮分離表皮細胞并 通過酶消化(膠原酶/DNA酶)真皮細胞。在細胞懸液中和在樹突狀細胞中檢測OVA-A488， 所述細胞通過通過流式細胞術(FACscallibur and Cellquest軟件)使用CDllc標志進 行識別。圖11中示出的結果用在每種細胞懸液(表皮和真皮)的總細胞中和樹突狀細胞 (⑶Ilc+)中的熒光細胞(OVA-A488+)的百分數表示。結果表明一些表皮細胞和真皮細胞是OVA-A488+,并且它們的比例隨著具有含 OVA-A488的冷凝隔室的皮膚給藥裝置的施用時間延長而增加。這些OVA-A488+細胞中的一部 分是樹突狀細胞(CDllc+)并且類似地，樹突狀OVA-A488+細胞的百分數隨著包括冷凝隔室的 皮膚給藥裝置的施用時間的延長而增加。-按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但是其具有包含干形式的 OVA (100 μ g/cm2)偶聯 Alexa 488 (A488)的 10mm7cm2 體積，將其施用于豬(η = 1)的后背 24 小時，豬后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。對冷凝隔室下方的皮膚區域進行取樣。在從真皮分離表皮后(0. 5%胰蛋白酶)， 通過機械再懸浮分離表皮細胞并通過酶消化(膠原酶/DNA酶)真皮細胞。在細胞懸液中和 在樹突狀細胞中檢測OVA-A488，所述細胞通過流式細胞術(FACscallibur and Cell quest 軟件)使用SLA-II標志進行識別。圖11中示出的結果用在每種細胞懸液(表皮和真皮) 的總細胞中和樹突狀細胞(SLA-II+)中的熒光細胞(OVA-A488+)的百分數表示。結果表明在施用具有含OVA-A488的冷凝隔室的皮膚給藥裝置24小時之后，一些表 皮細胞和真皮細胞是0VA-A488+。這些OVA-A488+細胞的一部分是樹突狀細胞(SLA-II+)。圖11中示出的結果表明包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置促進了抗原進入皮膚，并 且促進其被樹突狀細胞的處理。實施例12表皮郎格罕氏細胞網絡中被誘導的變化，其與具有冷凝隔室的裝置的皮膚施用時 間的延長成比例。
按照實施例1制備包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的 OVA (100 μ g)的IOmmVcm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 5)的后背0、24或48小 時，小鼠后背在施用前一天經過剃毛和脫毛。對冷凝隔室下方的皮膚區域進行取樣并冷凍。 用CD207標志從得自樣品的皮膚切片上識別郎格罕氏細胞。圖12中的結果表明在χ200放 大倍數的顯微鏡檢術下得到的觀測結果。結果表明，施用具有含OVA的冷凝隔室的皮膚給藥裝置誘導表皮郎格罕氏細胞網 絡的變化，這在施用24小時之后可見，在施用48小時之后顯著。這一現象是這些細胞活化 的特征。實施例13誘導產生對腫瘤抗原特異的抗體，所述抗體能夠在將具有含腫瘤抗原的冷凝隔室 的裝置施用于皮膚24小時時間之后，在體外靶定表達該抗原的細胞。按照實施例1制備了包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的腫瘤 抗原的10mm7cm2體積，將其施用于雌性BALB/c小鼠(η = 6)的后背24小時，小鼠后背在 施用前一天經過剃毛和脫毛。在首次施用之后2和4周重新施用。對在最后一次施用之后 2周取樣的動物血清進行的ELISA，測試抗-抗原總IgG類型抗體。動物的血清與表達該腫 瘤抗原的細胞溫育。通過流式細胞術(FACscallibur and Cell quest軟件)，用熒光小鼠 抗Ig抗體標記之后，檢測在細胞上固定的腫瘤抗-抗原抗體。圖13中的結果以顯示與細 胞數目有關的熒光強度的矩形圖形式給出。結果表明使用具有含腫瘤抗原的冷凝隔室的皮膚給藥裝置，經由表皮途徑進行免 疫的小鼠血清中所含的腫瘤抗-抗原抗體，表現出體外識別表達所述腫瘤抗原的細胞。實施例14在將具有含RSV抗原的冷凝隔室的裝置施用于皮膚48小時之后，在幼年小鼠中誘 導的抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的部分防護。按照實施例1制備了包括冷凝隔室的皮膚給藥裝置，但其具有包含干形式的呼吸 道合胞病毒抗原的10mm7cm2體積，將其施用于幼年BALB/c小鼠(7日齡)的后背48小時。 經由鼻內途徑與佐劑共同給藥的抗原作為對照。病毒測試在經鼻途徑接種之后第23天進 行。病毒RNAs的測試在感染之后第5天取樣的肺上進行。圖14中示出的結果用肺中與參 比基因相比較的相對量的病毒RNA表示，并相對于陽性對照(未接種個體)進行歸一化。結果表明在幼年小鼠中的病毒載量，在具有含RSV抗原的冷凝隔室的裝置皮膚施 用48小時之后，與未經處理的幼年小鼠相比，減低了一半。
1權利要求
疫苗制劑在制備哺乳動物、優選人的表皮接種用組合物中的應用，特征在于所述疫苗制劑為干形式并且不含佐劑，以及特征在于所述疫苗制劑借助于在接觸皮膚時形成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室的皮膚裝置而被施用于哺乳動物的完好無損的皮膚上進行給藥。
2.皮膚給藥裝置在制備計劃用于在沒有任何皮膚處理或佐劑的共同給藥的條件下將 包含抗原的疫苗制劑進行給藥的組合物中的應用，所述皮膚給藥裝置包含沒有佐劑化合物 的干形式的疫苗制劑，并且在接觸皮膚時形成包含所述疫苗制劑的冷凝隔室，從而允許在 沒有佐劑或先前皮膚處理的條件下所述抗原進入表皮和誘導免疫應答。
3.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述冷凝隔室的壁包含濕氣透過率小于約 10g/m2/24h 的材料。
4.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述冷凝隔室的體積為1到300mm7cm2裝 置表面、優選2到100mm7cm2裝置表面。
5.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述冷凝隔室允許誘導在所述冷凝隔室內 和在表皮的外表面上的水合率在施用1小時后增加至少50%。
6.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述裝置通過粘合機構被保持在皮膚上。
7.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述疫苗制劑為粉末形式。
8.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述疫苗制劑在裝置表面不存在粘合材料 的條件下，通過化學或物化類型的力被保持在所述裝置的該表面上。
9.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述疫苗制劑通過靜電力或通過范德華力 被保持在所述裝置的表面上。
10.前述權利要求中任一項的應用，特征在于所述裝置包含0.1 μ g到500μ g/cm2表 面、優選20 μ g到300 μ g/cm2表面、更優選20 μ g到100 μ g/cm2表面的量的疫苗制劑。
11.前述權利要求任一項的應用，特征在于所述疫苗制劑包含肽或多肽類型、或具有不 同化學類型組分的多肽結合物的至少一種抗原。
12.前述權利要求中任一項的應用，特征在于其包括給對象連續施用至少兩個裝置、優 選至少三個裝置，每次施用間隔約7到30天，優選10到20天，一般約15天。
13.前述權利要求中任一項的應用，特征在于，對于每次施用，所述裝置被保持在皮膚 上歷時約6到72小時、優選約6到48小時、更優選約48小時。
14.前述權利要求中任一項的應用，特征在于其包括對給對象至少連續三次施用裝置 歷時約48小時，每次施用間隔約15天。
15.前述權利要求中任一項的應用，用于制備誘導對抗抗原和對抗原特異的免疫應答 的疫苗。
16.前述權利要求中任一項的應用，用于制備誘導IgG類型的抗體應答的疫苗。
17.疫苗組合物，特征在于其包括在施用于對象的皮膚之后形成冷凝隔室的皮膚給藥 裝置，所述冷凝隔室包含干形式的且不含任何佐劑化合物的疫苗制劑。
18.權利要求17的組合物，特征在于所述疫苗制劑是粉末形式。
19.權利要求18的組合物，特征在于所述疫苗制劑借助于靜電力被保持在所述冷凝隔 室的表面上。
20.干形式的疫苗制劑在制備用于在哺乳動物中誘導免疫應答的醫藥產品中的應用， 特征在于所述疫苗制劑在沒有任何佐劑化合物的條件下借助于皮膚裝置被施用于哺乳動物的未經處理的皮膚上，歷時約48小時。
21.權利要求1-16和20中任一項的應用，特征在于所述疫苗制劑另外包含免疫調節化 合物或與免疫調節化合物共同給藥，所述免疫調節化合物優選選自細胞因子和Toll受體 配體。
全文摘要
本發明涉及開發經由皮膚途徑遞送疫苗的系統。本發明更具體涉及包含冷凝隔室的裝置在表皮接種中的應用。本發明還涉及允許在無任何皮膚處理的條件下即可獲得有效免疫應答的表皮接種方案。本發明可以在任何哺乳動物、優選在人類中實施，以誘導對抗任何類型的抗原的治療性或預防性免疫應答。
文檔編號A61K9/70GK101883560SQ200880118865
公開日2010年11月10日 申請日期2008年12月3日 優先權日2007年12月3日
發明者約爾格·龍科, 西爾維·戈德弗魯瓦, 貝特朗·杜邦 申請人:Dbv技術公司