可注射的速效胰島素組合物的制作方法

專利名稱：可注射的速效胰島素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上在可注射的、速效藥物遞送胰島素制劑領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
糖尿病綜述葡萄糖是身體所有細(xì)胞利用以產(chǎn)生能量和維持生命的單糖。不論何時，人們在他 們的血液內(nèi)需要最低水平的葡萄糖以維持生命。身體產(chǎn)生血糖的主要方式是通過消化食物 來進(jìn)行。當(dāng)人不能從食物消化中取得該葡萄糖時，葡萄糖由組織內(nèi)的貯藏物產(chǎn)生或者由肝 臟釋放。身體的葡萄糖水平由胰島素來控制。胰島素是由胰腺自然分泌的肽類激素。胰島 素幫助葡萄糖進(jìn)入身體細(xì)胞，以提供重要的能源。當(dāng)健康個體開始用餐時，胰腺分泌自然峰值的胰島素，其被稱為第一時相胰島素 分泌。除了提供足夠的胰島素以處理從食物消化進(jìn)入血液的葡萄糖之外，第一時相胰島素 分泌在進(jìn)行食物消化時對肝臟發(fā)出停止制備葡萄糖的信號。因?yàn)楦闻K不產(chǎn)生葡萄糖并且有 足夠的胰島素處理來自消化物的葡萄糖，所以健康個體的血糖水平保持相對恒定，并且他 們的血糖水平不會變得過高。糖尿病是以異常高的血糖水平和胰島素水平不夠?yàn)樘卣鞯募膊?。糖尿病主要有?種類型-1型和2型。在1型糖尿病中，身體不產(chǎn)生胰島素。在2型糖尿病的早期階段中，雖 然胰腺產(chǎn)生胰島素，但是要么身體不在適當(dāng)?shù)臅r候產(chǎn)生胰島素、要么身體細(xì)胞忽視胰島素， 這種癥狀稱作胰島素抵抗。甚至在有任何其他癥狀之前，2型糖尿病的首先影響之一是食物導(dǎo)致的第一時相 胰島素分泌的缺失。在第一時相胰島素分泌缺失時，肝臟無法接受停止制備葡萄糖的信號。 結(jié)果，當(dāng)身體通過食物消化開始產(chǎn)生新葡萄糖時，肝臟繼續(xù)產(chǎn)生葡萄糖。結(jié)果，糖尿病患者 在餐后血糖水平變得過高，這種癥狀稱作高血糖癥。高血糖癥導(dǎo)致葡萄糖不正常地附著到 血液中某些蛋白上，干擾蛋白發(fā)揮維持小血管完整性的正常功能。隨著每餐后都發(fā)生高血 糖，最終導(dǎo)致細(xì)小血管破裂和滲漏。高血糖的長期不良影響包括失明、腎功能衰竭、神經(jīng)損 傷和失去感覺以及末梢血液循環(huán)不良，還可能需要四肢截肢。在餐后2到3小時之間，未經(jīng)治療的糖尿病患者的血糖提高到一個程度使得胰腺 接受信號而分泌不尋常地大量的胰島素。在早期2型糖尿病患者中，胰腺仍然可以響應(yīng)和 分泌大量的胰島素。但是，這些現(xiàn)象在消化快要結(jié)束和血糖水平應(yīng)該開始下降時發(fā)生。此 不尋常地大量的胰島素造成兩種不利影響。首先，它對已經(jīng)受損的胰腺提出過度極端的要 求，這可導(dǎo)致其更迅速劣化，最終使胰腺不能產(chǎn)生胰島素。其次，在消化后，過多的胰島素導(dǎo) 致體重增加，這可進(jìn)一步加重病情。
目前糖尿病的治療及其局限性因?yàn)?型糖尿病患者不產(chǎn)生胰島素，所以對1型糖尿病的主要治療是每天強(qiáng)化胰 島素治療。2型糖尿病的治療通常始于飲食控制和鍛煉。雖然在短期內(nèi)有幫助，但是對于絕 大多數(shù)2型糖尿病患者而言，僅通過飲食和鍛煉的治療不是有效的長期治療方案。當(dāng)飲食 和鍛煉再沒有效果時，就要開始各種非胰島素口服藥物治療。這些口服藥物通過增加由胰 腺產(chǎn)生的胰島素量、增加胰島素敏感細(xì)胞的敏感度、減少肝臟的葡萄糖產(chǎn)出或者這些機(jī)制 的某些組合來起效。這些治療在有效控制疾病的能力方面有限，并且通常有顯著的副作用， 如體重增加和高血壓等。由于非胰島素治療的局限性，因此隨著時間的推移，許多2型糖尿 病患者的病情惡化，并且最終需要胰島素治療以支持他們的代謝。胰島素治療方法已被用于治療糖尿病80多年。該治療方法通常包括每日施用幾 次胰島素注射。這些注射包括每日1次或2次施用長效基礎(chǔ)注射劑、以及在進(jìn)餐時施用速 效胰島素注射劑。雖然該治療方案被認(rèn)為有效，但是其具有局限性。首先，由于不便且有針 痛，因此患者通常不喜歡給自己注射胰島素。結(jié)果，患者往往不充分遵守規(guī)定治療方案，并 且經(jīng)常用藥不當(dāng)。更重要的是，甚至在正確地進(jìn)行施用時，胰島素注射也無法復(fù)制胰島素的自然的 時間-效果的特征。特別是，沒有糖尿病的人的第一時相胰島素分泌的自然峰值導(dǎo)致在來 自于食物的葡萄糖進(jìn)入血液后的幾分鐘內(nèi)血液胰島素水平提高。與此相比，注射的胰島素 進(jìn)入血液緩慢，峰值胰島素水平出現(xiàn)在注射常規(guī)人胰島素后80分鐘到100分鐘內(nèi)?？尚械慕鉀Q方案是在進(jìn)餐之前直接將胰島素注射到糖尿病患者的靜脈內(nèi)。在胰島 素靜脈內(nèi)注射的研究中，餐后3到6小時，患者顯示出對他們的血糖更佳的控制。然而，由 于各種醫(yī)療原因，每餐之前靜脈內(nèi)注射胰島素的方法不是實(shí)用的治療方法。胰島素治療方法的重要改進(jìn)之一是二十世紀(jì)九十年代引入的速效胰島素類似物， 諸如Humalog 、NovoLog⑧和Apidra⑧。但是，即使使用速效胰島素類似物，峰值胰島素 水平也通常出現(xiàn)在注射后50分鐘到70分鐘內(nèi)。由于速效胰島素類似物無法充分模擬第一 時相胰島素分泌，因此使用胰島素治療方法的糖尿病患者在開始進(jìn)餐時胰島素水平仍然不 夠，而在兩餐之間存在過多的胰島素。在餐后早期，該胰島素遞送滯后可導(dǎo)致高血糖癥。此 外，在兩餐之間的過多的胰島素可能導(dǎo)致異常低的血糖水平，其稱作低血糖癥。低血糖癥可 導(dǎo)致精神敏銳度喪失、混亂、心率增快、饑餓、發(fā)汗和眩暈。在葡萄糖水平非常低時，低血糖 癥可能導(dǎo)致意識喪失、昏迷，甚至導(dǎo)致死亡。據(jù)美國糖尿病協(xié)會或ADA的記錄，使用胰島素 的糖尿病患者每年發(fā)生平均1. 2次的嚴(yán)重的低血糖癥事件，其中多數(shù)事件需要患者去醫(yī)院 急診室就診。由于胰島素遞送至血液的時間過程在全面控制血糖中起如此重要的作用，因此明 顯需要比速效胰島素類似物更加快速到達(dá)血液的可注射的胰島素。因此，本發(fā)明的目的是提供具有改善的穩(wěn)定性并且快速起效的可注射的速效胰島 素組合物。發(fā)明概述本文描述了具有改善的穩(wěn)定性并且快速起效的可注射的胰島素制劑。該制劑可以 皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)施用，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該制劑通過皮下注射施用。該制劑含有胰 島素并聯(lián)合螯合劑、和溶解劑、以及可任選添加的賦形劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該制劑含有人胰島素、鋅螯合劑(例如EDTA)和溶解劑(檸檬酸)。當(dāng)通過皮下注射施用這些制劑 時，其迅速地被吸收入血流中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素以干燥粉末的形式設(shè)置在無菌瓶內(nèi)。在施用前或施 用時，將其與含有可藥用的載體(例如水)的稀釋液、鋅螯合劑Gf^BEDTA)和溶解劑(檸 檬酸)混合。在另一個實(shí)施方案中，該胰島素以冷凍混合物形式貯存，解凍后可隨時使用。附圖簡要說明

圖1為胰島素的三維示意圖，其示出暴露的表面電荷、以及用適當(dāng)大小的分子 (“溶解劑和螯合劑”)覆蓋來屏蔽該電荷。圖2為transwell裝置10的示意圖，其用于測定胰島素從供給室12通過0. 1微 米過濾器16上的4-5層永生化口腔上皮細(xì)胞14進(jìn)入接受室18的吸收。圖3a和3b為根據(jù)選擇為溶解劑的酸的變化，在含有和不含0. 45mg EDTA/ml的條 件下、在圖2所示的transwell系統(tǒng)內(nèi)比較體外通過口腔上皮細(xì)胞的胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)(累積胰 島素，單位為微單位)的圖。EDTA恒定為0.45mg/mL，而酸的濃度變化如下圖3a，天冬氨 酸(0. 47mg/mL)、谷氨酸(0. 74mg/mL)、琥珀酸(0. 41mg/mL)、己二酸(0. 73mg/mL)、以及檸 檬酸(0. 29mg/mL 和 0. 56mg/mL)，pH 范圍為 3. 2-3. 8。圖 3b，馬來酸(0. 32mg/ml)、富馬酸 (1. 28mg/mL)、以及草酸(0. 32mg/mL),pH范圍為2-3。選擇兩個時間點(diǎn)(10分鐘和30分鐘) 進(jìn)行比較分析。結(jié)果為4次測定的平均值加或減標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4a和4b為在含有和不含0. 56mg EDTA/mL的條件下、在圖2所示的transwell 系統(tǒng)內(nèi)體外通過口腔上皮細(xì)胞的胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)(累積胰島素，單位為微單位)以比較不同的 溶解劑的圖，其中酸為下列等摩爾(1.50X10_3Mol)濃度天冬氨酸(0.20mg/mL)、谷氨酸 (0. 22mg/mL)、以及檸檬酸(0. 29mg/mL)(圖4a)和檸檬酸(1. 80mg/mL)(圖4b)。選擇兩個 時間點(diǎn)(10分鐘和30分鐘)進(jìn)行比較分析。圖5為在圖2所示的transwell系統(tǒng)內(nèi)體外通過口腔上皮細(xì)胞的胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)以 比較不同的螯合劑的功效的圖。測定胰島素(lmg/mL)從一溶液中通過口腔上皮細(xì)胞的 轉(zhuǎn)運(yùn)(累積胰島素，微摩爾)，所述溶液含有谷氨酸、檸檬酸或HCl并且加入等摩爾濃度 (4.84X10—3摩爾)的不同螯合劑。所述螯合劑為無螯合劑(對照)』014丄614、01^々、0)丁八 和 TSC。圖 6 為與 HUMALOG (12U)和 HUMULIN R (12U)相比，用檸檬酸和 EDTA (12U)制 備的胰島素在人受試者中的體內(nèi)藥效學(xué)效果的圖，所述效果以平均GIR/kg的形式測定。圖7為與HUMULIN R 相比，用檸檬酸和EDTA制備的胰島素在人受試者中胰島素 濃度(微單位/ml)隨時間(分鐘)變化的體內(nèi)藥物動力學(xué)效果的圖。胰島素劑量的平均 值(+SEM, η = 10)為 12U/ 受試者。圖8為與HUMULIN R⑧和HUMALOG⑧相比，用檸檬酸和EDTA制備的胰島素在16位 2型糖尿病患者中以血糖(mg/dl)隨時間(分鐘)變化而繪制的體內(nèi)藥效學(xué)的圖。用于患 者試驗(yàn)的劑量是針對個別患者的，這基于他們的目前的胰島素治療方法來對每個患者進(jìn)行 調(diào)節(jié)。發(fā)明詳述在進(jìn)餐之前或進(jìn)餐后，立即施用了本文中所描述的可注射的人胰島素的胰島素制 劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑聯(lián)合使用重組人胰島素和通常被FDA認(rèn)為是安全的特異性成分。所述制劑被設(shè)計(jì)為較目前市售的速效胰島素類似物更快地吸收入血液中。所述 胰島素制劑的重要的特征之一是其使六個分子或六聚體形式的胰島素解離或分開，從而形 成單分子或單體形式的胰島素，并防止重新締合形成六聚體形式。據(jù)信，通過優(yōu)先形成單體 形式，在該制劑可被吸收到體內(nèi)而產(chǎn)生其理想的生物作用之前，該制劑使胰島素更加快速 地遞送到血液中作為人體所需要的單分子形式胰島素。大部分市售的注射用人胰島素為六 聚體形式。這使其更加難以被吸收入體內(nèi)，這是因?yàn)橐葝u素六聚體必須首先解離以形成二 聚體和之后的單體。I.定義除非另有說明，否則本文中所使用的“胰島素”是指人類或非人類的重組、純化或 合成的胰島素或胰島素類似物。本文中所使用的“人類胰島素”是由胰腺分泌的人類肽激素，其由天然來源分離或 由基因改造的微生物制備。本文中所使用的“非人類胰島素”是與人類胰島素相同的胰島 素，不同之處在于其來自于豬或牛等動物來源。本文中所使用的胰島素類似物是改良胰島素，雖然與由胰腺分泌的胰島素不同， 但是仍然可以對身體產(chǎn)生與天然胰島素相同的作用。通過DNA為基礎(chǔ)的基因工程，可以改 變胰島素的氨基酸序列，從而改變它的ADME (吸收、分配、代謝、和排泄)特征。其例子包括 賴脯胰島素、甘精胰島素、門冬胰島素、賴谷胰島素、地特胰島素。這些胰島素也可通過化學(xué) 方法來改造，例如乙酰化反應(yīng)。本文中所使用的人類胰島素類似物是能夠進(jìn)行與人類胰島 素相同作用的改良人類胰島素。本文中所使用的“螯合劑”是指能夠與鋅離子形成單鍵或多鍵的化合物。所述鍵 通常為離子鍵或配位鍵。所述螯合劑可為無機(jī)或有機(jī)化合物。螯合絡(luò)合物是金屬離子與螯 合劑的兩個或多個原子鍵合的絡(luò)合物。本文中所使用的“增溶劑”是提高物質(zhì)在溶劑中的溶解性的化合物，例如胰島素 在水溶液中的溶解性。增溶劑的例子包括表面活性劑(TTOENS )；溶劑，如乙醇等；膠束 (micelle)形成化合物，如氧乙烯單硬脂酸酯等；以及pH調(diào)節(jié)劑。本文中所使用的“溶解劑”是這樣的酸，當(dāng)將其加入到胰島素和EDTA時，在相同的 PH條件下，相對于HCl和EDTA，提高胰島素的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，這利用下面實(shí)施例中所描述的上 皮細(xì)胞transwell板分析法來測定。HCl不是溶解劑，但可以是增溶劑。當(dāng)用該分析法來測 定時，檸檬酸是溶解劑。本文中所使用的“賦形劑”是除了螯合劑或溶解劑之外的惰性物質(zhì)，其可用作胰島 素載體或用于輔助產(chǎn)品制備加工。在這種情況下，用賦形劑來溶解或混合活性物質(zhì)。II.制劑制劑包含胰島素、螯合劑和溶解劑，還可選擇地包含一種或多種其他賦形劑。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，該制劑適用于皮下施用，并且迅速被吸收入脂肪皮下組織中。溶解劑和螯 合劑的選擇、溶解劑和螯合劑二者的濃度、以及制劑被調(diào)節(jié)的PH均對系統(tǒng)的功效產(chǎn)生深切 的影響。當(dāng)多種組合都具有功效時，根據(jù)種種理由選擇優(yōu)選的實(shí)施方案，所述理由包括安全 性、穩(wěn)定性、常規(guī)特征、以及性能。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種制劑成分被選擇以屏蔽活性藥劑上的任何電荷。 這可以促進(jìn)胰島素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而加快胰島素的起效和提高胰島素的生物利用度。還選
6擇所述成分以形成迅速溶解于水性介質(zhì)中的組合物。優(yōu)選的是，胰島素迅速被吸收并轉(zhuǎn)運(yùn) 到血漿中，從而迅速起效(優(yōu)選的是，在施用后約5分鐘內(nèi)開始起效，并且在施用后約15-30 分鐘達(dá)到峰值)。諸如EDTA之類的螯合劑螯合胰島素中的鋅，由此從胰島素溶液中除去鋅。這使胰 島素采取其二聚體和單體形式，并且阻止重新締合形成六聚體形態(tài)。由于這兩種形式以濃 度驅(qū)動的平衡狀態(tài)存在，因此隨著單體被吸收，更多的單體產(chǎn)生。因此，隨著單體通過皮下 組織被吸收，另外的二聚體解聚而形成更多的單體。所述單體形式的分子量小于六聚體形 式的分子量的六分之一，因此顯著地提高胰島素吸收的速度和量。就螯合劑(例如EDTA) 和/或溶解劑(例如檸檬酸)與胰島素發(fā)生氫鍵結(jié)合來說，據(jù)信其屏蔽胰島素上的電荷，從 而促進(jìn)它的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而加快胰島素的起效和提高胰島素的生物利用度。胰島素所述胰島素可以由天然來源重組或純化。所述胰島素可以是人類或非人類胰島 素。優(yōu)選人類胰島素。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述胰島素為人類重組胰島素。重組人類胰 島素由許多來源獲得。所述胰島素還可以是胰島素類似物，其可以基于人類胰島素的氨基 酸序列，但具有一個或多個不同的氨基酸，或者可以是化學(xué)改良的胰島素或胰島素類似物。胰島素的劑量取決于它的生物利用度和待接受治療的患者。劑型中包含的胰島素 通常為1. 5-100IU/人劑量，優(yōu)選為3-50IU/人劑量。溶解劑如圖1所示，某些酸表現(xiàn)出屏蔽胰島素上的電荷，提高攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。相對于鹽酸， 下述酸作為溶解劑有效，包括醋酸、抗壞血酸、檸檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、琥珀酸、富馬酸、 馬來酸和己二酸，這是利用下面實(shí)施例中所描述的transwell板分析法來測定的。例如，如 果活性藥劑為胰島素，則優(yōu)選的溶解劑為檸檬酸。在聯(lián)合任意制劑時，鹽酸可用于調(diào)節(jié)PH， 但其不是溶解劑。相當(dāng)于與胰島素和EDTA聯(lián)合的檸檬酸的有效量的溶解劑的范圍在9. 37X10_4M檸 檬酸至9. 37 X 10_2M檸檬酸之間。螯合劑在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鋅螯合劑與活性藥劑混合。所述螯合劑可以是離子型或非 離子型。合適的螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、EGTA、海藻酸、α-硫辛酸、二巰基丁二 酸(DMSA)、⑶ΤΑ(1，2-環(huán)己二胺四乙酸)、檸檬酸三鈉(TSC)。鹽酸可以與TSC聯(lián)合使用以 調(diào)節(jié)ΡΗ，并且在該過程中形成作為溶解劑的檸檬酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述螯合劑為EDTA。例如，當(dāng)活性藥劑為胰島素時，已知螯 合劑從胰島素中奪取鋅，因此，相對于六聚體形式，該胰島素更有利地保持為二聚體形式， 并且促進(jìn)施用周圍部分組織(例如，粘膜或脂肪組織)的胰島素吸收。此外，所述螯合劑可 以與活性藥劑氫鍵鍵合，從而有助于活性藥劑的電荷屏蔽，并且促進(jìn)活性藥劑的跨膜輸送。相當(dāng)于與胰島素和檸檬酸聯(lián)合的EDTA的有效量的螯合劑的范圍在2. 42Χ 10_4Μ EDTA 至 9. 68 X ICT2M EDTA 之間。賦形劑可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體(其包括賦形劑和助劑)按照常規(guī)的 方式來配制藥物組合物，其中所述載體有利于將活性化合物加工成可被藥用的制劑。例如，I^^WK^^fei Hoover, John Ε. , Remington ISlr^ Pharmaceutical Sciences (Mack 出版公司，Easton，美國賓夕法尼亞(1975))以及Liberman，H. A.和Lachman，L.編著的 Pharmaceutical Dosage Forms (Marcel Decker,紐約，美國紐約州(1980))中有所討論。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素制劑包含一種或多種增溶劑，以使其在水介質(zhì)中快 速溶解。合適的增溶劑包括潤濕劑如聚山梨醇酯、甘油和泊洛沙姆、非離子和離子型表面 活性物質(zhì)、食品酸味劑和食品堿味劑(例如碳酸氫鈉)、醇類、以及PH控制用的緩沖鹽。穩(wěn)定劑用于抑制或延遲藥物的分解反應(yīng)，例如氧化反應(yīng)?？梢允褂枚喾N穩(wěn)定劑。合 適的穩(wěn)定劑包括多醣如纖維素和纖維素衍生物；簡單的醇如甘油；抑菌劑如苯酚、間甲酚 和羥苯甲酯；等滲劑如氯化鈉、甘油和葡萄糖；卵磷脂如天然卵磷脂(例如蛋黃卵磷脂或大 豆卵磷脂)以及合成或半合成卵磷脂(如二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿或 二硬脂酰磷脂酰膽堿)；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰絲氨酸如二硬脂酰磷脂酰絲氨酸、 二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸和二花生四烯酰磷脂酰絲氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；心磷脂； 鞘磷脂。在一個例子中，所述穩(wěn)定劑可以是甘油、抑菌劑和等滲劑的組合。II.制劑的制備方法可注射的制劑包含胰島素、螯合劑和溶解劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可注射的制劑 包含胰島素、EDTA、檸檬酸、和鹽水、和/或甘油。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過混合鹽水和/或甘油、檸檬酸和EDTA，以形成溶液并對 該溶液滅菌(將其稱作“稀釋液”)，從而制備可皮下注射的制劑。所述胰島素分別被添加 到無菌水中形成溶液后，過濾，并將指定的量分別加入到許多無菌注射瓶中。凍干所述胰島 素溶液以形成粉末，為了維持其穩(wěn)定性，應(yīng)該與稀釋液分開貯存。在施用之前，將所述稀釋 液加入到胰島素注射瓶中。在給患者皮下注射規(guī)定量的胰島素后，剩余胰島素溶液可以貯 存，優(yōu)選冷藏貯存。在另一個實(shí)施方案中，胰島素可以與稀釋液聯(lián)合，在使用之前，進(jìn)行無菌過濾以形 成多用注射液并冷凍。III.制劑的使用方法所述制劑可以皮下施用或肌肉內(nèi)注射。所述制劑被設(shè)計(jì)為快速吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿 中以進(jìn)行系統(tǒng)遞送?？稍诓颓盎騼刹椭g給1型或2型糖尿病患者施用包含胰島素作為活性藥劑的制 劑。由于迅速被吸收，因此在肝臟中所述組合物可以停止將糖原轉(zhuǎn)換成葡萄糖，從而預(yù)防高 血糖癥(其是發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的主要原因，并且是2型糖尿病的首發(fā)癥狀)。為了在肝臟 中停止產(chǎn)生葡萄糖，目前可用標(biāo)準(zhǔn)的人胰島素皮下注射劑必須在進(jìn)餐之前約半小時至1小 時施用，但產(chǎn)生低于預(yù)期的效果，這是因?yàn)?，胰島素吸收太慢而無法在肝臟中停止葡萄糖的 產(chǎn)生。此外，如果在病情發(fā)展中及早給予注射劑，則皮下胰島素組合物可以能夠減緩或停止 2型糖尿病的進(jìn)展。通過參照下面的非限制性的實(shí)施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例1 根據(jù)溶解劑的改變，使用上皮細(xì)胞Transwell分析法來進(jìn)行胰島素的攝 取和轉(zhuǎn)運(yùn)的體外比較材料和方法如圖2所示，口腔上皮細(xì)胞在transwell小室(transwell insert)上生長2周，直到形成多層(4-5層)細(xì)胞層為止。通過將合適的溶液加入到供給孔(donor well)中 并在10分鐘后從接收孔中取出樣品來進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。溶液由水、+/-EDTA(0. 45mg/ml), NaCl (0. 85% w/v) Umg/ml的胰島素和足以維持pH為3. 8的量的酸構(gòu)成。采用ELISA法來 分析接收孔中胰島素的量。MM圖3a和3b所示的結(jié)果證明，一些酸更有效地提高通過上皮細(xì)胞的胰島素的攝取 和轉(zhuǎn)運(yùn)。這些酸可容易測試且可與使用HCl而獲得的結(jié)果比較，從而提供針對可被測試的 任意酸、并確定其是不是溶解劑的標(biāo)準(zhǔn)(例如，相對于HC1，提高攝取和轉(zhuǎn)運(yùn))。使用pH范圍為3. 2-3. 8的酸而獲得的結(jié)果示于圖3a中。更強(qiáng)的酸(pH < 3)示 于圖3b中。該結(jié)果證明，在使用與酸濃度相同的螯合劑時，酸的選擇對通過細(xì)胞培養(yǎng)的胰島 素的轉(zhuǎn)運(yùn)有實(shí)質(zhì)影響。優(yōu)選的酸為檸檬酸。實(shí)施例2 根據(jù)溶解劑濃度的改變，使用上皮細(xì)胞Transwell分析法來進(jìn)行胰島素 的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的體外比較材料和方法采用實(shí)施例1的材料和方法，不同之處在于試劑的濃度。在本試驗(yàn)中，加入了等摩 爾濃度的酸和螯合劑。溶液由水、+/-EDTA(0. 56mg/mL)、NaCl (0. 85% w/v) Umg/mL的胰 島素和酸構(gòu)成，所述酸為天冬氨酸(0. 20mg/mL)、谷氨酸(0. 22mg/mL)或檸檬酸(0. 29mg/ ml)。在1.8mg/mL的更高的濃度下、螯合劑存在或不存在下對檸檬酸進(jìn)行測試。該數(shù)據(jù)顯 示供給室的細(xì)胞給藥后10分鐘、30分鐘的兩個時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。MM使用天冬氨酸(0. 20mg/mL)、谷氨酸(0. 22mg/mL)或檸檬酸(0. 29mg/ml)而獲得的 結(jié)果示于圖4a中。在這種情況下，加入螯合劑時沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。相對地，在使用1. 80mg/mL的更高濃度的檸檬酸的試驗(yàn)中，在將螯合劑加入到溶 液后顯示顯著提高(t-檢驗(yàn)比較，單側(cè))。請參照圖4b。該結(jié)果證明，兩種成分的濃度對優(yōu) 化攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)是重要的。實(shí)施例3 根據(jù)螯合劑的改變，使用上皮細(xì)胞Transwell分析法來進(jìn)行胰島素的攝 取和轉(zhuǎn)運(yùn)的體外比較材料和方法口腔上皮細(xì)胞在transwell小室上生長2周，直到形成多層(4_5層)細(xì)胞層為止。 通過將適當(dāng)?shù)娜芤杭尤氲焦┙o孔中并在10分鐘、20分鐘和30分鐘后從接收孔中取出樣品 來進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。即將在進(jìn)行transwell試驗(yàn)之前，按照下面的方法來制備溶液將1. 8mg/ml的 檸檬酸溶解在0.85% w/v的鹽水中，然后向該溶液中加入下面所示濃度的一種螯合劑 1. 80mg/ml 的 EDTA, 1. 84mg/ml 的 EGTA、0. 88mg/ml 的 DMSA 和 1. 42mg/ml 的 TSC。由于使用 了 液態(tài)⑶TA，將檸檬酸直接加入到⑶TA中。在每一種情況下，螯合劑的濃度始終為4. 84 X 10_3 摩爾。隨后，加入lmg/ml的胰島素，并在必要時將pH重新調(diào)節(jié)到3. 8。包括僅使用了 pH 校正用HCl的對照組試樣用于比較。在pH3. 8的條件下，海藻酸固化，因此，對該例子不作對比。通過向供給孔中加入0. 2ml的各溶液，進(jìn)行了 Transwell試驗(yàn)。采用ELISA法來分析接收孔中胰島素的量。MM施用胰島素30分鐘后的數(shù)據(jù)曲線示于圖5中。當(dāng)使用了檸檬酸或谷氨酸時，更多 的胰島素通過細(xì)胞遞送，除了與使用TSC(檸檬酸鈉)而獲得的結(jié)果比較時除外。在使用 TSC的情況下，HCl用于PH校正。PH的校正使TSC產(chǎn)生檸檬酸，這可以解釋上述結(jié)果。這些結(jié)果證明，攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的提高取決于螯合劑的選擇。實(shí)施例4 在基于檸檬酸的胰島素制劑中的螯合劑在豬中的臨床前評價(jià)材料和方法與A. Plum, H. Agerso和L. Andersen公開的研究一樣，在大鼠、狗和豬中研究速效 胰島素類似物、門冬胰島素的藥物動力學(xué)，并且在豬中研究門冬胰島素的藥效學(xué)。在Drug Metab.Dispos. ,28(2) 155-60 (2000)中，消除半衰期是確定胰島素吸收性的有用決定因 素，這是因?yàn)橄舆t意味著從注射部位吸收緩慢。因此，為了檢測PK和PD參數(shù)、特別是、 消除半衰期，進(jìn)行了豬的非房室分析研究。給糖尿病豬皮下注射四種胰島素制劑中的一種。三種制劑包含螯合劑(EDTA、EGTA 或TSC)，第四種對照制劑僅包含常規(guī)人胰島素Humulin R ，而不包含螯合劑。在所有的含 有螯合劑的制劑中，作為酸，使用了檸檬酸，并且在所有情況下，為了等滲性和制劑無菌性， 加入了 NaCl和間甲酚。螯合劑的濃度均為4. 84 ΧΙΟ"3摩爾。使豬禁食過夜，并皮下注射0. 125U/kg劑量的含有EDTA(n = 3)的人胰島素或者 0.08U/kg的含有EGTA或TSC(n = 2)的人胰島素。因?yàn)槭褂酶邉┝繒r血糖非常低，所以減 少了劑量。在給藥后8小時內(nèi)的所有時間點(diǎn)，檢測了血糖和胰島素水平。使用均勻加重的非房室模型，采用WinNonlin分析了藥物動力學(xué)模型。在表1中， 比較了消除半衰期。表1 作為螯合劑函數(shù)的豬中的血糖比較 在初步試驗(yàn)中，豬中的常規(guī)人胰島素的消除半衰期(120分鐘)與在文獻(xiàn)中公開所 見的數(shù)據(jù)一致，并且為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)將其用作測試指標(biāo)。該消除半衰期大大超過靜脈內(nèi)注射 后的時間，因此證明了注射后從注射部位仍然進(jìn)行緩慢吸收。含有螯合劑的檸檬酸的制劑 明顯地降低了該參數(shù)，這證明這三種螯合劑對提高常規(guī)人胰島素的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)有效，盡管在程度上有所不同。實(shí)施例5 =EDTA-檸檬酸胰島素制劑和常規(guī)人胰島素在人臨床試驗(yàn)中的比較材料和方法本研究的目的是評價(jià)含有與檸檬酸和EDTA組合的胰島素的測試制劑“CE”的 藥效學(xué)(PD)性質(zhì)。對10名空腹健康的志愿者(平均年齡為40(20-62歲范圍)；BMI為 22.5(19. 2-24. 9)kg/m2)進(jìn)行了 5次正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。采用了固定治療次序的正交設(shè) 計(jì)，在腹部部位皮下注射了 12IU的常規(guī)胰島素和12IU的CE胰島素制劑。MM結(jié)果示于圖6和7中。通過皮下注射CE得出了這樣的時間-效果特征，所述特征 為與使用常規(guī)人胰島素時相比，更明顯地加快葡萄糖的消耗(圖6)。平均藥物動力學(xué)數(shù) 據(jù)證實(shí)了 PD結(jié)果(圖7)。本試驗(yàn)表明，與僅含有常規(guī)人胰島素的制劑相比，添加了檸檬酸和EDTA的常規(guī)人 胰島素到達(dá)最大濃度的時間更快(圖7)且起效更快(圖6)，這證明其提高了胰島素的吸收率。實(shí)施例6 在餐前立即給1型糖尿病患者皮下注射CE胰島素、賴脯胰島素和常規(guī) 人胰島素時，它們的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)背景和目的本試驗(yàn)的目的是確定給1型糖尿病患者進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐后的VIAject (與檸檬酸和EDTA 聯(lián)合的常規(guī)人胰島素(RHI)的非?？焖倨鹦е苿?，上文中由CE來表示)、RHI和賴脯胰島素 (Lispro)對餐后血糖(BG)偏移的作用材料和方法在進(jìn)餐前，通過葡萄糖鉗夾法(glucose clamp)來穩(wěn)定9名患者(5男4女；年齡 為 40士 10 歲，體重指數(shù)(“BMI”)為 24. 0士2. Okg/m2)的血糖(“BG”)(目標(biāo) BG 為 120mg/ dl)。在標(biāo)準(zhǔn)餐和施用胰島素之前，停止輸注葡萄糖。采用固定治療次序的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 在餐前立即給同一患者皮下注射特定劑量的VIAject (CE)、Lispro或RHI。隨后，連續(xù)監(jiān) 控血糖8小時，如果BG < 60mg/dl，則重新開始輸注葡萄糖。在整個試驗(yàn)過程中測定血漿中 的胰島素水平。MM在給2型糖尿病患者進(jìn)餐后，皮下注射常規(guī)人胰島素、添加了檸檬酸和EDTA的胰 島素(CE)以及賴脯胰島素，并依照平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的方式比較了胰島素Tmax，結(jié)果示于表 2中。比較同一測試受試者的血糖的結(jié)果示于表3中。表2 胰島素Tmax的比較(分鐘) *p < . 001，配對 t_ 檢驗(yàn)表3 胰島素藥物動力學(xué)血糖比較 *p < 0. 05，配對 t_ 檢驗(yàn)注射后3到8小時發(fā)生低血糖事件的總數(shù)(需要葡萄糖輸注的時間)為使用RHI 時13件，使用Lispro時11件，使用CE時4件。為了防止發(fā)生低血糖癥，在上述時間內(nèi)輸 注平均總量的葡萄糖，，使用RHI時多于使用VIAjectTM(CE)時6倍，而使用Lispro時多于 使用VIAject (CE)時2倍。對每組所有患者計(jì)算的正常血糖目標(biāo)區(qū)以上和以下的面積(BG 曲線下面積(AUC)高于140mg/dL、低于80mg/dL)的總和為使用RHI時81，895mg/dL*min， 使用 Lispro 時 57，423mg/dL*min，并且使用 VIAject 時 38，740mg/dL*min。平均血糖水平 示于圖8中?？偨Y(jié)來說，VIAject (CE)扭轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)餐后血糖上升的作用最快。用VIAject 治療 的患者經(jīng)歷餐后血糖偏移度的降低。與此相比，使用RHI時血糖偏移度最高，這符合它的最 低的吸收率。與使用Lispro時相比，使用VIAject 時葡萄糖水平的變化(最高值和最低 值的平均差)顯著較小，證實(shí)了 VIAject 更好地控制了這些1型糖尿病患者的血糖。通過以上描述本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能清楚理解本發(fā)明的修改和改變都落入所附權(quán) 利要求的范圍內(nèi)。
1權(quán)利要求
一種可注射的胰島素組合物，其含有胰島素與有效量的溶解劑和鋅螯合劑，以與聯(lián)合鋅螯合劑和HCl的胰島素相比，提高所述胰島素通過上皮細(xì)胞的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述藥劑選自由人胰島素和胰島素類似物組成的組。
3.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述藥劑為人胰島素。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述螯合劑選自由乙二胺四乙酸(EDTA)、EGTA、檸檬 酸三鈉(TSC)、海藻酸、α-硫辛酸、二巰基丁二酸(DMSA)、⑶TA (1，2-環(huán)己二胺四乙酸)組 成的組。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述溶解劑為選自由醋酸、抗壞血酸、檸檬酸、谷氨 酸、琥珀酸、天冬氨酸、馬來酸、富馬酸和己二酸組成的組中的酸。
7.權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述溶解劑為檸檬酸。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述螯合劑的濃度范圍相當(dāng)于2.42Χ10_4Μ至 9. 68 X ICT2M 的 EDTA0
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述溶解劑的濃度范圍相當(dāng)于9.37Χ ICT4M至 9. 37 X KT2M的檸檬酸。
10.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述鋅螯合劑為EDTA，所述溶解劑為檸檬酸，并且 所述螯合劑的濃度范圍相當(dāng)于2. 42Χ 10_4Μ至9. 68Χ 10_2Μ的EDTA，所述溶解劑的濃度范圍 相當(dāng)于9. 37 X ICT4M至9. 37 X ICT2M的檸檬酸。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胰島素以干燥粉末的形式設(shè)置在第一容器內(nèi)， 并且所述螯合劑和溶解劑中的至少一種設(shè)置在含有稀釋劑的第二容器內(nèi)。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其以冷凍的可藥用的藥劑的形式被提供來治療糖尿病。
13.一種治療糖尿病個體的方法，該方法包括注射有效量的可注射的胰島素組合物， 該組合物包含胰島素與有效量的溶解劑和鋅螯合劑，以與聯(lián)合鋅螯合劑和HCl的胰島素相 比，提高所述胰島素通過上皮細(xì)胞的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。
全文摘要
本發(fā)明描述了具有改善的穩(wěn)定性并且快速起效的可注射的胰島素制劑。該制劑可以皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)施用，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該制劑通過皮下注射施用。該制劑含有胰島素并聯(lián)合螯合劑、和溶解劑、以及可任選添加的賦形劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該制劑含有人胰島素、鋅螯合劑(例如EDTA)和溶解劑(例如檸檬酸)。當(dāng)通過皮下注射施用這些制劑時，其迅速地被吸收入血流中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素以干燥粉末的形式設(shè)置在無菌瓶內(nèi)。在施用前或施用時，將其與含有可藥用的載體(例如水)的稀釋液、鋅螯合劑(例如EDTA)和溶解劑(檸檬酸)混合。在另一個實(shí)施方案中，該胰島素以冷凍混合物形式貯存，解凍后可隨時使用。
文檔編號A61K38/26GK101883609SQ200880118760
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者所羅門·S·斯坦納, 羅德里克·波爾 申請人:百達(dá)爾公司