針對流感病毒的多種亞型的新穎疫苗的制作方法

專利名稱：針對流感病毒的多種亞型的新穎疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及改進的流感疫苗、改進的用于誘導針對流感的免疫反應和用于預防性 地和/或治療性地針對流感免疫個體的方法。背景已研究接種針對動物和人類疾病的核酸序列的使用。研究已集中于有效力和有效 率的遞送手段以產生期望抗原的必要表達，產生免疫原性反應和最后這項技術的成功。一 種用于遞送核酸序列例如質粒DNA的方法是電穿孔(EP)技術。該技術已被用于人臨床試 驗以遞送抗癌藥物例如博來霉素并用于對大量動物物種的許多臨床前研究中。流感病毒基因組包含在編碼i^一種蛋白(HA、NA、NP、Ml、M2、NS1、NEP、PA、PB1、 PB1-F2、PB2)的八個單(非成對的)RNA鏈上。基因組的分段性質允許不同病毒菌株的全部 基因在細胞共居過程中交換。八個RNA區段是HA，它編碼血球凝集素(需要大約500個血 球凝集素分子組成一個病毒粒子)；NA，它編碼神經氨酸酶(需要大約100個神經氨酸酶分 子組成一個病毒粒子)；NP，它編碼核蛋白；M，它通過使用來自相同RNA區段的不同閱讀框 來編碼兩種基質蛋白(Ml和M2)(需要大約3000個基質蛋白分子組成一個病毒粒子)；NS， 它通過使用來自相同RNA區段的不同閱讀框來編碼兩種不同的非結構蛋白(NS1和NEP)； PA，它編碼RNA聚合酶；PB1，它通過使用來自相同RNA區段的不同閱讀框來編碼RNA聚合物 和PB1-F2蛋白(誘導凋亡)；以及PB2，它編碼RNA聚合酶。流感病毒血球凝集素(HA)在流感病毒粒子的表面表達并且負責該病毒與其宿主 細胞之間的最初接觸。HA是一種公知的免疫原。甲型流感菌株H5W為一種禽流感菌株，因 其HA蛋白(H5)而特別地威脅人類種群，如果通過自然突變稍微遺傳重配，它相比于病毒的 其他菌株具有大大提高的對人類細胞的傳染性。嬰兒和老人或無免疫應答的成人感染病毒 H5N1菌株通常與差的臨床結果相關聯。因此，公眾非常需要針對流感H5W菌株的保護。有兩類可利用的抗流感劑，甲型流感細胞進入/脫殼抑制劑(例如抗病毒藥金剛 烷胺和金剛乙胺)和神經氨酸酶抑制劑(例如抗病毒藥奧塞米韋、扎那米韋)。這些抗病毒 劑抑制甲型和乙型流感病毒的細胞釋放。由于對這些藥劑有抵抗力的病毒菌株的發現，已 報道了對使用這些藥劑的憂慮。流感疫苗是流行性季節性疫苗，許多人經歷過此類接種。然而，接種的保護結果是 有限的，因為疫苗對某些病毒亞型是特異性的。疾病控制與預防中心推進用“流感針(flu shot)”接種，所述流感針是包含三種流感病毒(滅活病毒)的疫苗一種甲型(H3N2)病毒、 一種甲型(H1N1)病毒和一種乙型病毒。每年他們還基于國際監督和科學家對于在給定年 中病毒的哪種型和菌株將流行的估測來報道在該疫苗中的病毒改變。因此，很明顯接種疫 苗受限于亞型的預測和針對那種亞型的特定疫苗的可用性。
對于經濟的和在許多亞型都有效的有效流感疫苗仍存有需求。此外，為了在預防 上或治療上提供針對流感的免疫，對于向哺乳動物施用DNA疫苗的有效方法存有需求。發明概述本發明的一個方面涉及能夠在哺乳動物中產生針對多種流感病毒亞型的免疫反 應的DNA質粒疫苗，包含DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑。所述DNA質粒能夠在哺乳動 物的細胞中以有效引發哺乳動物中免疫反應的量表達共有流感抗原，其中所述共有流感抗 原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白、核蛋白、M2胞外結構域核蛋白 (M2e-NP)或它們的組合。優選地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它們的組合。所 述DNA質粒包含與編碼所述共有流感抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子。優選地，所 述DNA質粒疫苗是具有lmg/ml或更大的總DNA質粒濃度的疫苗。本發明的另一方面涉及能夠在哺乳動物細胞中表達共有流感抗原的DNA質粒，所 述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白、核蛋白、M2胞外 結構域核蛋白(M2e-NP)或它們的組合。優選地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或 它們的組合。所述DNA質粒包含與編碼所述共有流感抗原的編碼序列可操作地連接的啟動 子。本發明的另一方面涉及在哺乳動物中引發針對多種流感病毒亞型的免疫反應的 方法。所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗并且用有效允許DNA質粒進 入細胞的恒定電流的能量脈沖將所述組織的細胞電穿孔，所述DNA質粒疫苗包括能夠在哺 乳動物的細胞中表達共有流感抗原以引發在哺乳動物中的免疫反應的DNA質粒，所述共有 流感抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它們的組合。附圖簡述通過參考附圖本領域的技術人員可以更好地理解本發明的許多目的和優點，其 中

圖1展示了本文所述研究中使用的DNA質粒構建體的示意圖(質粒圖譜)。通過 分析來自16種H5病毒和超過40種人類m病毒(美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室流感病毒 序列數據庫)的主要病毒序列產生了共有HA、NA和M2e-NP的構建體，所述16種H5病毒 最近幾年中已被證明對人具有致死性。在產生共有序列之后，對所述構建體進行優化用于 哺乳動物表達，包括加入Kozak序列、密碼子優化和RNA優化。然后將這些構建體亞克隆到 pVAX 載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。示出 了質粒 pGX2001 (共有 HA)、pGX2002 (共有 NA)、pGX2003 (共有M2e-NP)。所展示的質粒pCMVSEAP編碼報告蛋白分泌型胚胎堿性磷酸 酶(SEAP)。圖2展示了在注射后第35天豬血清HI滴度的結果的條形圖。在施用了 2mg表達 HA的質粒、以0. 5A的電流設置的組中發現最高滴度(120士40 ；*P = 0. 11相對于2mg/0. 3A 和乍=0. 02相對于2mg/0. 1A)。施用遞減劑量質粒并以0. 5A電穿孔的三組也表現出遞減 的HI滴度。圖3展示了 IFN- y的酶聯免疫斑點計數的條形圖。計數在施用2mg的HA和2mg 的NA質粒疫苗(總計4mg質粒)并以0.3A的電流電穿孔的豬中(2000個斑點)以及在施 用0. 8mg的HA和0. 8mg的NA質粒疫苗(總計1. 6mg質粒)并以0. 5A的電流電穿孔的組 中(934個斑點)是最高的。出于比較的目的，描繪了未免疫的對照組的細胞免疫反應。
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圖4A和4B展示了示出來自第14天和第35天處理的豬的肌肉活組織檢查的結果 的條形圖圖4A展示了示出所有組的平均病理學得分的條形圖。圖4B展示了示出肌肉壞死 和纖維化的得分的條形圖。以6mg的總質粒注射并且在0. 5A電穿孔的組顯示出最高的平均 病理學得分(相比于對照 *P < 0. 0002)。除了 0. 3mg/0. 3A 組(P = 0. 057)和 2. 4mg/0. 1A 組(P = 1. 0)之外在所有組中第35天相比于第14天的病理學得分均顯著降低(P < 0. 05)。圖 5 展示了在以 H5N1 病毒(甲型 / 越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG)攻擊 后雪貂體重的變化百分比。在攻擊后9天的時間內，以HA、HA+M2e-NP或HA+M2e_NP+NA接 種的雪貂損失的體重顯著小于對照動物(相對于對照乍< 0. 005)。HA疫苗組中一只動物 實際上在攻擊后增加了體重。圖6展示了示出在攻擊后9天期間的雪貂體溫的圖。對照動物顯示比接種動物體 溫更高。沒有描繪第5天的體溫，因為它是在那天的不同時間測量的，并且不論哪組所有溫 度都更低。圖7展示了來自雪貂接種后HI滴度結果的條形圖；使用從疾病控制中心獲得的重 配病毒進行測定甲型/越南/1203/04或印度尼西亞/05/2005流感菌株。圖8展示了來自第二次免疫后三周測量的HI滴度的結果的條形圖。皮內(ID)免 疫僅接著電穿孔(EP)的獼猴示出比所有其他組顯著更高的HI滴度(P < 0. 03)。無處理的 對照沒有顯示出任何HI滴度。優選實施方案的詳細描述給出下述簡略或簡短的定義以幫助理解本發明的優選實施方案。這里所給出的簡 略的定義絕不是窮舉性的，它們與本領域理解的定義或字典含義也絕不矛盾。在這里給出 簡略的定義是為了補充或更清晰地界定本領域中已知的定義。定義如本文使用的核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST (Altschul等人，Nuc. Acids Res.，1997，25，3389，其以全文通過引用并入本文)以 及 PAUP*4. OblO 軟件(D. L. Swofford,SinauerAssociates,Massachusetts)確定。簡言之， BLAST算法代表基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，它適合于 確定序列相似性(Altschul等人，J. Mol. Biol.，1990，215，403-410，其以全文通過引用并 入本文)。用于執行BLAST分析的軟件是通過美國國家生物技術信息中心(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov)公共可利用的。由BLAST算法提供的一個相似性量度是最小和概率 (P (N))法，它提供了在兩條核苷酸序列之間的匹配將偶然發生的概率的指示。例如，如果在 測驗核酸與另一種核酸的比較中最小和概率小于大約1、優選地小于大約0. 1、更優選地小 于大約0. 01、以及最優選地小于大約0. 001，那么認為該核酸與所述另一種核酸是相似的。 可使用 PAUP*4. OblO 軟件(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)計算“相 似性的百分比”。計算出與系統進化樹中的所有序列相比共有序列的平均相似性。如本文使用的術語“基因構建體”或“核酸構建體”可被互換使用并且都是指包含 編碼蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列或“編碼核酸序列”包括可操作地與 調控元件連接的起始信號和終止信號，所述調控元件包括能夠在施用了所述核酸分子的個 體的細胞中指導表達的啟動子和聚腺苷酸化信號。如本文使用的術語“可表達的形式”是指包含必要調控元件的核酸構建體，所述調控元件與編碼蛋白的編碼序列可操作的連接以使得當所述編碼序列存在于個體的細胞中 時將被表達。本文使用術語“恒定電流”來定義由組織或界定所述組織的細胞在遞送到相同組 織的電脈沖的持續期間所接受或經歷的電流。所述電脈沖是從本文所述的電穿孔裝置中遞 送的。這種電流在電脈沖的存在期在所述組織中保持恒定安培數，因為本文提供的電穿孔 裝置具有反饋元件，優選地具有瞬時反饋。所述反饋元件能夠測量整個脈沖持續期間組織 (或細胞)的阻抗并引起電穿孔裝置改變其電能輸出(例如增加電壓)，所以相同組織中的 電流在整個電脈沖(微妙數量級)以及從脈沖到脈沖中保持恒定。在一些實施方案中，反 饋元件包括控制器。術語“反饋”或“電流反饋”可被互換使用并且表示所提供的電穿孔裝置的主動反 應，所述反應包括測量在電極之間的組織中的電流并且因此改變由EP裝置遞送的能量輸 出以保持電流在恒定水平。這個恒定水平是由使用者在脈沖序列或電處理開始之前預先設 定。優選地，反饋是由電穿孔裝置的電穿孔部件例如控制器完成的，因為其中的電路能夠連 續地監測在電極之間的組織中的電流并將被監測的電流(或組織內的電流)與預設電流進 行比較，并且能夠連續地進行能量輸出調整以保持監測的電流在預設水平。在一些實施方 案中，所述反饋環路是瞬時的，因為它是類似物閉合環路反饋。如本文可互換使用的術語“電穿孔”、“電滲透”或“電動力學增強”(“EP”)是指 使用跨膜電場脈沖來誘導生物膜中的微觀途徑(孔)；這些微觀途徑的存在允許生物分子 例如質粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子和水從細胞膜的一側通過到另一側。本文使用術語“分散電流”來定義從本文所述的電穿孔裝置的各個針電極陣列中 遞送的電流模式，其中所述模式使得在被電穿孔的組織的任何區域上的電穿孔相關的熱應 激的發生減到最小或者優選地將其消除。如本文使用的術語“反饋機制”是指通過軟件或硬件(或固件)執行的過程，所述 過程接收期望組織的阻抗(在遞送能量脈沖之前、期間中和/或之后)并將其與現值(優 選地是當前值)進行比較，并且調整遞送的能量脈沖以達到預設值。當討論反饋機制時術 語“阻抗”被本文使用并且能夠根據歐姆定律被轉換為電流值，由此能夠與預設電流比較。 在一個優選的實施方案中，“反饋機制”是通過類似物閉合環路執行的。本文使用術語“免疫反應”來表示宿主的免疫系統例如哺乳動物的免疫系統的激 活，作為對通過所提供的DNA質粒疫苗引入流感共有抗原的反應。免疫反應可以是細胞反 應或體液反應的形式或二者兼有。本文使用術語“共有”或“共有序列”來表示基于特定流感抗原的多個亞型的比對 的分析而構建的合成的核酸序列或對應的多肽序列，其可被用來誘導針對特定流感抗原的 多個亞型或血清型的廣泛的免疫性。共有流感抗原包括HA(包括共有的H1、H2、H3或H5)、 NA、NP、基質蛋白和非結構蛋白。同樣，可將合成的抗原例如融合蛋白(例如M2e-NP)操作 為共有序列(或共有抗原)。本文使用術語“佐劑”來表示加到本文所述的DNA質粒疫苗中以增強由所述DNA質 粒和下文所述的編碼核酸序列所編碼的流感抗原的抗原性的任何分子。術語“亞型”或“血清型”可被本文互換使用并且是關于流感病毒，表示流感病毒抗 原的遺傳變體以致于一個亞型被免疫系統識別以區別于一個不同的亞型(或者換句話說，
8每個亞型與不同亞型在抗原特征上是不同的)。在一些實施方案中，具有能夠在哺乳動物細胞中表達共有流感抗原的DNA質粒， 所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白、核蛋白、M2胞 外結構域核蛋白(M2e-NP)或它們的組合。優選地，共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它 們的組合。DNA質粒包含與編碼共有流感抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子。在一些實施方案中，本發明提供了能夠在哺乳動物中產生針對多種流感病毒亞型 的免疫反應的DNA質粒疫苗，所述DNA質粒疫苗包含DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑。所 述DNA質粒能夠以有效引發該哺乳動物中免疫反應的量在哺乳動物細胞中表達共有流感 抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白、核 蛋白、M2胞外結構域核蛋白(M2e-NP)或它們的組合。優選地，所述共有流感抗原包括HA、 NA、M2e-NP或它們的組合。所述DNA質粒包含與編碼所述共有流感抗原的編碼序列可操作 地連接的啟動子。在一些實施方案中，所述DNA質粒疫苗是具有lmg/ml或更大的總DNA質 粒濃度的疫苗。所述免疫反應可以是細胞反應或體液反應或二者兼有；優選地，所述免疫反 應是細胞和體液二者兼有。在一些實施方案中，DNA質粒能夠還包括與編碼序列的N端末端相連并與啟動子 可操作地連接的IgG前導序列。此外，在一些實施方案中，DNA質粒能夠還包括與編碼序列 的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。在一些實施方案中，DNA質粒是密碼子優化的。在本發明的一些實施方案中，DNA質粒疫苗能夠還包括佐劑。在一些實施方案中， 佐劑選自以下組成的組a-干擾素、干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF_a、 TNF-0、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達的 趨化因子(TECK)、粘膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL_15、MHC、⑶80、⑶86，包括具有 被刪除信號序列的IL-15并任選地包括來自IgE的信號肽。可能是有用的佐劑的其他基因 包括編碼以下的基因MCP-l、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、 E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac_l、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、 ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的突變形式、CD40、CD40L、血管生 長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、 Apo-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、 DR6、胱天蛋白酶比￡、？08、(；-」1111、5 -14 -14 -24384651^1、]\^088、11^1(、11^ 6、11^、無 活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、 TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、 NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它們的功能片段。在一些優選的實施方案中，佐劑選 自 IL-12、IL-15、CTACK、TECK 或 MEC。在一些實施方案中，藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑，它可包括以下轉染促 進劑表面活性劑例如免疫刺激復合物(ISC0MS)；弗氏不完全佐劑；LPS類似物，包括單 磷酰脂質A ；胞壁酰肽；醌類似物；小囊泡(vesicle)例如角鯊烯和菠菜烯(squalene and squalene)；透明質酸；脂質；脂質體；韓離子；病毒蛋白；聚陰離子；聚陽離子；或納米顆粒 或者其他已知的轉染促進劑。優選地，轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子、包括聚L谷氨酸 (LGS)或脂質。優選地，轉染促進劑是聚L谷氨酸，并且更優選地，聚L谷氨酸以小于6mg/ ml的濃度存在于DNA質粒疫苗中。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗中聚L谷氨酸的濃度小于 4mg/ml、小于 2mg/ml、小于 lmg/ml、小于 0. 750mg/ml、小于 0. 500mg/ml、小于 0. 250mg/ ml、小于 0. 100mg/ml、小于 0. 050mg/ml 或小于 0. 010mg/mlo在一些實施方案中，DNA質粒疫苗可包括多種不同的DNA質粒。在一些實施例中， 不同的DNA質粒包括含有編碼共有HA的核酸序列的DNA質粒、含有編碼共有NA的序列的 DNA質粒和含有編碼共有M2e-NP的序列的DNA質粒。在一些實施方案中，共有HA是共有 HI、共有H2、共有H3或共有H5。優選地，共有HA是核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQ ID NO 1 (H5N1HA 共有 DNA)、SEQ ID NO 9(共有 HI 的 DNA)、SEQID N0 11(共有 H3 的 DNA)或 SEQ ID 而13(共有115)。共有 HA 還可以是對序列 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 14的多肽進行編碼的核苷酸序列。在一些實施方案中，共有NA是為 SEQ IDN0 :3的核苷酸序列或對序列SEQ ID NO :4的多肽進行編碼的核苷酸序列。在一些 實施方案中，共有M2e-NP是為SEQ ID NO 7的核苷酸序列或對序列SEQ ID NO 8的多肽進 行編碼的核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，DNA質粒疫苗包括包含編碼共有HI的序 列的DNA質粒、包含編碼共有H2的序列的DNA質粒、包含編碼共有H3的序列的DNA質粒、 包含編碼共有H5的序列的DNA質粒、包含編碼共有NA的序列的DNA質粒和包含編碼共有 M2e-NP的序列的DNA質粒。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗可包括多種不同的DNA質粒，所述DNA質粒包括 能夠表達共有流感抗原的至少一種DNA質粒和能夠表達一種流感亞型抗原的至少一種DNA 質粒。在一些實施例中，表達共有抗原的不同的DNA質粒包括含有編碼共有HA的核酸序列 的DNA質粒、含有編碼共有NA的序列的DNA質粒和含有編碼共有M2e_NP的序列的DNA質 粒。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗包括能夠表達共有HA抗原例如共有的HI、H3或H5 的DNA質粒和能夠表達以下甲型流感抗原中的任何一種的DNA質粒H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、 NS1或NEP，或其組合。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗包括能夠表達共有NA抗原的DNA 質粒和能夠表達以下甲型流感抗原的任一種的DNA質粒HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1 或 NEP， 或其組合。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗包括能夠表達共有M2e-NP的DNA質粒和能夠 表達以下甲型流感抗原中的任何一種的DNA質粒H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、 H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1 或 NEP，或其 組合。在一些實施方案中，可以將DNA質粒疫苗遞送給哺乳動物以弓丨發免疫反應；優選 地，哺乳動物是靈長類動物，包括人類和非人類的靈長類動物、牛、豬、雞、狗或雪貂。更優選 地，哺乳動物是人類靈長類動物。本發明的一個方面涉及在哺乳動物中引發針對多種流感病毒亞型的免疫反應的 方法。所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗并且用有效允許DNA質粒進 入細胞的恒定電流的能量脈沖將所述組織的細胞電穿孔，所述DNA質粒疫苗包括能夠在哺 乳動物的細胞中表達共有流感抗原以引發在哺乳動物中的免疫反應的DNA質粒，所述共有 流感抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它們的組合。在一些實施方案中，本發明的方法包括遞送步驟，所述遞送步驟包括將DNA質粒 疫苗注射到皮內、皮下或肌肉組織中。優選地，這些方法包括使用體內電穿孔裝置來預先設定期望被遞送到組織的電流；并且以等于預設電流的恒定電流的能量脈沖將所述組織的細 胞電穿孔。在一些實施方案中，電穿孔步驟還包括測量電穿孔的細胞中的阻抗；相對于測 量的阻抗調整能量脈沖的能量水平以保持電穿孔細胞中的恒定電流；其中測量和調整步驟 發生在能量脈沖的存在期內。在一些實施方案中，電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送能量脈沖的脈沖序列模 式將能量脈沖遞送至多個電極。在一些實施方案中，本發明的DNA質粒流感疫苗包括編碼共有HA或共有HA的核 苷酸序列和編碼選自以下組成的組的流感蛋白的核酸序列SEQ ID N0:4、6和8。SEQ ID NO 1和13分別包括編碼流感病毒的共有H5m HA和H5的核酸序列。SEQ ID NO 2和14分 別包括流感病毒的共有H5W HA和H5的氨基酸序列。在本發明的一些實施方案中，本發明 的疫苗包含 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。SEQ ID NO :3 包含編碼流感Hmi 和 H5m (H1N1/ H5N1)的NA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO :4包含流感H1N1/H5m的NA共有序列的氨 基酸序列。在本發明的一些實施方案中，本發明的疫苗包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 6。SEQ ID NO :5包含編碼流感H1N1/H5m的Ml共有序列的核酸序列。SEQ ID NO :6包含 流感Hmi/H5m的Ml共有序列的氨基酸序列。在本發明的一些實施方案中，本發明的疫苗 包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8。SEQ ID NO :7包含編碼流感H5m的M2E-NP共有序列 的核酸序列。SEQ ID NO :8包含流感H5m的M2E-NP共有序列的氨基酸序列。在本發明的 一些實施方案中，本發明的疫苗包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10。SEQ ID NO 9包含編 碼流感Hmi的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO 4包含流感Hmi的NA共有序列的氨 基酸序列。在本發明的一些實施方案中，本發明的疫苗包含SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12。SEQ ID NO : 11包含編碼流感H3m的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID N0:12包含流 感H3m的HA共有序列的氨基酸序列。流感病毒菌株H5W的HA共有序列包括SEQ IDN0 1 或SEQ ID NO 13中列出的免疫優勢表位。由SEQ ID NO 1編碼的流感病毒H5W的HA氨 基酸序列是SEQ ID N0 2并且由SEQ ID NO 13編碼的流感病毒H5W的HA氨基酸序列是 SEQ ID NO :140流感病毒H1N1/H5m的NA共有序列包括SEQ ID NO :3中列出的免疫優勢 表位。由SEQ ID NO :3編碼的流感病毒菌株Hmi/H5m的NA氨基酸序列是SEQ ID NO :4。 流感病毒菌株Hmi/H5m的Ml共有序列包括SEQ IDN0 5中列出的免疫優勢表位。由SEQ ID NO 5編碼的流感病毒H1N1/H5m的Ml氨基酸序列是SEQ ID NO :6。流感病毒H5W的 M2E-NP共有序列包括SEQ ID NO :7中列出的免疫優勢表位。由SEQ ID NO :7編碼的流感 病毒H5W的M2E-NP氨基酸序列是SEQ ID NO :8。本發明的疫苗可包括由以上定義核酸分 子所編碼的蛋白質產物或任何的蛋白質片段。本發明還包括編碼能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽的DNA片段，所述免疫 反應基本上類似于至少一種流感亞型的非片段的免疫反應。當所述DNA片段應用于本文提 供的特定編碼核酸序列時，它是選自于本發明的各種編碼核苷酸序列的至少一種的片段， 包括SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll和13，并且可以是以下所述DNA片段中的任一種。在一些實 施方案中，DNA片段可包含30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或更 多、120個或更多、150個或更多、180個或更多、210個或更多、240個或更多、270個或更多、 300個或更多、360個或更多、420個或更多、480個或更多、540個或更多、600個或更多、660 個或更多、720個或更多、780個或更多、840個或更多、900個或更多、960個或更多、1020個
11或更多、1080個或更多、1140個或更多、1200個或更多、1260個或更多、1320個或更多、1380 個或更多、1440個或更多、1500個或更多、1560個或更多、1620個或更多、1680個或更多或 者1740個或更多的核苷酸。在一些實施方案中，DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前導 序列的編碼序列。在一些實施方案中，DNA片段可包括少于60、少于75、少于90、少于120、 少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少 于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、少 于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于 1560、少于1620、少于1680或者少于1740個核苷酸。優選地，DNA片段是SEQ ID NO :1、3、 7、9、11或13的片段，并且更優選地是SEQ ID N0:l、5、9、ll或13的片段，并且甚至更優選 地是SEQ ID N0S :1、9或13的片段。本發明還包括能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽片段，所述免疫反應基本上 類似于至少一種流感亞型的非片段的免疫反應。當所述多肽片段應用于本文提供的特定多 肽序列時，它們選自于本發明的各種多肽序列的至少一種，包括SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12 和14，并且可以是以下所述多肽片段中的任一種。在一些實施方案中，多肽片段可包括15 個或更多、30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或更多、105個或更 多、120個或更多、150個或更多、180個或更多、210個或更多、240個或更多、270個或更多、 300個或更多、360個或更多、420個或更多、480個或更多、540個或更多或者565個或更多 的氨基酸。在一些實施方案中，多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、 少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少 于480、少于540或者少于565個氨基酸。優選地，多肽片段是SEQ ID NO :2、4、8、10、12或 14的片段，并且更優選地是SEQ ID NO :2、6、10、12或14的片段，并且甚至更優選地是SEQ ID N0S :2、10 或 14 的片段。在哺乳動物中引發基本上類似于至少一種流感亞型的非片段的免疫反應的免疫 反應的片段的確定，可容易地由本領域普通技術人員確定。如由公共可利用的數據庫例如 美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室流感病毒序列數據庫所提供的，可分析所述片段以包含至少 一個、優選地更多個抗原表位。此外，可使用小鼠和HI滴度以及酶聯免疫斑點分析常規地 評估免疫反應研究，例如在下文實施例中所示。根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株H5m共有HA蛋白、其功能片段或其可 表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由此類核酸分子編 碼的蛋白或其片段。根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株Hmi和流感菌株H5m共有NA蛋白、其 功能片段或其可表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由 此類核酸分子編碼的蛋白或其片段。根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株Hmi和流感菌株H5m共有Ml蛋白、其 功能片段或其可表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由 此類核酸分子編碼的蛋白或其片段。
根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株H5m的M2E-NP共有蛋白、其功能片段 或其可表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由此類核酸 分子編碼的蛋白或其片段。根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株Him的HA共有蛋白、其功能片段或其 可表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由此類核酸分子 編碼的蛋白或其片段。根據本發明的一些實施方案，在哺乳動物中誘導或引發針對多種流感病毒的免疫 反應的方法包括向所述哺乳動物施用a)流感菌株H3m的HA共有蛋白、其功能片段或其 可表達的編碼序列；和b) —種或多種本文所提供的分離的編碼核酸分子、由此類核酸分子 編碼的蛋白或其片段。在本發明的一些實施方案中，本發明的疫苗包括以下序列的至少兩種SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14，或者上述名單中的兩種或多種序列的任何組合。疫苗在一些實施方案中，本發明通過提供蛋白和編碼具有如下表位的蛋白的基因構建 體而提供了改進的疫苗所述表位使得蛋白作為免疫原是特別有效的，針對所述免疫原免 疫反應可被誘導。因此，可提供疫苗以誘導治療性或預防性免疫反應。根據本發明的一些實施方案，將根據本發明的疫苗遞送給個體來調節個體免疫系 統的活性并由此增強免疫反應。當編碼所述蛋白的核酸分子被所述個體的細胞攝取時，所 述核苷酸序列在細胞中被表達并且所述蛋白由此被遞送給個體。本發明的各方面提供了在 核酸分子例如質粒上遞送蛋白的編碼序列的方法。根據本發明的某些方面，提供了預防性和/或治療性免疫個體的組合物和方法。當被細胞攝取時，DNA質粒能夠作為分離的遺傳物質留在細胞中。可替代地，RNA 可被施用至細胞。還可慮提供作為線性微小染色體的基因構建體，包括著絲粒、端粒和復制 起點。基因構建體包括核酸分子的基因表達必需的調控元件。所述元件包括啟動子、起始 密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。此外，增強子通常為編碼靶蛋白或免疫調節蛋白的 序列的基因表達所需。有必要將這些元件與編碼期望蛋白的序列可操作地連接并且調節元 件可操作地處于它們被施用的個體中。一般認為起始密碼子和終止密碼子是編碼期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然 而，有必要的是這些元件在施用核酸構建體的哺乳動物中是有功能的。起始密碼子和終止 密碼子必須與編碼序列處于框內。所使用的啟動子和聚腺苷酸化信號必須是在個體細胞中有功能的。實施本發明尤其是在人基因疫苗的生產中有用的啟動子的實例包括但不限于來 自猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如牛 免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復(LTR)的啟動子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽白血病病毒 (ALV)、巨細胞病毒(CMV)例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(EBV)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)的啟動子，以及來自人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人 金屬硫蛋白(metalothionein)的啟動子；在其他實施方案中，啟動子可以是組織特異性啟 動子例如肌肉或皮膚特異性啟動子，天然的或合成的。此類啟動子的實例描述于美國專利 申請公開號US20040175727中，其以全文由此并入本文。實施本發明尤其是在人基因疫苗的生產中有用的聚腺苷酸化信號的實例包括但 不限于SV40聚腺苷酸化信號、LTR聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、人 生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號和人珠蛋白聚腺苷酸化信號。具體而言，可使用pCEP4 質粒(Invitrogen，SanDiego, CA)中的SV40聚腺苷酸化信號，稱為SV40聚腺苷酸化信號。除了 DNA表達所需的調控元件之外，其他元件也可以被包括在DNA分子中。此類另 外的元件包括增強子。增強子可選自于包括但不限于以下的組人肌動蛋白、人肌球蛋白、 人血紅蛋白、人肌肉肌酸和病毒增強子例如來自CMV、RSV和EBV的增強子。基因構建體可以被提供哺乳動物復制起點以便使構建體保持在染色體外并且在 細胞中產生構建體的多個拷貝。來自Invitrogen (San Diego, CA)的質粒pVAXl、pCEP4和 pREP4包含EB病毒的復制起點和產生高拷貝的未整合附加型復制的核抗原EBNA-1編碼區。為了使蛋白的產生達到最大，可選擇如下調控序列很好地適合于在構建體被施 入的細胞中的基因表達。此外，可選擇如下編碼所述蛋白的密碼子在所述宿主細胞中被最 有效率地轉錄。本領域普通技術人員可生產在細胞中有功能的DNA構建體。在一些實施方案中，可提供如下核酸構建體其中本文所述蛋白的編碼序列與 IgE信號肽相連。在一些實施方案中，本文所述的蛋白與IgE信號肽相連。在使用蛋白的一些實施方案中，例如，本領域普通技術人員可使用公知技術生產 并使用公知技術分離本發明的蛋白。在使用蛋白的一些實施方案中，例如，本領域普通技術 人員可使用公知技術將編碼本發明的蛋白的DNA分子插入到在公知表達系統中使用的可 商購獲得的表達載體中。例如，可商購獲得的質粒PSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.) 可被用于在大腸桿菌(E.coli)中生產蛋白。例如，可商購獲得的質粒pYES2 (Invitrogen， San Diego, Calif.)可被用于在酵母的釀酒酵母菌株中的生產。例如，可商購獲得的 MAXBAC 完整的桿狀病毒表達系統(Invitrogen，San Diego, Calif.)可用于在昆蟲細胞中 的生產。例如，可商購獲得的質粒pcDNA I或pcDNA3 (Invitrogen，San Diego，Calif.)可 用于在哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中的生產。本領域普通技術人員可使用 這些商品化表達載體和系統或以其他方式通過常規技術和可容易獲得的起始材料生產蛋 白(參見例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆實驗 指南)，第二版.Cold Spring Harbor Press (1989))。因此，可以在原核和真核系統中制備 期望蛋白，產生蛋白的各種加工形式。本領域普通技術人員可使用其他可商購獲得的表達載體和系統或者使用公知方 法和容易獲得的起始材料來生產載體。包含必要的調控序列例如啟動子和聚腺苷酸化信號 以及優選地增強子的表達系統可容易地獲得并且在本領域中對于各種宿主是已知的。參見 例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆實驗指南)，第 二版.ColdSpring Harbor Press (1989)。基因構建體包括與啟動子可操作地連接的蛋白編 碼序列，所述啟動子在構建體被轉染的細胞系或靶組織的細胞中是有功能的。組成型啟動 子的實例包括來自巨細胞病毒(CMV)或SV40的啟動子。誘導型啟動子的實例包括小鼠乳腺白血病病毒或金屬硫蛋白的啟動子。本領域普通技術人員可從容易獲得的起始材料中容 易地生產對于用編碼本發明的蛋白的DNA轉染細胞有用的基因構建體。將包括編碼蛋白的 DNA的表達載體用來轉化相容的宿主，然后將所述宿主培養并保持在其中發生外源DNA的 表達的條件下。按照對本領域技術人員來說適當且已知的，通過溶解細胞或者從培養基中將產生 的蛋白從培養物中回收。本領域普通技術人員可使用公知技術來分離使用此類表達系統 生 產的蛋白。使用與以上所述的特定蛋白特異性結合的抗體從自然來源中純化蛋白的方法可 同樣地應用于通過重組DNA方法產生的純化蛋白。除了通過重組技術生產蛋白之外，還可以采用自動化肽合成器來生產分離的、基 本上純的蛋白。此類技術對于本領域普通技術人員是公知的，并且如果具有取代的衍生物 沒有為DNA編碼的蛋白的生產中提供的話，此類技術是有用的。可使用幾種公知技術中的任一種遞送核酸分子，所述技術包括有和沒有體內電 穿孔的DNA注射(也稱為DNA接種)，脂質體介導，納米顆粒推進，重組載體例如重組腺病 毒、病毒相關的重組腺病毒和重組牛痘苗。優選地，本文所述的核酸分子例如DNA質粒是通 過DNA注射以及與體內電穿孔共同遞送的。施用途徑包括但不限于肌內、鼻內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、動脈內、眼內和 口服以及局部地、經皮、通過吸入或栓劑或者至粘膜組織，例如通過灌洗至陰道、直腸、尿 道、口腔或舌下的組織。優選的施用途徑包括肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。基因構建 體可以通過如下手段施用，包括但不限于傳統注射器、無針注射裝置、“微彈轟擊基因槍 (microprojectile bombardment gone gun) ”或其他物理方法例如電穿孔(“EP”)、“流體 動力學方法”或超聲。用于促進本發明的DNA疫苗的遞送的優選的電穿孔裝置和電穿孔方法的實 例包括在Draghia-Akli等人的美國專利號7，245,963、Smith等人遞交美國專利公布 2005/0052630中描述的那些，兩篇文獻的內容均以全文通過引用并入本文。用于促進下 述文獻中提供的DNA疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法也是優選的2007年10月17 號提交的共同待審和共有擁有的美國專利申請系列號11/874072，它要求享有美國法典第 35條119款之下對2006年10月17日提交的美國臨時申請序列號60/852，149和2007年 10月提交的60/978，982的權益，所有這些文獻均以全文并入本文。優選的，電穿孔裝置是 CELLECTRA 裝置(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)，包括肌內(IM)和皮內(ID)模 型。Draghia-Akli等人的美國專利號7，245，963描述了模塊化電極系統和它們用于 促進將生物分子引入到身體或植物內的選定組織的細胞中的用途。模塊化電極系統包括多 個針狀電極；皮下的針；提供從程序化恒定電流脈沖控制器到所述多個針狀電極的導電連 接的電連接器；以及電源。操作者可以抓住裝在支撐結構上的多個針狀電極并將它們牢固 地插入到身體或植物內的選定組織中。然后將生物分子通過皮下的針遞送到選定組織中。 程序化恒定電流脈沖控制器被激活并且恒定電流的電脈沖被應用到多個針狀電極。應用的 恒定電流電脈沖促進將生物分子引入到多個電極之間的細胞中。美國專利號7，245，963的 全部內容通過引用并入本文。Smith等人遞交的美國專利公布2005/0052630描述了可被用來有效促進將生物分子引入到身體或植物內的選定組織的細胞中的電穿孔裝置。所述電穿孔裝置包括由軟件 或固件限定操作的電動力學裝置(“EKD裝置”)。EKD裝置基于使用者的控制和脈沖參數 的輸入在陣列中的電極之間產生一系列可程序化的恒定電流脈沖模式并且允許電流波形 數據的存儲和獲取。電穿孔裝置還包括具有針狀電極陣列的可替代的電極盤、用于注射針 的中心注射通道以及可移去的引導盤。美國專利公布2005/0052630的全部內容通過引用 并入本文。在美國專利號7，245，963和美國專利公布2005/0052630中描述的電極陣列和方 法被修改以用于深深穿入不僅例如肌肉的組織而且還有其他組織或器官。因為電極陣列的 配置，注射針(遞送選擇的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由 電極預先劃定的區域中的靶組織，在美國專利號7，245，963和美國專利公布2005/005263 中描述的電極優選地是20mm長以及21規格(gauge)。以下是本發明的方法的一個實例，并且在以上討論的專利參考文獻中更詳細地被 討論可以配置電穿孔裝置來將產生恒定電流的能量脈沖遞送至哺乳動物的期望組織，所 述恒定電流類似于使用者輸入的預設電流。電穿孔裝置包括電穿孔部件和電極組件或手柄 組件。電穿孔部件可包括并結合電穿孔裝置的各種元件中的一個或多個，包括控制器、電 流波形發生器、阻抗測驗器、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶部件、電 源和電源開關。電穿孔部件能夠作為電穿孔裝置的一個元件發揮作用，并且其他元件是與 電穿孔部件保持聯系的分開的元件(或部件)。在一些實施方案中，電穿孔部件不只能夠作 為電穿孔裝置的一個元件發揮作用，它還能夠與電穿孔裝置的其他元件保持聯系，所述其 他元件與電穿孔部件是分開的。本發明不受作為一個機電或機械裝置的零件而存在的電穿 孔裝置的元件限制，因為所述元件能夠作為一個裝置或者作為彼此保持聯系的分開的元件 起作用。電穿孔部件能夠遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖并且包括反饋機制。 電極組件包括在空間布置中具有多個電極的電極陣列，其中所述電極組件接收來自電穿孔 部件的能量脈沖并且將此能量脈沖通過電極遞送到期望組織。多個電極中的至少一個在遞 送能量脈沖的過程中是中性的，并且測量期望的組織中的阻抗，并且將該阻抗傳遞到電穿 孔部件。反饋機制能夠接收測量的阻抗并且能調整由電穿孔部件遞送的能量脈沖以保持恒 定電流。在一些實施方案中，所述多個電極能夠以分散模式遞送能量脈沖。在一些實施方 案中，所述多個電極能夠通過控制電極于程序化順序以分散模式遞送能量脈沖，并且所述 程序化順序是由使用者向電穿孔部件輸入。在一些實施方案中，程序化順序包括按順序遞 送的多個脈沖，其中多個脈沖中的每個脈沖是通過具有測量阻抗的一個中性電極的至少兩 個活性電極遞送，并且其中多個脈沖中的隨后的脈沖是通過具有測量阻抗的一個中性電極 的至少兩個活性電極中的不同的一個遞送。在一些實施方案中，反饋機制是通過硬件或軟件執行的。優選地，反饋機制是通過 類似物閉合環路執行的。優選地，這種反饋每50i! s、20i! s、10i! s或1 i! S發生，但優選地 是實時反饋或是瞬時的(即如通過用于確定反應時間的可獲得的技術所確定的基本上瞬 時)。在一些實施方案中，中性電極測量期望組織中的阻抗并且將該阻抗傳遞至反饋機制， 該反饋機制對該阻抗作出反應并調整能量脈沖以將恒定電流保持在與預設電流類似的值。 在一些實施方案中，反饋機制在遞送能量脈沖的過程中連續地并瞬時地保持恒定電流。
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藥學上可接受的賦形劑可包括例如運載體(vehicle)、佐劑、載體(carrier)或稀 釋劑這類公共已知并且可容易獲得的功能分子。優選地，藥學上可接受的賦形劑是佐劑或 轉染促進劑。在一些實施方案中，將核酸分子或DNA質粒與施用多核苷酸功能增強劑或基 因疫苗促進劑(或轉染促進劑)聯合遞送至細胞。多核苷酸功能增強劑描述于美國系列號 5，593，972、5，962，428和1994年1月26日提交的國際申請系列號PCT/US94/00899中，這 些文獻各自通過引用并入本文。基因疫苗促進劑描述于1994年4月1日提交的美國系列號 021，579中，其通過引用并入本文。轉染促進劑能夠作為與核酸分子的混合物與核酸分子聯 合施用或者在核酸分子施用同時、之前或之后分開施用。轉染促進劑的實例包括表面活性 劑例如免疫刺激復合物(ISC0MS)；弗氏不完全佐劑；LPS類似物，包括單磷酰脂質A;胞壁 酰肽；醌類似物以及小囊泡例如角鯊烯和菠菜烯；并且也可以使用透明質酸與基因構建體 聯合施用。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗還可以包括轉染促進劑例如脂質；脂質體，包 括卵磷脂脂質體或本領域已知的其他脂質體，為DNA脂質體混合物(參見例如W09324640)； 鈣離子；病毒蛋白；聚陰離子；聚陽離子或納米顆粒；或者其他已知的轉染促進劑。優選地， 轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。在一些優選的實施方案中，將DNA質粒與佐劑一起遞送，所述佐劑是進一步增強 針對此類靶蛋白的免疫反應的蛋白的基因。此類基因的實例是那些編碼其他細胞因子和淋 巴因子的基因，所述細胞因子和淋巴因子例如a-干擾素、干擾素、血小板衍生生長因 子(PDGF)、TNF-a、TNF-3、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15，包括具有被刪除信號序列的IL-15并任選 地包括來自IgE的信號肽。可能有用的其他基因包括編碼以下的基因MCP-l、MIP-la、 MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、 LFA-l、VLA-l、Mac-l、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、 IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長 因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo_l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c_jun、Sp_l、 Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素 反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 體、0x40、0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2 以 及它們的功能片段。根據本發明的藥物組合物包含的DNA量為從約1納克到100毫克；約1微克到約 10毫克；或者優選地約0. 1微克到約10毫克；或者更優選地約1毫克到約2毫克。在一些 優選的實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含約5納克到約1000微克的DNA。在一些 優選的實施方案中，藥物組合物含有約10納克到約800微克的DNA。在一些優選的實施方 案中，藥物組合物含有約0. 1到約500微克的DNA。在一些優選的實施方案中，藥物組合物 含有約1到約350微克的DNA。在一些優選的實施方案中，藥物組合物含有約25到約250 微克的DNA。在一些優選的實施方案中，藥物組合物含有約100到約200微克DNA。根據本發明的藥物組合物是根據待使用的施用方式而配制。在藥物組合物是可注 射的藥物組合物的情況中，它們是滅菌的、無熱原的和無顆粒的。優選地使用等滲制劑。一 般來說，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況中，等滲溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水是優選的。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案 中，將血管收縮劑加到制劑中。在一些實施方案中，使得制劑在室溫或環境溫度穩定延長時 段的穩定劑例如LGS或其他聚陽離子或聚陰離子被加到制劑中。在一些實施方案中，在哺乳動物中弓丨發針對共有流感抗原的免疫反應的方法包括 誘導粘膜免疫反應的方法。此類方法包括向所述哺乳動物施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC 蛋白和它們的功能片段或它們的可表達的編碼序列中的一種或多種，結合包括以上所述的 共有流感抗原的DNA質粒。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它們的功能片段中的一種或 多種可以在本文提供的DNA質粒流感疫苗的施用之前、同時或之后施用。在一些實施方案 中，向哺乳動物施用分離的核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種選自由以下組成的組 的蛋白CTACK、TECK、MEC和它們的功能片段。實施例 在以下實施例中進一步舉例說明了本發明。應當理解這些實施例當指出本發明的 優選實施方案時僅通過舉例說明方式被給出。從以上討論和這些實施例，本領域技術人員 能夠確定本發明的必要特征，并且在不背離本發明的精神和范圍的情況下能夠對本發明作 出各種變動和修改以使其適合于各種運用和條件。因此，從上述描述，本發明的各種修改除 了本文示出并描述的那些之外對本領域技術人員將是明顯的。此類修改也旨在落入所附權 利要求的范圍之內。優選地，供本文所述的肌肉或皮膚EP裝置使用的DNA制劑具有高DNA濃度，優選 包括毫克到數十毫克量并且優選數十毫克量的DNA的濃度，以對于遞送到皮膚最適的小體 積、優選小注射體積、理想的是25-200微升(yL)。在一些實施方案中，所述DNA制劑具有 高DNA濃度，例如lmg/mL或更大(mg DNA/制劑的體積)。更優選地，DNA制劑具有的DNA 濃度提供了 200 μ L的配方中克量的DNA，并且更優選100 μ L的配方中克量的DNA。可使用已知裝置與技術的組合配制或制造供本發明的EP裝置使用的DNA質粒，但 優選使用在以下文獻中所述的優化的質粒制造技術來制造它們共同擁有的、共同待審的 美國臨時申請美國系列號60/939，792，它于2007年5月23日提交。在一些實施例中，在這 些研究中使用的DNA質粒能夠在大于或等于lOmg/mL的濃度配制。制造技術還包括或結合 了本領域普通技術人員通常知道的各種裝置和方案，除了在美國系列號60/939792中描述 的那些之外還包括在下述文獻中描述的裝置和方案2007年7月3日授予的共同擁有的專 利美國專利號7，238，522。供本文描述的皮膚EP裝置和遞送技術使用的高濃度質粒允許質 粒以合理低體積施用到ID/SC空間中并且幫助增強表達和免疫的效應。共同擁有的申請和 專利美國系列號60/939，792和美國專利號7，238，522分別以全文并入本文。實施例1 質粒構建體普遍存在的巨細胞病毒(CMV)啟動子驅使pCMV-SEAP載體中人分泌型胚胎 堿性磷酸酶(SEAP)報告轉基因產物表達。使用可商購獲得的試劑盒(Qiagen Inc., Chatsworth，CA)獲得質粒。內毒素水平為小于0. OlEU/μ g，如通過Kinetic Chromagenic LAL (Endosafe，Charleston，SC)所測量的。通過分析來自16種H5病毒和超過40種人附病 毒的主要病毒序列產生了共有的HA和NA構建體，所述16種H5病毒已在近年中被證明對人 具有致死性。這些序列從美國洛斯阿拉莫斯國家實驗室流感病毒序列數據庫下載。在產生 共有序列之后，對所述構建體進行優化用于哺乳動物表達，包括加入Kozak序列、密碼子優化和RNA優化。然后這些構建體亞克隆到pVAX載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。除非 另外指明，將質粒制品在無菌水中稀釋并且以聚L谷氨酸鈉鹽(LGS)(平均MW= 10. 5kDa) (Sigma, St. Louis,MO)配制 1 %重量 / 重量，在 VGX Pharmaceuticals 免疫治療劑分部(The Woodlands, TX)進一步 HPLC 純化。實施例2豬的處理將豬分成10組每組4頭，總計40頭豬(表1)。使豬適應環境4天，稱重并且在耳 朵做標記。在研究的第0天，對豬稱重、采血并使用豬的組合前驅麻醉劑-開他敏-(20mg/ kg)、甲苯噻嗪_(2.2mg/kg)和阿托品(0. 04mg/kg)麻醉，然后使用異氟烷(在5%誘導， 保持在2-3% )麻醉。用0.6mL的CMV-HA(表達共有H5抗原的基于pVAX的構建體)、 CMV-NA (表達共有m抗原的基于pVAX的構建體)和CMV-SEAP (表達報告基因分泌型胚胎堿 性磷酸酶SEAP的構建體)質粒(最后被添加以增加質粒濃度和溶液粘度用于“肌肉損傷” 評定)+1. 0% wt/wt LGS在改變的質粒濃度和電流強度對豬(n = 4/組)進行注射。根據 實施例1中提供的材料和方法制備所述質粒。4s后，使用適合的恒定電流CELLECTRA 肌內 (IM)系統(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)將動物電穿孔，所述系統配有5個針狀 電極并以下述脈沖參數操作52毫秒脈沖，脈沖間隔1秒、具有改變電流的3個脈沖(0. 1、 0. 3 和 0. 5A)。表1.豬疫苗實驗的組 對每個注射部位周圍區域進行紋身用于在注射后第14天和35天快速鑒定活組織 檢查。使豬從麻醉中復蘇并且緊密監測24小時以確保完全復蘇。記錄在處理后2到 3小時內沒有完全復蘇的任何豬。在第10天、21天和35天將豬稱重并采血。在第21天 對豬施用第二次接種。將血收集在2個紫色蓋子的管中，l.OmL用于CBC和分類(Antech Diagnostics, Irvine, CA) ；lOmL用于針對HA和NA抗原的干擾素-、酶聯免疫斑點法；并 將血收集在分開的falcon管中，使其凝塊，離心以分離血清，然后將其等分到冰上的管中。 在第35天，在麻醉的外科平面之下給所有的豬放血，并獲取注射部位的針孔活組織檢查用 于組織學。血球凝集素抑制(HI)測定通過用三份酶稀釋一份血清用受體破壞酶(RDE)處理豬血清，并在37 °C水浴中孵 育過夜。通過在56°C孵育30min接著加入六份PBS以最終稀釋1/10使酶失活。在V形底 的96孔微量滴定板中進行HI測定，如之前所述使用了病毒的四個HA單位和的馬紅細 胞(Stephenson, I.，等人 ，Virus Res.，103 (1-2) :91_5 (2004 年 7 月))。在來自以0. 5A的電流設置(120 士40 ；P = 0. 11相對于2mg/0. 3A和P = 0. 02相 對于2mg/0. 1A)施用2mg的表達HA的質粒的組的血清中發現通過HI測定表現出最高滴度 (圖2)；使用接收2mg每種質粒的組的電場強度滴度降低；如果此后當前每種質粒的量降 低，那么滴度更加易變并且在組間是不同的。在施用了 2mg的表達HA的質粒并在0. 5A電穿孔的組中HI滴度最高。此外，滴度 隨著以0. 5A電穿孔的組中遞減的質粒劑量并隨著電場強度而降低。更低的質粒量或更低 的電流強度看起來增加了組內可變性。HA和NA的干擾素-Y酶聯免疫斑點如之前所述使用干擾素_ Y捕獲抗體和檢測抗體(MabTech，Sweden)進行酶聯免 疫斑點實驗(Boyer JD，等人.，J Med Primatol，34(5-6) :262_70 (2005 年十月))。通過從 含有肽的孔中減去陰性對照孔中的斑點數目確定抗原特異性反應。結果被顯示為三重孔獲 得的平均值(斑點/百萬脾細胞)。在0.3A的電流設置施用了 2mg每種質粒(總計4mg)的組達到最高的細胞免疫反 應，如通過每百萬細胞537士322SFU的干擾素酶聯免疫斑點所測量的。所有其他組的平均反應是在該測定的背景水平之內。圖3中凸顯了達到最高細胞免疫反應的兩只動物的 單獨的酶聯免疫斑點反應。CBC 結果不考慮電流設置，淋巴細胞在施用最高疫苗劑量的組中在研究的第21天達到最 高水平，盡管具有最高劑量(4mg的總質粒，各2mg)和最高電流設置(0. 5A)的組表現出最 高的淋巴細胞反應，比對照高40% (分別為12670士 1412對7607士 1603淋巴細胞計數/100 血液；P < 0. 002)。肌肉組織病理學在給豬放血處理后第14天和第35天識別注射部位并且獲取打孔活組織檢查。將 組織固定在緩沖的福爾馬林中24小時，然后在PBS中洗滌3次并儲存在70%乙醇中。將 活組織檢查樣品交付給Antech Diagnostics，在那里樣品被加工并且切片用蘇木精和曙紅 (H&E)染色。一位委員會認證的病理學家評價了所有的玻片，根據各個組織層(表3)中的 病理學標準(表2)為它們評分為0至5。在每個時間點計算出每組的平均得分。表2.活組織檢查病理學評分參數 表3.活組織檢查組織層和病理學參數
從質粒注射后第14天和35天的肌肉活組織檢查(圖4A)和基于0到5等級標準 (表2)的EP對組織病理學評分。在電穿孔后總的病理學得分在第14天到第35天的組織 層(表3)中下降。在0. 3A的設置接受6mg的總質粒的組在第14天展示出最高的總病理學 得分(18. 3 士6. 4，相比于對照P < 0. 0002)，與最高的平均淋巴細胞反應相關。在第35天的 所有病理學得分接近非處理的對照水平的水平(6. 67到4. 25的范圍)。盡管如此，當肌肉 壞死和纖維化(通常與EP程序有關)(Gronevik E，等人.，J Gene Med, 7 (2) =218-27(2005 年2月))被分開分析時(圖4B)，得分范圍在1和2之間，組間或處理組與對照之間沒有差 異，而由于免疫反應更高的得分與淋巴的、漿細胞的或嗜酸性炎癥有關。顯著地，這些得分 也從處理后第14天到第35天下降。數據分析使用微軟Excel統計軟件包分析數據。圖中示出的值是平均值士SEM。使用單因 素ANOVA和隨后的t檢驗通過比較獲得了具體的值。將ρ < 0. 05的值設定為統計顯著性 的水平。實施例3:雪貂的處理將4-6月齡或至少Ikg體重的二十只雄性雪貂(Triple F Farms, Sayre，PA)用于 本研究中并且飼養在BI0QUAL公司(Rockville，MD)。在表4中是雪貂的研究設計。使動 物在研究之前適應環境兩周。在第0、4和9周免疫動物(在麻醉之下)。每2周抽一次血。 在第三次免疫后，將動物移至BSL-3設施中并且在第13周用非常有力的禽流感菌株(H5W) 攻擊，然后攻擊后又過兩周。在攻擊后的兩周，每天監測動物，并且記錄體重、溫度和臨床得 分。監測并記錄活性水平；記載死亡。這項研究在雪貂的流感攻擊模型中測驗了肌內接著是電穿孔遞送的HA、NA和 M2e-NP的DNA疫苗的效力，所述電穿孔使用了 CELLECTRA 適合的恒定電流電穿孔肌內 (IM)系統(VGXPharmaceuticals，Blue Bell，PA)。根據實施例1中提供的材料和方法制備 了 DNA質粒。如在表4中概述，在組2、3和4中的動物接受了 0. 2mg的各自的流感質粒疫苗。為了校正劑量，接受1種質粒疫苗的組(組2和組3)或未接受疫苗的組(對照組1)， 通過pVAX空載體彌補差額以使得每組中的所有動物都接受0. 6mg總劑量的質粒。使用5 個針狀電極陣列的電穿孔的條件是0. 5安培、52毫秒脈沖寬度、脈沖間隔1秒、注射與電穿 孔之間4秒延遲。表4.雪貂中流感攻擊實驗的組 血球凝集素抑制(HI)分析通過用三份酶稀釋一份血清用受體破壞酶(RDE)處理血清，并在37 °C水浴中孵育 過夜。通過在56°C孵育30min接著加入六份PBS以最終稀釋1/10使酶失活。在V形底的 96孔微量滴定板中進行HI測定，如之前所述使用了病毒的四個HA單位和1 %的馬紅細胞 (Stephenson, I.，等人 ，VirusRes.，103 (1-2) :91_5 (July 2004))。HI 測定使用的病毒是 我們從疾病控制中心獲得的重配菌株甲型/越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG(進化 枝1的病毒)和甲型/印度尼西亞/05/2005(H5Nl)/PR8-IBCDC-RG2(進化枝2的病毒)。 流感感染的雪貂模型被認為更多的反映了人類疾病并且是更為嚴格的攻擊模型。雪貂展示 出與感染流感的人相似的癥狀和關于人和禽流感病毒的相似組織嗜性。使用整個研究中在 不同時間點收集的血清來檢測針對H5W病毒的HI活性。如圖7中示出的，含有共有H5的 特定HA構建體的兩組在兩次免疫后均達到了抗體的保護水平(> 1 40)并且還能抑制 進化枝2的H5W病毒。換言之，該HI測定針對兩種毒株是陽性的，盡管共有HA菌株是以 進化枝1的病毒為基礎。數據分析使用微軟Excel統計軟件包分析數據。圖中示出的值是平均值士SEM。使用單因 素AN0VA和隨后的t檢驗通過比較獲得了具體的值。將p < 0. 05的值設定為統計顯著性 的水平。雪貂流感攻擊流感攻擊的結果描繪于圖5和圖6中。對照動物在攻擊后平均損失25%的體重 (圖5)，而接種HA (組1)或HA+M2e-NP+NA (組4)的動物損失了 9%至10% (相比于對照 *P < 0. 004)。體溫在對照動物中升高直到發現所有對照動物死亡或到第8天被實施安樂死
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
在0.6 mL中 的 0.6 mg
24(圖6)。所有接種動物，不論哪種疫苗方案，都在攻擊下存活并且顯示出與對照動物相比更 少的感染體征，如通過其臨床得分證明的(表5)。對照動物臨床得分惡化(鼻排出物、咳 嗽、昏睡)，并且在攻擊后第5天和第7天之間死亡。如表5中所示，接種動物中臨床得分的 嚴重度與抗體滴度呈反向相關(抗體滴度越高，臨床得分越低，臨床結果越好)。
表5受攻擊的雪貂的結果 表5注釋描繪了對于攻擊后觀察期的臨床得分。“*”指示出動物被實施安樂死； FD =發現死亡。每一欄中第一個臨床得分是鼻的癥狀0 =無；1 =鼻排出物；2 =由嘴呼 吸。第二個得分是活動0 =睡覺；1 =聰明且警覺；2 =警覺但無反應；3 =昏睡。出于比較的目的，描繪了攻擊前3周測量的每只動物的HI滴度。實施例4在靈長類動物中皮內遞送與肌內遞送的比較在這些研究中免疫了獼猴。使動物在實驗開始之前適應環境2個月。該研究如下 進行第0周-進行第一次免疫(質粒劑量施用)和基線采血；第2周進行采血；第3周進 行第二次免疫(質粒劑量施用)；第5周進行采血；第6周進行第三次免疫(質粒劑量施 用)和采血；第8周進行采血。表6 DNA構建體# 編碼抗原1無流感抗原的對照質粒6流感H5共有9無流感抗原的對照質粒10無流感抗原的對照質粒將所有質粒在注射用水+1% LGS中配制成10mg/mL，如以上在之前的實施例中描 述的，并且將其混合成每個研究組(在上個表6中的組C、D、G和H)的單一溶液。計算出指 定 IM CELLECTRA EP(VGXPharmaceuticals)、 ID CELLECTRA EP(VGX Pharmaceuticals) 和IM注射器的各組的校正注射體積。對于皮內施用，如果每個位點所需注射體積超過 100 μ L，那么將制劑分成多個注射位點(為2、3或6，取決于施用多少總mg的疫苗)。對接 受IM注射的動物在一單個位點給出全部制劑。在豬實驗、雪貂實驗和非人類實驗中使用的CELLECTRA 合適的恒定電流裝置描 述于實施例中。電穿孔條件如下對于IM灃射和電穿孔的組，條件是0. 5安培，52毫秒/ 脈沖，三個脈沖，質粒注射與電穿孔之間4秒延遲。對于ID灃射和電穿孔的組，條件是0. 2 安培，52毫秒/脈沖，三個脈沖，質粒注射與電穿孔之間4秒延遲。血細胞凝集抑制(HI)測定-通過用三份酶稀釋一份血清用受體破壞酶(RDE)處 理猴血清，并在37°C水浴中孵育過夜。通過在56°C孵育30min接著加入六份PBS以最終稀 釋1/10使酶失活。在V形底的96孔微量滴定板中進行HI測定，使用了病毒的四個HA單位和的馬紅細胞。本文呈現的數據是第二次免疫后的結果(第三次免疫前采的血)。在第二次免疫后三周測量了 HI滴度。可以看到結果展示在圖8的圖中。通過ID 注射緊接著電穿孔接受HA質粒疫苗的猴表現出多于兩倍的IM+EP組的平均滴度和幾乎三 倍的單獨的IM組的平均滴度CP < 0. 03)。無處理的對照沒有顯示出任何HI滴度。實施例5靈長類動物中的交叉保護使用遞送方法-ID注射緊接著電穿孔(EP)對于流感疫苗(包括H5、NA和M2e_NP共有抗原，見以上)在非人類靈長類動物中 的研究指明，ID注射緊接著電穿孔引發了比IM注射更高的對疫苗抗原的抗體反應。在我 們的一項非人類靈長類動物研究(NHP)中，根據表7接種動物。 表7.研究設計和條件。在第0、4和8周免疫獼猴。每只動物接受三次接種，并且對相同進化枝和交叉進化枝執行了 HAI滴度和微量 中和。如所示，共有疫苗不僅在相同進化枝內而且在交叉進化枝內提供了廣泛的保護。結 果被包含在表8中。 表8.血細胞凝集(HAI)和微量中和測定法的結果。所呈現的值指明了平均滴度、 范圍(括號中)和小于5/5 (上標)的反應者數目。注釋一般認為在NHP模型中HAI滴度 >1 20有血清保護性。皮內電穿孔裝置中的針要短得多(約5mm)、具有較低的規格(gauge)并且在迄今 為止測驗的動物中沒有引發肌肉收縮或可見的疼痛反應。此外，有效的ID EP所需的電場 比最適肌內遞送所需更低。ID注射已顯示出更好的對流感疫苗抗原的免疫反應(Holland D，等人.(2008). J Inf Dis. 198:650-58.)。通常，與肌內遞送相比皮內遞送的疫苗中需要 更低的劑量來達到相似的體液反應。
權利要求
一種能夠在哺乳動物中產生針對多種流感病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗，包含能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物中免疫反應的量表達共有流感抗原的DNA質粒，所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、M2胞外結構域核蛋白(M2e-NP)或它們的組合，以及藥學上可接受的賦形劑；所述DNA質粒包含與編碼所述共有流感抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子，并且所述DNA質粒疫苗具有1mg/ml或更大的總DNA質粒濃度。
2.如權利要求1所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒還包含與所述編碼序列的N 端末端相連并且與所述啟動子可操作地連接的IgG前導序列。
3.如權利要求1-2中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒還包含與所述編 碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒是密碼子優化的。
5.如權利要求1-4中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述藥學上可接受的賦形劑是 佐劑。
6.如權利要求5所述的DNA質粒疫苗，其中所述佐劑選自由IL-12和IL-15組成的組。
7.如權利要求1-6中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述藥學上可接受的賦形劑是 轉染促進劑。
8.如權利要求7所述的DNA質粒疫苗，其中所述轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子或脂質。
9.如權利要求7所述的DNA質粒疫苗，其中所述轉染促進劑是聚L谷氨酸。
10.如權利要求1-9中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述轉染促進劑是濃度小于 6mg/ml的聚L谷氨酸。
11.如權利要求1-10中任一項所述的DNA質粒疫苗，包含多種不同的DNA質粒； 其中所述多種DNA質粒之一包含編碼共有HA的序列，所述多種DNA質粒之一包含編碼共有NA的序列，并且 所述多種DNA質粒之一包含編碼共有M2e-NP的序列。
12.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有HA是共有HI、共有H2、共有H3 或共有H5。
13.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有HA是SEQIDNO :2、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO :14。
14.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有HA是SEQIDN0 :2。
15.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有HA的序列是SEQID NO 1、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13。
16.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有HA的序列是SEQID NO 1。
17.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有NA是SEQIDN0 :4。
18.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有NA的序列是SEQID NO 3。
19.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有M2e-NP是SEQID NO :8。
20.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有M2e-NP的序列是SEQID NO :7。
21.如權利要求1-10中任一項所述的DNA質粒疫苗，包括 包含編碼共有Hl的序列的DNA質粒，包含編碼共有H3的序列的DNA質粒， 包含編碼共有H5的序列的DNA質粒， 包含編碼共有NA的序列的DNA質粒，以及 包含編碼共有M2e-NP的序列的DNA質粒。
22.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有Hl是SEQIDNO :2。
23.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有Hl的序列是SEQID NO Io
24.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有H3是SEQIDNO 120
25.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有H3的序列是SEQID NO 11。
26.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有NA是SEQIDNO :4。
27.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有NA的序列是SEQID NO3。
28.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中共有M2e-NP是SEQIDNO :8。
29.如權利要求21所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼共有M2e-NP的序列是SEQID NO :7。
30.如權利要求1-29中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述哺乳動物是靈長類。
31.如權利要求1-30中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是體液反應。
32.如權利要求1-30中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是細胞反應。
33.如權利要求1-30中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是聯合的體液 反應和細胞反應。
34.一種在哺乳動物中引發針對多種流感病毒亞型的免疫反應的方法，包括 向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗，所述DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中表達共有流感抗原以在所述哺乳動物中引發免疫反應的DNA質粒，所述共有流 感抗原包含共有的HA、NA、M2e-NP或它們的組合，用有效允許所述DNA質粒進入細胞的恒定電流的能量脈沖將所述組織的細胞電穿孔。
35.如權利要求34所述的方法，其中遞送步驟包括 將所述DNA質粒疫苗注射到皮內、皮下或肌肉的組織中。
36.如權利要求34-35中任一項所述的方法，包括 預先設定期望被遞送到所述組織的電流；并且用等于預設電流的恒定電流的能量脈沖將所述組織的細胞電穿孔。
37.如權利要求34-36中任一項所述的方法，其中電穿孔步驟還包括 測量被電穿孔的細胞中的阻抗；相對于被測量的阻抗調整所述能量脈沖的能量水平以在所述被電穿孔的細胞中保持恒定電流；其中測量和調整步驟發生在所述能量脈沖的存在期內。
38.如權利要求34-37中任一項所述的方法，其中電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送所述能量脈沖的脈沖序列模式將所述能量脈沖遞送至多個電極。
39.一種能夠在哺乳動物的細胞中表達共有流感抗原的DNA質粒，包含包含共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、M2胞外結構域核蛋白(M2e-NP)或它 們的組合的編碼序列；與所述編碼序列可操作地連接的、調控所述共有流感抗原的表達的啟動子。
40.如權利要求39所述的DNA質粒，其中所述DNA質粒還包含與所述編碼序列的N端 末端相連并且與所述啟動子可操作地連接的IgG前導序列。
41.如權利要求39-40中任一項所述的DNA質粒，其中所述DNA質粒還包含與所述編碼 序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。
42.如權利要求39-41中任一項所述的DNA質粒，其中所述DNA質粒是密碼子優化的。
43.如權利要求39-42中任一項所述的DNA質粒，其中共有HA是共有HI、共有H2、共有 H3或共有H5。
44.如權利要求39-43中任一項所述的DNA質粒，其中共有HA是SEQID NO :2、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14。
45.如權利要求39-44中任一項所述的DNA質粒，其中共有HA是SEQID NO :2。
46.如權利要求39-45中任一項所述的DNA質粒，其中編碼共有HA的編碼序列是SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11 或 SEQ IDNO :13。
47.如權利要求39-46中任一項所述的DNA質粒，其中編碼共有HA的編碼序列是SEQ ID NO 1。
48.如權利要求39-47中任一項所述的DNA質粒，其中共有NA是SEQID NO :4。
49.如權利要求39-48中任一項所述的DNA質粒，其中編碼共有NA的編碼序列是SEQ ID NO :3。
50.如權利要求39-49中任一項所述的DNA質粒，其中共有M2e-NP是SEQID NO :8。
51.如權利要求39-50中任一項所述的DNA質粒，其中編碼共有M2e_NP的編碼序列是 SEQ ID NO :7。
52.如權利要求39-42中任一項所述的DNA質粒，其中所述DNA質粒包含SEQID NO 15、SEQ ID N0:16 或 SEQ ID NO :17。
全文摘要
本發明的一個方面涉及能夠在哺乳動物中產生針對多種流感病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗，包含DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑。所述DNA質粒能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物中免疫反應的量表達共有流感抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白、核蛋白、M2胞外結構域核蛋白(M2e-NP)或它們的組合。優選地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它們的組合。所述DNA質粒包含與編碼所述共有流感抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子。另外，本發明的一個方面包括使用提供的DNA質粒疫苗在哺乳動物中引發針對多種流感病毒亞型的免疫反應的方法。
文檔編號A61K31/70GK101877965SQ200880118583
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月12日 優先權日2007年11月12日
發明者D·B·韋納, D·雷蒂, R·德拉奇亞-阿科利, 嚴健 申請人:賓夕法尼亞州立大學托管會;Vgx制藥有限公司