用于輸送到xcr1陽性細胞中的系統及其用途的制作方法

專利名稱：用于輸送到xcr1陽性細胞中的系統及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及適用于將物質輸送到XCRl陽性專職抗原提呈細胞(professional antigen-presenting cell)中的輸送系統，用于編碼該系統的一個或多個核酸，含有所述 一個或多個核酸的載體，含有所述輸送系統或者一個或多個核酸的藥劑，以及含有XCLl或 其功能活性片段的佐劑。針對病原體和腫瘤細胞，免疫系統通過各種機制為身體提供保護。為了正確地發 揮功能，其必須區分“自身”和“外源”(病原體/腫瘤)。其檢測并攻擊各種病原體，包括 細菌、病毒、寄生蟲、真菌和毒素。脊椎動物諸如人的免疫系統由許多類型的蛋白質、細胞、 組織和器官構成，它們在動態網絡中相互作用。作為這種復雜的免疫應答中的一部分，脊椎 動物的免疫系統久而久之適應了更高效地識別特定病原體的過程。這種適應過程建立了免 疫記憶并允許在未來遇到這些病原體時更有效地進行保護。這種獲得性免疫過程是疫苗的 ■石出。免疫系統的紊亂可引起疾病。當免疫系統的活性低于正常狀態時發生免疫缺陷疾 病，導致復發和危及生命的感染。相反，自身免疫性疾病的起因在于異常活躍的免疫系統攻 擊正常組織如同它們是外來的生物體。常見自身免疫性疾病包括類風濕性關節炎、1型糖尿 病、多發性硬化和紅斑狼瘡。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)形成免疫系統的一部分。它們的主要功能是加 工(process)抗原物質并使它們呈現在免疫系統的其他細胞的表面上，從而起到抗原提呈 細胞的作用。T輔助細胞(T helper cell，也被稱為效應T細胞或者Th細胞)也是免疫系統的 重要成員，因為它們在建立免疫系統并將其能力最大化方面起到基礎性作用。Th細胞參與 活化和導引(directing)其他免疫細胞，在免疫系統中特別重要。它們在確定B細胞抗體 種類轉換(antibody classswitching)、在細胞毒性T細胞活化及生長中以及在吞噬細胞 諸如巨噬細胞發揮最大限度的殺菌活性中是必需的。正是這種功能的多樣性以及它們在影 響其他細胞中的作用給它們帶來了 T輔助細胞的名字。發育成效應T細胞的增殖的輔助性 T細胞分化成兩種主要亞型的細胞，稱為ThI和Th2細胞(也分別被稱為1型和2型輔助T 細胞)，其中Th2細胞主要促進體液免疫系統(刺激B細胞增殖、誘導B細胞抗體種類轉換 以及增加抗體產量)，而ThI細胞主要促進細胞免疫系統(巨噬細胞殺死效率的最大化以及 細胞毒性CD8+T細胞的增殖)。取決于入侵病原體的性質，免疫系統產生Thl或Th2免疫應 答。在Thl免疫應答的情況下，CD8+T細胞顯示了分化成細胞毒性T細胞的強烈趨勢。同時， Thl免疫應答的⑶8+和⑶4+輔助性T細胞分泌大量的IFN- γ (以及其他Thl細胞因子/趨 化因子)，并引起小鼠中的占優勢的同型IgG2a和IgG2b抗體以及人類中占優勢的同型IgG 抗體的生成。Thl免疫應答對于身體防御病毒和(細胞內)細菌來說尤其有效。在Th2免 疫應答的情況下，輔助T細胞產生另一種模式的細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13以及其他)。 這種模式的細胞因子，特別值得說的是，其在小鼠中通過B細胞和漿細胞促進IgGl/IgE應 答，并在人類中促進IgE應答。這種類型的應答對于寄生蟲感染特別有效。
4
目前可購買到的針對活的、減毒或者失活病原體成分的疫苗和佐劑系統主要誘 發抗體免疫應答，但不是有效的Thl細胞毒性應答(Steinman等人，2007，Nature 449， 419-26)。誘導的抗體與病原體成分結合，由此使其失去生物活性(“中和抗體”)。然而， 有許多疾病存在，其中中和抗體不足以針對疾病提供保護或者控制疾病，并且目前的疫苗 技術也是無效的。這些疾病可能需要對于遏制和/或消除感染有效的Thl免疫應答。例子 有結核病、瘧疾、利什曼原蟲、朊病毒病、正粘病毒特別是流行性感冒、甲型肝炎、乙型肝炎、 人免疫缺陷病毒(HIV)，以及其他慢病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒 (bunyaviruses)、杯狀病毒、絲狀病毒(filoviruses)、黃病毒(flaviviruses)特別是丙型 肝炎病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、各種與呼吸有關的病毒，以及其他需要有效Thl免疫應 答特別是Thl細胞毒性應答遏制并消除的病毒。因此高度需要開發這種誘導有效Thl應答 的疫苗技術。另外，對于Thl優勢的Thl/Th2失衡被認為在自身免疫性疾病諸如多發性硬 化或者類風濕性關節炎的發展中起到重要作用。因此，Thl應答的調節是自身免疫性疾病的 預防和治療中的有希望的目標(promising target)。此外，對病毒、細菌、寄生蟲和真菌病 原體的Thl免疫應答的誘導，靶向Thl應答和“交叉遞呈(cross-presentation) ”機制(見 下)對于對病毒、細菌、寄生蟲和真菌病原體的Thl免疫應答的誘導而言是極為重要的，因 為在感染過程中樹突狀細胞最通常不直接被感染。沒有Thl免疫應答的產生，許多病毒、細 菌、寄生蟲或者真菌感染不能在人體中被遏制或者消除。另外，在器官移植中也存在一種需 要，使得對于阻礙宿主的Thl免疫系統破壞移植的組織并使受體免疫系統忍受供體的細胞 成分(抗原)。令人驚奇的是，已經發現在Thl應答中起主要作用的細胞可選擇性地靶定 (targeted)。發現趨化因子(C基元)受體1 (XCRl)存在于專職抗原提呈細胞的表面上，尤 其是樹突狀細胞(DC)的表面上，這可被使用以便選擇性地將物質輸送到這些細胞中。將物 質靶向輸送到攜帶(bearing) XCRl的DC中允許首次在哺乳動物/人類中誘導有效的Thl免 疫反應。目前的疫苗主要引起(address)Th2抗原遞呈途徑，并且主要導致Th2型(中和) 抗體和免疫反應的產生。特別是，通過靶向攜帶XCRl的DC，可針對給定免疫原誘發Thl型 體液和細胞(細胞毒性)免疫反應。可以預期的是，NK細胞、CD8+T細胞和ThlCD4+T細胞 參與這種反應，但其他CD4+T細胞也有助于這種類型的反應。首次，單獨使用或者與免疫原 或者藥物化合物結合使用的佐劑可被選擇性靶向攜帶XCRl的抗原提呈細胞(APC)。如上所述，發育的免疫系統必須識別“自身”和主要在胸腺中出現的“外源”， 其中樹突狀細胞(DC)通過將自體抗原遞呈到發育的胸腺細胞誘導“中樞耐受(central tolerance) 所述自體抗原是由DC表達的內源蛋白質以及由胸腺上皮細胞異位表達的組 織特異性抗原。胸腺DC將外源抗原遞呈到MHC II類分子上的能力以及將它們”交叉遞呈 “(見下)到MHC I類分子上的能力允許胸腺DC介導CD4+和CD8+胸腺細胞兩者的負選擇。 該任務可由從外周組織進入到胸腺中的DC輔助。盡管存在這種胸腺選擇的過程，自體反應 的T細胞可逃過胸腺選擇并進入外周，并且這些必需由脾和其他淋巴組織中的DC初步引起 的外周耐受機制進行檢查。在外周，免疫系統必須一方面識別無害的外來物質或者自體抗原，另一方面識別 危險的(病毒、細菌，真菌、寄生蟲、類毒素(toxin-like))抗原。抗原由DC獲取并分解成 肽(“加工”)。由此產生的肽被“遞呈”到MHC I類或者MHC II類環境(context)中的T淋巴細胞(T細胞)上。⑶4+亞組的T細胞識別MHC II類環境中的抗原，⑶8+亞組的T細 胞識別MHC I類環境中的抗原。伴隨抗原的攝入，DC能夠通過大量“危險信號”識別受體 (例如toll樣受體、NOD狀受體)感測抗原是否具有危險性或者其是否無害。由“危險信 號”識別受體識別的模式(也被稱為“模式識別受體”)常常是對微生物來說獨一無二的分 子結構。在微生物的情況下，這些可以是細胞壁成分(例如脂多糖、肽聚糖)或者核酸修飾 (例如未甲基化的CpG基元)、或者對病毒DNA或病毒RNA (例如雙鏈RNA)來說是獨一無二 的結構特征或者修飾。而且來自凋亡的垂死細胞釋放出能夠觸發“危險信號”識別受體的 分子(例如高速泳動蛋白Bi、熱休克蛋白)。存在無害(自體)抗原的情況下，DC不“成熟”，相反它們保持為“未成熟”狀態。 當抗原通過“未成熟APC”被遞呈到CD4+和CD8+T細胞時，T細胞被活化并大量增殖，但在數 天內由于程序化限制的壽命而死亡。識別無害(自體)抗原的其他T細胞分化成“調節性T 細胞”，當重復暴露于相同抗原時它們能夠使用各種機制(例如TGF-β、CTLA-4、IL-10)抑 制免疫應答。作為T細胞死亡和/或T調節應答的結果，免疫系統對給定無害(自體)抗 原形成“外周耐受”(無響應)。誘導耐受的抗原是“致耐受性的(tolerogenic)”。存在危險抗原的情況下，DC活化不同的應答程序(“成熟”)。抗原被遞呈到CD4+ 和CD8+T細胞，它們同時從DC細胞接收指示抗原的危險本質的附加信號。結果是，兩種T細 胞亞組被活化，大量發育成延長壽命的細胞，發育成“效應T細胞”。這些可以是對其他DC 或者B細胞或者免疫系統的其他細胞提供“幫助”的CD4+T細胞，或者可以是平滑(even)的 ⑶4+細胞毒性細胞。在⑶8+T細胞亞組中，再次形成T輔助細胞，但大部分⑶8+T細胞變成 能夠通過分泌IFN-Y或者其他可溶性因子或者通過殺死感染的體細胞來消除侵入病原體 的效應細胞。由于T細胞幫助B細胞的原因，抗原特異性B細胞分化成分泌針對抗原(病 原體)的抗體的漿細胞。這些抗體通過許多機制幫助抵御病原體(例如中和作用、提高抗 原攝入、調理作用(opsonization)、補體結合)。一定數量的CD4+和CD8+T細胞幸存了對抗原的免疫應答的急性期，并成為長期存 活的“記憶T細胞”。記憶T細胞和長期存活的漿細胞在重新暴露于相同病原體(抗原)時 會組織非常迅速的免疫應答，允許免疫系統非常有效地消除病原體(抗原)。這種在重新暴 露于相同病原體時增強的τ細胞和B細胞免疫應答的能力被稱為“免疫性”，并且誘導免疫 性的抗原是“免疫原的”。根據上述有關專職的抗原提呈細胞尤其是樹突狀細胞表面上趨化因子(C基元) 受體I(XCRl)的存在的發現，以及它們在免疫系統中的作用，本發明的第一方面涉及適于 將物質輸送到XCRl陽性專職抗原提呈細胞中的輸送系統，所述輸送系統包括i)與趨化因子(C基元)受體1 (XCRl)結合的分子，以及ii)待輸送的物質，其中物質與分子結合。該輸送系統尤其適于在免疫系統中影響Thl應答，任選地同樣適于影響Th2應答。XCRl是趨化因子受體，并且是迄今為止趨化因子“C”亞類中的唯一成員。其還被 稱為GPR5或者CCXCR1。以前作為孤立的G蛋白偶聯受體被克隆的GPR5已經首先在人類中 被識別，然后在鼠中作為XCLl(IT)的單一特異性受體被識別，因此被稱作為XCR1。據 報道，通過多種方法，初生組織中的XCRl在胸腺、脾、胎盤、肺、淋巴結、扁桃體、克羅恩氏病 的固有層以及人類黑素細胞(melanocytic)病變中表達，而不在表達XCRl的細胞類型上提供信息。更具體的分析要求XCRl在以下細胞中表達脾臟⑶8+細胞和NKl. 1+CD3—細胞、NK 和T細胞系、CD3+T細胞系、T細胞、B細胞和嗜中性粒細胞、T細胞系Jurkat、人類成纖維細 胞系、初生纖維狀滑膜細胞、滑膜細胞以及發炎關節中的單核細胞、鼠科的CD8+T細胞，以及 人類中性粒細胞、B細胞、T細胞、NK細胞和單核細胞。所有關于XCRl的細胞類型特異性表 達的后來的報導都利用了總RNA的PCR分析，并且使用的引物是僅對XCRl外顯子2具有特 異性，因此不能跨過外顯子_內含子邊界。兩種策略都易于出現方法學錯誤(見下)。XCRl的天然配體是XCL1，也被稱為ATAC、淋巴細胞趨化因子(Iymphotactin)或者 SCM-I0其為趨化因子C家族的唯一成員。活化誘導的、來自T細胞的以及趨化因子相關的 細胞因子(ATAC)在人類中被克隆(Muller等人，1995，Eur. J. Immunol. 25，1744-48)，并且 各自地在小鼠中為淋巴細胞趨化因子(Kelner等人，1994，Science 266，1395-99)，在人類 中為SCM-I (Yoshida等人，1995，FEBS Lett. 360，155-9)。根據趨化因子的命名法，ATAC/淋 巴細胞趨化因子/SCM-I現在被命名為“XCL1”。XCLl主要由活化的⑶8+T細胞、Thl⑶4+T 細胞和NK細胞分泌。在人類中，已有被命名為XCL2的XCLl的變體的描述，其中在全長蛋 白質中的第28位和第29位中的氨基酸天冬氨酸和賴氨酸分別被替換成組氨酸和精氨酸 (Yoshida等人，1996，FEBS Lett. 395，82_8)，其也可被用于本發明。產生生物學活性形式 的XCLl的典型方法在實施例8中描述。可使用類似的方法以便產生其他生物學活性形式 的XCL1，例如其他物種的那些。最初，XCLl/淋巴細胞趨化因子/ATAC已經被報道用來誘導(至多)各種沒有 很好限定的胸腺和脾細胞群的弱趨化性(Kelner等人，1994，Science 266，1395-99)，但 這些觀察不能由他人重現(MUller等人，1995，Eur. J. Immunol. 25，1744-8 ；Bleul等人， 1996，J.Exp. Med. 184，1101-9)。后來，更多有關XCLl對T細胞的趨化效果的更多具體報 道(Kennedy 等人，1995，J. Immunol. 155，203-9)不能由他人重現(Miiller 等人，1995，Eur. J. Immunol. 25，1744-8，Dorner 等人，1997，J. Biol. Chem. 272，8817-23)。XCLl 誘導的 NK 細胞、NKT細胞、B細胞、中性粒細胞和單核細胞的趨化性充其量仍然處于爭議中。有關 人類單核細胞來源的DC的趨化性(Sozzani等人，1997，J. Immunol. 159，1993-2000，Lin 等人，1998，Eur. J. Immunol. 28，4114-4122)和鼠科 DC 細胞系(Foti 等人，1999，Intern. Immunol. 11,979-86)被專門排除(ruled out)。基于小鼠中ATAC詳細的表達分析，過去可以證實XCLl (ATAC)在具有IFN-γ， MIP-I α，MIP-I β以及RANTES的T細胞和NK細胞中共同分泌(co-secreted)。除了該觀 察之外，XCL1-XCR1趨化因子-趨化因子受體系統在免疫系統中的生物學功能仍然不清楚 并存在爭議。現在已經發現，在小鼠中⑶8+陽性DC似乎是淋巴系統中唯一的XCRl-表達抗原 提呈細胞群(見實施例1)。為了識別表達用于XCRl的mRNA細胞群，我們首先從全部的脾 細胞群中分離了總RNA并在RNA反轉錄成cDNA之后進行定量PCR(qPCR)。在下一步中我們 分離了 B細胞、T細胞、NK細胞或者粒細胞、巨噬細胞，得到總RNA，并進行定量PCR。在所有 情況下，我們得到明顯的信號。然而，當在進行qPCR之前總RNA沒有反轉錄成cDNA時，我 們也得到定量的相似信號。在當時，鼠科XCRl基因的第二外顯子被認為是唯一存在的外顯 子，因此我們的PCR系統(如同所有有關文獻中關于XCRl表達的PCR結果的情況那樣)利 用了僅跨過這一外顯子的引物。我們的實驗結果的全面分析表明，使用總RNA得到的PCR信號可能是來自基因組DNA的假陽性信號，其典型地污染了總RNA的制備。為了排除這種實 驗誤差的可能性，作為代替我們從全部脾細胞群中以及B細胞、T細胞、NK細胞或者粒細胞 中分離了 mRNA而不是總RNA，如下所述。與使用總RNA得到的結果形成鮮明對比，我們使用 總脾細胞仍然得到了 XCRl信息的(低)的qPCR信號，但是使用分離的B細胞、T細胞、NK 細胞、粒細胞或者巨噬細胞則沒有獲得信號(圖1和表1)。在隨后的實驗表明qPCR信號與 ⑶Ilc+脾細胞相關之后，我們通過流式細胞儀(flow cytometry，純度> 95% ))高度純化 了脾⑶Ilc+⑶8_和⑶Ilc+⑶8+DC，從這些細胞群中得到了 mRNA，并將該mRNA進行qPCR。在 該實驗中得到的數據清楚地表明，幾乎所有的XCRl mRNA信號都存在于CDllc+CD8+DC細胞 群中(圖1)，在⑶Ilc+⑶8_DC中僅存在很少的信號(其最可能來自污染的⑶Ilc+⑶8+DC)。 同時，當CDllc+細胞從總脾細胞中耗盡時，qPCR信號消失的程度與CDllc+細胞的耗盡程度 對應呈線性相關。綜合在一起考慮，我們的結果清楚地表明，文獻(見上述)中有關在T細胞、B 細胞、NK細胞、中性粒細胞和單核細胞中XCRl的表達的報道是錯誤的，因為他們是在總 RNA(其含有少量的基因組DNA)上使用單個外顯子進行PCR得到的。此外，我們的數據清楚 地表明，XCRl mRNA存在于⑶Ilc+⑶8+DC中。由此我們能夠首次鑒別免疫系統中的細胞群 ⑶llc+CD8+DC，其特異且專門地表達XCRl mRNA。可以假設在哺乳動物/人類的其他器官中 可能存在表達XCRl受體的其他APC細胞群。這些APC不能表達⑶8細胞表面標記。基于 各種細胞表面標記并將它們進行對于哺乳動物/人類XCRl的qPCR，這些APC可以很容易通 過高純度分選細胞來識別。在功能水平上，本發明的發明人發現XCLl選擇性地活化⑶8+DC但不活化⑶8—DC。 將⑶8+DC和⑶8_DC流式分選至高純度(> 95% )。然后將它們暴露到IOOnM的合成鼠科 XCLl并隨著細胞內Ca2+水平的增加測定DC細胞的活化程度。得到的結果(見實施例2)證 明僅CD8+DC(圖2A)，伴隨鈣離子信號和活化對鼠科XCLl產生響應，而CD8_DC(圖2B)不產 生響應。這些結果表明⑶8+DC的表面上存在功能性XCRl受體。此外，該數據證明⑶8+DC 或者任何XCRl陽性細胞可通過暴露于XCLl中而被活化。因此，這些結果表明，通過改善它 們的活化狀態以及對NK細胞或T細胞的抗原遞呈能力，XCLl可被用作XCRl-耐受的哺乳 動物/人APC的佐劑。這些結果進一步暗示，XCLl可通過其與XCRl的特異性結合被用于 將抗原、佐劑或者任何其他化合物專門地輸送到XCRl-表達的DC中。此外，本發明的發明人能夠證明XCLl在⑶8+DC中可誘導趨化性，但在⑶8_DC、B細 胞、T細胞或者NK細胞中不能誘導趨化性(見實施例3)。通過磁分離將CDllc+細胞從鼠科 動物脾細胞群中高度富集。當將這樣的細胞群應用于transwell遷移小室系統(transwell migration chambersystem)的上部小室時，DC細胞群包括了大約25%的CD8+DC和70%的 CD8_DC，反映了鼠科脾臟中這些DC的自然相對頻率(natural relativefrequency)。在不 加入趨化因子的情況下，在2小時之內僅可以觀察到非常低的DC非特異性背景遷移(圖 3)。當將鼠科乂0^1(1，100或10001^/!^)加入到下部小室中時，從上部小室到下部小室的 細胞遷移可以劑量依賴的形式觀察到，其中30%以上的輸入⑶8+DC遷移到lOOng/mL的 XCLl下部小室中。只有⑶8+DC能遷移到XCL1，而⑶8_DC只能顯示與沒有使用趨化因子時 相同的非特異性背景遷移。將趨化因子CCL21加入到下部小室中作為陽性對照，證明了預 期的⑶8+和⑶8—DC兩者的趨化效果。將XCLl加入到transwell系統的上部和下部小室兩者中不能引起任何遷移，證明XCLl不僅是化學運動誘導劑，而且還是真正的化學吸引劑 (chemoattractant)。使用從外周淋巴結高度富集的⑶Ilc+細胞進行的類比的實驗再次證 明，XCLl僅對于⑶8+DC有趨化性，而對于⑶8—DC則沒有趨化性(圖4)。使用高度富集的B 細胞、T細胞或者NK細胞進行的類比的實驗不能證明對XCLl的任何特異性趨化性(圖5)。 這些實驗首次證明XCLl是特異性作用于XCRl表達的CD8+DC趨化因子，而不作用于其他DC 細胞群。通過這些結果可以預期，XCLl作為趨化因子作用于哺乳動物/人類XCRl-表達的 APC上。這些結果證明XCLl可通過其化學吸引作用而用作XCRl表達APC的佐劑。另外，可 以證明XCLl (ATAC)在CD8+T細胞的細胞毒性誘導中作為佐劑發揮作用(見實施例9)。這 些結果進一步暗示了 XCLl可通過其與XCRl的特異性結合而被用于將抗原、佐劑或者其他 任何化合物專門地輸送到XCRl-表達的DC中。此外，XCLl有利于細胞攝入到⑶8+DC樹突狀細胞中(見實施例4)。將鼠科前B 細胞系300-19使用編碼ATAC的載體轉染，可得到ATAC-表達的轉染子“muATAC/300_19”。 當ATAC KO小鼠注射了 IOxlO6個熒光標記的野生型“wt/300-19”細胞時，在12小時后可在 大約10%的脾CD8+DC中檢測到熒光信號，相反在CD8—DC中則沒有觀察到信號。當注射相 同數目熒光標記的muATAC/300-19細胞時，當與注射了 wt/300_19相比時，12小時之后恢復 的信號不斷地并明顯高于⑶8+DC中的信號(圖7和8)。并且在這種情況下，⑶8—DC中仍沒 有觀察到信號。這些結果表明，⑶8+DC優先攝入異源細胞。此外，這些結果證明XCLl大幅 度提高了將異源細胞攝入到XCRl-耐受的APC中。通過這些結果可以預期，XCLl還有利于 活的或者死亡的XCLl-修飾的(即耐受外表面上的XCLl-分子)的哺乳動物/人同源細胞 特異性地攝入到XCRl-表達的哺乳動物/人的APC中。通過這些結果還可以預期，XCLl可 特異性地將任何活的或者死亡物質靶向XCRl-耐受的APC，或者至少促進其攝入到XCRl-耐 受的APC中。本發明的概念可通過在體內耐受或者免疫性的誘導過程中顯示的XCLl利用來證 實(見實施例5)。為了確定在免疫性或者耐受誘導過程中XCL1-XCR1系統是否在體內被 利用，我們使用了一個行之有效的過繼轉移系統(adoptive transfer system)，通過這個 系統將轉基因D011. 10⑶4+T細胞轉移到同系BALB/c小鼠中。這些轉基因T細胞將來自雞 卵清蛋白(OVA)的肽識別為抗原。受體小鼠通過以下幾種方式進行引導(challenged)將 100 μ g OVA注射到跗節中(致耐受性刺激)，或者將100 μ g 0VA+10 μ g的LPS注射到跗節 中(潛在的免疫原刺激，因為LPS提供了“危險信號”)，或者靜脈內注射2mg OVA潛在的致 耐受性刺激。在該系統中，D011. 10轉基因T細胞識別抗原，被活化并擴增。在致耐受性條 件下，轉基因T細胞具有有限的壽命并死亡，然而在免疫原條件下，轉基因T細胞很大程度 上發育成記憶T細胞。當14、24和48小時之后從受體小鼠排出的淋巴組織中回收注射的 轉基因T細胞并進行鼠科XCLl mRNA的表達分析時，在所有情況下均明顯顯示在OVA注射 時XCLl的表達受到非常強而且相同的上調節(upregulated，大約受到30個因子的調節) (表2)。這些數據證明，XCLl可在⑶4+T細胞中高表達。它們進一步顯示XCL1-XCR1的功 能軸(functional axis)在強免疫原性和強致耐受條件下都可被利用。這些數據暗示抗原 通過XCLl對XCRl-耐受APC的靶定是誘導哺乳動物/人類宿主中強免疫性(與佐劑/“危 險信號”一起靶定抗原時)或者誘導強耐受性(在沒有佐劑的情況下靶定抗原時)的合理 方式。
在進一步的實驗中，發明人能夠通過⑶8+T細胞在體內與⑶8+DC相互作用證明 XCLl-介導的促進的抗原識別(見實施例6)。為了檢測XCLl在體內的佐劑效果，我們將 C57BL/6ATAC-K0小鼠與在0T-IATAC-K0小鼠中得到的OT-I轉基因小鼠回交。OT-I轉基因 CD8+T 細胞將 OVA 肽 SIINFEKL (SEQ ID NO 15)識別為抗原。OT-I 或者 0T-IATAC-K0 轉基 因T細胞繼承性地被轉移到同源ATAC-KO⑶57BL/6動物中。24小時后，通過靜脈注射與抗 DEC-205抗體(“DEC-205-0VA”)耦合的OVA對所有受體鼠進行免疫。在所選條件下，抗原 優選由脾中的⑶8+DC占據并優選被交叉遞呈到⑶8+T細胞。一些小鼠與DEC-205-0VA —起 接受抗-CD40抗體的注射，為DC提供“危險信號”。在注射抗原三天后，測定脾中轉基因T 細胞的頻率(圖9)。在耐受條件下(使用DEC-205-0VA免疫而沒有“危險信號”)以及在免 疫條件下(使用與CD40介導的“危險信號”一起免疫的DEC-205-0VA)，在抗原暴露3天后， OT-I T細胞分泌XLC1/ATAC的能力顯著增加了轉基因T細胞的數目(圖9)。另外，OT-I T 細胞分泌XLC1/ATAC的能力也非常顯著地增加了 OT-I T細胞產生細胞因子IFN- γ的能力 (圖10)。在XCLl存在的情況下細胞數目的增加以及IFN-Y產量的增加可作為抗原識別 時XCLl改善⑶8+DC與⑶8+Τ細胞的相互作用的能力的證據。這些數據證明XCL1/XCR1軸 被免疫系統用于誘導耐受或者誘導免疫。此外，這些數據暗示抗原通過XCLl對XCRl-耐受 APC的靶定是在哺乳動物/人類宿主中誘導強免疫性(與佐劑/ “危險信號”一起靶定抗原 時)或者誘導強耐受性(在沒有佐劑的情況下靶定抗原時)的合理方式。在所述治療條件 下，可以使用XCLl或者模擬載體系統輸送抗原，以便將抗原或者抗原+ “危險信號”直接輸 送到XCRl-耐受的哺乳動物/人類APC中。此外，發明人能夠生成對人類XCRl受體特異的單克隆抗體(見實施例7)。為此， 使用代表hXCRl (hATACR)的第一個31N-末端氨基酸的肽對BALB/c小鼠進行免疫，然后將 脾細胞與骨髓瘤細胞系P3X63Ag8. 653融合。以ELISA測定篩選得到的雜交瘤用于分泌特 異性識別免疫肽的抗體。在ELISA中表現特異性反應模式的一種所述抗體6F8被選擇用于 進一步研究。抗體的特異性通過使用人類XCRl的整個編碼區轉染的3個獨立的細胞系的 XCLl的免疫沉淀反應進行檢測。單克隆抗體6F8使來自所有三個轉染子的人類XCRl受體 免疫沉淀，但是不與各自的野生型細胞系發生反應(圖11)。這些實驗確定我們已經產生了 對人類XCRl特異的單克隆抗體。最后，發明人能夠證明ATAC在CD8+T細胞毒性的誘導中作為佐劑起作用(見實施 例9)。根據本發明，待輸送的物質(物質ii)可以是任何合適的物質。例如該物質可以 是蛋白質，(多)肽或者小分子。其可以是天然存在的物質或者其部分，也可以是合成的化 合物。特別優選的是對免疫系統具有影響的物質。在一種替代方式中，理想地是能夠更改交叉遞呈的功能XCRl-表達的APC。該更 改可引起活化、抑制或者XCRl-耐受的APC新陳代謝的任何其他更改(例如導致APC的成 熟或者防止其成熟)。理想地是這可以在要求針對外源或者自體免疫信號的防御的所有條 件下進行，或者在其他條件下進行，諸如阿爾茨海默氏癥疾病。在這種情況下，更改的物質 )可使用靶定劑靶定到XCRl-耐受的APC。靶定的藥物化合物可以是化學物質，藥物、蛋 白質或者肽、脂類、碳水化合物、天然或修飾的(穩定的)DNA或RNA、siRNA、反義核酸、雙鏈 DNA、單鏈DNA、任何形式的RNA，包括三鏈、雙鏈和單鏈RNA、反義RNA，多核苷酸、寡核苷酸、單核苷酸或者它們的衍生物(同樣見下述)。靶定的化合物可以是表達載體系統或者具有 編碼調節性質的蛋白質或者肽的工程病毒，如上所述。理想地是，編碼的蛋白質或肽可在 XCRl-啟動子的控制下特異性表達以保證在XCRl-耐受的APC中特異性表達。在另一種替代實施方式中，理想地是能夠特異性消除XCRl-表達的APC。這可通過 將在XCRl-耐受的APC中直接或間接誘導細胞死亡的化合物靶定到XCRl-耐受的APC來實 現。理想地是這可在所有條件下進行，包括過敏、自體免疫和移植。所述化合物的例子是細 胞毒性試劑(例如氨甲喋呤)、毒素(白喉毒素、假單胞菌外毒素)、細胞凋亡誘導劑(例如 凋亡蛋白酶)、核糖體失活劑(例如篦麻毒素、皂角苷、志賀毒素)、DNA或RNA抑制劑(RNA 或DNA-裂解劑)，或者蛋白質合成抑制劑(反義DNA、反義RNA、siRNA)，以及其他細胞新陳 代謝抑制劑(同樣見下述)。蛋白質性質的細胞誘導劑可直接被輸送到XCRl-耐受的APC 中或者通過基于核酸的表達載體系統或者工程病毒輸送，兩者都優選使用XCRl-啟動子控 制所需蛋白的表達。在另一種替代方式中，理想地是可以修改與XCRl-耐受的APC相互作用的細胞的 功能。這可通過分泌的肽或蛋白質(例如細胞因子、化學因子、生長因子或激素)的表達來 實現，或者可通過XCRl-耐受的APC表面上的受體和配體(例如⑶95L、ICOS-L,⑶86或其 他)的表達來實現。最后，可將DNA或RNA或者編碼所述肽或蛋白質的表達載體系統或者 表達所述肽或蛋白質的工程病毒靶定到XCRl-耐受APC。優選地，所選的表達載體系統可由 XCRl-啟動子驅動以保證XCRl-耐受APC的特異性表達。肽或蛋白質可含有信號肽，使其 能夠在核酸或病毒內化到XCRl-耐受APC中之后，表達為可溶性或者跨膜蛋白。編碼的可 溶性蛋白或肽或細胞表面受體或配體可被設計為和與XCRl-耐受APC(諸如CD4+Thl細胞、 CD8+T細胞、NK細胞或者其他)相互作用的免疫細胞表面上的配體分子相互作用。在這種 方式中這些相互作用的細胞可被活化、在它們的活化過程中被抑制甚至消除(例如通過細 胞凋亡的誘導)。此外，輸送系統可被用作診斷目的檢測XCRl-耐受APC。為此，該物質可以是任何 可檢測化合物諸如標記物，包括例如發色團、放射性配體等。另外，物質可被改性以便允許XCRl-耐受APC的分離，諸如用于進一步的體外醫療 分析或者操作(例如加載藥物化合物)。為此，物質可含有(熒光)標記物。所述標記物包 括標記(His，FLAG, STREP或者c-myc)或者生物素-親和素系統或者地高辛-抗-地高辛 系統(digoxigenin-anti-digoxigenin system)的成分，允許通過磁性粒子、流式分選法等 進行分離。在本發明的優選實施方式中，物質ii)是免疫原、佐劑、藥物或者毒性劑。免疫原是刺激免疫應答的抗原。抗原是由免疫系統中的T細胞(T細胞受體)和B 細胞(B細胞受體)上的特異性受體識別物質。這包括細菌、病毒和其他微生物的部分(膜、 被膜、細胞壁、鞭毛、菌毛、以及毒素)。一般說來，只有與蛋白質和多糖結合時脂類和核酸才 是抗原。非微生物外源(非自身)抗原可包括花粉、蛋清和來自移植組織或器官的蛋白質 或者融合血細胞表面上的蛋白質。抗原可分類為內源性抗原或外源性抗原。內源性抗原是由抗原提呈細胞(APC)本 身合成的蛋白質(“自身蛋白”)，或者可以是病毒、細菌、真菌或者寄生病原體的成分，它們 感染/侵入APC。內源性抗原在MHC I類和II類的環境中存在。外源性抗原通過胞飲作
11用、吞噬作用或者受體介導的內吞作用吸收。內化的抗原由此變得易于被內源蛋白質接近， 從而可通過MHC II類分子遞呈。另外，一些細胞可經MHC I類分子遞呈外源抗原，已知為“交叉遞呈”途徑。所述途 徑在DC中尤其相關，因為它們是可在體內交叉遞呈抗原的主要細胞群，這使得它們能夠在 耐受誘導中和在抗病毒、抗細菌、抗真菌和抗寄生蟲免疫中起核心作用。在小鼠淋巴DC內， ⑶8+DC在吞噬死亡細胞水平方面是最有效的DC，所以在MHC II類遞呈和外源細胞抗原的 MHC I類交叉遞呈水平方面上也是最有效的DC。⑶8+小鼠的DC還是用于外源性可溶性抗 原或者由C-型外源凝集素受體捕獲的抗原的最有效的交叉遞呈DC亞型。需要注意的是， CD8分子的表達對于交叉遞呈來說不是必須的。可以預期的是，存在不能耐受CD8的標記物 的有效交叉遞呈的小鼠和人類系統的XCRl-耐受DC。由DC從胞外空間吸收的大多數可溶性抗原在MHC II類的環境中被遞呈，由此誘 導了⑶4/Th2模式的免疫應答(Th2⑶4T細胞幫助的產生，Th2細胞因子的分泌，Th2_模式 抗體的產生，但是極少的細胞毒性應答)。細胞內抗原(包括已經感染了 DC的細菌、真菌、 病毒和寄生蟲的成分)MHC I類和MHC II類的環境中處理之后被遞呈，因此引起了混合的 Thl/Th2應答。交叉遞呈的抗原在MHC I類和MHC II類的環境下被遞呈并主要引起Thl應 答(Thl⑶4T細胞幫助的產生，Thl-模式抗體的產生，IFN-Y和其他Thl細胞因子的分泌， T細胞毒性的形成)。抗原由DC遞呈，其在抗原攝取、處理和遞呈方面具有高度特異性。有許多亞型的 DC。小鼠中的主要細胞群是漿細胞樣DC，⑶1 Ic+⑶8_DC (簡寫為“⑶8_DC”，有時候也被稱作 CD4+DC)，CDllc+CD8+DC(簡寫為“CD8+DC”)，朗格漢斯細胞，雙陰性(double negative, DN) DC以及組織間隙DC。如同它們作為DC的分類那樣，類漿細胞DC在抗原遞呈和T細胞引發 (priming)中的作用尚不清楚。有淋巴-器官-駐留DC(⑶8_DC，⑶8+DC和DN DC)以及遷 移 DC (間隙 DC 和朗格漢斯細胞)(Villandagos 等人，2007，Nat. Rev. Immunol. 7，543-55)。 所有這些DC均表達⑶lie細胞表面分子。⑶Ilc+⑶8—DC代表了大約1.6%的總的核脾細胞 并且⑶Ilc+⑶8+DC代表了大約0. 4%的總的核脾細胞。抗原的交叉遞呈對于體內腫瘤的根除也是核心重要的。腫瘤細胞和腫瘤抗原必須 由DC攝取、處理并遞呈以引起抗腫瘤免疫應答。由于大多數腫瘤的消除需要有效的毒性 Thl T細胞應答，腫瘤抗原的交叉遞呈是必要的。因此，對于有效的抗腫瘤應答而言，交叉遞 呈DC起了顯著的作用。當向人類受體中移植外源細胞或器官時，一些細胞或者細胞組分由宿主的DC攝 取，處理并遞呈到宿主的免疫系統。可以預期這些外源抗原的遞呈通過交叉遞呈途徑發 生，并且已知其引起對外源組織的強Thl免疫應答。在沒有治療性介入(therapeutic intervention)的情況下，宿主的Thl免疫系統將破壞移植的組織(“宿主抗移植 物”(HVG)-反應)。有許多用來控制HVG-反應的治療方案，但其中沒有完全有效的，并且其 中沒有有效誘導針對供體組織成分的耐受性的。因此存在對于使受體免疫系統耐受供體細 胞成分(抗原)的需要。佐劑是一種改善其他試劑的效果同時如果將其單獨給藥時很少有直接效果的試 劑。在藥理學中，佐劑是本身很少或者沒有藥理學效果但在同時給藥時可增加其他藥物的 效率或潛能的藥物。在免疫學中，佐劑是一種本身沒有任何特異性抗原效應，同時可刺激免疫系統，增加對疫苗的免疫應答的試劑。鋁鹽磷酸鋁和氫氧化鋁是人用疫苗中兩種最常 見的佐劑。鯊烯也在一些人用疫苗中使用，并且更多具有鯊烯和磷酸鹽佐劑的疫苗在對人 類進行試驗。在動物疫苗中使用油類佐劑。另一種獲得市場認可的佐劑和載體系統是病 毒顆粒。在最近的二十年間，已經研究了許多技術來改善基于鋁鹽的廣泛使用但不太理想 的佐劑。這些鹽通過誘導局部炎癥而顯示了它們的效果，這也是這種佐劑的延長的副作 用的基礎。相反，病毒顆粒的佐劑能力不依賴于任何炎癥反應。病毒顆粒含有來自流感 病毒的膜結合紅血球凝聚素和神經氨酸酶，它們可對融合活性進行放大，因此有利于吸收 到抗原提呈細胞(APC)中并誘導本身的抗原處理途徑。抗原以近乎自然的方式通過病毒 顆粒輸送到免疫系統中，這可能是為什么基于病毒顆粒的疫苗由于它們極佳的安全藥歷 (safetyprofile)而突出的主要原因。藥物一般是外源的物質，其對細胞或有機體的功能具有特定影響。通常藥物在疾 病的治療、治愈、預防或診斷中使用，或者用于增強身體或者精神的安寧。藥劑或醫藥是用 于治愈和/或改善疾病或醫學狀態的任何癥狀的藥物，或者可被用作具有未來益處但不治 療任何已有或者預先存在疾病或癥狀的預防性藥物。藥物通常以從有機體外引入而與內源 生化藥劑來區分。毒劑或者毒素是對活細胞或者有機體有毒的物質或者組合物。毒素通常是在與身 體組織接觸或被身體組織吸收時通過與其他蛋白質諸如酶或者細胞受體相互作用而能夠 引起疾病的蛋白質。毒素的嚴重程度差異非常大，包括從通常小且急性的(如蜂蜇傷)到 幾乎立即致死(如肉毒桿菌毒素)的范圍。生物毒素在目的和機制上差異非常大，并且高 度復雜(錐形蝸牛的毒液含有許多小的蛋白質，每個靶向特異的神經通道或者受體)，或者 是相當小的蛋白質。在本發明的更優選的實施方式中，免疫原是病原體，病原體源性抗原、過敏原、腫 瘤抗原或者耐受原。病原體或者傳染劑是生物試劑，尤其是活的有機體，其引起其宿主的疾病或者病 患。根據本發明，病原體優選指的是病毒，細菌和/或真核細胞寄生蟲。病原體源性抗原是 來自病原體的抗原。過敏原是能夠產生過敏性或者過敏反應的物質。通常，其包括來自非病原體的 能夠在個體中刺激過敏性反應的抗原。因此，引起了由免疫系統對抗原物質的誤導反應 (misguided reaction)。過敏反應被誤導是因為外來物質常常是無害的。過敏原的例子包 括花粉、塵螨、真菌、頭皮屑以及特定的食物。腫瘤抗原是在腫瘤細胞中產生的觸發宿主體內免疫應答的物質。腫瘤抗原在識別 腫瘤細胞中是有用的，并且在癌癥治療中是可能的候選物。體內的正常蛋白質由于自我耐 受而不具有抗原性。然而，由于突變而具有異常結構的腫瘤細胞中產生的任何蛋白質都可 作為腫瘤抗原。特別是，導致異常蛋白產生的原癌基因和腫瘤抑制基因的突變是形成腫瘤 的原因，因此所述異常蛋白質被稱作腫瘤特異性抗原。腫瘤特異性抗原的例子包括ras和 P53基因的異常產物。相反，其他與腫瘤形成不相關的基因的突變可導致所謂的腫瘤相關抗 原的異常蛋白的合成。正常時產量低但在腫瘤細胞中產量急劇增加的蛋白質觸發了免疫應 答。這種蛋白質的一個例子是黑色素產生所需的酪氨酸酶。正常地，酪氨酸酶以微量產生， 但其產量在黑色素瘤細胞中增加得非常多。瘤胚抗原是另一種重要的腫瘤抗原族。例子有α-胎甲球蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。這些蛋白質在胚胎發育的早期正常產生，并隨著 免疫系統完全發育而消失。因此不對這些抗原形成自我耐受。異常蛋白也通過被致癌病毒 例如EBV和HPV感染的細胞產生。由這些病毒感染的細胞含有潛伏的病毒DNA，其可被轉錄 并且由此產生的蛋白質產生免疫應答。除蛋白質之外，其他物質例如細胞表面糖脂和糖蛋 白在腫瘤細胞中也可具有異常結構，因此成為免疫系統的靶標。耐受原是刺激免疫應答并且不引起炎癥免疫防御反應的免疫原。其可被用于在免 疫系統中誘導針對其組分的耐受。耐受可由于中樞耐受(central tolerance)或者外周耐 受(peripheral tolerance)而出現。中樞耐受涉及耐受原，其中相應的抗原已經暴露于胸 腺中的T細胞，導致特異性T細胞的消除。當抗原被遞呈到T細胞而沒有合適的其他“危險 信號”時出現外周耐受。在本發明的輸送系統的進一步優選的實施方式中，毒劑是一種細胞毒素、凋亡誘 導劑、核糖體失活劑、DNA或RNA裂解劑或者蛋白質合成抑制劑。細胞毒素是對特定的體細胞(通常是特定器官中的那些)具有直接毒性或者破壞 性影響的物質。具體例子包括腎毒素和神經毒素。許多癌癥治療使用毒素或者細胞毒素來殺死活躍并快速分裂的癌細胞。這種化學 治療劑的令人遺憾的副作用是使體內一些健康的正常細胞諸如毛囊和骨髓也活躍地分裂 并且也可被細胞毒性劑攻擊，其限制了給藥的頻率。許多化學治療劑藥物通過破壞有絲分 裂、有效地靶定快速分裂的細胞起作用。常見化學治療劑的例子是烷化劑(例如順鉬、卡鉬 和奧沙利鉬)、抗代謝物(例如偽裝成嘌呤((硝基咪唑硫嘌呤，巰基嘌呤))或者嘧啶)的抗 代謝物，蒽環類抗生素(anthracycline)、植物堿(例如長春花生物堿和紫杉烷(taxane)) 以及影響細胞分裂或者DNA合成的拓撲異構酶抑制劑(例如依立替康、拓撲替康、安吖啶、 依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊甙)。以不同方式起作用的其他化學治療劑還包括單克隆 抗體(靶定腫瘤特異性抗原(例如曲妥珠單抗(赫賽汀)、西妥昔單抗和利妥昔單抗)或者 阻斷新的腫瘤血管的形成(例如貝伐單抗(阿瓦斯丁))和新的酪氨酸激酶抑制劑例如甲 磺酸伊馬替尼(Gleevec 或者Glivec )，其直接以特定類型的癌細胞中的分子異常作為 靶標(慢性粒細胞白血病、胃腸基質瘤)。從功能上講，毒素還可以是凋亡誘導劑(一種誘導細胞程序性死亡的試劑，諸如 吉西他濱(gemcitabinehTNF相關的凋亡誘導配體(TRAIL)或者含有金剛烷基的類維生素 A相關化合物)，核糖體失活劑(廣泛分布在植物界中并使核糖體失活的一大組毒性蛋白， 例如通過酶攻擊真核生物核糖體60S亞基并不可逆修飾其大的核糖體RNA(rRNA)，諸如篦 麻毒素，aviscumine，或者志賀-狀核糖體失活蛋白質)，DNA或者RNA裂解劑(即結合并 裂解DNA/RNA的DNA/RNA相互作用化合物諸如1，2，4-苯并三嗪(benzotriazine)、1，4- 二 氧化物、白藜蘆醇、順鉬或者錘頭狀核酶)或者蛋白質合成抑制劑(例如通過中斷肽鏈延 伸、封閉核糖體位點、錯讀遺傳密碼而抑制蛋白質合成的化合物)，或者防阻止寡糖側鏈與 糖蛋白諸如抗生素連接的化合物(例如茴香霉素、氯霉素、鏈霉素、四環素、新霉素或者紅 霉素)，梭鏈孢酸(fusidic acid)、白喉(diptheria)毒素、篦麻毒素或者環己酰亞胺。除了待輸送的物質(物質ii))之外，輸送系統包括與趨化因子(C基元)受體 I(XCRl)(分子i)結合的分子。所述分子的功能在于其選擇性地靶定XCRl陽性專職抗原 提呈細胞并影響將待輸送的物質引入到該細胞中。之后，基于物質ii)的性質，物質ii)可以其預期的方式起作用。在化學上，分子i)可以是任何合適的化學物質；例如分子可以是 蛋白質、(多)肽、抗體或其片段或者小分子。從功能上講，分子可以是激動劑或者拮抗劑； 但是，全部或部分激動劑是優選的。不限于該理論，假定在將分子特別是激動劑與XCRl結 合的情況下，配體與XCRl的復合物被內化到細胞中。通過與G蛋白偶聯受體家族的其他成 員，已知與拮抗劑相比激動劑易于誘導更高的內化水平，因此激動劑是優選地。另外，應當 理解的是配體易于與能夠介導將待輸送物質包含到細胞中的結構域結合。假定受體的外部 結構域是(a)對于介導物質ii)的內化特別合適的結構域。因此，假定與這些結構域結合 的配體特別適于本發明的輸送系統。人類XCRl的氨基酸序列是已知的(NCBI ；登錄號NP_001019815)MESSGNPEST TFFYYDLQSQ PCENQAffVFA TLATTVLYCL VFLLSLVGNS LVLffVLVKYESLESLTNIFI LNLCLSDLVF ACLLPVffISP YHWGWVL⑶F LCKLL匪IFS ISLYSSIFFLTIMTIHRYLS VVSPLSTLRV PTLRCRVLVT MAVffVASILS SILDTIFHKV LSSGCDYSELTffYLTSVYQH NLFFLLSLGI ILFCYVEILR TLFRSRSKRR HRTVKLIFAI VVAYFLSffGPYNFTLFLQTL FRTQIIRSCE AKQQLEYALL ICRNLAFSHC CFNPVLYVFV GVKFRTHLKHVLRQFffFCRL QAPSPASIPH SPGAFAYEGA SFY(SEQ ID NO: 17)然而，XCRl或者其他趨化因子受體的精確三維結構仍然未知。基于初級氨基酸序 列的分析，XCRl最接近的同源趨化因子受體是CCR5，其具有36% —致性，并在321個殘基 延伸的氨基酸水平上有56%的相似性。一些研究已經提出了域結構和CCR5的配體結合位 點的詳細分析，并且由于CCR5與XCRl之間明顯的同源性，所以這些研究的結果可被用于預 測XCRl的結構特征。一項研究分析了一些趨化因子的保守結構域并取得了有關CCR5的細 胞內、細胞外和跨膜區位置的精確預測(Raport等人，1996，J. Biol. Chem. 271，17161-66)。 由于這些區域的主體在XCRl中也是保守的，其可合理地采用CCR5的結構域預測，并由此 提出鼠科和人類XCRl的結構域結構，見下表中的描述。對于配體結合來說重要的CCR5的 殘基在另一研究中被詳細研究(Zhou等人，2000，Eur. J. Immunol. 30，164-73)，并且提出 在胞外結構域在配體結合中涉及的同時，N-端結構域和第二胞外環(ECL2)是主要協助者 (contributor) 0基于這些實驗可以得出，人類XCRl的1_34和166-191位的氨基酸是XCLl 的主要結合位點，并且89-103和251-271位氨基酸作出了較小的貢獻。因此，與這些結構域 結合的分子可能是合適的XCRl配體，并且該基本原理可被用于尋找和/或設計合適的XCRl 配體，例如通過分子模擬。
除與XCRl結合外，應當理解分子i)應當能夠介導物質ii)合并到細胞中(例如 通過受體內化或者內吞作用或者吞噬作用)。可通過標準方法來檢查分子i)與XCRl結合 并介導物質合并的能力，例如通過標記分子i)并對其去向(fate)進行示蹤(攝入到XCRl 耐受細胞中)，或者在培養階段之后，在分子i)與XCRl結合之后通過測定APC表面上的 XCRl水平。XCRl的內化可在XCRl-耐受的初級APC上檢測或者作為替代在XCRl-轉染子 (比較實施例7)上測定。待測分子i)可被標記(例如使用放射性化合物或者熒光染料，或 者毒素或者影響XCRl耐受細胞代謝的藥物)并在趨化因子受體內化的最佳時間(典型地 超過5分鐘)出現的溫度下(典型地高于7。C )與XCRl-耐受細胞反應(Neel等人，2005， Cyt. GrowthFactor Rev. 16，637-58)。在充分培養階段之后，XCRl內化的速度可通過利用 光學方法(在使用熒光標記的情況下)測定內化分子i)的量或者通過測定結合的放射性 (在放射性標記例如[125I]-XCLl的情況下)或者通過評估細胞死亡(在毒素的情況下)或 者通過任何其他適于使用標記物的檢測方法來確定。作為替代，XCRl的內化速度可通過使用流式細胞儀或者任何其他能夠確定細胞表面上XCRl水平的測定(例如細胞ELISA)來 比較分子i)與XCRl結合之前和之后的XCRl細胞表面表達的水平間接測定。作為替代， 轉染的XCRl受體可被標記(例如通過熒光劑或者通過使用用于轉染的XCRl的熒光融合 蛋白變體)，使受體的去向/內化可直接被評估，例如通過光學方法。所有描述的方法都適 于高通量篩選系統。所描述的方法對本領域的技術人員來說都是公知的(例如Colvin等 人，2004，J. Biol. Chem. 279,30219-27 ；Sauty 等人，2001，J. Immunol. 167，7084-93 ；Rose 2004，J. Biol. Chem. 279,24372-86 ；Signoret 等人，2000，J. Cell. Biol. 151，1281-94 ；以及 在表2中列舉的出版物Nee等人，2005，Cyt. Growth Factor Rev. 16，637-58)。作為替代， 分子i)的結合還可使用如在實施例2中詳細描述的活化檢測通過測定細胞內Ca2+濃度或 者任何其他合適的XCRl誘導的細胞活化代謝物的濃度來研究。作為替代，分子i)的攝取 可根據在實施例4中詳細描述的原理進行測定。在本發明的一個優選實施例中，分子i)是趨化因子(C基元)配體I(XCLl)或者其 功能活性變體。如上面詳細描述的那樣，XCLl是天然形成的XCRl配體。其天然形成的變體 為XCL2(見上述)也可被使用。重組的人的XCLl的三維結構通過NMR分光術確定。發現XCLl 在所有其他必須的趨化因子之間采用高度保守的折疊，其特征在于無序(disordered)的 N-末端，三鏈反平行片層和C-末端α-螺旋(“典型”的趨化因子折疊)。正如其他的 趨化因子，N-末端看起來對于XCLl的功能來說是需要的。因此可假定XCLl對其受體XCRl 的結合非常類似于結合其他趨化因子的受體，并可由兩步模型(two-step model)來描述 在第一步中，趨化因子的主體特異性識別并與受體結合，這誘導趨化因子的構象發生變化 以及柔性N-末端的重新排列。在第二步中，趨化因子N-末端與受體相互作用并誘導其活 化，典型地觸發鈣離子的流入。除了一般的相似性以外，三維結構特征被鑒別，其對于XCLl 是獨特的；這包括二硫鍵的數目，C末端的長度和N-末端結構域的特定排列。雖然大多數 趨化因子顯示出了兩個二硫鍵，但在XCLl中缺少其中的一個。這被認為其使得XCLl的結 構不穩定，因為在接近生理條件下可檢測到兩種構象狀態保守的趨化因子折疊和非趨化 因子構象。這種結構的非均一性的生物學意義不清楚，但這表明非趨化因子構象不與受體 結合。ATAC的第二種結構特征是較大C-末端延伸的存在(殘基73-93)。該獨特C-末端 的作用不清楚，并且其缺少后的功能性后果也處于爭議之中。已經在延伸的C-末端發現了 八個可能的糖基化位點，但尚未檢測到糖基化對XCLl的結構或功能的影響。最后，第二個 二硫鍵的缺失導致對于受體相互作用來說中的所謂的30' s環的不同定向。另外，該環縮 短了兩個氨基酸，并從N-末端解偶聯。該特定排列的功能含義尚不清楚。多個物種的XCLl (ATAC)的氨基酸序列(包括人類SEQ ID NO :l，GenBank登錄號 P47992 ；小白鼠SEQ ID NO :2，GenBank登錄號 P47993 ；以及大鼠 SEQ ID NO :3，GenBank登 錄號P51672)是已知的，并且顯示為SEQ ID N0:1到3(見下)。另外，稱為K4. 1HHV8 (SEQ ID NO :4，GenBank登錄號AAB62672. 1)(見下)的特異性XCLRl激動劑也是已知的，其為 病毒趨化因子樣蛋白質。這些天然形成的XCRl配體的任何一種或者任何其他天然形成的 XCRl配體都可使用。
17 作為替代，可使用任何天然形成的XCLl的功能活性變體。術語變體包括片段，添 加、缺失和/或替代一個或多個氨基酸得到的變體，以及分子，特別是蛋白質，包括任何天 然形成的XCLl或其部分，例如融合蛋白。融合蛋白的XCLl部分可被C-末端、N-末端、或 者C-和N-末端氨基酸殘基保護(flanked)。功能活性片段的特征在于來自任意天然形成的XCRl配體，特別是XCL1，尤其是一 個或多個氨基酸缺失的SEQ ID N0:l-4的那些。缺失可以是C-末端、N-末端和/或者內 部缺失。優選地，片段由至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或者60，更優選至多1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25 或者 30，甚至更優選至多 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12， 13，14或者15，還優選至多1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，最優選1，2，3，4或者5個氨基酸缺失 得到。本發明的功能活性片段的特征在于具有與由其來自的配體顯示的活性類似的生物學 活性，包括結合XCRl并介導物質ii)內化的能力。天然形成的XCRl配體，如果片段的活性 (結合以及內化)等于至少10%，優選至少25%，更優選至少50%，甚至更優選至少70%， 還更優選至少80 %，尤其優選至少90 %，特別是至少95 %，最優選至少99 %的XCLl活性而 沒有序列改變的話，天然形成的XCRl配體，尤其是XCLl的片段，尤其是SEQ ID NO :1_4的 那些是具有本發明上下文中的功能活性的。這些片段可以任何所需長度設計或得到，包括 少到大約18到50個氨基酸長度。天然形成的XCRl配體，特別是XCLl，尤其是SEQ ID NO :1_4的那些的功能活性片 段的特征還在于其他結構性質。因此，在本發明的一種優選實施方式中，功能活性片段包括 至少60 %，優選至少70 %，更優選至少80 %，還更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %，最 優選99%的SEQ ID NO: 1-4的任何一個的XCRl配體的氨基酸序列。如上定義的功能活性 片段可來自缺失一個或多個氨基酸的肽。缺失可以是C-末端，N-末端和/或內部。上述 SEQ ID NO :1-4的序列排列顯示出了看起來保守的天然形成的配體的結構域。在本發明的 優選實施方式中，這些結構域在片段中可被保持。保守區包括對于SEQ ID NO :1_3的加工的N末端的那些氨基酸(加工的N-末 端從未加工的N-末端的22位氨基酸開始)，對于SEQ ID NO 4包括在位置1_2 (V/S G)，13-27 (S/N L X T/S Q/A R L P V/P X K/R I/L K/IX T/G X Y 處具有氨基酸 27，X =任何 氨基酸或者沒有氨基酸；SEQ ID NO :5)，35-51 (R/K A V I F I/V T K/H R/S G L/R K/R I/ V C A/G D/S P ；SEQ IDNO 6)以及在位置11和48的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(也參見 上述的排列)。如果僅考慮相同氨基酸的話，對于序列SEQ ID NO: 1-4的一致序列是XGXX XXXXXXXXCXXXLXXXRLPXXXXXXXXYXXXXXX-XXXXAVIFXTXXGXXXCXXP(SEQ ID NO :7)，如果考慮 相同氨基酸和多數氨基酸(例如在序列3和4中存在的氨基酸，在斜線之后列舉的替代氨 基酸)的話，一致序列是(V/S) GX (E/A) (V/T) XXXXXXXC (V/E) X (S/N) LX (T/S) (Q/A) RLP (V/P) X (K/R) (I/L) (K/I) X (T/G) XYX (I/T) X (E/T) (G/V) XXXX (R/K) AVIF (V/I) T (K/H) (R/S) G (L/R) (K/R)XC(A/G) (D/S) P (SEQ ID NO :8)。如果僅考慮相同氨基酸的話，對于序列SEQ ID NO 1-3 的一致序列是 VGXEVXXXXXCVXLXTQRLPVXXIKTYXIXEGXXRAVIFXTKRGL-XXCADPXAXWVXXXX XXXDXXXXXXXXXXXTXPTXXQXSXXTAX-TLTG(SEQ ID NO :9)，如果考慮相同氨基酸和多數氨基 酸(例如在序列2和3中存在的氨基酸，在斜線之后列舉的替代氨基酸)的話，一致序列 是 VG(T/S)EV(L/S)X(E/K)(S/R)XCV(S/N)LXTQR LPV(Q/S)(K/R)IKTY-(T/I)IXEG(A/S)(M/ L) RAVIF (V/I) TKRGL (K/R) (I/V) -CADP (Q/E) A (K/T) ff-V (K/R) X (A/V) (I/V) (K/R) (T/S) (V/M) D (G/R) (R/K) (A/S) (S/N) (T/A) (R/S) (K/-N) (N/S) (M/K) (A/I) (E/Q) TXPT (G/Q) (A/T)Q(R/Q) S(T/A) (S/N)TA(V/I)TLTG(SEQ ID N0:10)。因此，在本發明的優選輸送系統中，XCLl的功 能活性變體，優選功能活性變體片段或者由SEQ ID NO :7-10的任何一個的序列組成，優選 SEQ ID NO :8-10，更優選 SEQ ID NO :9 或 10，尤其是 SEQ ID NO :10。本發明的另一種優選實施方式涉及如上面定義的XCLl變體，其中XCRl配體是序 列SEQ ID NOS 1-4的任何一個的XCRl配體的功能活性變體，其中變體具有至少50%與序 列SEQ ID N0S: 1-4的任何一個的XCRl配體相同的序列。在更優選的實施方式中，功能活 性變體具有與序列SEQ ID NOS 1-4的任何一種的抗原的至少60%的序列一致性，優選至 少70 %，更優選至少80 %，還更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %，最優選99 %的一致 性。序列一致性的百分比例如可通過序列比對(sequence alignment)確定。用于比較 的序列比對方法在本領域是公知的。各種程序和比對算法已經在例如Smith和Waterman， Adv. App 1. Math. 2 482,1981 或者 Pearson 禾口 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 2444-2448，1988 中描述。美國國立生物技術信息中心(NCBI)基本的局部對比排列搜索工具(BLAST) (Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990)是一些可利用的資源，包括美國國立 生物技術信息中心(NCBI，貝塞斯達，MD)以及在網上，與序列分析程序blastp，blastn, blastx，tblastn和tblastx結合使用。SEQ ID NOS 1-4的任何一種抗原的變體的典型特征 在于使用 NCBIBlast 2.0，設定為缺省參數(default parameter)的空位(gapped)blastp。 為了比較至少35個氨基酸的氨基酸序列，Blast 2序列的功能使用設定為缺省參數的缺損 BL0SUM62陣列進行采用(空位存在值(gap existencecost)為11，并且每個殘基空位值 (residue gap cost)為1)。當將短肽(少于大約35個氨基酸)進行比對時，使用Blast 2 序列函數采用設定為缺省參數的PAM30陣列(開放空位為9，延伸空位為1罰分(penalty) 進行比對。在所述短窗口(short window)上諸如15個氨基酸或更短確定序列一致性的 方法在由馬里蘭州貝塞斯達的美國國立生物技術信息中心持有的網站(http://WWW. ncbi.nlm. nih. gov/BLAST/)上描述。作為替代，多重序列的比對可使用來自DNAStar (麥迪遜，威斯康星州，美國)的 MegAlign軟件進行，該軟件采用ClustalV比對算法(Higgins等人，1992，Comput. Appl. Biosci. 8，189-91)。在上述比對中該軟件被使用并設定為下列缺省參數空位罰分10，空 位長度罰分10。由于同源性非常低，為了將SEQ ID NO 4包含到比對中，需要手動調節。功能活性變體通過在天然形成的XCRl配體中的序列變化得到，其中具有序列變 化的XCRl配體保留了未改變的XCRl配體的功能，例如具有與由天然形成的XCRl配體顯示 的那些類似的生物學活性，包括與XCRl結合并介導物質ii)內化的能力。所述序列改變可 包括但不限于，保守替代，缺失、突變和插入。功能活性變體的這些性質例如可通過上面詳 細描述的那樣進行評估。在本發明的還一更優選實施方式中，功能活性變體來自通過SEQ IDNO :1_4的任 何之一的天然形成的XCRl配體的保守替代得到。保守替代在與它們的側鏈和化學性質相 關的氨基酸家族中發生。這些家族的例子是具有堿性側鏈、酸性側鏈、非極性脂肪族側鏈、 非極性芳香族側鏈、不帶電荷的極性側鏈、小側鏈、大側鏈等的氨基酸。在一種實施方式中， 肽中包括一個保守替代。在另一種實施方式中，肽中包括兩個或更少的保守替代。在進一 步的實施方式中，肽中包括三個或更少的保守替代。保守氨基酸替代的例子如下，包括但不限于以下例子最初的殘基保守替代AlaSer
ArgLys
AsnGln；His
AspGlu
CysSer
GlnAsn
GluAsp
HisAsn；Gln
IleLeu；Val
Leulie；Val
LysArg；Gln ；Asn
MetLeu；Ile
PheMet；Leu ； Tyr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp；Phe
Vallie；Leu 在本發明的另一優選實施方式中，分子i)是抗-XCRl抗體或其能夠與XCRl特異 性結合的功能活性片段。抗體的功能活性片段被定義為與XCLl的功能活性片段(見上)類 似，即功能活性片段(a)的特征在于來自通過一個或多個氨基酸缺失得到的任何抗-XCRl抗體，諸如C-末端，N-末端和/或內部缺失，以及(b)其特征在于具有與其來自的抗-XCRl 抗體所顯示的那些類似的生物學活性，包括與XCLl結合的能力。天然形成的抗體是由免疫 系統識別并中和外來物質所使用的蛋白質。每個天然形成的抗體具有兩個較大的重鏈和 兩個較小的輕鏈，并可結合不同的抗原。本發明包括例如單克隆抗體和多克隆抗體、嵌合抗 體、單鏈抗體和人源化抗體以及Fab片段、Fab、Fab'、F(ab' )2'、Fv、或者Fab表達文庫 的產物。抗體或者抗體組分可進一步被修飾以進一步延長其生物學半衰期或者以其他方式 使它們更適于靶定。針對XCRl產生的抗體可通過將XCRl或其片段直接注射到動物體內或 者將XCRl或其片段給藥到動物優選非人動物得到。這樣得到的抗體然后可與XCRl結合。 為了制備單克隆抗體，通過連續細胞系培養例如雜交瘤細胞系提供抗體的現有技術中任何 已知的技術均可被使用。在實施例7中詳細描述了合適的單克隆抗體的生產。所描述的用 于單鏈抗體生產的技術(美國專利號4，946，778)可被采用以生產對XCRl的單鏈抗體。而 且，轉基因小鼠或者其他生物體諸如其他哺乳動物科被用于表達對XCRl的人源化抗體。在本發明的另一優選實施方式中，分子i)是(多)肽。肽或多肽是通過以限定順 序連接的α-氨基酸形成的聚合物。一個氨基酸殘基與下一氨基酸殘基之間的連接已知為 酰胺鍵或者肽鍵。蛋白質是多肽分子(或者包括多個多肽亞基)。它們的區別在于肽比較 短而多肽/蛋白質比較長。然而，在本發明的上下文中，術語肽、多肽和蛋白質被互換使用。 (多)肽優選被用作在本發明中在上面結合XCLl及其變體詳細描述的分子i)。作為替代， 人們還可使用(多)肽文庫識別能夠結合XCR1、能夠活化XCRl耐受的APC并優選能夠誘 導XCRl耐受APC中的內吞作用的(多)肽。識別內吞誘導的(多)肽的測定系統已經在 上面和實施例2和4中描述。在本發明的另一優選實施方式中，分子i)是小的有機分子，即通常具有低于大約 2, 000g/mol的分子量的含碳化合物，優選低于大約1500g/mol，還更優選大約低于IOOOg/ mol的分子量的含碳化合物。有機分子例如可以是醇、醛、烷烴(alkan)、烯烴(alkene)、胺 或者芳香族化合物。人們還可使用小有機物分子文庫或者天然產品文庫來識別能夠結合 XCRl的分子，能夠活化XCRl-耐受APC的分子，優選能夠誘發XCRl-耐受APC內吞的分子。 識別誘導內吞的小有機物分子的測定系統在上面已經描述，并在實施例2和4中描述。如上面詳細描述的那樣，本發明的輸送系統適于將物質輸送到XCRl陽性專職抗 原提呈細胞中。XCRl陽性指的是專職抗原提呈細胞耐受它們表面上的XCRl受體。抗原提 呈細胞(APC)是在其表面上顯示出與MHC復合的外源抗原的細胞。T細胞可識別使用它們 的T細胞受體(TCR)的這種復合物。APC分為兩類專職或者非專職。由于幾乎體內的每 個細胞在技術上而言都是APC (由于其可通過MHC I類分子將抗原遞呈到⑶8+T細胞)，術 語“專職抗原提呈細胞”被限制為那些可引起天然(naiVe) T細胞(即活化先前沒有暴露于 抗原的T細胞)的APC。專職APC表達MHC II類以及MHC I類分子，并可刺激⑶4+( “輔 助性”)細胞以及CD8+( “細胞毒性”)T細胞。這些專職APC在內化抗原時是非常有效地， 例如通過吞噬作用或者通過(受體介導)內吞作用，然后在它們的膜上顯示與I類或II類 MHC分子結合的抗原片段。T細胞識別并與APC膜上的抗原-I類或II類MHC分子復合物 相互作用。然后其他的共-刺激信號(co-stimulatory signal)由抗原提呈細胞產生，導 致T細胞活化。雖然巨噬細胞和B細胞可有效遞呈抗原，但目前僅公知的專職APC是在那 些CD8+樹突狀細胞中的樹突狀細胞(DC)。更優選地，輸送系統能夠通過受試者中的XCRl
21陽性專職抗原提呈細胞介導作為抗原的物質或其片段的遞呈，特別是通過主要的組織相容 性復合物(MHC) I類分子(“交叉遞呈”)。根據本發明，輸送系統可以是包括成分((分子i)和物質ii))的任何合適的系 統，如此處詳細描述的那樣。例如，輸送系統的物質ii)(包括例如免疫原、過敏原、耐受原、佐劑、藥物、化學物 質、DNA、RNA、表達載體系統、工程病毒(engineeredvirus)、毒素、酶等)可以非共價連接到 分子i)(即靶定劑)，例如通過離子強度力(ionic strength force)、粘附力、黏聚力和其 他作用。作為替代并優選的，物質ii)可通過化學耦合直接與分子i)連接，或者利用連接 子諸如肽連接子連接，或者在蛋白顆粒(proteinacious)組分的情況下作為融合蛋白。作為替代，待輸送的物質(例如免疫原、過敏原、耐受原、佐劑、藥物、化學物質、 0嫩、1 嫩、表達載體系統、工程病毒、毒素、酶等)可被包裝/封裝到“載體”中以保持待與 XCRl-耐受APC靶定的物質的完整性和有效性。所述載體可以是活的或死亡的細胞、病毒、 病毒狀顆粒、納米顆粒、脂基(lipid-based)系統(例如脂質體)、外來體、凋亡小體、膠體分 散系統、聚合物、碳水化合物、微球或者任何其他合適的載體。該載體可通過靶定劑即分子 i)(見上)的存在被靶定到載體(外)表面上的XCRl-耐受APC，以便允許載體與XCRl-耐 受APC的特異性結合，如果需要的話接著進行內化。特別優選的載體是病毒的結構蛋白或者其多聚體結構，諸如殼粒、病毒狀顆粒或 病毒。多聚體結構可以是至少大約5個，優選至少大約10個、更優選至少大約30個，最優選 大約至少60個結構蛋白的聚集體并可在多聚體結構內含有待輸送的物質。已知病毒諸如 微小病毒(例如腺病毒相關病毒2)的結構蛋白可被修飾以在它們的表面上遞呈特定蛋白 質。根據這些，結構蛋白可被修飾以將與XCRl諸如天然形成的XCRl配體或其變體(將上 面限定的)結合的蛋白顆粒(proteinacious)分子遞呈到載體表面上。然后，載體經XCRl 與DC結合并可被包含到DC中。合適的插入位點已經在例如US6719978中公開。在本發明的進一步的實施方式中本發明的輸送系統進一步包括iii)佐劑，特別是“危險信號”。佐劑是能夠通過許多機制中的至少一種提高對給藥抗原的免疫應答的化合物，這 些機制包括提高抗原攝入，延長抗原的生物半衰期，沉淀狀效果(cbposit-like effect), 通過活化提供“危險信號”的最初免疫應答，誘導細胞因子、活化DC和/或使DC成熟、誘導 對于T細胞刺激分子的配體以及其他。提高NK細胞或者T細胞與DC特異性相互作用的任 何化合物也都可用作佐劑。佐劑可被分成兩類。一種類型的佐劑通過免疫系統提高抗原的 識別，例如通過提高將抗原攝入到專職APC中或者通過優化NK細胞與專職APC的相互作 用。這種類型的佐劑不能誘發炎癥或者提供“危險信號”，因此可被用于提高試圖誘導免疫 系統中對耐受原的無反應力或者耐受性的耐受原的效果。另一種類型的佐劑在免疫系統中 誘發炎癥，例如通過提供“危險信號”(見上)。“危險信號”型佐劑的例子是免疫刺激復合 物(ISCOM)、病毒狀顆粒(VLP)、LPS、BCG、未甲基化的CpG-基元、雙鏈RNA等等。蛋白顆粒 (proteinacious) “危險信號”型佐劑的例子是熱休克蛋白或者高速泳動族蛋白Bi。在本發明的一種實施方式中，分子i)、物質ii)和任選地佐劑iii)是一種或多種 (多)肽，其中多肽如上面的定義。分子i)、物質ii)和任選地佐劑iii)可以是一種(多) 肽(即融合蛋白)，并且其可以是兩種或多種(多)肽。
在本發明的進一步的實施方式中，分子i)、物質ii)和任選地佐劑iii)彼此共價 和/或非共價結合。如上面詳細描述的那樣，該成分可以是一種融合蛋白。作為替代，所述 成分可以通過合適的連接子彼此連接。在融合蛋白的情況下，連接子由一個或多個氨基酸 殘基組成。作為替代，所述成分可以彼此非共價結合，諸如通過離子鍵、氫鍵和/或范德華 鍵結合。所述成分可包括提供共價結合或非共價結合的合適結構域。對于共價結合，這包 括肽連接子或者耦合基團，使成分能夠彼此耦合。對于非共價結合，提供用于結合的結構域 的例子包括生物素_親和素系統、抗體或其片段、以及抗原或者酶或其部分和其底物。在本發明的進一步的方面中涉及一種或多種編碼本發明的輸送系統的(多)肽的 核酸，如果分子i)、物質ii)和任選地佐劑iii)是一種或多種(多)肽的話。本發明的核 酸分子可以是RNA的形式，諸如mRNA或者cRNA，或者可以是DNA的形式，包括例如cDNA和 基因組DNA，例如通過克隆得到的或者通過化學合成技術產生的或者通過二者結合得到的。 DNA可以是三鏈、雙鏈或者單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，也被稱為有義鏈，或者其可以是 非編碼鏈，也稱為反義鏈。其中，在這里使用的核酸分子也指單鏈DNA和雙鏈DNA，單鏈RNA 和雙鏈RNA混合物的DNA，以及單鏈和雙鏈區的混合物的RNA，雜交分子包括可以是單鏈更 典型地是雙鏈或三鏈或者單鏈和雙鏈區的混合物的DNA和RNA。另外，這里使用的核酸分子 指的是包括RNA或DNA或者RNA和DNA兩者的三鏈區。此外，編碼本發明的輸送系統的任何一種核酸分子可使用標準技術諸如標準克隆 技術在功能上連接任何所需的調控序列，諸如啟動子或增強子或者前導序列，或者異源編 碼序列，以形成融合蛋白。在本發明的還一方面涉及包括本發明的一種或多種核酸的載體。載體可另外包 括允許其在宿主細胞中復制的核酸序列，諸如復制起點、一個或多個治療性基因和/或選 擇標記基因和本領域已知的其他遺傳成分諸如指導編碼蛋白的轉錄、翻譯和/或分泌的調 控元件。載體可被用于轉導、轉化或者感染細胞，從而引起細胞表達不同于細胞本身的那 些核酸和/或蛋白質。載體可選地包括幫助核酸實現進入細胞的物質，諸如病毒顆粒、脂 質體、蛋白包被等等。通過標準的分子生物學技術用于蛋白質表達的許多類型的合適表 達載體在本領域是已知的。所述載體選自常規載體類型，包括昆蟲，例如桿狀病毒表達， 或者酵母、真菌、細菌或者病毒表達系統。其中許多類型是本領域已知的其他合適的表達 載體也可被用于此目的。得到所述表達載體的方法是公知的(例如參見Sambrook等人， Molecular Cloning. A Laboratory Manual，第二片反，Cold SpringHarbor Laboratory, New York(1989)) 0在一種實施方式中，載體是一種病毒載體。病毒載體包括但不限于反轉錄病 毒載體和腺病毒載體。用于由此方法轉染的合適宿主細胞或者細胞系包括細菌細胞。例 如，各種大腸桿菌菌株作為宿主細胞在生物技術領域是公知的。枯草芽孢桿菌、假單胞菌、 鏈霉菌和其他桿菌以及類似菌株的各種菌株也可在該方法中采用。本領域技術人員已知的 許多酵母細胞菌株也可用作表達本發明的肽的宿主細胞。其他真菌細胞或者昆蟲細胞諸如 Spodopterafrugipedera (Sf9)細胞也可被用作表達系統。作為替代，哺乳動物細胞諸如人 293細胞，中國倉鼠卵細胞(CHO)J^COS-I細胞系或者來自瑞士的，BALB/c或MH小鼠的 鼠科3T3細胞可被使用。還有其他合適的宿主細胞以及用于轉染、培養、擴增、篩選、生產和 純化的方法在本領域是已知的。本發明的(多)肽可通過在合適的宿主細胞中表達本發明的核酸產生。宿主細胞可被轉染，例如通過常規方法諸如在轉錄調控序列的控制下使用至少一種含有本發明的 核酸的表達載體電穿孔。然后將轉染或轉化的宿主細胞在允許蛋白質表達的條件下培養。 通過本領域技術人員已知的合適方式將表達的蛋白質回收、分離并選擇性地從細胞中純化 (或者如果在細胞外表達的話則從培養基中回收)。例如，在細胞裂解之后將蛋白質以溶解 形式分離出來，或者使用已知技術提取出來，例如在氯化胍中提取。如果需要的話，本發明 的(多)肽以融合蛋白形式生產。所述融合蛋白為如上所述的那些。作為替代，例如，理想 地是產生的融合蛋白增強蛋白質在所選宿主細胞中的表達或者提高蛋白質純度。包含本發 明的成分的分子可進一步使用各種常規方法的任何一種純化，包括但不限于使用HPLC， FPLC以及類似技術的液相色譜諸如正相或者反相液相色譜親和色譜(諸如使用無機配體 或者單克隆抗體)；體積排阻色譜(size exclusion chromatography)；固定化金屬螯合物 色i普(immobilizedmetal chelate chromatography) ； 疑月交電辦太等等。本領域技術人員可 在不偏離本發明的范圍的情況下選擇最合適的分離和純化技術。這種純化提供了其本上不 含微生物的其它蛋白顆粒(proteinacious)和非蛋白顆粒(non-proteinacious)物質的抗 原。在本發明的進一步的方面涉及一種藥劑，其含有本發明的輸送系統或者本發明的 一種或多種核酸。關于本發明的藥劑，包括在這里描述的所有情形的疫苗、免疫原或耐受原，物質 ii)，特別是靶向XCRl-耐受APC的免疫原(包括病原體源性抗原、過敏原、腫瘤抗原、耐受 原、外源組織抗原、自體免疫抗原等等)可作為(多)肽或蛋白質應用。作為替代，物質ii) 可用作天然或者修飾(穩定)的編碼(多)肽或蛋白質的DNA或RNA。作為替代，其可被 用作以核酸為基礎的啟動子驅動的表達載體(例如質粒或者線性化RNA或DNA)，其一旦被 內化到XCRl-耐受APC中則能夠表達免疫原性蛋白質/多肽。優選地，這樣的載體系統可 利用XCRl啟動子來驅動(多)肽或者蛋白質的表達，以便編碼的(多)肽/蛋白質可在 XCRl-耐受的哺乳動物人APC中選擇性地表達。作為替代，(多)肽或者蛋白質可通過重組 技術設計(engineer)到病毒中，其后選擇性地靶定到XCRl-耐受APC，其可被內化并開始表 達(多)肽/蛋白質。再次地，優選(多)肽或蛋白質的表達可由XCRl-啟動子驅動。在 以核酸為基礎的表達載體系統或者病毒系統的情況下，(多)肽或者蛋白質可在XCRl-耐 受APC中表達、加工并在APC細胞表面上遞呈。取決于環境(發炎/ “危險信號”針對“危 險信號”缺失)，表達的肽會引起免疫反應或者耐受性。(多)肽或者蛋白質可單獨或者與 其他佐劑或者任何修飾XCRl耐受APC的功能的藥物化合物結合被靶定到XCRl-耐受細胞。本發明的藥劑可在需要時被給藥到受試者，優選哺乳動物，還更優選人類。給藥的 可能模式包括皮內(皮下)、肌肉內、腸胃外、胃腸、靜脈內、動脈內、關節內、腦池內、眼內、 心室內、鞘內、氣管內、腹膜內、胸腺內、脾內、黏膜，或者局部或口服或者它們的組合，但最 優選地是肌肉內或者皮下或者靜脈內注射。肌肉內給藥的劑量體積優選至多大約5mL，例 如0. 3mL和3mL之間，ImL和3mL之間，大約0. 5到ImL之間，或者大約2mL。每個劑量中活 性成分的量應當足以提供治療或預防。在不同的實施方式中，單位劑量的待輸送物質應當 至多大約5 μ g物質/kg體重，在大約0. 2 IlJ 3 μ g之間，在大約0. 3到1. 5 μ g之間，在大 約0. 4到0. 8μ g之間，或者大約0. 6μ g。在替代的實施方式中，單位劑量可以是至多大約 6 μ g物質/kg體重，在大約0. 05到5 μ g之間，或者在大約0. 1到4 μ g之間。在不同的實
24施方式中，劑量被給藥1到3次，例如以1到3周為間隔。代表性的每劑量的蛋白量從大約 1 μ g到大約lmg，更優選從大約5 μ g到大約500 μ g，還更優選從大約IOyg到大約250 μ g， 并且最優選從大約25 μ g到大約100 μ g。治療涉及將有效量的物質ii)給藥到受試者，優選哺乳動物，更優選人類。因此， 本發明的進一步的方面涉及預防或治療疾病(如這里特指的那樣)的方法，其中使用本發 明的輸送系統將有效量的物質ii)給藥到受試者。預防和治療可進一步如在本文中特指的 那樣。“有效量”的藥劑或者物質ii)可作為能夠顯示體內效果的量被計算，例如預防或 改善本文中特指的病征或癥狀。所述量可由本領域技術人員來確定。優選地，所述藥劑不 經腸道給藥，優選肌肉注射或者皮下注射。然而，其還可以通過任何其他合適的途徑制成制 劑給藥，包括口服或者局部給藥。所述治療性組合物的輸送途徑和劑量的選擇在本領域技 術人員的知識范圍內。本發明的上下文中提到的治療指的是治療性治療和預防或預防性措施，其中目標 是預防或減緩(減少)靶定的病理狀態或者疾病。那些需要治療的個體包括已經患病和有 患病趨勢或者將要預防疾病的個體。藥劑一般可包括至少一種合適的藥物學上可接受的載體或者輔助物質。所述物質 的例子是去礦質水、等滲鹽水、林格氏溶液、緩沖液、有機或者無機酸以及堿和它們的鹽、氯 化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉或者磷酸氫鈣、乙二醇，丙二醇，酯諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯， 糖諸如葡萄糖、蔗糖和乳糖，淀粉諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉，溶解劑和乳化劑諸如乙醇、 異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、芐基苯甲酸、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺，油 諸如花生油、棉籽油、玉米油、豆油、蓖麻油，合成脂肪酸酯諸如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯， 聚合物佐劑諸如白明膠、葡萄聚糖、纖維素及其衍生物、清蛋白，有機溶劑，復合劑諸如檸檬 酸鹽和尿素，穩定劑諸如蛋白酶或者核酸抑制劑，優選抑酶肽、ε _氨基己酸或者胃酶抑素 Α，防腐劑諸如苯甲醇，氧化抑制劑諸如硫酸鈉、蜂蠟和穩定劑諸如EDTA。著色劑、防粘劑、涂 層劑、增甜劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以在組合物中存在。生理緩沖液優 選PH值大約為6. 0-8. 0，尤其是ρΗ值大約為6. 8-7. 8，特別是ρΗ值大約為7. 4，和/或大約 200-400毫滲模/升的滲透壓，優選大約290-310毫滲模/升的滲透壓。藥劑的ρΗ —般使 用合適的有機或者無機緩沖液調節，例如優選使用磷酸緩沖液，tris緩沖液(三羥甲基氨 基甲烷)，HEPES緩沖液(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)或者MOPS緩沖液(3-嗎啉基丙磺酸)。各 個緩沖液的選擇一般依賴于所需緩沖液的摩爾濃度。磷酸鹽緩沖液是合適的，例如用于注 射和輸液。將藥物制成制劑以及合適的藥物學上可接受的載體或者輔助物質的方法對本領 域技術人員來說是已知的。藥物學上可接受的鹽和輔助性物質為根據其中包括(a. ο.)流 行劑型和化合物來選擇。輸送系統可基于需求和狀態被靶定到XCRl-耐受APC。可以預期的是XCRl-耐受 APC不僅保留在脾臟、淋巴結和排泄(draining)淋巴組織內，而且保留在哺乳動物/人體中 所有其他器官內，例如胸腺、肝臟、肺、腦中以及粘膜表面下(例如在內臟中)。因此藥物化 合物的靶定可通過注射/應用到各個組織中來實現。在本發明的一個優選實施方式中，藥劑是疫苗和/或佐劑。如上面詳細描述的那 樣，疫苗包括細胞、病毒、細菌、真菌、寄生蟲或者毒素成分，或者其他抗原成分，將其給藥到哺乳動物或人的體內。作為替代，疫苗可以編碼病毒、細菌、真菌、寄生蟲或者毒性成分的 DNA或者RNA形式給藥；一旦在體內，核酸由體細胞翻譯成編碼的蛋白質，然后作為抗原起 作用。疫苗常常與“佐劑”一起給藥，所述佐劑為能夠通過一些機制顯著提高對給藥抗原的 免疫應答的化合物，這些機制包括提高抗原攝入、延長抗原的生物學半衰期、沉淀狀效應、 通過提供“危險信號”活化初始免疫應答，誘導細胞因子、活化DC和/或使DC成熟、誘導對 于T細胞協同刺激分子的配體以及其他。提高NK細胞或者T細胞與DC相互作用的任何 化合物也都可作為佐劑。在許多情況下佐劑含有病原體成分，其為免疫系統提供“危險信 號”(見上)。靶定APC以及特別是靶定交叉遞呈APC的疫苗可被用于免疫健康個體以保護他 們不受感染(“保護性疫苗”)。作為替代，這樣的疫苗可被用于治療目的。不能對抗原 發動(mount)足夠的Thl免疫應答的受感染個體可以接種設計成引起強大的特定Thl應 答特別是細胞毒性應答的疫苗，并可由此變得能夠控制或者消滅感染(“治療性疫苗”)。 例子可以是瘧疾、肺結核、利什曼原蟲、朊病毒病、正粘病毒特別是流感、甲型肝炎，乙型 肝炎、慢性丙型肝炎、HIV和其他慢病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒 (bimyaviruses)、杯狀病毒、線狀病毒、黃病毒特別是丙型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、副粘病 毒、各種呼吸道病毒以及其他病毒，或者任何在說明書中指出的感染。疫苗還可被用于保護健康個體遠離由已知的抗原成分形成腫瘤(例如黑色素瘤、 前列腺癌)(“腫瘤保護性疫苗”)。作為替代，引起強大的Thl免疫應答特別是Thl細胞毒性 應答的這種疫苗可被用于治療已經產生腫瘤的患者。所述腫瘤的例子可以是人病毒引起的 腫瘤，特別是乳頭瘤病毒、HCV引起的腫瘤、乙型肝炎病毒引起的腫瘤以及在慢性感染時引 起腫瘤的其他病毒。此外，Thl免疫性特別是細胞毒性免疫性的超感應(superinduction)， 對于自發引起的實體腫瘤(例如黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、腸道癌、肺癌)和白血病來說 是需要的。在這種情況下患者可使用已知的腫瘤抗原或者其自身的(切除)腫瘤材料以所 述靶向APC的方式治療，以便引起對腫瘤特異性抗原的強大的細胞毒性Thl免疫應答。一些疫苗可被用于使敏感個體脫敏。敏感個體易于對環境抗原產生Th2_過度反 應。結果他們產生各種過敏反應諸如鼻炎、結膜炎、食物過敏、對毒液過敏以及過敏性哮喘。 目前可用的以將免疫平衡傾斜(tipping)成對各種免疫原更易產生Thl免疫應答為目標的 脫敏方案和脫敏治療并不完全有效。因此，對各種免疫原誘導更多Thl-定向的免疫性的新 方法是高度需要的。這可通過將各種免疫原靶定到能夠對免疫原引起有效Thl應答的APC 特別是DC上實現，并可包括使用對Thl免疫系統共同靶定的佐劑(“治療性脫敏”)。在使 免疫平衡向Thl免疫應答傾斜之前，通過將毒素特異性靶定到該細胞群對于首次消除APC 細胞群是有幫助的。脫敏疫苗還可被用于具有形成過敏反應的易患病體質但還沒有出現過 敏癥狀的個體(“預防性脫敏”)。脫敏的相同原理可被用于對自體抗原引起的免疫反應特別是以Thl為基礎的抗 體或者細胞免疫反應引起的自身免疫性疾病，例如，類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、自 體免疫性甲狀腺炎(autoimmunethyrodiditis)以及其他以Thl-對自體抗原過度反應為基 礎的自身免疫性疾病。這樣的脫敏疫苗可以不對免疫系統和APC提供“危險信號”的制劑 的形式使用。脫敏疫苗可替代地以防止遞呈自體免疫原的DC成熟甚至誘導靶定DC的“未 成熟”狀態的形式和制劑靶定。實現該目的的一種方式可包括通過將特異性毒素靶定到這種細胞群使APC細胞群瞬間消除來實現。該整個方案以修飾樹突狀細胞的狀態為目標，以 將耐受原信號提供到與DC相互作用的抗原特異性T細胞。在該方式中，人們可以預期誘導 針對各種(自體)抗原的免疫耐受。在本發明的另一種優選實施方式中，本發明的藥劑用于誘導針對肽的記憶免疫應 答，優選其中記憶免疫應答為Thl應答，尤其是Thl細胞毒性應答。在其中需要免疫原性疫苗的情況下，免疫原必須被靶定到“危險信號”環境中的 XCRl-耐受哺乳動物/人類APC (見上)。可在疫苗制劑中應用靶定的免疫原，其中靶定免疫 原和危險信號型佐劑在制劑(例如乳劑)中混合然后使用。作為替代并優選地，危險信號 型佐劑直接與靶定免疫原耦合，因此如所描述的那樣使用靶定劑共同靶定XCRl-耐受APC。本發明的另一種優選實施方式中涉及免疫原性疫苗，本發明的藥劑用于預防或者 治療腫瘤和/或感染。免疫原性疫苗可被用于特別是哺乳動物/或人中的腫瘤預防或者治療。靶定的免 疫原是腫瘤抗原。這可以是已知的腫瘤抗原；已知的腫瘤抗原的例子是黑色素瘤抗原、前列 腺抗原以及腺癌抗原(同樣見上)。在這種情況下腫瘤抗原可被用作能夠誘導對腫瘤的免 疫應答的蛋白質或者肽部分(moiety)。在已經建立但未知的腫瘤抗原的情況下，來自切除 腫瘤材料的患者特異性組織制劑可被用作抗原制備。靶定的免疫原還可以是慢性感染時誘 發腫瘤的病毒、支原體或者細菌。這種感染劑的例子是均誘導肝癌的丙型肝炎病毒、乙型肝 炎病毒和誘導宮頸癌的HPV以及其他病毒。對于免疫原性疫苗，同時應用“危險信號型”佐 劑是必需的。該方法可在兩種不同的環境(setting)中使用。首先，其可以預防的方式用 已知腫瘤抗原在易于形成腫瘤的個體中給哺乳動物/人類接種針對腫瘤或者腫瘤誘導抗 原的疫苗。在這種情況下，產生的針對腫瘤成分或者腫瘤誘導的Thl免疫可預防腫瘤的形 成。在第二種環境下，已經患有腫瘤的患者以治療形式接種疫苗以便發動針對腫瘤和/或 腫瘤誘導抗原的有效免疫應答，尤其是Thl (細胞毒性)免疫應答并以消除腫瘤為目的。這 種類型的方法在各種類型的腫瘤中應用，包括黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、腸道癌、肺癌、 肉瘤、白血病、淋巴瘤、神經膠質瘤、骨髓瘤、肉瘤、肉狀瘤病、小神經膠質細胞瘤、腦膜瘤、星 形細胞瘤、少突神經膠質瘤、霍奇金病。免疫原性疫苗可被用于特別是哺乳動物/人類中感染的預防或治療。由于靶定的 免疫原可以是活的、減毒或者死亡的病原體，即病毒、細菌、寄生蟲、真菌、支原體、失活毒素 或者其免疫原性組分。免疫原還可以被用作誘導對病原體的免疫性的蛋白質或者肽部分 (moiety)。對于免疫原性疫苗，同時應用“危險信號”型佐劑通常是需要的，除非病原體或 其組分已經提供了所需“危險信號”。這種“危險信號”可通過各種組分提供，例子是LPS、未 甲基化的CpG、高速泳動族蛋白Bi、熱休克蛋白等(見上)。這種方法可被用于各種病原體。 例子是肺結核、螺桿菌、瘧疾、利什曼原蟲、朊病毒病、正粘病毒特別是流感病毒、冠狀病毒 特別是SARS病毒、西尼羅河病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV) 和其他慢病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、線狀病毒、黃病 毒特別是丙型肝炎病毒、副粘病毒、各種呼吸病毒以及需要控制并消除有效Thl免疫應答 特別是Thl細胞毒性應答的其他病毒。免疫原性疫苗可被用于過敏性疾病尤其是哺乳動物/人類中的過敏性疾病的預 防或治療(脫敏)。靶定的免疫原是過敏原。過敏原的例子是塵螨過敏原、花粉過敏原、草
27過敏原、毒液過敏原、食物過敏原和其他。過敏原還可以被用作過敏原的免疫原性成分，或 者能夠誘導對過敏原的免疫反應的蛋白質或肽部分(moiety)。對于免疫性疫苗，同時應用 “危險信號”型佐劑是需要的。目的在于在各種條件下將個體對來自Th2的過敏原的免疫應 答改變成Thl免疫應答模式。例子是過敏性哮喘、其他過敏性肺部疾病、食物過敏、過敏性 鼻竇炎、過敏性鼻炎(花粉病)、息肉病以及其他過敏狀態。該方法可在已經建立的過敏條 件下作為治療性疫苗使用(脫敏)。作為替代，易產生過敏反應的個體可以預防形式針對已 知過敏原接種疫苗，于是他們不再產生對于過敏原的麻煩的Th2過敏反應。在本發明的另一種優選實施方式中，本發明的藥劑用于誘導針對(多)肽的耐受 性。存在許多條件，其中對給定免疫原形成耐受而不是免疫所需要的。這是可能的，因 為存在對于首次將免疫原(即耐受原)特異性靶定到XCRl-耐受APC的可能，該XCRl-耐 受APC在哺乳動物/人體中免疫耐受的建立和維持中起到突出的作用。耐受的誘導在器官 移植、自身免疫性疾病和過敏狀態下是需要的。在這些條件下不應當在藥物中存在“危險信號”。優選地，所述藥劑用于抑制移植排斥、過敏和/或自身免疫性疾病。耐受性疫苗可在器官移植中使用。器官或組織的人類受體可在移植之前在缺少危 險信號佐劑的情況下通過將免疫原靶定到XCRl-耐受APC而對外來組織抗原耐受。在這種 情況下的免疫原可以是供體細胞、供體細胞的組分、肽或蛋白質。在這些情況下，宿主的Thl 免疫系統可耐受外來組織抗原并耐受移植。該方法可在器官移植(例如肝臟移植、心臟移 植、肺移植、皮膚移植、腎臟移植)、骨膜移植或者胰島細胞移植或者任何其他外源組織移植 中應用。通過將外源組織抗原應用到胸腺或者骨膜中，人們可誘導中樞耐受。通過將免疫 原應用到外周，人們可誘導外周耐受。耐受性疫苗可被用于過敏癥的治療和/或預防。過敏個體或者易產生過敏反應的 個體可在缺少危險信號佐劑的情況下通過將過敏原靶定到XCRl-耐受APC對過敏原產生耐 受。這可以用預防的形式在易過敏個體中或者在已經建立的過敏中進行。靶定的免疫原是 過敏原或者過敏原的部分。目標是使個體的免疫系統對給定過敏原產生耐受。該方法可應 用于過敏條件下，其中過敏應答由Thl免疫系統驅動，例如重金屬(鎳、鉻及其他)敏感。 該方法還可在其中需要使Th2和Thl免疫系統兩者都耐受過敏原或者敏感劑的個體中應 用，例如在過敏性哮喘、其他過敏性肺部疾病、食物過敏、過敏性鼻竇炎、過敏性鼻炎(花粉 病)、息肉病以及其他過敏狀態中應用。耐受性疫苗可被用于自體免疫狀態的治療和/或預防。許多人類自身免疫性疾病 由Thl自體免疫過程驅動。理想地是使自體免疫個體或者易產生自體免疫反應的個體對自 體免疫抗原產生耐受。這些自體免疫抗原是已知的(例如在假麻痹性重癥肌無力、自體免 疫甲狀腺炎、多發性硬化、自身免疫性糖尿病)，或者可在可預見的未來確定。個體可在缺少 佐劑的情況下通過將自體抗原靶定到XCRl-耐受APC對自體抗原產生耐受。該方法可被應 用于假麻痹性重癥肌無力、自體免疫甲狀腺炎、多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬、發炎 性腸道疾病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、強直性脊柱炎、反 應性關節炎、銀屑病關節炎以及其他Thl驅動的自體免疫狀態。許多佐劑的缺點是當以非定向的形式給藥時，它們施加在體內一些細胞類型上的效果廣泛并且不特異。因此試圖使佐劑的使用效果更具有特異性，例如通過將佐劑與免疫 原耦合。然而，目前沒有可利用的方法允許將佐劑選擇性地靶定到DC，并更具體地靶定到 交叉遞呈DC，兩者都將不適當的效果最小化并選擇性地靶定最有效的抗原遞呈DC細胞群。 因此，存在對于所述佐劑靶定的需要。如上面詳細描述的那樣，現在能夠使用XCRl配體特 異性靶定DC。另外，在CD8+T細胞毒性的誘導下能夠顯示出XCLl (ATAC)作為佐劑起作用。因此，本發明的另一方面涉及含有XCLl或者其功能活性片段的佐劑(如上述限 定)，特別是通過調節XCRl陽性抗原提呈細胞的功能的用于增強受試者免疫應答的佐劑。XCLl吸引、活化的能力以及提高XCRl-耐受APC的抗原遞呈能力使XCLl成為沒 有危險信號性質的理想疫苗佐劑。將XCLl加入到任何疫苗或者制藥配方中都可被預期將 XCRl-耐受APC吸引到哺乳動物/人體內的應用部位。在應用免疫原的情況下，這可提高 抗原攝入和在XCRl-耐受APC中的遞呈，特別是交叉遞呈，并提高T細胞和B細胞免疫應 答。根據應用的環境，該免疫應答可導致對于應用的免疫原的更高程度的耐受(非炎癥狀 態下，無“危險信號”)，或者當在炎癥狀態下給藥時(“危險信號”)導致對應用的免疫原提 高的免疫性。將XCLl與藥物化合物共同給藥可被預期將導致這種化合物攝入到XCRl-耐 受APC中的增加。


圖1示出了在10000個細胞中正常化表達的不同鼠科脾細胞群polyA-mRNA的定 量PCR之后觀察到的XCRl拷貝數。僅⑶Ilc+⑶8+DC表達了顯著量的XCRl mRNA。圖 2 示出 了通過XCLl 的 XCRl-耐受DC 的活化。CD8+CDllc+(A)或者 CD8TDllc+(B) 樹突狀細胞(DC)被固定在多聚-L-賴氨酸-包被的蓋玻片上并裝載有fura-2/AM(2 μ Μ)。 將細胞在單色器-輔助的數字視頻成像系統中成像，并在60s以IOOnM ATAC激發 (challenged) 0數據代表了在3個獨立實驗中測定的27-33單細胞(細線，thin lines)中 細胞內Ca2+的濃度([Ca2+]i)。粗線(Thick lines)指在所有細胞測定時的平均[Ca2^i信 號。XCLl誘導了⑶8+⑶Ilc+㈧中的[&2+幾信號但不誘導⑶8_CD1 Ic+⑶樹突狀細胞中的 [Ca2Ulr號。圖 3 示出 了在 1-lOOOng/mLXCLl 和 500ng/mL CCL21 存在下在體外 transwell 趨 化實驗中遷移脾⑶8+DC和⑶8T)C的百分比。僅CD8+DC響應于XCLl遷移。圖4示出了在100ng/mL XCLl和500ng/mLCCL21存在下在體外transwell趨化實 驗中遷移淋巴結⑶8+DC和CD8T3C的百分比。僅CD8+DC響應于XCLl遷移。圖 5 示出了分別在 Ι-lOOOng/mLXCLl 或者 200ng/mLCXCL12 或者 100ng/mLCCL21 或者200ng/mL CXCL9存在下脾B細胞、T細胞和NK細胞在體外transwell趨化實驗中的 遷移行為。沒有細胞群響應于XCLl遷移。圖6示出了含有三個外顯子(有數字的黑框，位于上方)的內源ATAC基因座、靶 載體ATACmut/pTV-0 (位于中間)和靶定基因座(位于底部)的預期結構的圖譜。限制酶切 位點:X, XbaI ；Sc, SacI ；E1, EcoRI。選擇性標記neo，新霉素抗性；tk，來自單純皰疹病毒 的胸苷激酶。示出了內源ATAC和靶定ATAC基因座的預期的XbaI限制片段的大小(分別 為 16kb 和 22. 5kb)。圖7示出了通過流式細胞儀分析脾CDllc+CD8+DC的設門策略(gating strategy)。在軸上示出了染色的細胞表面標記。在死亡細胞(DAPI+，7D)和CD19+細胞(7E)除去 (gate out)之后，CDllc+MHC-Ir細胞代表了大約4%的有核脾細胞。這些CDllc+MHC-II+ 細胞進一步被細分成CDllb+和CD8+(樹突狀)細胞(7G)。示出了對于CDlIc+CDS+(7H)和 ⑶Ilc+CDllb+(71)(樹突狀)細胞的熒光信號(CFSE)。圖8示出了注射了 CSFE-標記的細胞系之后脾CSFE+DC的百分比。A中示出了使 用⑶8+DC得到的數據，B中示出了使用⑶8_DC得到的數據。XCLl顯著促進了細胞(抗原) 攝入到CD8+DC中。圖 9 示出了 PBS、DEC-205-0VA 或者 DEC-205-0VA/ α -CD40 注射 3 天之后，0Τ-Ι 細 胞在受體小鼠脾中的百分比。與ATAC-KO-小鼠(白圈)相比，在野生型小鼠(黑圈)中觀 察到更高的百分比。圖10示出了分離自第三天的受體鼠脾中并在體外再次刺激的IFN-Y-表達OT-I 細胞的百分比。與ATAC-KO小鼠(白圈)相比，在野生型小鼠(黑圈)中觀察到IFN-分泌 OT-I細胞的更高的百分比，表明XCLl對T細胞分化有佐劑效應。圖11示出了使用mAb 6F8的人XCRl蛋白質的免疫沉淀(腹腔注射，i. P.)的蛋 白質印跡(Western Blot)。泳道1:標記物泳道2 用來自轉染子“5' c-myc/hATACR/P3X”的mAb 6F8進行腹腔注射泳道3 用來自P3X野生型細胞系的mAb 6F8進行腹腔注射泳道4 用來自轉染子“3' c-myc/hATACR/P3X”的mAb進行腹腔注射泳道5 用來自轉染子“hATACR/300-19”的mAb 6F8進行腹腔注射泳道6 用來自300-19野生型細胞系的mAb 6F8進行腹腔注射圖12示出了加載了不同重組體鼠科XCLl制劑的考馬斯染色(Coomassie)的 SDS-PAGE。泳道1:標記物泳道2 金屬親和純化的XCL1-SUM0融合蛋白泳道3 使用SUMO蛋白酶消化后的XCL1-SUM0融合蛋白泳道4:純化的XCLl圖13分別示出了過繼轉移到C57BL/6或者ATAC-KO小鼠中之后0T_I T細胞和 ATAC-KO OT-I T細胞的OVA特異性細胞毒性。0VA/300-19細胞在轉移1天之后被用于免 疫作用，并在第6天進行體內細胞毒性測定。圖14示出了 XCRl在脾DC中的表達。
具體實施例方式實施例1 :CD8+DC中XCRl mRNA的專門測定將來自C57BL/6小鼠的脾臟在含有2% (v/v) FBS (低內毒素；ΡΑΑ，帕興，奧地利)， 500 μ g/mL 膠原酶 D 以及 20 μ g/mL DNase I (均購自 RocheDiagnostics GmbH,彭茨貝格， 德國)的RPMI1640中在37°C搖動水浴中消化25分鐘。將懸浮液調整為IOmM EDTA溶液并 另外培養5分鐘。將細胞通過70-μ m-篩(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亞州，美國) 并使用 MACS-PBS(PBS，2mM EDTA,0. 5% (w/v)BSA 低內毒素)清洗。在使用 380Xg 在 4°C下沉淀之后，將細胞懸浮在MACS-PBS中。為了將B細胞、T細胞、NK細胞、粒細胞或者巨噬細胞磁性分離，通過使用 抗-⑶Ilc-微珠(Miltenyi Biotec，貝爾吉施格拉德巴赫，德國)陰性選擇將消化的脾 細胞中的DC (樹突狀細胞)耗盡。通過使用抗-CD19-微珠的陽性選擇純化B細胞，使用 抗-CD90-微珠純化總T細胞，使用抗DX5-微珠純化NK細胞，使用抗_Ly6G_微珠純化粒 細胞，使用生物素結合的mAb F4/80(ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)和抗-生物素 微珠(Miltenyi Biotec，同上)純化巨噬細胞，所有純化都根據生產商的說明(Miltenyi Biotec,同上)進行。為了分離DC，將消化的脾細胞襯以(underlayed) 1. 069g/mL Nycodenz 溶液(Axis-Shield，奧斯陸，挪威)并在4°C下SOOXg離心20分鐘。從界面處收集低密度 細胞并用MACS-PBS洗滌一次。根據生產商的說明(Miltenyi Biotec，同上)使用抗-CDllc 磁珠通過磁性細胞分選純化總DC。簡言之，使用含有200μ g/mL抗-FCRII/III(mAb 2. 4G2 ； ATCC,同上)以及500 μ g/mL純化的小鼠IgG(Nordic，蒂爾堡，荷蘭)的MACS-PBS使細 胞在4°C下預培養5分鐘，以防止非特異性結合。加入CDllc-微珠再培養15分鐘，并用 MACS-PBS洗滌兩次。將細胞加載到安裝在MidiMACS S印erator磁鐵(MiltenyiBiotec， 同上)中的LS柱(Miltenyi Biotec，同上)上并洗滌3次；將⑶lie-陽性細胞保持在 柱上，并且將柱從磁場中移去之后加入5mL的MACS-PBS進行洗脫。將⑶Ilc+脾細胞在含 有 200 μ g/mL 抗-FcRI I/I 11 (mAb 2. 4G2)，500 μ g/mL 純化的小鼠 IgG (均為阻斷劑)的 FACS-PBS (PBS，2. 5% (v/v) FBS, 0. 1% (w/v) NaN3)中使用抗-CD8 (mAb 53-6. 72 ；ATCC,同 上)，抗-CDllb (mAb 5C6 ;ATCC，同上)，抗-CDllc (mAb N418 ;ATCC，同上)以及抗-MHC II 類(mAb M5/114. 15. 2 ;ATCC，同上)在4°C下染色20分鐘。洗滌后，將細胞在Aria Cell Sorter (BD Bioscience)上分類成 CDllc+CDK 和 CDllc+CD8+DC 亞細胞群至純度> 95%。根據試驗方案使用高純度RNA提取試劑盒(Roche DiagnosticsGmbH,同上)制備 總RNA。簡言之，通過離心收集細胞(IO5-IO7)并懸浮在200 μ LPBS中并與400 μ L Lysis/ Binding緩沖液混合。將裂解物施加到過濾管上并以SOOOXg離心15秒。使用500 μ L洗 滌緩沖液I將過濾器洗滌一次并用DNase I培養15min以除去殘留的DNA。在使用500 μ L 洗滌緩沖液I洗滌并使用洗滌緩沖液II洗滌兩次之后使用50 μ L洗脫緩沖液將RNA洗脫兩 次。合并的洗脫液的RNA濃度和純度在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, 瓦爾特布隆，德國)上測定并通過光度計讀取。將來自IO5-IO7個細胞的小比例mRNA使用μ MACS mRNA提取試劑盒(Miltenyi Biotec，同上)分離。將細胞沉淀在ImL Lysis/Binding緩沖液中裂解并以13000Xg離心 3分鐘。在加入50yL Oligo-(dT)-微珠之后，將裂解物加載到固定在yMACS分離磁鐵中 的μ MACS柱上。將柱用200μ L的Lysis/Binding緩沖液清洗兩次，用洗滌緩沖液清洗4 次。通過使用5U DNase I (Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國)消化1分鐘除去痕量的殘 留DNA。重復洗滌步驟除去消化的DNA和DNase。將預先加熱的洗脫緩沖液(120 μ L，70°C ) 用于洗脫純化的mRNA。如上所述進行質量控制。根據生產商的說明使用反轉錄系統(Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國)將總 RNA或者mRNA反轉錄成cDNA。簡言之，將0. 1-1 μ g總RNA或者1-lOng poly (A) mRNA在 70°C下變性10分鐘后立即冷卻。使用Oligo (dT) 15引物和AMV反轉錄酶在室溫下反轉錄 15分鐘，接著在42°C培養。4°C培養5分鐘之后，通過95°C加熱5分鐘的步驟終止反應。然后通過定量PCR分析cDNA關于它們的XCRl拷貝數的含量，并以β 2-微球蛋白作為內 部標準。為了擴增鼠科 XCR1，使用 400ηΜ 正向引物(5，-TGCCTGTGTTGATCTCAGCAC-3，；SEQ ID NO :11)，200ηΜ 反向引物(5，-CGGTGGATGGTCATGATGG-3，；SEQ ID NO 12)，和 150nM 雜 交探針(5，-FAM-CATCAGCCTCTACAGCAGCATCTTCT-TCCT-TAMRA-3，)。鼠科 β 2-微球蛋白 使用 300ηΜ 正向引物(5，-CGCTCGGTGACCCTAGTCTTT-3，；SEQ ID NO 13)，300ηΜ 反向引物 (5，-TTCAGTATGTTCGGCTTCCCA-3，； SEQ ID NO: 14)和 150nM 雜交探針(5，-FAM-CGGCTTGTA TGCTATCCAGAAAACCCCTCA-TAMRA-3‘)擴增。為了產生對于mRNA/cDNA拷貝數定量的標準， 擴增了特定XCRl基因片段并使用Zero Background克隆試劑盒(Invitrogen，格羅寧根， 荷蘭)將其克隆到PZErO載體中。對于qPCR，將引物與包括R0X(ABgene，埃普瑟姆，英國) 以及1/10的溶入20 μ L PCR-反應液中的cDNA的10 μ LABsolute QPCR Mix混合。在ABI Prism 7000或者7700序列檢測系統(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州，美 國)上進行PCR并定量，在PCR中95°C下初始酶活化15分鐘，接著進行50個循環(95°C， 15秒；60°C，1分鐘)。為了進行定量，將范圍從100到108拷貝的克隆基因片段的一些溶 液對應地用于產生標準曲線。結果在表1中示出。表1 :mRNA拷貝數的定量
細胞類型mRNA拷貝數/10000個細胞脾細胞912T細胞15B細胞16NK細胞0粒細胞5巨噬細胞41CDllc+CD8+DC925CDllc+CD8DC148717實施例2 通過XCLl選擇性活化⑶8+DC如實施例1中描述的那樣通過流式分選法新分選至純度> 95%的⑶8+和⑶8_DC 被補充添加2μΜ fura-2/AM (Molecular Probes，布拉特爾伯勒)并允許在潮濕環境中 37°C下5% CO2中置于多聚-L-賴氨酸-包被的蓋玻片上30分鐘。使用含有(mM) 128 NaCl, 6KC1, IMgCl2, ICaCl2, 5. 5 葡萄糖，10HEPES，0. 2 % (w/v)BSA 的 HEPES 緩沖液冷卻 (superfuse)粘附細胞，并將其安裝到倒置顯微鏡(Axiovert 100，Zeiss，耶拿，德國)的 載物臺上。在施加XCLl (IOOnM的合成鼠科XCLl (Dictagene，洛桑，瑞士))過程中，使 用340nm、358nm、380nm和480nm的單色光依次激發fura-2并使用冷卻的CCD-照相機(TILL-Photonics，格雷弗爾芬，德國)通過512nm長通濾波器測定熒光發射。與⑶8+DC結 合的FITC-標記的抗體的弱干擾信號被消除，并在光譜分離(spectral unmixing)之后計 M- [Ca2+Iiaenz J. Cell Biol. 2002，179 :291_301)。數據代表了在 3 個獨立實驗中測定的 45-56單細胞中的細胞內Ca2+的濃度([Ca2Ii)(黑線)。加粗的黑線指的是所有測定細胞 的平均[Ca2Uf號。結果表明XCLl在⑶8+DC中誘導了強Ca2+信號(圖2，A)，但沒有在 CD8—DC中誘導出Ca2+信號(圖2,B)。因此，該結果證明了 XCLl特異性活化CD8+DC的能力， 因此XCLl作為XCRl-耐受APC的佐劑起作用。實施例3 =XCLl誘導了 CD8+DC的趨化性，但不誘導⑶8—DC、B細胞、T細胞或NK細 胞的趨化性根據生產商的試驗方案使用⑶Ilc-微珠(Miltenyi Biotec，貝爾吉施格拉 德巴赫，德國)通過磁分離從C57BL/6脾細胞中高度富集⑶Ilc+細胞。將⑶Ilc+細胞 (0. 5-lxlO6)懸浮在100 μ L培養基中并轉移到6. 5mm含有5-μ m多孔聚碳酸酯膜(Corning Costar Co.，阿克頓，馬薩諸塞州，美國)的懸掛式細胞培養插入皿(Transwell Permeable Support)中。將懸掛式細胞培養插入皿插入到填充了 600 μ L含有連續稀釋的化學合成 XCLl/ATAC(Dictagene，洛桑，瑞士)或者 500ng/mLCCL21 (趨化因子(C-C基元)配體 21 ；R&D Systems,明尼阿波利斯，明尼蘇達，美國)的培養基的24孔板(Corning Costar Co.，同上) 中，后者用作陽性對照；所有試驗重復兩次。將細胞在細胞培養箱中37°C下培養120-150分 鐘。緩慢清洗膜的下部并通過流式細胞儀分析下部室中的細胞⑶8 (53-6. 72-FITC ；ATCC, 同上)、CDllb(5C6-PE ；ATCC,同上)和CDllc (N418_Cy5 ；ATCC,同上)的表達。在限定時間 (5分鐘)內分析每孔的細胞懸液并測定活細胞的絕對數(DAPI-陰性)。通過將下部室中 的細胞數除以輸入的細胞數計算遷移細胞的百分比[遷移細胞數/輸入細胞數xlOO]。圖 3中示出了代表性的實驗。響應于XCL1，CD8+DC顯示了趨化性遷移的特征性鐘形曲線，在 Ing/mL沒有遷移，在100ng/ml最大遷移，并在1000ng/mL處有下降反應。CD8_DC不對XCLl 產生響應，但在CCL21存在時遷移。通過膠原酶消化組織而分離來自外周淋巴結的DC，接著如上所述使用⑶Ilc-微 珠進行陽性磁分選。如上所述在Costar Transwell Chamber中使用濃度為100ng/mL的 XCLl和濃度為500ng/mL的CCL21進行趨化性測定。細胞用流式細胞儀分析，并如上所述計 算遷移細胞的百分比。再次地，僅⑶8+DC響應于XCLl發生遷移，而⑶8_DC僅對CCL21產生 響應(圖4)。為了研究其他脾細胞群的趨化反應，根據生產商的說明書(同樣見實施例1)，使 用抗-⑶90結合的小珠通過陽性磁性選擇從C57BL/6脾細胞中分離T細胞，使用抗_49b結 合的小珠分離NK細胞，以及使用生物素化的抗-CD19抗體(克隆1D3)和抗-生物素結合 的小珠分離B細胞。如上所述使用XCL 1/ATAC連續洗脫進行趨化實驗。用200ng/mL的 CXCL12(趨化因子(C-X-C基元)配體12)作為B細胞的陽性對照，用lOOng/mL的CCL21 (趨 化因子(C-C基元)配體21)作為T細胞的陽性對照，并且用200ng/mL的CXCL9((趨化因 子(C-X-C基元)配體9)作為NK細胞的陽性對照(均來自R&D Systems，明尼阿波利斯， 明尼蘇達，美國)。B細胞、T細胞或者NK細胞均不能對XCL1/ATAC產生趨化反應，而各自 的陽性對照在這些細胞群中誘導了明顯的細胞遷移(圖5)。這些實驗證明XCLl在⑶8+DC 中誘導了趨化性，但沒在CD8-DC、T細胞、B細胞或者NK細胞中誘導出趨化性。因此，這些實驗證明XCLl作為XCRl-耐受APC的特異性佐劑起作用。實施例4 =XCLl-促進細胞/抗原攝入到⑶8+樹突狀細胞中使用靶定載體通過同源重組在胚胎干細胞中斷裂鼠科ATAC基因產生 XCLl (“ATAC-K0”)缺陷型小鼠，在所述載體中將ATAC基因的外顯子2和3替換成反向的新 霉素基因(圖6)。如同由Southern印跡雜交鑒別的那樣，用正確靶定的胚胎干細胞產生嵌 合小鼠。在突變等位基因的生殖細胞系遺傳和它們中的雜合ATAC缺陷小鼠喂養之后，純合 的ATAC-缺陷型小鼠在F2代以預期的孟德爾頻率出生并與C57BL/6背景回交10代。通過電 穿孔使用 BCMGSneo 載體(Karasuyama 等人，1989，J Exp Med 169，13-25)轉染鼠科前-B 細 胞系300-19 (Alt等人，1981，Cell27，381-90)，通過標準方法將完整的鼠科XCLl (GenBank 登錄號匪008510)編碼區克隆到所述載體中。在含有G418的選擇培養基進行亞克隆之 后，得到穩定分泌鼠科XCL1/ATAC的細胞系(稱為muATAC/300-19)，如同通過細胞內流式 細胞儀確定的那樣(Dorner 等人，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,6181-86) 通過標 準方法將脾細胞對CD3、CD4、CD8、⑶lib、⑶11c、⑶19、MHC II和NKl. 1染色，并通過使用 FlowJo (Tree Star Inc.，阿什蘭，俄勒岡州，美國)分析 LSR 11 (BD Biosciences)流式細 胞儀(結果在圖7中示出)將CSFE信號與細胞表面標記物關聯以便進行數據評估。結果 證明已經有300-19野生型細胞由脾中的CD8+DC攝入(圖8A)。但是，XCLl-轉染的300-19 細胞(“muATAC/300-19”)被攝入達到明顯更高的程度(增加天約50% )(圖8A)。這些結 果證明XCLl通過⑶Ilc+⑶8+DC促進了抗原攝入。沒有觀察到由脾⑶Ilc+⑶8_DC的引起的 細胞攝入。實施例5 在體內耐受或免疫性誘導過程中通過⑶4+T細胞的ATAC的表達將含有5-7x106KJ1_26+轉基因 D011. 10CD4+T 細胞(Murphy 等人，1990，Science 250，1720-3)的脾細胞過繼性地轉移到同源BALB/c小鼠中。這些轉基因D011. 10⑶4+T細 胞特異于雞卵清蛋白(OVA)肽323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)。將受體小鼠使用100 μ g OVA 或者100 μ g OVA+佐劑LPS (10 μ g)在足跖中進行免疫。作為替代，將受體鼠使用2mg OVA 靜脈注射進行免疫。在14小時、24小時或者48小時之后通過流式細胞儀細胞分選(純度 >97%)從受體，或者從排出的腿彎部的淋巴結(在足跖OVA注射的情況下)，或者從外周 淋巴結(在靜脈OVA注射的情況下)中回收OVA-特異性KJ1-26+CD4+T細胞。從回收的轉 基因T細胞中提取總RNA并使用常規TaqMan低密度陣列(TLDA) (Applied Biosystems)進 行基因表達分析。在表2中列出了獲得的數據。與0小時時間點對照相比，在14,24和48小時Ct-值(當使用定量PCR時得到的 參數)在所有實驗設置(setup)下增加大約5個值。該增加代表了在所有試驗條件下體內 轉基因T細胞活化時XCLl mRNA表達大約增加30倍。這些數據表明，在免疫條件和耐受條 件下XCLl由免疫系統表達并利用。因此這些數據表明XCLl可被用于物質輸送以實現免疫 /記憶(在“危險信號”存在的情況下)或者實現耐受(在“危險信號”不存在的情況下)。表2
34 實施例6 通過⑶8+T細胞與⑶8+DC體內相互作用的XCLl-介導的提高的抗原識 別將ATAC-KO小鼠(見實施例4)與C57BL/6背景回交10x，然后與OT-I轉基因小 鼠("0T-I ATAC-KO“)回交。OT-I轉基因小鼠表達對來自雞卵清蛋白(OVA) (Hogquist等 人，1994，Cell 76，17-27)的SIINFEKL肽(SEQ ID NO 15，卵清蛋白的8個氨基酸的抗原決 定基)特異的轉基因T-細胞受體。將含有2x1060T-I T細胞的總腎細胞通過靜脈(i. v.) 注射過繼性地轉移到同源C57BL/6受體鼠中。并行的，將含有2x1060T-IATAC-K0 T細胞 的總腎細胞過繼性地轉移到同源C57BL/6受體鼠中。在所有情況下，使用雌性供體和受體 鼠。細胞轉移24小時后，將受體鼠使用與抗-DEC205抗體(“DEC-205-0VA”)結合的IOOng OVA激發以實現抗原對CD8+DC的優先輸送，如上所述(Bonifaz等人，2002，J. Exp. Med. 196， 1627-38)。通過使用2mg SMCC-活化的OVA根據生產商的試驗方案(PierceChemical Co.) 培養 Img 抗-DEC-205mAb NLDC-145 (得自 Georg Kraal, Amsterdam)產生 DEC-205-0VA。進 行試劑的G蛋白沉淀以除去未結合的OVA，并且每毫克抗體結合的OVA的量通過分析考馬 斯_染色的非還原SDS-凝膠仔細測定。將DEC-205-0VA以200 μ 1的體積應用到靜脈注射 中；對照鼠接受PBS。將一些小鼠在沒有“危險信號”存在的情況下單獨注射具有耐受效果 的 DEC-205-0VA (Bonifaz 等人，2002，J. Exp. Med. 196，1627-38)。將其他小鼠注射與 6yg 抗-CD40 抗體 FGK (得自 TonRolink，Basel)組合的 DEC-205-0VA，其中抗-CD40mAb 將“危險 信號”提供到 DC ((Bonifaz 等人，2002，J. Exp. Med. 196，1627-38)。DEC-205-0VA 注射三天 后，處死小鼠并通過標準方法對脾細胞的⑶3、⑶8、⑶90. 1以及MHC II的表達進行染色，并 使用FlowJo軟件在LSRII流式細胞儀上進行分析，以便確定OT-I CD8+T細胞的存在。另外， 在5μ g/mL布雷菲德菌素A存在下，將處死的小鼠的脾細胞使用50ng/mL肽SIINFEKL體外 培養5小時。該階段之后，根據標準方法通過流式細胞儀分析OT-I T細胞和OT-I ATAC-KO T細胞的IFN- γ分泌。結果證明在XCLl存在的情況下，在耐受(沒有抗-⑶40mAb)條件
35或者免疫(加入了抗-⑶40mAb)條件下⑶8+0T-I T細胞與⑶8+DC的相互作用導致T細胞 活化和膨脹的減少(圖9)。同時，在耐受條件或者免疫條件下XCLl的不存在導致了 CD8+T 細胞分化成IFN- γ分泌效應T細胞的減少(圖10)。兩種結果證明了 XCLl對與⑶8+T細 胞相互作用的⑶8+DC的活化和佐劑效應。實施例7 針對人類XCRl的單克隆抗體(hXCRl)的生成使用代表hXCRl 前 31 個 N-端氨基酸(MESSGNPESTTFFYYDLQSQ PCENQAffVFA T ； SEQ ID NO 18)的肽使雌性 BALB/c 小鼠免疫。使用戊二醛(31-N-hXCRl-KLH ；由 P. Henklein, Charite, Berlin合成)將肽的N-端氨基酸與鑰孔蟲戚血藍蛋白耦合。在完全弗式佐劑 中使用Sl-N-hXCRl-KLHOOyg腹腔內施加，30yg皮下施加)進行初始免疫。在3-4周 間隔之后使用腹腔內施加的完全弗式佐劑中的50μ g31-N-hXCRl-KLH對小鼠加強免疫 兩次。第二次加強之后六周，使用生理鹽水中的與小牛血青蛋白結合的31-N-hXCRl肽 (31-N-hXCRl-BSA)對小鼠進行靜脈注射(50 μ g)。三天后處死小鼠并根據用于單克隆抗 體生產的標準試驗方案與黑素瘤細胞系P3X63Ag8. 653融合。在標準ELISA測定中使用吸 附到96孔板上的未結合31-N-hXCRl肽進行雜交瘤上清液的篩選。一種雜交瘤(6F8)在 ELISA測定中給出了強烈且一致的信號；因此對該雜交瘤進行亞克隆并將6F6抗體用于進 一步描述hXCRl的特征。為此，通過將hXCRl/hATACR(GenBank Acc. No. :L36149)的整個編 碼區以在3，末端或者5，末端標記有c-myc抗原決定基EQKLISEEDL(SEQ ID NO 19)的方 式克隆到載體BCMGSne。(同上)中產生一些hXCRl轉染子。隨后，通過使用任一版本的載體 電穿孔轉染鼠科黑素瘤細胞系P3X63Ag8. 653，并且兩種轉染的細胞系“5' c-myc/hATACR/ P3X”和“3' c-myc/hATACR/P3X”在含有G418的選擇培養基中亞克隆之后建立。在該研究 中還包括使用來自Dr. Bernhard Moser，伯爾尼，瑞士 ( “hATACR/300-19”)的hXCRl轉染 的細胞系。將mAb 6F8的上清用于從各種細胞系中免疫沉淀hXCRl蛋白(圖11)。至此， 來自轉染子 “5 ‘ c-myc/hATACR/P3X”，“3 ‘ c_myc/hATACR/P3X” 和 “hATACR/300-19” 以及 各自的野生型細胞系的裂解物根據標準方法每種產生5-lOxlO6個細胞(裂解緩沖液50mM Tris/HCl(pH 8), 150mM NaCl, ImM EDTA, +1% (ν/ν) Nonident Ρ-40, ImM PMSF，10yM 亮抑 酶肽Α，1μΜ胃酶抑素，10yg/ml抑肽酶)。在預清除之后，將這些裂解物接種到mAb 6F8 上清液(5-10mL)中，并根據標準方法使用G蛋白珠進行免疫沉淀。將免疫沉淀物在SDS緩 沖液中變性，在還原型12% SDS-凝膠上分離，并根據標準方法電印跡(electroblotted)到 Immobilon P膜(Millipore)上。使用在封閉液中以1 2500稀釋的多克隆兔-抗hXCRl 血清(針對代表 hXCRl 的 N-末端的肽產生，MESSGNPEST TFFYYDLQSQ PCENQAffVFA T, SEQ ID NO :18，使用標準方案)對印跡進行染色，并使用生物素耦合的羊-抗兔-IgG(在封閉緩 沖液中以1 5000稀釋)、抗生物素蛋白-堿性磷酸酶和Western Light/⑶P-Star檢測系 統(Tropix)展開。光信號的檢測使用X0MatAR-film(KOdak)進行。兔抗-hXCRl血清已經 通過在11周的時候在完全弗式佐劑中使用250 μ g的31-N-hXCRl肽使兔三次免疫而產生。實施例8 重組的鼠科XCLl以其生物學活性形式生成在體內通過蛋白水解除去信號肽產生天然鼠科XCL1，得到N-末端具有纈氨酸的 蛋白質(Dorner等人，1997，J. Biol. Chem. 272，8817-23)。為了產生N-末端以纈氨酸開頭 的相應重組的鼠科XCLl，使用標準的DNA重組技術和表達載體pET SUMO (Invitrogen，格羅 寧根，荷蘭)將全長鼠科ATAC的氨基酸22-114與組氨酸標記的SUMO-蛋白的C-末端融合。將融合蛋白在大腸桿菌中使用標準試驗方案進行表達并根據生產商的試驗方案通過固 定化金屬親和層析(Ni-NTA Superflow，Qiagen，希爾登，德國)純化。通過使用SUMO蛋白 酶(Irwitrogen) 37°C下培養3小時實現融合蛋白的位點特異性裂解。進行第二次固定化金 屬親和層析步驟以除去組氨酸標記的SUMO融合部分。使用該試驗方案，制備了高產量高純 度生物活性形式的重組的鼠科XCLl蛋白(圖12)。實施例9 與ATAC-KO OT-I相比由WT OT-I增強的細胞毒性使用針對⑶4、⑶lib、⑶llc、NKl. 1和B220的抗體通過磁消除其他腎細胞將對OVA 肽特異的轉基因⑶8+T細胞從OT-I或者ATAC-KO OT-I小鼠的脾細胞中純化。將OT-I或 者OT-I ATAC-KO T細胞(3xl05)分別過繼性地轉移到同源C57BL/6或者ATAC-KO小鼠中。 24小時之后將兩組小鼠使用0VA( “0VA/300-19”)轉染的3χ106300_19細胞進行免疫。通 過將野生型300-19細胞電轉化到BCMGSne。載體(Karasuyama等人，1989，J Exp Med 169， 13-25)中產生0VA/300-19細胞，在該載體中通過標準方法將OVA的縮短的編碼區(對應于 氨基酸138-386 ；GenBank登錄號匪205152)克隆到其內。在使用0VA/300-19細胞免疫 后第六天，如前面描述的那樣進行體內細胞毒性測定(Romano等人，2004，J. Immunol. 172， 6913-6921)。簡言之，分離C57BL/6小鼠的脾細胞并在培養基中單獨或者在10 μ M特異性 OVA肽SIINFEKL存在下37°C下培養1小時。洗滌后，使用ΙΟμΜ 5，6_羧基熒光素二乙酸 琥珀酰亞胺酯(CSFE，分子探針，俄勒R州，美國)標記肽脈沖激發(ρ印tide-pulsed)的細 胞，同時使用1 μ M CSFE標記未脈沖激發的細胞。將等量的CSFE-低和CSFE-高/SIINFEKL 脾細胞(每次IOxlO6細胞)注射到0VA/300-19免疫的小鼠中，并在18小時后通過流式細 胞儀測定幸存CSFE-低和CSFE-高/SIINFEKL脾細胞的相對豐度。如上所述計算OVA-特 異性細胞毒性(Hernandez 等人，2007，J. Immunol. 178,2844-2852)。在 0Τ-Ι T 細胞存在下 0VA/300-19細胞的注射誘導了 32士4% OVA-特異性細胞毒性，但在ATAC-KO OT-I T細胞 存在下僅誘導了 14士 10%細胞毒性(圖13)。具有野生型300-19細胞的小鼠的對照免疫 沒有通過轉移的OT-I T細胞誘導細胞毒性。該實驗證明ATAC在CD8+T細胞毒性的誘導中 作為佐劑起作用。實施例10 體內XCRl的表達被限制為DC的亞細胞群分析了其中ATAC已經被替換成IacZ-報告基因(“敲入(knock-in)”)的來自 B6. 129P2-XcrltmlDgen/J 小鼠(The Jackson Laboratory，緬因州，美國)的器官組織原位 β -半乳糖苷酶的活性。為此，將器官小片浸入到4°C的0. 戊二醛和4%仲甲醛的PBS 中4h，在10%蔗糖/PBS中4°C下過夜培養，并迅速冷凍。組織的冰凍切片在室溫下(RT)下 在0. 戊二醛和4%多聚甲醛的PBS中重新固定10分鐘，使用3x冷卻PBS(pH 7.4)洗滌 5 分鐘，使用 X-Gal 染色液(Sanes 等，1986，EMBO J. 5，3133-3142) 37°C下培養過夜，在 PBS 中洗滌3x，并通過中性紅復染色。可以在脾、胸腺、淋巴結、肺、肝、睪丸、卵巢、胎盤、派伊爾小結(Payer’ s patches)、小腸和大腸中觀察到lacZ(以及由此XCRl基因)的表達。在脾中，得到的信號 與CD8+DC的分布模式相對應。在其他器官中(常常很低)信號的豐度、形態以及組織分布 完全與被限制為DC亞細胞群的XCRl的表達構思一致。實施例11 通過流式細胞儀對XCRl在鼠科脾細胞中的表達進行分析將來自B6. 129P2-XcrltmlDgen/J小鼠的脾細胞分離并通過標準方法對CD3、CD4、⑶8、⑶19、⑶llc、MHC II和NK. 1. 1進行染色。根據生產商的方案使用熒光素二 _β -D-吡 喃半乳糖苷(FDG，Invitrogen)測定的IacZ報告基因的表達在 % -10%的CD4XD8_DC和 在75% -90%的⑶8+DC中檢測到，但沒有在⑶4+DC中檢測到(圖14)。所有其他脾細胞群 都是陰性的。這些結果證明在免疫系統中XCRl僅在DC亞細胞群中表達，其在脾細胞中最 多地攜帶了⑶8細胞表面標記物。
權利要求
一種適于將物質輸送到XCR1陽性專職抗原提呈細胞中的輸送系統，所述輸送系統包括i)與趨化因子(C基元)受體1(XCR1)結合的分子，以及ii)待輸送的物質，其中物質與分子結合。
2.根據權利要求1所述的輸送系統，其中物質ii)是免疫原、佐劑、藥物或者毒性劑。
3.根據權利要求2所述的輸送系統，其中免疫原是病原體、病原體源性抗原、過敏原、 腫瘤抗原或者耐受原。
4.根據權利要求2所述的輸送系統，其中毒性劑是細胞毒素、凋亡誘導劑、核糖體失活 劑、DNA-或者RNA-裂解劑或者蛋白合成抑制劑。
5.根據權利要求1-4任一項所述的輸送系統，其中分子i)是趨化因子(C基元)配體 KXCL 1)或者其功能活性變體。
6.根據權利要求5所述的輸送系統，其中XCLl的功能活性變體優選功能活性片段包括 或者由SEQ ID NO 7-10的任一序列組成，優選SEQ IDNO 8到10，更優選SEQ ID NO 9或 10，尤其是 SEQ ID NO :10ο
7.根據權利要求1-6任一項所述的輸送系統，其中分子i)是抗-XCRl抗體或其片段。
8.根據權利要求1-6任一項所述的輸送系統，其中分子i)是(多)肽。
9.根據權利要求1-6任一項所述的輸送系統，其中分子i)是分子量小于大約2，OOOg/ mol的小有機分子。
10.根據權利要求1-9任一項所述的輸送系統，進一步包括iii)佐劑，優選“危險信號”。
11.根據權利要求1-8和10任一項所述的輸送系統，其中分子i)、物質ii)和任選地 佐劑iii)是一種或多種(多)肽。
12.根據權利要求1-11任一項所述的輸送系統，其中分子i)、物質ii)和任選地佐劑 iii)彼此共價和/或非共價結合。
13.根據權利要求1-12任一項所述的輸送系統，其中細胞是樹突狀細胞。
14.根據權利要求8和10到13任一項所述的輸送系統，其中輸送系統能夠通過受試者 中的XCRl陽性專職抗原提呈細胞，特別是通過主要組織相容性復合物(MHC)I類分子介導 作為抗原的物質或其片段的遞呈。
15.一種或多種編碼權利要求11-14的輸送系統的(多)肽的核酸。
16.一種包含權利要求15中的一種或多種核酸的載體。
17.—種藥劑，包括權利要求1-14任一項所述的輸送系統或者權利要求15中的一種或 多種核酸。
18.根據權利要求17所述的藥劑，其特征在于，藥劑是疫苗和/或佐劑。
19.根據權利要求17所述的藥劑用于誘導針對肽的記憶免疫應答，優選其中記憶免疫 應答是Thl應答，尤其是Thl細胞毒性應答。
20.根據權利要求19所述的藥劑用于預防或治療腫瘤和/或感染。
21.根據權利要求17所述的藥劑用于誘導針對(多)肽的耐受。
22.根據權利要求21所述的藥劑用于抑制移植排斥，過敏和/或自身免疫性疾病。
23.一種佐劑，包括XCLl或者其功能活性片段。
24.根據權利要求23所述的佐劑通過調節XCRl陽性抗原提呈細胞的功能用于增強受 試者中的免疫應答。
全文摘要
本發明涉及一種適于將物質輸送到XCR1陽性專職抗原提呈細胞中的輸送系統，用于編碼所述系統的一個或多個核酸，含有所述一個或多個核酸的載體，含有所述輸送系統或者一個或多個核酸的藥劑，以及含有XCL1或其活性功能片段的佐劑。
文檔編號A61K47/48GK101896191SQ200880117058
公開日2010年11月24日 申請日期2008年11月19日 優先權日2007年11月20日
發明者理查德·克羅切克 申請人:德意志聯邦共和國羅伯特-科赫研究所