痘病毒溶瘤載體的制作方法

專利名稱：痘病毒溶瘤載體的制作方法
技術領域：
溶瘤病毒是一類用于治療癌癥，具有腫瘤依賴性自我永續獨特性質的新型治療 因子(HERMISTON. A demand for next-generation oncolyticadenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006，8 卷，4 號，322-30 頁.)。溶瘤病毒能夠 在惡性細胞中選擇性復制，并因此提供可能遠遠超過癌癥常規治療的效力和特異性的水 平(FISHER. Striking out atdisseminated metastases the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006,8 卷，4 號， 301-13頁.)。使用這些病毒的好處是，當他們復制時，他們溶解其宿主細胞。癌細胞是多種 病毒的理想寄主，因為它們的抗病毒的干擾素途徑滅活或者具有突變的腫瘤抑制基因，這 能使病毒復制不受阻礙地繼續下去(CHERNAJ0VSKY，等Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical journal. 2006，332 卷，7534 號，170-2 頁·)。一些病毒天然地可以在腫瘤細胞中選擇性地復制，但也可以通過修飾天然存 在的病毒而獲得溶瘤病毒。為了這一目的，目前使用的修飾病毒的主要策略包括主要 病毒基因中的功能性缺失；控制這些病毒基因的表達的腫瘤或組織特異性啟動子；向 性修飾將腺病毒重定向至癌細胞表面。在不久的將來，溶瘤腺病毒需要被優化，以充分 發揮其作為重要的抗癌工具的潛力，并且從而改善惡性神經膠質瘤病人的預后(JIANG， 等 Oncolyticadenoviruses as antiglioma agents.Expert review of anticancer therapy. 2006,6 卷，5 號，697-708 頁·)。例如，腺病毒0NYX-015，被選擇性的修飾從而在具有p53突變的細胞中復制并殺 死細胞，其正由Onyx Pharmaceuticals開發，用于各種實體瘤，包括頭部和頸部、胃腸和胰 腺腫瘤的潛在治療。它是一個重組腺病毒，它在ElB座位載有功能缺失性突變，其產物是結 合于P53腫瘤抑制蛋白并使其滅活的55kDa的蛋白質。因此，認為0NYX-015腺病毒應使 正常細胞不受影響。P53腫瘤抑制基因突變是癌癥遺傳異常中最常見的類型，存在于一半 以上的所有主要癌癥類型中。因此，這些細胞對能很容易的復制并導致細胞死亡的病毒敏 感。0NYX-015正處于用于治療復發性頭部和頸部癌癥的III期臨床試驗，結直腸、卵巢、胰 腺和口腔腫瘤的II期臨床試驗，以及消化疾病、食道和肝臟腫瘤的I期臨床試驗(C0HEN，等 ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, 2 卷，12 號，1770-5 頁.)。天然的溶瘤病毒是具有復制能力的病毒，其具有選擇性感染并殺死腫瘤細胞的先 天能力。盡管50年前被用于使用活病毒治療癌癥的最初嘗試，但對天然溶瘤病毒作為癌 癥療法的關注已經滯后于支持改造的腺病毒和皰疹病毒作為癌癥療法。然而，最近已經對 這些天然存在的物質的高效能和選擇性重新關注了(ROBERTS，等Naturally oncolytic viruses. Currentopinion in molecular therapeutics. 2006，8 卷，4 號，314—21 頁·)。在天然溶瘤病毒中，痘苗病毒(痘病毒科)具有很多用于溶瘤病毒療法的理想病 毒主鏈所必需的關鍵屬性。這些包括生命周期短、和快速的細胞間播散、裂解能力強、巨 大的克隆能力和明確的分子生物學。此外，盡管它們能夠在人類細胞中復制，但并不考慮為天然的健康問題，且它們特別好地得到表征，在消滅天花的戰爭中已經被遞送給數百萬人。使用疫苗株或基因修飾的牛痘株的早期臨床結果已經證明了抗癌效果(THORNE，等 Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion inmolecular therapeutics. 2005，7 卷，4 號，359—65 頁·)。相比之下，痘病毒粘液瘤病毒是一種新型的溶瘤候選者，其沒有直接用于人類的 歷史，因為它對兔類(兔子)有特殊的和絕對的宿主種類向性。最近已證明粘液瘤病毒也 能夠選擇性的感染并殺死人類腫瘤細胞，該特有的向性聯系在大多數人類癌癥中所見的失 調的細胞內信號途徑。這篇綜述概述了關于粘液瘤病毒對人類癌細胞向性的現有知識，以 及展示其在癌癥的動物模型中感染和清除腫瘤能力的臨床前期數據(STANFORD，等Myxoma virus and oncolytic virotherapy :a new biologic weapon in thewar against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007,7 卷，9 號，1415-25 頁·)。技術問題注射達到抗腫瘤效果所需的高劑量的痘病毒引發了毒性的問題。不利的事件大 多不嚴重，通常與痘苗病毒有關的不良反應是自限性的，包括發燒、頭痛、疲勞、肌痛、寒戰、 局部皮膚反應、非特異性疹、多形性紅斑、淋巴結病、和種痘位置疼痛。其他反應可能需要 另外的治療方法(例如，首要的治療VIG，第二線治療西多福韋)。不良反應可能需要進一 步的評估或治療，包括非故意接種、全身性牛痘(GV)、牛痘性濕疹(EV)、進行性牛痘(PV)、 種痘后的中樞神經系統疾病、和胎兒牛痘(C0N0，等Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports-Morbidity and mortality weeklyreport. Recommendations and reports/Centers for Disease Control. 2003，52 卷，RR-4 號，1-28 頁.)。因此，需要更安全的、具有與對于其天然相應物一樣好的溶瘤活性的痘病毒。
背景技術：
1994 年 11 月 15 日的美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TR0Y，紐約))描述了 改造的重組痘病毒，更特別是有滅活的非必要的病毒編碼遺傳功能的痘苗病毒，使重組痘 病毒具有減弱的毒力和增強的安全性。特別地，通過缺失編碼毒力因子的開放閱讀框，或 通過編碼毒力因子的開放閱讀框的插入失活，滅活遺傳功能。更特別的是，這項專利描述 了痘苗病毒，其中J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和I4L的開放閱讀框已被滅活。 這種病毒(NYVAC)可以被改造為用于外源核酸的載體，并用作疫苗誘導宿主動物中的免 疫應答。但是，NYVAC不能在大多數哺乳動物細胞中有效地復制，且不能被用作溶瘤病毒 (XIANGZHI,等Vaccinia virus KlL protein supports viral replication in human and rabbitcells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that aredistinct from its binding site for ACAP2. Journal of Virology. 2006,353 卷，1 號，220-233 頁.)。2004年2月19日的WO 2004/014314(KIRN DAVID(美國))描述了在其病毒基因 組中包含了一個或更多突變的改變的痘苗病毒。所描述的突變是以下多肽種類中的一種或 多種1)干擾素調節多肽；2)補體控制多肽；3) TNF或趨化因子調節多肽；4)絲氨酸蛋白酶 抑制劑；5) IL-Ip調節多肽；6)非感染性EEV形式的多肽；和7)用作抑制傳染性病毒從細胞中釋放的病毒多肽(抗傳染病毒形式的多肽)。此外，還公開了痘苗病毒A41L或CllR中 的突變。在這一申請中更特別描述了牛痘基因組區域，如A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、 B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、CUR、E3L、K2L、NIL、vC12L,和 vCKBP。本發明的方法涉 及使用任何本文中討論的痘病毒。本發明的發明人還公開了通過給予癌細胞或患者有效量 的這一改變的痘苗病毒來治療癌癥的方法。發明公開本發明的發明人吃驚地發現，包含缺損F2L基因的痘病毒具有改善的安全性，但是保持了相同的溶瘤活性(與其天然相應物相比)。本發明涉及一種包括缺損F2L基因的痘病毒。在整個申請中所使用的術語“一個”和“一種”是用意為表示所引用的成分或步驟 中的“至少一個”、“至少第一個”、“一個或多個”或“多種”，除非上下文清楚規定了其它的意 思。例如，術語“一個細胞”包括多個細胞，包含其混合物。本文所用的術語“和/或”包括，“和”、“或”和“全部或任何其它由該詞連接的成 分的組合”的含義。本文所用的術語“大約”或“約”表示在給定值或范圍的20%以內，優選在10%以 內，且更優選在5%以內。本文所用的術語“包含”和“包括”意在表示產物、組成物和方法包括所提及的成 分或步驟，但不排除其它的。當“基本上由...組成”被用于定義產物、組成物和方法時，表 示不包括其他任何具顯著性的成分和步驟。因此，基本上由所述的成分組成的組合物將不 排除微量污染物和可藥用的載體。“由...組成”意味著排除其它不止是微量成分的成分或步驟。本文所用的術語“包括缺損基因的痘病毒”指的是痘病毒，其在所述缺損基因的 一個或多個核酸中包含缺失、取代或添加，或這些可能的任何組合，其中所述修飾導致該 病毒無法產生這樣的蛋白質，即具有未修改的基因所產生的蛋白質的活性的蛋白質。在 本發明的優選的實施方案中，包含基因缺損的痘病毒，是指其中整個基因序列已被刪除 的痘病毒。可以通過本領域的技術人員所知道的許多方法，利用重組技術進行突變。本 領域內有修飾痘病毒基因組的方法。例如，MCCART，等Systemic cancertherapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidinekinase and vaccinia growth factor genes. . Cancer res. . 2001,61 號，8751-57 頁.,KIM,等.Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy forcancer with JX—594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. MolecularTherapeutic. 2006,14 號，361-70 頁.，2004 年 2 月 9 日 的 WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US))禾口 1994 年 11 月 15 日的 US 5364773 (VIR0GENETICS CORPORATION (TROY, NY))所公開的方法，可以被用來生產本發明的痘病毒。在本申請的實 施例中公開的方法與生產根據本發明的痘病毒特別相關。本領域內可得到各種痘病毒的基 因組序列，例如，痘苗病毒(vaccinia virus)、痘苗病毒(cowpox virus)、金絲雀痘病毒、 鼠痘病毒、粘液瘤病毒基因組可在Genbank中得到(登錄號分別是NC_006998、NC_003663、 NC_005309、NC_004105、NC_001132)。 本發明中所使用的術語“痘病毒”是指屬于痘病毒科(Poxviridaefami Iy)的病毒。根據優選的實施方案，根據本發明的痘病毒屬于脊椎動物痘病毒亞科 (Chordopoxvirinae subfamily)，更優選地屬于正痕病毒屬(Orthopoxvirus genus)，更力口 優選地屬于痘苗病毒種(Vaccinia virusspecie)。例如，可以利用痘苗病毒株Dairen I、IHD-J、L-IPV、LC16M8、LC16M0、Lister、 LIVP、Tashkent，、WR 65-16,ffyeth, Ankara,Copenhagen,Tian Tan 禾Π WR。根據特別優選的 實施方案，根據本發明的痘病毒是痘苗病毒株Copenhagen。痘病毒牛痘包含大的雙鏈DNA基因組(187千堿基對)，并且是僅知的在受感染細 胞的細胞質中進行復制的DNA病毒家族成員。由于被感染的細胞必須向細胞質的復制位點 遞送大量的DNA前體，該病毒編碼并表達DNA代謝與合成所需的許多酶的活性，包括脫氧尿 嘧啶核苷5’ -三磷酸核苷酸水解酶(脫氧尿苷三磷酸酶，dUTPase)。 脫氧尿嘧啶核苷5，-三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase，EC 3. 6. 1. 23)在Mg離子 (2+)存在下催化dUTP水解為dUMP和焦磷酸鹽。在將dUTP從dNTP池中除去并產生dUMP時， dUTPase參與維持DNA復制的保真度并參與為通過胸苷酸合酶生產TMP提供前體。牛痘脫 氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)是由F2L基因編碼的15kDa的蛋白質(MCGE0GH. . NucleicAcids Research. 1990，18 號，4105-10 頁· ；BR0YLES. · Virology. 1993，195 號，863-5 頁.)。痘苗 病毒F2L基因的序列可以通過登錄號M25392從GenBank中得到，不同痘病毒類基因組中 F2L基因的序列和位點也可以從GenBank中獲得，例如，通過登錄號NC_006998、DQ121394、 NC_001611、AY689436、AY689437、NC_008291、DQ437594、DQ437593、AY313847、AY313848、 NC_006966、NC_005309、NC_003391、NC_003389、NC_001132、NC_003310、NC_002188、M35027、 AY243312、AF170726、DQ011157、DQ011156、DQ011155、DQ011154、DQ011153、X94355、Y16780、 AY318871、U94848、AF198100 和 M34368。本文所使用的基因命名是Copenhagen牛痘株的基因命名，除非另有注明，其也被 用于其他痘病毒科的同源基因。然而，基因命名可能根據痘株而不同。作為信息，Copenhage 和MVA基因的對應關系可以在ΑΝΤ0ΙΝΕ. . Virology. 1998，244號，365-396頁.的表中找到。根據優選的實施方案，本發明的痘病毒還包含缺損的J2R基因。J2R基因編碼一種胸苷激酶(TK)，其形成嘧啶脫氧核苷酸合成補救途徑的一部 分。TK催化的反應涉及將Y -磷酰基部分從ATP轉移至2’脫氧-胸苷(dThd)，以產生胸 苷5’-單磷酸(dTMP)。痘苗病毒的TK是2型TK。2型TK相對于1型具有較小的多肽鏈， 具有約25KDa，但形成同源四聚體。它們對反饋抑制劑dTDP或dTTP敏感，其在代謝途徑的 最終生成。2型TK相對于1型TK具有窄得多的底物特異性，并且只能使2’脫氧尿苷(dU) 禾口 / 或 dThd 磷酸化(EL 0MARI,等· Structure of vacciniavirus thymidine kinase in complex with dTTP insights for drug design. BMC structural biology. 2006,6號，22 頁)。本領域內已知J2R區域缺損的痘病毒和獲得它們的方法。例如MCCART，等 Systemic cancer therapy with a tumor-selective vacciniavirus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes, cancer research· 2001，61卷，24 號，8751-7 頁·、PUHLMANN，等 Vacciniaas a vector for tumor-directed gene therapy biodistribution of a thymidinekinase-deleted mutant. Cancer gene therapy. 2000， 7 卷，1 號，66_73 頁·、GNANT，等 Systemic administration of a recombinant vacciniavirusexpressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongationof survival in mice. Cancer Research. 1999，59 卷，14 號，3396-403 頁.的教導可用于產生 J2R區域缺失的痘病毒。
根據優選的實施方案，根據本發明的痘病毒還包含目的核酸。在優選的實施方案中，目的核酸包含至少一種目的序列，其編碼作為治療性分子 的基因產物(即治療的基因)。“治療性分子”是這樣的分子，其在適當地施用于患者，尤其 是患疾病或病癥的患者，或者應受保護以避免該疾病或病癥者，具有藥理學的或保護性的 活性。該藥理學或保護性活性預期與對所述疾病或所述病癥的病程或癥狀產生有利的影響 相關。當技術人員按本發明選擇編碼治療性分子的基因時，他通常將他的選擇與先前獲得 的結果聯系起來，并可以合理地預期得到這樣的藥理學特性，而無需實施本發明所主張以 外的過多實驗。根據本發明，目的序列與其被轉入其中的靶細胞可以是同源的或者異源的。 有利地，所述目的序列編碼全部或部分的多肽，尤其是給出治療或預防特性的治療性或預 防性多肽。多肽被理解為多核苷酸的任何翻譯產物，不論其大小、糖基化與否，且包括肽和 蛋白質。作為一個首要的實例，治療性多肽包括那些可以在動物或人類有機體中補償缺損 或缺陷蛋白質的多肽，或者那些通過毒性作用從機體中限制或除去有害細胞的多肽。它們 也可以是賦予免疫性的多肽，其作為內源性抗原激起體液或細胞反應，或兩者兼有。由治療性基因編碼的多肽的實例包括，編碼細胞因子(α、β或Y干擾素，白細 胞介素，特別是IL-2、IL-6、IL-IO或IL-12，腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子GM-CSF、 C-CSF, M-CSF....)、免疫刺激多肽(Β7. 1、Β7. 2等)、凝結因子(FVIII、FIX...)、生長因子 (轉化生長因子TGF、成纖維細胞生長因子FGF等)、酶(脲酶、腎素、凝血酶、金屬蛋白酶、 一氧化氮合酶N0S、S0D，過氧化氫酶...)、酶抑制劑(α 1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、病毒 蛋白酶抑制劑、纖溶酶原激活物抑制劑ΡΑΙ-1)、CFTR(囊性纖維化跨膜傳導調節因子)蛋 白質、胰島素、肌營養不良蛋白、I或II類MHC抗原、可以調節/調控細胞基因表達的多肽、 能夠抑制細菌、寄生蟲或病毒感染或其發展的多肽(抗原多肽、抗原表位、通過競爭抑制天 然蛋白質作用的轉顯性(transdominant)變體....)、凋亡誘導劑或抑制劑(Bax、Bcl2、 BclX. · ·)、細胞生長抑制劑(p21、pl6、Rb. · ·)、載脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE. · ·)，血管生 成抑制劑(血管生成抑制素、內皮他丁(endostatin)...)、血管生成多肽(血管內皮細胞生 長因子VEGF家族、FGF家族、CCN家族，包括CTGF、Cyr61和Nov)、氧自由基scaveyer、具有 抗腫瘤作用的多肽、抗體、毒素，免疫毒素和標記(β_半乳糖苷酶、熒光素酶....)的基因 或本領域內認為可以被用于臨床癥狀的治療或預防的任何其它目的基因。適當的抗腫瘤基因包括但不限于，那些編碼腫瘤抑制基因(如Rb、p53、DCC、NF_l、 腎母細胞瘤、匪23、BRUSH-l、pl6、p21、p56、p73以及它們各自的突變體)、自殺基因產物、抗 體、抑制細胞分裂或轉導信號的多肽的基因。根據特別優選的實施方案，本發明的痘病毒還包含自殺基因。自殺基因是指能將藥物前體轉化成細胞毒性化合物的蛋白質的編碼基因。自殺基因包括但不限于，編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸 核糖轉移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性和/或胸苷激酶活性的蛋白質的基因。下表中公開了包含一個核堿基(nucleobase)部分的自殺基因和相應的藥物前體的例子表 1 根據本發明優選的實施方案，自殺基因編碼具有至少一種CDase活性的蛋白 質。CDase參與嘧啶代謝途徑，通過該途徑，外源胞嘧啶利用水解脫氨作用被轉化為尿嘧 啶。雖然已經在原核生物和低等真核生物中證明了 OTase活性(JUND，等.Journal of Bacteriology. 1970,102 號，607-15.頁；BECK，等.Journal of Bacteriology. 1972, 110 號，219-28.頁；H0EPRICH，等.Journal of Infectious Diseases. 1974，130 號， 112-18.頁；ESDERS,等· J. biol. chem. · 1985,260 號，3915-22.頁)，但它們不存在于哺 乳動物中(K0ECHLIN，等.Biochemical pharmacology. 1966，15 號，435-46.頁；P0LAK， 等· Chemotherapy. 1976, 22 號，137-53.頁)。OTase也使胞嘧啶類似物，即5_氟胞嘧啶(5_FC)脫去氨基，從而形成5_氟尿嘧 啶(5-FU)，5-FU是一種化合物，當其被轉化成5-氟UMP (5-FUMP)時，有高細胞毒性。無論 是因為突變而使編碼酶的基因失活還是因為其天然地缺少這種酶(就像哺乳動物細胞一 樣)，缺少 CDase 活性的細胞對 5-FC 有抗性(JUND,等· Journal of Bacteriology. 1970， 102 號，607-15 頁· ；KILLSTRUP,等.Journal of Bacteriology. 1989，171 號，2124-2127 頁.)。相比之下，被轉化了編碼CDase活性的序列的哺乳動物細胞變得對5_FC敏感 ((HUBER,等· Cancer Research. 1993, 53 號，46I9-4626 頁.；MULLEN，等· Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America. 1992,89 號，33-37頁.；W093/01281(US HEALTH))。此外，鄰近的，未經轉化的細胞也變得對5-FC敏感 (HUBER,等· Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 1994，91號，8302-6頁.)。這種被稱為旁觀者效應的現象，是由于表達⑶ase 活性的細胞分泌5-FU，然后其通過穿越質膜的直接擴散使鄰近的細胞中毒。5-FU的這一被 動擴散性質與tk/GCV參照系統相比，表現出優勢，后者中旁觀者效應需要與表達tk的細胞 接角蟲(MESNIL,等· Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 1996，93號，1831-35頁.)。因此可以很容易地理解CDase在基因治療 中，尤其是抗癌基因治療中所提供的所有優勢。分別編碼這兩種生物的CDase的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae， S. cerevisiae)FCYl、白色念珠菌(Candida Albicans) FCAl和大腸桿菌codA基因是已知的 且它們的序列已被公布(分別是SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6)。在這方面，根據本發明更優選的實施方案，編碼具有CDase活性的蛋白質的基因是FCY1、FCAl或CodA或其類似物。這些基因的類似物是指這樣的基因，其具有的核酸序 列與親本基因的核酸序列，至少具有程度大于70%的同一性，最好大于80%，優選地大于 90 %，和最優選地大于95 %。專利WO 2005/007857公開了一種基因，其編碼具有改善的OTase活性的蛋白質。 這種多肽來源于天然CDase加上一氨基酸序列。根據本發明的另一優選的實施方案，該具 有CDase活性的蛋白質是WO 2005/007857公開的多肽，更優選的是序列號SEQ ID NO :2中 描述的FCU1-8多肽及其類似物。在原核生物和低等的真核細胞中，尿嘧啶在尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(UPRTase)的 作用下被轉化成UMP。這種酶將5-FU轉化為5-FUMP。根據本發明的另一優選的實施方案， 自殺基因編碼具有UPRTase活性的蛋白質。正在談論的UPRTase可以是任何來源的，特別是原核的、真菌的或酵母菌來源的。 以舉例的方式，在本發明的情況下可以使用的核酸序列編碼源自大腸桿菌(ANDERSEN，等 Characterization of the upp geneencoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992，204 號，51-56 頁·)， 源自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) (MARTINUSSEN，等 Cloning andcharacterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferasefrom Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994,176 卷，21 號，6457-63 頁.)，源 自牛 分枝桿菌(Mycobacterium bovis) (KIM,等 Completesequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase fromMycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biologyinternational. 1997,41 卷，6 號，1117-24 頁.) 和源自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) (MARTINUSSEN,等 Two genes encoding uracilphosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal 0亡8肌切1^01叫7.1995，177卷，1號，271-4頁·)的UPRTase。不過，最特別優選地使用酵 母 UPRTase 且尤其是其序列在 KERN，等 The FURl gene ofSaccharomyces cerevisiae cloning，structure and expression of wild-typeand mutant alleles. Gene. 1990,88 卷，2號，149-57頁.中公幵的釀酒酵母(S. cerevisiae) FURl基因所編碼的UPRTase，其在 此通過引用作為參考。作為指導，該基因序列和相應的UPRTase序列可以在文獻和專門數據庫(SWISSraOT、EMBL、Genbank、Medline 等)中找到。專利申請EP 0998568A描述了 FURl基因，其在編碼部分5，端缺少105個核苷酸， 使得由其開始的UPRTase的合成，其在天然的蛋白質中開始的35個殘基已在N端的位置缺 失，且開始于在36位置的蛋氨酸。該突變基因的表達產物，命名為FURl Δ 105，其能夠補充 釀酒酵母的furl突變。此外，截短的突變體表現出比天然酶高的UPRTase活性。因此，根 據本發明的特別有利的實施方案，自殺基因編碼天然UPRTase的缺失突變。該缺失優選地 位于原UPRTase N端的區域。其可以是完全的(影響所述N端的區域的所有殘基)或部分 的(影響一級結構中一個或多個連續或非連續殘基)。一般而言，多肽由N端、中心和C端 部分組成，每一部分約占分子的三分之一。例如，由于釀酒酵母UPRTase有251個氨基酸， 其N端部分由前83個殘基組成，開始于位于天然形式第一個位點的所謂的起始蛋氨酸。至 于大腸桿菌UPRTase，其N端部分涵蓋位點1至69。優選的具有UPRTase活性的蛋白質包含，基本上如E P 0998568A的序列號SEQ ID NO 1中所描述的氨基酸序列，開始于位于位點1的Met殘基并結束于位于位點216的 Val殘基。術語“基本上”指的是與所述的EP 0998568A的SEQ ID NO :1序列的同一程度 大于70 %，最好大于80 %，優選大于90 %，和最優選大于95 %。但更優選的是，其包含EP 0998568A的序列號SEQ ID NO 1中所描述的氨基酸序列。如上所述，它可能包括額外的突 變。可以特別提及位于位點2的絲氨酸殘基(在天然UPRTase中的位點37)被丙氨酸殘基 取代。根據本發明另一項優選的實施方案，自殺基因編碼具有至少一種⑶ase和一種 UPRTase活性的蛋白質。專利申請WO 96/16183和EP0998568A描述了一種融合蛋白的用途， 其編碼的酶包含具有CDase和UPRTase活性的兩個結構域，和展示了由表達質粒攜帶的融 合基因codA upp或FCYl FURl或FCYl FURl Δ 105 (即FCU1)的轉移提高了被轉化的 Β16細胞對5-FC的敏感性。根據本發明更優選的實施方案，自殺基因編碼的多肽包含的氨 基酸序列基本上如序列號 SEQ ID NO :3(coda upp)、SEQ ID NO :1 (FCUl)或 FCYl FURl 中所述。術語“基本上”是指與所述序列的同一程度大于70%，最好大于80%，優選大于 90%，和最優選大于95%。但更優選的是，其包含如序列號SEQ ID NO 3 (coda upp) ,SEQ ID NO :l(rcUl)或FCYl FURl中所述的氨基酸序列。如上所述，它可包含額外的突變。根據目前使用的常用技術，可以容易地通過克隆、通過PCR、或通過化學合成獲得 核酸序列。它們可以是天然基因或源自其通過突變、缺失、取代和/或添加一個或多個核苷 酸的基因。此外，它們的序列被廣泛地描述于本領域的技術人員能夠查閱的文獻中。本領域的技術人員能夠從公開的數據克隆CDase或UPRTase序列并能夠進行可能 的突變體，能夠根據現有技術方法或者基于申請EP 0998568A中所示的方案在非細胞或者 細胞體系中檢測突變體形式的酶活性，并能夠，尤其是同相地融合具有CDase和UPRTase活 性的多肽，從而融合全部或部分相應基因。根據更優選的實施方案，本發明的痘病毒還包括核酸序列，其包含編碼透性酶 (permease)的基因。透性酶是指跨膜的蛋白質，其參與包含一個核堿基(nucleobase)部分的藥物，或 其前體通過細胞膜的轉移。透性酶包括但不限于嘌呤透性酶、胞嘧啶透性酶和核苷轉運蛋白。
根據本發明的優選的實施方案，透性酶是釀酒酵母的嘌呤或胞嘧啶透性酶。釀酒 酵母的核堿基轉運蛋白由嘌呤_胞嘧啶透性酶(稱為FCY2)和尿嘧啶透性酶(稱為FUR4) 組成。嘌呤-胞嘧啶透性酶FCY2介導質子和腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和胞嘧啶穿越酵母質 膜的同向轉運(Grensonl969，Jund 和 Lacroute 1970，Polak 和 Grenson 1973,Chevallier 等1975，HopkinS等1988)。FCY2蛋白質也介導5氟胞嘧啶的轉運，5氟胞嘧啶是胞嘧啶的 類似物(Grenson 1969，Jund 和 Lacroute 1970)。FCY2 基因編碼 533 個氨基酸(58kDa)的 蛋白質，最初預計有10-12個跨膜區(Weber等1990)，現在傾向認為有9個(Ferreira等 1999)。FCY2對嘌呤核堿基和胞嘧啶表現出相似的親和力(Brethes等1992)。尿嘧啶是 由尿嘧啶透性酶FUR4介導而攝取到釀酒酵母中(Jund和Lacroute 1970，Jund等1977)。 FUR4是尿嘧啶-質子共轉運蛋白(Hopkins等1988)，預測是633個氨基酸(71. 7kDa)的蛋 白質，具有10個跨膜結構域和長的細胞質親水N-和C-端尾巴(Jimd等1988，Garnier等 1996)。FUR4蛋白質還可以介導5氟尿嘧啶的轉運，5氟尿嘧啶是尿嘧啶的類似物(Jimd和 Lacroute 1970)。
swissprot數據庫中特別提供FCY2和Fur4的氨基酸序列(登錄號分別為P17064 和P05316)。優選地，透性酶具有選自于，如在專利申請WO 2006/048768中所公開的氨基酸 序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在這方面，根據本發明的優選的實施方案，透性酶選自于FCY2和Fur4和其類似 物。Fur4和FCY2的類似物是指多肽，該多肽具有的氨基酸序列與本文上述親本蛋白質的氨 基酸序列的同一程度，至少大于70 %，最好大于80 %，優選大于90 %，優選大于95 %，并且 該多肽保留了轉運含有一個核堿基部分的藥物穿過細胞膜的能力。本領域的技術人員能夠選擇，將與包含一個核堿基部分的藥物或藥物前體關聯的 透性酶。例如，FCY2和Fur4優選地與5氟胞嘧啶(5-FC)關聯。根據更優選的實施方案，本發明的痘病毒還可包含表達目的核酸所必需的元件。根據更優選的實施方案，本發明的痘病毒可還包含表達包括編碼透性酶的基因的 核酸序列所必需的元件。這些表達目的核酸和/或包含編碼透性酶的基因的核酸序列所必需的元件包括， 所述DNA轉錄成mRNA以及(如果需要的話)mRNA翻譯成多肽所必需的元件。文獻中廣泛地 描述了適合在各種脊椎動物體系中使用的轉錄啟動子。舉例來說，適合的啟動子包括病毒 啟動子，諸如RSV、MPSV、SV40、CMV或7. 5k，牛痘啟動子，誘導型啟動子，等。優選的啟動子是 由痘病毒分離，例如痘苗病毒的7. 5K、H5R、TK、p28、pll或K1L。另外，可以使用合成啟動子， 例如那些在 CHAKRABARTI. Biotechniques. 1997,23 號，1094-97 頁.，HAMMOND，等.Journal ofVirological Methods. 1997,66 號，135-38 頁.和 KUMAR. Virology. 1990，179 號，151-8 頁.中所描述的啟動子，以及早期和晚期痘病毒啟動子之間的嵌合啟動子。目的核酸序列和包含編碼透性酶基因的核酸序列還可以包括額外的功能元件，如 內含子序列、定向序列、轉運序列、分泌信號、核定位信號、IRES、多聚A轉錄終止序列、三聯 前導序列、參與復制或整合的序列。所述序列已在文獻中報道并可很容易地由本領域的技 術人員獲得。本發明還涉及制備根據本發明的痘病毒的方法，在其中(i)將根據本發明的痘病毒引入到細胞中；
(ii)將所述細胞培養在適合于能使所述痘病毒產生的條件下和；(iii)從細胞培養物中回收所述痘病毒。當然可以從培養上清液回收痘病毒，同時也可以從細胞中回收它。普遍采用的方 法之一在于通過反復凍融循環的方法裂解細胞，以從裂解上清中收集病毒顆粒。然后可以 使用本領域中的技術(色譜法、超速離心法、特別是通過氯化銫密度梯度，等)擴增和純化 病毒顆粒。本發明還涉及一種組合物，其包含根據本發明的痘病毒，與可藥用的賦形劑組合。根據本發明的組合物更具體地被用于，通過基因治療方法預防或治療疾病，和更 具體地針對增殖性疾病(癌癥、腫瘤、再狹窄，等)，或針對與破骨細胞活性增強相關的疾病 (如類風濕關節炎、骨質疏松癥)。 可按照慣例，以局部、腸胃外或消化途徑給藥為目的，制成根據本發明的組合物。 特別是，治療有效量的本發明的重組載體或痘病毒與可藥用的賦形劑組合。可以設想大量 的給藥途徑。可被提及的實例是胃內的、皮下的、心內的、肌肉內、靜脈內的、腹腔內的、腫瘤 內的、鼻內的、肺內的和氣管內的途徑。對于后三個實施方案，通過氣霧劑或通過滴注法進 行給藥更有利。可以以單劑量進行給藥，或者在特定的時間間隔后，按照一次或多次重復的 劑量進行給藥。適合的給藥途徑和劑量取決于各種因素，例如個體、將被治療的疾病或將被 轉化的目的基因。可以按IO4至IO14Pfu (空斑形成單位)，最好IO5至IO13Pfu,優選地IO6 至IO12Pfu,更優選地IO6至IO7之間劑量的形式配制基于本發明的病毒顆粒的制劑。該組合物還可以包含可藥用的稀釋劑、佐劑或賦形劑，以及增溶、穩定和防腐劑。 在可注射給藥的情況下，優選制劑是水溶液，非水溶液或等滲溶液。它可以以單一劑量或多 劑量、液體或干燥(粉末、凍干物，等)的形式存在，該干燥形式可在使用的時候用適當的稀 釋劑重構。本發明還涉及，將根據本發明的痘病毒或組合物用于制備藥物的用途，該藥物被 用于通過基因療法治療人體或動物體。該藥物可直接體內施用(例如，通過靜脈注射、進入 可進入的腫瘤、通過氣霧劑方法進入肺部，使用適當的導管進入血管系統，等)。優選的用途 在于，治療或預防有害細胞增殖導致的癌癥、腫瘤和疾病。可提及的可以想到的用途是乳腺 癌、子宮癌(特別是乳頭瘤病毒引起的)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌、胃 癌、食道癌、喉癌、中樞神經系統癌(如膠質母細胞瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病，等)。另 一個優選的用途在于治療或預防類風濕性關節炎、骨質疏松癥和與增加破骨細胞活性相關 的其他疾病。其也可以用在心血管疾病方面，例如，為了抑制或延緩血管壁平滑肌細胞增殖 (再狹窄)。最后，在傳染病的情況下，可以設想該藥物被應用于艾滋病。當本發明的痘病毒、組合物或方法被用于治療癌癥時，優選的施用途徑是全身途 徑，因為根據本發明的痘病毒能夠特異地靶向腫瘤細胞。本發明還涉及治療疾病的方法，其特征是，向需要這種治療的宿主生物體或細胞 施用根據本發明的痘病毒、組合物。根據有利的實施方案，該治療應用或治療方法還包含另外的步驟，其中向宿主生 物體或細胞施用可藥用數量的前藥，最好是胞嘧啶類似物，特別是5-FC。舉例而言，可以使 用劑量為50到500mg/kg/天，優選劑量是200mg/kg/天，或者100mg/kg/天。在本發明的 情況下，依照標準方法施用前藥(例如，口服，系統施用)。
優選地，在施用根據本發明的痘病毒、組合物之后進行給藥，優選地在施用根據本 發明的痘病毒、組合物至少3天，更優選地至少4天，甚至更優選地至少5天之后。據本發 明甚至更優選的實施方案，在施用治療劑7天之后進行施用前藥。優選的是口服途徑。可 以施用單劑量的前藥，或者是在能使宿主生物體或細胞內產生毒性代謝產物的足夠長時間 段內重復施用的劑量。
此外，根據本發明的組合物或方法可以與一種或多種使5-FU的細胞毒作用增強 的物質組合。可特別提到的藥物是，抑制嘧啶從頭生物合成途徑中酶的藥物(例如下文 所述)，藥物如甲酰四氫葉酸(Waxman 等，1982，Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18，685-692)， 其在存在5-FU(5-FdUMP)的代謝產物的情況下，增加胸苷酸合酶的抑制作用，導致dTMP 池減少，dTMP是復制所必需的，最后是藥物如甲氨蝶呤(Cadman等，1979，Science 250， 1135-1137)，其通過抑制二氫葉酸還原酶和提高PRPP(磷酸核糖焦磷酸)池，使得增加5-FU 整合入細胞RNA。根據本發明，抑制嘧啶從頭生物合成途徑的酶的藥物，優選地選自于PALA (N-(膦 酰乙酰基)-L-天冬氨酸；Moore 等，1982，Biochem. Pharmacol. 31,3317-3321)、來氟米 特、A771726(來氟米特活性代謝產物，Davis等，1996，Biochem. 35，1270-1273)和布喹那 (Brequinar) (Chen 等，1992，Cancer Res. 52,3251-3257)。根據本發明的組合物或方法，可以與一種或多種在抗癌治療中有效的物質組合。 在抗癌治療中有效的制藥物質中，能提到的可以與根據本發明的組合物聯合或組合使用的 是，烷化劑例如，如絲裂霉素C、環磷酰胺、白消安、異環磷酰胺、isosfamide、美法侖、六甲三 聚氰胺、塞替派、苯丁酸氮芥、或氮烯唑胺；抗代謝藥物，例如吉西他濱、卡培他濱、5-氟尿 嘧啶、阿糖胞苷、2-氟脫氧胞苷、甲氨蝶呤、idatrexate、拓優得或三甲曲沙；拓撲異構酶II 抑制劑，例如，阿霉素、表柔比星、依托泊苷、替尼泊苷或米托蒽醌；拓撲異構酶I抑制劑，如 依立替康(CPT-11)、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)或托泊替康；抗有絲分裂的藥物，例 如，帕尼特西、多西他賽、長春堿、長春新堿或長春瑞濱；和鉬衍生物，如順鉬、奧沙利鉬、順 螺鉬或 carboplatinum。根據本發明的組合物或方法也可以與放射療法組合使用。根據本發明的組合物或方法也可以與一種或多種這樣的物質組合使用，包含但不 限于免疫調節劑，例如，如α，β和γ干擾素、白細胞介素(特別是IL-2、IL-6、IL-IO或 IL-12)或腫瘤壞死因子；影響細胞表面受體調控的試劑，例如，如表皮生長因子受體抑制 齊Ll (特另1J是西妥昔單抗，Panitumumabλ zalutumumab、nimotuzumab、matuzumab、吉非替尼、 埃羅替尼或拉帕替尼)或人表皮生長因子受體-2抑制劑(特別是曲妥珠單抗)；以及影響 血管生成的試劑，如血管內皮生長因子抑制劑(特別是貝伐單抗或雷珠單抗)。附圖中圖表簡述

圖1.對感染痘苗病毒的人結肓腸腫瘤細胞(LoVo) 5-FC的體外敏感性。以 0. 0001 的 MOI 感染了指示病毒的 LoVo 細胞，(模擬(· ) VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/ FCUl(O))接觸不同濃度的5-FC。感染五天后測定細胞存活。以在存在或不存在藥物下 的細胞存活率百分比表達結果。3個單獨測定的平均值士標準差(無由于病毒復制導致的 細胞死亡)來表示數值。M2.以0.0001的MOI感染了指示病毒的LoVo中，感染后第五天病毒的體外復制效率。以3個單獨測定的平均值士標準差來表示數值。瑞士裸鼠靜脈注射病毒后，皮下LoVo的平均腫瘤體積士 SEM。接種腫瘤七 天后(可觸知的腫瘤)，用107pfu的緩沖液+鹽水( )、緩沖液+5-FC( )、VVTK-F2L-/ rcUl+鹽水(口)或VVTK-F2L-/rcUl+5-FC( ■)處理小鼠。注射病毒第7天后的三周中， 通過口服強飼用鹽水或100mg/kg/j的5-FC處理動物，每天兩次。每周測定腫瘤體積兩次。Mi^靜脈注射病毒后，瑞士裸鼠內皮下H印G2腫瘤的平均體積士SEM。接種腫瘤 14天后(可觸知的腫瘤)，用緩沖液+水( )、或緩沖液+5-FC(^)、或IO6Pfu的VVTK-/ FCUl+ 水(〇)、或 106pfu 的 VVTK-/FCUl+5-FC( · ) (A)；或緩沖液 + 水( )、或緩沖液 +5-FC ( )或 IO6Pfu 的 WTK-F2L-/FCU1+水( )、或 106pfu 的 WTK-F2L-/FCU1+5-FC ( ) (B)處理小鼠。注射病毒7天之后的3個星期，每天以100mg/kg通過口服強飼5-FC兩次來 治療這些動物。每周測定腫瘤體積兩次。M^分裂細胞對比融合細胞中病毒產量比率。用IOOpfu的(■ )VVTK_/F⑶1或 (□ ) VVTK-F2L-/FCU1感染PANCl (人類胰腺腫瘤)、H1299 (人類肺腫瘤)或U118MG (人神 經神經膠質瘤)細胞。感染48小時后，測定病毒滴度。值是分裂細胞對融合細胞中病毒產
量的比率。圖6.用 IxlO6Pfu 的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( □)靜脈注射攜帶人 類皮下腫瘤的瑞士裸鼠后第6天及第21天，器官或腫瘤中病毒滴度(pfu/mg組織)。圖 7.通過靜脈注射 IxlO8Pfu 的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( O )處理 后，瑞士裸鼠的生存率。圖8.通過靜脈注射 IxlO7Pfu(A)或者 lxl08pfu(B)的 VVTK-/FCU1 ( ■)或 VVTK-F2L-/FCU1 ( O )處理后，免疫活性B6D2小鼠生存率。圖9.向瑞士裸鼠靜脈注射IxlO6Pfu的VVTK-/FCU1或VVTK-F2L-/FCU1后，在感 染后第13天和第34天，尾巴上的平均痘皰數。圖10.向瑞士裸鼠靜脈注射 IxlO7Pfu 的 VVTK-/FCU1 或 VVTK-F2L-/FCU1 后，在感 染后第15天和第31天，尾巴上的平均痘皰數。本發明的實施方式
實施例質粒載體的構建利用痘苗病毒菌株Copenhagen (登錄號M35027)的DNA構建F2L缺失的穿梭質粒。利用PCR擴增F2L的DNA側翼區。F2L上游側翼區的引物是5，-CGC GGA TCC GAA AGC GAT GAA CTA AAT GTT C_3，(SEQ ID NO 7 ；下劃線為 BamHI 位點)和 5，_TCC CCC GGG GTT AGTTTC CTT AAC AAA TCT AAC-3，(SEQ ID NO 8 ；下劃線為 SmaI 位點)。下游區域的引物 為 5，-GCC TGG CCA ACA AAT AGA GGA GAT CAAGGG T-3，(SEQ ID NO 9 ；下劃線為 MscI 位 點)和 5，-GCC CAG CTGACC ACT ACA TCA ATT TTA CAA AAG-3，(SEQ ID NO 10 ；下劃線為 PvuII位點)。用限制性內切酶Smal/BamHI或MscI/PvuII消化被擴增的DNA片段并將其連 接到PpolyIII質粒的相應位點。通過PCR利用引物5，-GCC GCA TGC TCC AGA ATT GAT CAT AGT GGA TA-3，(SEQID NO 11 ；下劃線為 SphI 位點)禾口 5，-GCT CTA GAG TTA GTT TCCTTA ACA AAT CTA AC-3，(SEQ ID NO 12 ；下劃線為XbaI位點)擴增F2L下游側翼區的重復區域并將其插入PpolyIII質粒。在生產缺失的病毒的過程中，重復區域被用于消除選擇盒。 該選擇盒對應于在PH5R牛痘啟動子控制下的GFP/GPT融合基因，被插入到PpolyIII質粒 的Smal/SphI位點。所獲得的質粒即該重組穿梭質粒，因為缺失F2L基因而命名為ρ Δ F2L。重組痘苗病毒的產生 用VVTK-rcUl (痘苗病毒，缺損J2R基因，在合成啟動子pllk7. 5控制下表達TOUl 基因)Copenhagen株按0. 1的MOI感染CEF細胞并在37°C下孵育2小時，然后用重組穿梭 質粒(0.2 μ g)的氯化鈣共沉淀物轉染。將該細胞在37°C孵育48小時。然后用新產生病 毒的稀釋物在選擇培養基中感染CEF細胞，該選擇培養基含有終濃度為15μ g/ml的次黃嘌 呤，終濃度為250 μ g/ml的黃嘌呤和終濃度為250 μ g/ml的霉酚酸。分離熒光的(GFP)和陽 性的(GPT選擇)斑，并在存在GPT選擇培養基的CEF細胞中進行數輪篩選。利用使用缺失 區域內的引物進行40個PCR循環測定VVTk-FCUl是否存在。消除親本病毒后，用雙重缺失 病毒來感染無GPT選擇培養基的CEF，以消除選擇盒。分離非熒光斑并在CEF中篩選2輪。 在CEF中擴增最終的重組VV病毒，純化并通過空斑測定在CEF上滴定病毒儲液。細胞對5-FC的體外敏感性。用各重組VV在0.0001的MOI下轉導人類腫瘤細胞。將總數為3 X IO5個細胞/孔 鋪板于含有不同濃度5-FC的2毫升培養基的6孔培養皿中。然后將細胞在37°C下培養5 天，利用臺盼藍拒染法計數活細胞。在圖1和圖2中描繪的結果表明，T2R某因缺損的病毒 中的FCUl活性與F2L基因和J2R基因缺損的病毒中的FCUl活性相等。培養細胞的體外復制。用100PFU的病毒(約0. 0005M0I)在6孔板中感染分裂細胞或融合細胞。對于分 裂細胞使用添加10% FCS的2mL培養基，對于融合細胞使用不添加補劑的培養基。感染后 48小時收獲細胞。將細胞保存在_20°C并超聲處理以釋放病毒，也通過CEF細胞的蝕斑滴 定定量病毒。在所有細胞中，分裂細胞和融合細胞之間復制的比率相似。病毒VVTK-/FCU1 和VVTK-F2L-/FCU1在分裂細胞中的復制都比在融合細胞中的多。作為一個測定復制病毒的特異性的間接方法，測定分裂相對于融合腫瘤細胞(人 類胰腺腫瘤PANCl ；人類肺腫瘤H1299;人類神經膠質瘤U118MG)中產生病毒的產量。以 IxlO6細胞/孔鋪板融合細胞并在完全培養基中培養7天，然后在感染前1天洗滌細胞并將 其培養在無血清的培養基中。感染之前一天以3xl05細胞/孔鋪板分裂細胞。為了評估細 胞分裂水平，在鋪板細胞后的5小時、24小時和48小時測定滴定過的胸苷摻入核酸的量。 在此期間，在融合細胞中的胸苷摻入相對穩定而在分裂細胞中發現摻入隨時間而增長。然 后用IOOpfu病毒感染這些細胞，并在感染48小時后利用對CEF的噬斑滴定，測定分裂腫瘤 細胞和融合腫瘤細胞產生的病毒產量之間的比率。在圖5中所描述的結果表明，兩種病毒 νντκ-/κ:υι和vvTK-F2L-/rcui在分裂細胞中的復制都比在融合細胞中的多。皮下腫瘤模型雌性瑞士裸鼠是從Charles River Laboratories獲得的。在研究中使用的動物 年齡一致(6周)且體重范圍從20至23克。以5X106LoVo細胞/100 μ L向瑞士裸鼠側腹 內進行皮下注射(S. C.)。當腫瘤直徑達到50-70mm3，將小鼠盲式隨機化，并用指示載體處 理進行體內實驗。病毒的生物分布。
通過在腫瘤和器官樣本中的病毒滴定評估vv-rcui和WTK-F2L-/rcui的存在。利 用尾部靜脈注射將IxlO6PFU病毒靜脈(i. V.)注射到荷有確立的皮下LoVo腫瘤的裸鼠中。 在感染14天后處死小鼠，并采集和稱重腫瘤和其它器官。在PBS中均質化腫瘤和器官，并 如前所述地用CEF測定滴度。病毒滴度標準化至每毫克組織。表2和3中描沭的結果(病 毒滴度范圍以pfu/mg組織表示)顯示，14天后本發明的病毒多數在腫瘤中。按照如上所述 的相同條件的另一套實驗中，在感染后的6天和21天處死小鼠。Ml中描述的結果顯示， 除了 VVTK-/TOU1在尾巴中的情況以外，病毒VVTK-/TOU1和VVTK-F2L-/rcUl以在腫瘤中比 在被分析的其他器官中的多大約1000至10000倍的病毒來靶向腫瘤。第6天在肺、脾臟、 腎臟和淋巴結中檢測到少量的VVTK-/FCU1 (少于10pfU/mg)，在皮膚、尾巴和骨髓中發現更 多，第21天在皮膚和尾巴中發現。相比之下，VVTK-F2L-/rcUl具有更高的腫瘤特異性，第6 天在肺、脾臟、腎臟、淋巴結中和皮膚中，第21天在皮膚和尾巴中只含有少量。表2
表3 本發明的痘病毒在皮下腫瘤模型中的抗腫瘤活性。分別用1. IO4PFUU. IO6或1. IO7PFU劑量的指示載體一次瘤內或兩次靜脈注射(通 過尾巴靜脈)處理荷有已確立的皮下LoVo腫瘤(50-70mm3)的裸鼠。注射病毒后第7天開 始，持續3周每天兩次以100mg/kg(0. 5ml5-FC 0. 5%水溶液)口服強飼5-FC。每周用卡尺 測量腫瘤大小2次。使用公式(ρ/6)以mm3(長χ寬2)計算腫瘤體積。如圖3所示的結果 表明，兩種病毒具有相似的功效(P < 0. 05)，其溶瘤活性能夠控制腫瘤生長，并具有與施用 5-FC的組合活性(病毒的溶瘤活性和FCUl基因的治療活性)，施用5-FC可以進一步改進 腫瘤生長的控制(ρ <0.01)。用1. IO6PFU劑量的指示載體，靜脈注射(通過尾巴靜脈)處理荷有確立的皮下 H印G2(人類肝細胞癌細胞)的裸鼠，按照如下進行接種腫瘤14天后(可觸知的腫瘤)，用 緩沖液 + 水、或緩沖液 +5-FC、或 IO6Pfu 的 VVTK-/FCU1+ 水、或 106pfu 的 VVTK-/FCU1+5-FC、 或 IO6Pfu 的 VVTK-F2L-/FCU1+ 水、或 106pfu F2L-/FCU1+5-FC 處理小鼠。病毒注射 7 天之 后的3周期間，通過口服強飼用100mg/kg的5-FC每天處理這些動物兩次。用卡尺每周測定腫瘤大小2次。使用公式(π /6)(長χ寬2)以mm3計算腫瘤體積。如Mi所示的結果顯 示，與注射緩沖液相比較，注射VVTK-/TOU1和VVTK-F2L-/rcUl后，腫瘤的發展受到控制(ρ
<0.0005)。施用5-FC沒有增強活性。僅注射IxlO6Pfu病毒，單看病毒溶瘤活性非常強。病毒的致病性 用對瑞士裸鼠(圖7)和免疫活性的B6D2小鼠(源自Charles Rivers公司， 6周齡)進行存活研究以評估病毒的致病性。用100 μ L每鼠緩沖液中的1. IO7或 1. IO8PFU所有病毒靜脈注射小鼠。在整個實驗過程中每天觀察小鼠。瑞士裸鼠中(Μ1)，注 射IxlO8PFU的VVTK-/TOU1導致40%的動物在感染3天后死亡。其余的老鼠在感染后第50 至第80天死亡。施用VVTK-F2L-/rcUl致病性較低，大部分動物在第65至第115天死亡(ρ
<0. 05)。兩種病毒在IO7Pfu沒有觀察到毒性的跡象。所有小鼠在靜脈注射IO8Pfu VVTK-/ rcui后死亡。用vvTK-F2L-/rcui處理的組，與用νντκ-/κ:υι感染的小鼠相比，具有顯著的 延長存活達92% (P < 0.00005)。因此，這一結果表明了，雙重缺失的病毒VVTK-F2L-/rcUl 的毒性降低。痘皰尾巴損害模型對瑞士裸鼠靜脈注射1. IO6(SQ)或1. IO7PFU(圖10)的每種病毒。每周數一次 尾巴損害。如圖9(A)所示,在感染后第13天，用1. IO6PFU的VVTK_F2L_/rcUl注射的小鼠， 具有的痘皰/小鼠少于1，相比于注射VVTK-/FCU1的小鼠，平均各鼠8個痘皰。在注射后 的第34天結果類似，VVTK-/TOU1平均痘皰為4，相對比于注射VVTK_F2L_/rcUl的約為1 (ρ
<0. 0001),如圖9(B)所示。在感染后15天，用1. IO7PFU的VVTK-F2L-/FCU1注射的小鼠， 各鼠分別平均有3. 5個痘皰，相對比于，注射1. IO7PFU的VVTK-/TOU1，各鼠平均有10個痘 皰(圖10(A))。在感染后第31天，用1. IO7PFU的VVTK-F2L-/FCU1注射的小鼠，分別平均有 3. 5個痘皰/鼠，相對比于，注射VVTK-/F⑶1的，平均有7個痘皰/鼠(圖10(B))。VVTK-/ rcui和VVTK-F2L-/rcUl之間痘皰數量的差異是統計上顯著的(P < 0. 05)。該痘皰的形成 與尾巴中病毒的復制相關，也與毒性和毒力相關。靜脈注射VVTK-F2L-/FCU1的毒性比單一 缺失的TK病毒低。統計分析。采用非參數Mann-Whitney U 檢驗和 STAT ISTICA 7. 1 軟件(StatSoft，公司)進行 統計分析。P <0.05被認為是統計上顯著的。參考文獻·美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TROY, NY)) 1994 年 11 月 15 日.TO 2004/014314 (KIRN DAVID (美國))2004 年 2 月 19 日.TO 2004/014314 (KIRN DAVID (美國))2004 年 2 月 19 日·美國 5364773 (VIR0GENETICS 公司(TROY, NY)) 1994 年 11 月 15 日‘ WO 93/01281 (US HEALTH)· WO 2005/007857· WO 2005/007857· EP 0998568A· EP 0998568A· EP 0998568A
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權利要求
包含缺損F2L基因的痘病毒。
2.權利要求1的痘病毒，其中所述痘病毒還包含缺損J2R基因。
3.根據權利要求1或2所述的痘病毒，其中所述痘病毒屬于脊椎動物痘病毒亞科。
4.根據權利要求3所述的痘病毒，其中所述痘病毒屬于痘苗病毒種。
5.根據權利要求4所述的痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒Copenhagen株。
6.根據權利要求1至5中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含目的核酸。
7.根據權利要求6所述的痘病毒，其中所述目的核酸包含編碼治療性分子的至少一種 目的序列。
8.根據權利要求7所述的痘病毒，其中所述目的核酸包含自殺基因。
9.根據權利要求8所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的蛋白質至少具有胞嘧啶脫 氨酶活性。
10.根據權利要求9所述的痘病毒，其中所述自殺基因是FCY1、FCA1或CodA或其類似物。
11.根據權利要求9所述的痘病毒，其中所述至少具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質是 在序列編號SEQ ID NO 2中描述的rcUl-8多肽及其類似物。
12.根據權利要求8所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的蛋白質具有至少一種胞 嘧啶脫氨酶和一種尿嘧啶磷酸核糖轉移酶活性。
13.根據權利要求12所述的痘病毒，其中所述自殺基因編碼的多肽包含基本上如序列 編號 SEQ ID NO :3(coda:聊)、SEQID NO :1 (FCUl)中所描述的氨基酸序列或 FCYl FURl 的氨基酸序列。
14.根據權利要求1至13中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含核酸序列，所述 核酸序列包含編碼透性酶的基因。
15.根據權利要求14所述的痘病毒，其中透性酶是釀酒酵母的嘌呤或胞嘧啶透性酶。
16.根據權利要求15所述的痘病毒，其中透性酶選自于FCY2、Fur4及其類似物。
17.根據權利要求6至13中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含表達目的核酸 所必需的元件。
18.根據權利要求14至16中任一所述的痘病毒，其中所述痘病毒還包含表達核酸序列 所必需的元件，所述核酸序列包含編碼透性酶的基因。
19.制備根據權利要求1至18中任一所述的痘病毒的方法，其中 (i)將根據權利要求1至18中任一所述的痘病毒引入到細胞中； ( )將所述細胞培養在適合于使所述痘病毒能夠產生的條件下；和 (iii)從細胞培養物中回收所述痘病毒。
20.組合物，其包含根據權利要求1至18中任一所述的痘病毒，與可藥用的賦形劑組合 O
21.根據權利要求20所述的組合物，與一種或多種物質組合，所述物質增強5-氟胞嘧 啶的細胞毒性效應。
22.根據權利要求21所述的組合物，其中所述增強5-氟胞嘧啶的細胞毒性效應的物 質，是抑制嘧啶從頭生物合成途徑的酶的藥物，優選地選自PALA、來氟米特和A771726。
23.根據權利要求21所述的組合物，其中所述增強5-氟胞嘧啶的細胞毒性效應的物質是甲氨蝶呤。
24.將根據權利要求1至18中任一所述的痘病毒或者根據權利要求20至23中任一所 述的組合物用于制備藥物的用途。
25.根據權利要求24所述的用途，用于制備治療癌癥的藥物。
26.治療疾病的方法，其特征在于，將根據權利要求1至18中任一所述的痘病毒或者根 據權利要求20至23中任一所述的組合物施用于需要該治療的宿主有機體或細胞中。
27.根據權利要求26所述的方法，其中通過全身途徑施用所述痘病毒或組合物。
28.根據權利要求26或27所述的方法，還包含另外的步驟，其中向所述的宿主有機體 或細胞施用可藥用數量的前藥。
29.根據權利要求28所述的方法，其中在施用所述痘病毒或組合物優選地至少3天，更 優選地至少4天，和甚至更優選地至少5天之后進行施用所述前藥。
30.根據權利要求29所述的方法，其中在施用所述痘病毒或組合物7天之后進行施用 所述前藥。
全文摘要
本發明涉及包含F2L基因缺損的痘病毒，涉及包含該痘病毒的組合物，以及將該組合物和痘病毒用于治療目的、更具體地用于治療癌癥的方法和用途。
文檔編號A61K35/76GK101868546SQ200880116833
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月17日 優先權日2007年11月19日
發明者J·弗洛派, P·厄博斯 申請人:特朗斯吉有限公司