聯(lián)苯羧酸及其衍生物的制作方法

專利名稱：聯(lián)苯羧酸及其衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由通式I表示的化合物和/或它們的鹽或酯，該通式中R1-R4的定義在 下文給出。此外，本發(fā)明涉及所述化合物用于治療阿爾茨海默病的用途及其用于調(diào)節(jié)Y -分 泌酶活性的用途。本專利申請涉及專利申請WO 2006/04555A1中所公開的一類待審化合物 的一部分。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神經(jīng)退化性疾病，特征為喪失記憶、認知能力和 行為穩(wěn)定性。AD困擾著6%-10%的65歲以上人群，以及高達50%的85歲以上人群。它 是導致癡呆的首要原因，并且是繼心血管疾病和癌癥之后導致死亡的第三大原因。目前還 沒有針對AD的有效療法。在美國與AD相關(guān)的總費用凈額每年超過1000億美元。AD的病因并不單一，不過已將其與某些危險因素相關(guān)聯(lián)，包括(1)年齡，(2)家族 史，(3)以及頭部創(chuàng)傷；其他因素包括環(huán)境毒素和低教育水平。邊緣和大腦皮層中的特定神 經(jīng)病理學病變包括由過度磷酸化的tau蛋白組成的細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，以及β淀粉 樣肽的原纖維聚集體的細胞外沉積(淀粉樣斑塊)。淀粉樣斑塊的主要組分是不同長度的 β (A-beta、Abeta或Αβ)淀粉樣肽。據(jù)信其變體Aβ 1-42肽(Abeta-42)為形成淀粉樣斑 塊的主要病原體。另一個變體為Αβ1-40肽(Abeta-40)。β淀粉樣肽是前體蛋白、β淀 粉樣前體蛋白(beta-APP或APP)的蛋白酶解產(chǎn)物。已將家族性早發(fā)型常染色體顯性形式的AD與淀粉樣前體蛋白(β-APP或 APP)和早老蛋白1和2中的錯義突變關(guān)聯(lián)起來。在一些患者中，遲發(fā)型的AD已被關(guān)聯(lián)到載 脂蛋白E (ApoE)基因的特定等位基因，并且最近發(fā)現(xiàn)的α 2-巨球蛋白中的突變可能與至少 30%的AD人群有關(guān)。盡管存在此異質(zhì)性，但所有形式的AD均顯示出相似的病理學表現(xiàn)。遺 傳分析已經(jīng)為AD的合理治療方法給出了最好線索。所有目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的突變都會影響稱 為Abeta肽(Αβ)(尤其是Αβ42)的淀粉樣蛋白生成肽的定量或定性產(chǎn)出，并且這些突變 為 AD 的“淀粉樣級聯(lián)假說”(Tanzi and Bertram, 2005, Cell 120，545 (Tanzi 與 Bertram， 細胞雜志，2005年，第120卷第545頁))提供了有力的支持。Αβ肽的產(chǎn)生與AD病理學 之間可能存在的關(guān)聯(lián)凸顯出需要更好地了解Αβ的產(chǎn)生機制，并且強烈證明了需要在調(diào)節(jié) Aβ含量方面的治療方法。Αβ肽的釋放由至少兩種蛋白酶解活性進行調(diào)節(jié)，這兩種蛋白酶解活性是指 β -分泌酶和Y -分泌酶，分別在A β肽的N端(Met-Asp鍵)和C端(殘基37-42)進行 切割。在分泌途徑中，有證據(jù)表明β-分泌酶首先進行切割，導致分泌s-APP β (si3)，而保留IlkDa的膜結(jié)合的羧基端片段(CTF)。據(jù)信后者在被Y-分泌酶切割后產(chǎn)生Αβ肽。對 于在特定蛋白質(zhì)(早老蛋白)中攜帶某些突變的患者，較長的同種型Αβ42的含量呈選擇 性增加。已將這些突變與早發(fā)型家族性阿爾茨海默病相關(guān)聯(lián)。因此，許多研究者認為A β 42 是阿爾茨海默病發(fā)病的罪魁禍首?，F(xiàn)已清楚，Y-分泌酶活性不應(yīng)歸于一種特定蛋白，而是事實上與一群不同的蛋白 相關(guān)。
Y-分泌酶活性存在于多蛋白復合體，該復合體包含至少四種組分早老蛋白 (PS)異型二聚體、nicastriruaph-Ι和pen-2。PS異型二聚體由前體蛋白的內(nèi)切蛋白酶解 所產(chǎn)生的氨基和羧基末端PS片段組成。催化部位的兩個天冬氨酸鹽在此異型二聚體的界 面處。最近有人提出nicastrin起到Y(jié) -分泌酶底物受體的作用。分泌酶的其他成員 的功能還未知，但是它們均為活性所必需(Steiner，2004. Curr. AlzheimerResearch 1(3) 175-181 (Steiner,當代阿爾茨海默病研究，2004年，第1卷第3期第175-181頁))。因此，雖然第二切割步驟的分子機制至今仍不明了，但Y-分泌酶復合體已成為 尋找阿爾茨海默病治療化合物的過程中的主要靶標之一。已提出多種靶向阿爾茨海默病中的Y-分泌酶的策略，包括直接靶向催化部位， 開發(fā)Y-分泌酶活性的底物特異性抑制劑和調(diào)節(jié)劑(Marjaux etal. , 2004. Drug Discovery Today =Therapeutic Strategies, Volume 1，1-6 (Marjaux 等人，今日藥物開發(fā)治療策 略，2004年，第1卷第1-6頁))。因此，有多種以分泌酶作為靶標的化合物已得到描述 (Larner,2004. Secretases as therapeutics targets in Alzheimer's disease :patents 2000-2004. Expert Opin. Ther. Patents 14，1403-1420 (Larner,作為阿爾茨海默病中的 治療靶標的分泌酶專利2000-2004，治療術(shù)專利專家評論，2004年，第14卷第1403-1420 頁))。事實上，此發(fā)現(xiàn)最近得到了生物化學研究的支持，研究顯示了某些非留體抗 炎藥(NSAID)對 γ-分泌酶的作用(Weggen et al (2001) Nature414,6860,212and WO 01/78721and US 2002/0128319 ；Morihara et al (2002)J Neurochem. 83,1009 ； Eriksen (2003) J. Clin. Invest. 112,440 (ffeggen 等人，自然雜志，2001 年，第 414 卷第 6860 期第212頁以及WO 01/78721和US 2002/0128319 ；Morihara等人，神經(jīng)化學雜志，2002年， 第83卷第1009頁；Eriksen，臨床研究雜志，2003年，第112卷第440頁))。使用NSAID 預(yù)防或治療AD的潛在局限性是它們具有對環(huán)加氧酶(Cox)的抑制活性(此活性可以導致 不良副作用)以及低中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)滲透性(Peretto et al.，2005，J. Med. Chem. 48， 5705-5720 (Peretto等人，藥物化學雜志，2005年，第48卷第5705-5720頁))。因此，強烈需要能調(diào)節(jié)Y-分泌酶活性，從而為阿爾茨海默病的治療開辟新途徑 的新型化合物。本發(fā)明的目的是提供這樣的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及如式I所示的化合物。 (式I)其中R1 為 F、Cl 或 CF3;R2 為 F、Cl 或 CF3 ；R3 為 F、Cl 或 CF3 ；R4 為 H、F、Cl 或 CF3 ；及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。本亞屬化合物在效價(potency)和體內(nèi)效能(efficacy)方面顯示了出乎意料的 提高。具體地講，R1和R2為吸電子基團(例如F、C1，或CF3)時，并且羧酸的α碳被仲丁基 取代時，效價和效能出現(xiàn)提高。
具體實施例方式本發(fā)明涉及如式I所示的化合物。 (式I)其中R1 為 F、Cl 或 CF3;R2 為 F、Cl 或 CF3 ；R3 為 F、Cl 或 CF3 ；R4 為 H、F、Cl 或 CF3 ；及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。在本發(fā)明的實施例中R1 為 F ；R2 為 F、Cl 或 CF3 ；R3 為 CF3 ；
R4 為 H、F、Cl 或 CF3 ； 及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。本發(fā)明的另一個實施例是選自由以下化合物組成的組的化合物(R) -2- [5- (3，5_ 二氟芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊酸、(S) -2- [5- (3，5- 二氟芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊酸、2-[5-(4-氟-2-三氟甲基芐氧基)-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊酸、2-[4'-氯-5-(3，5-二氟芐氧基)-3'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊酸、及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到式I的化合物可以在其結(jié)構(gòu)中具有一個或多個不對稱 碳原子。意圖本發(fā)明將化合物的單一對映體形式、外消旋混合物以及存在對映體過量的對 映體混合物包括在其范圍內(nèi)。本發(fā)明的一些化合物和/或它們的鹽或酯將以不同的立體異構(gòu)形式存在。所有這 些形式均是本發(fā)明的主題。以下所描述的為本文所包括的本發(fā)明化合物的示例性鹽。以下所指定的不同的鹽 的列表并不意味著是完整的和限制性的。含有一個或多個酸性基團的本發(fā)明化合物可按照本發(fā)明來使用，例如可作為它們 的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽來使用。此類鹽的更確切例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或 者與氨或有機胺(例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸)形成的鹽。術(shù)語“藥用的”是指已被諸如EMEA(歐洲)和/或FDA(美國)的監(jiān)管機構(gòu)和/或 任何其他國家監(jiān)管機構(gòu)批準用于動物、優(yōu)選地用于人類。本發(fā)明化合物各自的鹽可以用常規(guī)方法獲得，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知， 例如通過使這些化合物與有機堿或無機堿在溶劑或分散劑中接觸獲得，或通過與其他鹽進 行陽離子交換獲得。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的所有這樣的鹽，它們由于生理相容性低而并不 正好適合在藥物中使用，但它們可以用作(例如)化學反應(yīng)的中間體或制備可藥用的鹽的 中間體，或者它們可能適于以任何適當?shù)姆绞?例如任何合適的體外測定法)研究本發(fā)明 化合物的Y-分泌酶調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的所有溶劑化物。本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的衍生物/前體藥物(包括其鹽)，這些衍生物/前體藥物(包括其鹽)包含生理上可耐受的基團和可切割基團，并且在動物中，優(yōu)選地在哺乳動 物中，最優(yōu)選地在人類中被代謝為本發(fā)明化合物。本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的代謝物。術(shù)語“代謝物”是指在細胞或生物體中，優(yōu)選地在哺乳動物中，所有衍生自任何本 發(fā)明化合物的分子。優(yōu)選地，術(shù)語“代謝物”是指與在生理條件下在任何此類細胞或生物體中存在的任 何分子不同的分子。通過使用各種適當?shù)姆椒?，本發(fā)明化合物的代謝物的結(jié)構(gòu)對于本領(lǐng)域任何技術(shù)人 員都將是顯而易見的?？梢愿鶕?jù)文獻中公布的方法或以類似的方法制備通式(I)的化合物。
視各個具體情形而定，為了避免在合成通式(I)的化合物過程中出現(xiàn)副反應(yīng)，有 必要或有利的是通過引入保護基團暫時封閉官能團，并在合成后期階段中對其進行去保 護，或者以前體基團的形式引入官能團，并在后期階段中將它們轉(zhuǎn)化為所需的官能團。適當 的合成策略、保護基團和前體基團是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果需要，可以采用常規(guī)純化方法對式(I)的化合物進行純化，例如重結(jié)晶或色 譜法。用于制備式(I)的化合物的原料可商購獲得，或者可以根據(jù)文獻所述步驟或類似步 驟進行制備。
這些原料可以作為通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一些方法制備本發(fā)明的其他化 合物的基礎(chǔ)。本發(fā)明還涉及用作藥物的本發(fā)明化合物。這樣的化合物如上所定義，且符合藥物 的定義。下文針對本發(fā)明的用途(例如制劑、應(yīng)用和組合)所描述的實施例也適用于本發(fā) 明的這個方面。具體地講，本發(fā)明化合物適用于阿爾茨海默病的治療。有關(guān)所述用途的詳細內(nèi)容在下文中進一步公開。該化合物可以用于Y -分泌酶活性的調(diào)節(jié)。本文所用的術(shù)語“ Y -分泌酶活性的調(diào)節(jié)”是指對Y "分泌酶復合體對APP的加工 所產(chǎn)生的作用。優(yōu)選地，它是指這樣一種作用APP加工的總速率保持基本上如沒有應(yīng)用所 述化合物時的總速率，但加工產(chǎn)物的相對數(shù)量被改變，更優(yōu)選地以Aβ 42肽的產(chǎn)生量減少 的方式改變。例如，可以產(chǎn)生不同的Αβ種類(例如Aβ-38或氨基酸序列較短的其他Aβ 肽種類，而不是Aβ -42)，或者產(chǎn)物的相對數(shù)量不同(例如，Aβ-40與Αβ -42的比率改變， 優(yōu)選地升高)。Y-分泌酶活性可以(例如)通過檢測APP加工進行測定，例如通過測定生成的 A β肽種類的含量，最重要的是A β-42的含量(參見下文的實例部分)。之前已證明Y-分泌酶復合體也參與Notch蛋白的加工。Notch是一種信號轉(zhuǎn) 導蛋白，其在發(fā)育過程中起著決定性的作用(例如SchweisguthF(2004)Curr. Biol. 14， R129(Schweisguth F，2004年，當代生物學，第14卷第R129頁)中的綜述)。對于所述化合物在治療中調(diào)節(jié)Y-分泌酶活性的用途而言，似乎尤其有利的是不 干擾Y "分泌酶活性的Notch加工活性，以避免產(chǎn)生可能的不良副作用。因此，優(yōu)選不影響Y -分泌酶復合體的Notch加工活性的化合物。在本發(fā)明的涵義內(nèi)，“對Notch剪切活性的影響”包括Notch加工活性受抑制或活 化達某個系數(shù)。如果化合物以30μΜ 的濃度在 Shimizu et al (2000) Mol. Cell. Biol，20 6913 (Shimizu等人，分子與細胞生物學，2000年，第20卷第6913頁)中所述的各個測定中 測出，所述系數(shù)小于20，優(yōu)選地小于10，更優(yōu)選地小于5，最優(yōu)選地小于2，則該化合物定義 為不影響Notch加工活性。此種Y-分泌酶調(diào)節(jié)可以(例如)在諸如哺乳動物的動物中進行。示例性哺乳動 物為小鼠、大鼠、豚鼠、猴子、狗和貓。該調(diào)節(jié)也可以在人類中進行。在本發(fā)明的具體實施例 中，所述調(diào)節(jié)在體外或細胞培養(yǎng)物中進行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，有幾種體外測定法和細 胞培養(yǎng)物測定法可供使用。
可用于通過蛋白印跡分析測定細胞系或轉(zhuǎn)基因動物中C端APP片段的產(chǎn)生的示例 性測定法包括(但不限于)Yan et al. ,1999, Nature 402，533-537 (Yan等人，自然雜志， 1999年，第402卷第533-537頁)中所描述的那些方法。體外γ -分泌酶測定法的例子在W0-03/008635中有所描述。在此測定法中，使適 當?shù)碾牡孜锱cY “分泌酶制劑接觸，然后測定對底物的切割能力。Y-分泌酶切割的各種產(chǎn)物(Αβ肽)的濃度可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種 方法進行測定。此類方法的例子包括通過質(zhì)譜法對肽進行測定或通過抗體進行檢測。 可用于表征培養(yǎng)細胞介質(zhì)和生物流體中可溶性Αβ肽譜的示例性測定法包括(但 不限于)Wang et al.，1996，J. Biol. Chem. 271，31894-31902 (Wang 等人，生物化學雜志， 1996年，第271卷第31894-31902頁)中描述的測定法。此測定法融合使用了以特異性抗 體進行Αβ肽的免疫沉淀和以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行肽的檢測和定量?？捎糜谕ㄟ^ELISA測定A β -40肽和A β -42肽的產(chǎn)生的示例性測定法包括(但不 限于)Vassar et al, 1999, Science 286，735-741 (Vassar 等人，科學雜志，1999 年，第 286 卷第735-741頁)中所描述的那些方法。更多信息公開于(例如)N. Ida et al. (1996) J. Biol. Chem. 271，22908 (N. Ida 等人，生物化學雜志，1996 年，第 271 卷第 22908 頁)和 M. Jensenet al. (2000)Mol. Me d. 6，291 (M. Jensen 等人，分子醫(yī)學，2000 年，第 6 卷第 291 頁)。適當?shù)目贵w可得自(例如)The Genetics Company, Inc.(瑞士)?；诳贵w的試劑 盒還可得自Innogenetics (比利時)?？梢栽诖祟悳y定法中使用的細胞包括內(nèi)源性表達Y-分泌酶復合體的細胞以及 瞬時或穩(wěn)定表達Y-分泌酶復合體的一些或所有相互作用因子(interactor)的轉(zhuǎn)染細胞。 適用于此類測定法的許多可用細胞系是技術(shù)人員已知的。神經(jīng)元起源或神經(jīng)膠質(zhì)起源的細 胞和細胞系尤其適用。此外，還可以使用大腦細胞和組織，及其勻漿和膜制品(Xia et al., 1998, Biochemistry 37，16465-16471 (Xia等人，生物化學，1998 年，第 37 卷第 16465-16471 頁))?？梢赃M行此類測定法來(例如)研究本發(fā)明化合物在不同實驗條件和配置下的作用。此外，此類測定法還可以作為對Y-分泌酶復合體的功能研究的一部分來進行。例如，可以在某些細胞系中表達動物(優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人類)的Y-分 泌酶復合體的一種或多種相互作用因子(為野生型形式或帶有某些突變和/或修飾)，隨后 便可研究本發(fā)明化合物的作用。所使用的相互作用因子的突變形式可以是在某些動物(優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選 為人類)中已經(jīng)描述過的突變形式，也可以是在所述動物中以前還未描述過的突變形式。γ -分泌酶復合體的相互作用因子的修飾包括所述相互作用因子的任何生理學修 飾以及在生物系統(tǒng)中被描述為蛋白質(zhì)的修飾的其他修飾。此類修飾的例子包括(但不限于)糖基化、磷酸化、異戊二烯化、十四烷基化和法 尼基化。此外，本發(fā)明化合物可以用于制備調(diào)節(jié)Y-分泌酶活性的藥物。本發(fā)明還涉及所述化合物用于制備調(diào)節(jié)Y-分泌酶活性的藥物的用途。可以通過不同的方式調(diào)節(jié)Y-分泌酶的活性，即導致產(chǎn)生各種Αβ肽的不同譜圖。
優(yōu)選的是，使用化合物調(diào)節(jié)Y -分泌酶的活性，導致所產(chǎn)生的A β 42肽的相對數(shù)量 減少。
各自的劑量、給藥途徑、制劑等在下文進一步公開。本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物用于治療與A β 42產(chǎn)生量提高相關(guān)的疾病的用途。伴 有Αβ肽產(chǎn)生量提高并沉積于大腦的疾病通常為阿爾茨海默病(AD)、大腦淀粉樣血管病、 多發(fā)梗死性癡呆、拳擊員癡呆或唐氏綜合癥，優(yōu)選地為AD。本文所用的術(shù)語“治療”意指所有這樣的過程，其中可以是減緩、中斷、阻止或遏止 疾病的發(fā)展，但并不一定表示所有癥狀的完全消除。本文所用的術(shù)語“Α β 42產(chǎn)生量提高”是指這樣一種狀況由于APP加工的總體提 高，使A β 42肽的產(chǎn)率升高，或者優(yōu)選地是指這樣一種狀況由于與野生型APP和非病態(tài)情 況相比，APP加工譜被修飾，使Αβ 42肽的產(chǎn)量提高。如上文所概述，此類提高的Αβ 42含量是發(fā)展或罹患阿爾茨海默病的患者的標
ο本發(fā)明的化合物或一部分化合物的一個優(yōu)點可在于它們的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性增強。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含與惰性載體相混合的本發(fā)明化 合物。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含與惰性載體 相混合的本發(fā)明化合物，其中所述的惰性載體為藥物載體。術(shù)語“載體”是指據(jù)以給予該化合物的稀釋劑、助劑、賦形劑或介質(zhì)。此類藥物載 體可以是無菌的液體，例如水和油，包括那些來源于石油、動物、植物的油或合成的油，包括 (但不限于)花生油、大豆油、礦物油和芝麻油等等。當藥物組合物為口服時，水是優(yōu)選的載 體。當藥物組合物為靜脈內(nèi)給予時，鹽水和右旋糖水溶液是優(yōu)選的載體。鹽水和右旋糖水 溶液以及甘油溶液優(yōu)選用作注射溶液的液體載體。適當?shù)乃幱觅x形劑包括淀粉、葡萄糖、乳 糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、 脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇等等。如果需要，組合物也可以包含微量的潤濕劑 或乳化劑、或PH緩沖劑。這些組合物可以呈現(xiàn)溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、 散劑、緩釋制劑等劑型。組合物可以用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如三甘油酯配制成栓劑。口服 制劑可以包括標準的載體，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、 碳酸鎂等。適當?shù)乃幬镙d體的例子在E.W.Martin所著的“Remington' s Pharmaceutical Sciences"(《Remington的藥物科學》)中有所描述。此類組合物將包含治療有效量的化 合物(優(yōu)選地以純化的形式)并共混適量的載體，以給患者提供適當?shù)慕o藥形式。制劑應(yīng) 與給藥方式相適應(yīng)。本發(fā)明化合物及其可藥用的鹽(任選地與其他藥用活性化合物組合)適用于治療 或預(yù)防阿爾茨海默病或其癥狀。此類另外的化合物包括認知增強藥，例如乙酰膽堿酯酶抑 制劑(例如多奈哌齊、他克林、加蘭他敏、利伐司替明)、NMDA拮抗劑(例如美金剛)、PDE4 抑制劑(例如西洛司特(Ariflo))或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于治療或預(yù)防阿爾茨海默病 的任何其他藥物。此類化合物還包括降膽固醇藥，例如他汀類藥物(例如辛伐他汀)。這些 化合物可以單獨作為藥物、互相混合作為藥物或者以藥物制劑的形式給予動物，優(yōu)選為哺乳動物，尤其為人類。各種遞送體系是已知的，可以用于給予本發(fā)明的化合物以治療阿爾茨海默病或調(diào)節(jié)Y _分泌酶的活性，例如封裝在脂質(zhì)體、微粒和微膠囊中。如果不直接遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(優(yōu)選為大腦)，有利的是對給藥方法進行選擇 和/或修改，以使得藥物化合物能夠穿透血腦屏障。引入方法包括(但不限于)真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外途徑以 及口服途徑?？梢酝ㄟ^任何便利的途徑給予化合物，例如通過輸注、彈丸式注射、經(jīng)上皮吸收或 經(jīng)皮膚粘膜內(nèi)層吸收，還可以連同其他生物活性劑一起給予。可以全身給予或局部給予。另外，期望的是通過任何適當?shù)耐緩綄⒈景l(fā)明的藥 物組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，途徑包括心室內(nèi)注射和鞘內(nèi)注射；可通過例如連接到貯存器 (例如奧馬耶(Ommaya)貯存器)的心室內(nèi)導管促進心室內(nèi)注射。也可以采用肺部給予，例 如使用吸入器或噴霧器，以及帶有氣溶膠化劑的制劑。在另一個實施例中，化合物可以采用囊泡(具體地講為脂質(zhì)體)的形式進行遞送 (Langer (1990) Science 249，1527 (Langer，科學雜志，1990 年，第 249 卷第 1527 頁))。在又另一個實施例中，化合物可以通過控釋體系進行遞送。在一個實施例中， 可以使用泵(Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14,201 ；Buchwald et al. (1980) Surgery 88,507 ；Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321, 574 (Sefton, CRC 生物醫(yī)藥工 程評論，1987年，第14卷第201頁；Buchwald等人，外科雜志，第88卷第507頁；Saudek 等人，新英格蘭醫(yī)藥雜志，1989年，第321卷第574頁))。在另一個實施例中，可以使用 聚合物材料(Ranger and Peppas (1983)Macromol. Sci. Rev. Macromo 1. Chem. 23,61 ；Levy et al. (1985)Science 228,190 ；During et al. (1989)Ann. Neurol. 25,351 ；Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71，858 (Ranger 與 P印pas，高分子科學高分子綜述篇，1983 年，第 23卷第61頁；Levy等人，科學雜志，1985年，第228卷第190頁；During等人，神經(jīng)學年鑒， 1989年，第25卷第351頁；Howard等人，神經(jīng)外科雜志，1989年，第71卷第858頁))。在 又另一個實施例中，可以將控釋體系放置在治療靶標(即大腦)近旁，因此僅需要全身性劑 量的一小部分(例如 Goodson 1984 年在 Medical Applications of ControlledRelease, Vol.2，115(控制釋放的醫(yī)學應(yīng)用，第2卷第115頁)中所描述)。其他控釋體系由Langer 在綜述(1990，Science 249，1527 (科學雜志，1990年，第249卷第1527頁))中進行了討 論。為了選擇適當?shù)慕o藥途徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員也會考慮其他已知的抗阿爾茨海默病 藥物已經(jīng)選擇的給藥途徑。例如，安理申/多奈哌齊和康耐視/他克林(均為乙酰膽堿酯酶抑制劑)目前以 口服形式服用，Axura/美金剛(NMDA受體拮抗劑)已作為片劑/液體和靜脈注射溶液上市。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還會考慮NSAID家族成員在臨床試驗中以及在探索它們對 阿爾茨海默病的作用的其他研究中的與給藥途徑有關(guān)的可用數(shù)據(jù)。為了選擇適當?shù)膭┝?，本領(lǐng)域技術(shù)人員會選擇這樣一種劑量其在臨床前研究和 /或臨床研究中已經(jīng)證明為無毒，并可以與預(yù)先給定的值相一致，或者可以偏離這些值。在制劑中要使用的精確劑量也將取決于給藥途徑以及疾病或機能失調(diào)的嚴重程度，并且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個患者的情況來決定。然而，靜脈給藥的適當劑量范圍通 常為每千克體重約20-500微克的活性化合物。鼻內(nèi)給藥的適當劑量范圍通常為約0. Olmg/ kg體重至lmg/kg體重。有效劑量可以從得自體外試驗系統(tǒng)或動物模型試驗系統(tǒng)的劑量效 應(yīng)曲線推測得到。示例性動物模型是轉(zhuǎn)基因小鼠品系“Tg2576”，其包含具有雙突變KM670/67INL 的APP695型。有關(guān)參考文獻參見(例如)專利US5877399和Hsiao et al. (1996) Science 274，99 (Hsiao 等人，科學雜志，1996 年，第 274 卷第 99 頁)以及 Kawarabayahsi T(2001) J. Neurosci. 21, 372 (Kawarabayahsi T,神經(jīng)科學雜志，2001 年，第 21 卷第 372 頁)；Frautschyet al. (1998) Am. J. Pathol. 152，307 (Frautschy 等人，美國病理學雜志， 1998 年，第 152 卷第 307 頁)；Irizarry et al. (1997) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56， 965 (Irizarry 等人，神經(jīng)病理學期刊，1997 年，第 56 卷第 965 頁)；Lehman et al. (2003) Neurobiol. Aging 24，645 (Lehman等人，老化神經(jīng)生物學雜志，2003年，第24卷第645頁)。來自幾個研究的大量資料可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所用，這些資料可指導技術(shù)人員 為選定的治療方案選擇適當?shù)膭┝?。已?jīng)公布了許多研究，這些研究中描述了分子對Y-分泌酶活性的作用。示例性 研究為 Lim et al. (2001) Neurobiol. Aging 22，983 (Lim 等人，老化神經(jīng)生物學雜志，2001 年，第 22 卷第 983 頁)；Lim et al. (2000) JNeurosci. 20，5709 (Lim 等人，神經(jīng)科學雜志， 2000 年，第 20 卷第 5709 頁)；Weggen et al. (2001)Nature 414，212 (Weggen 等人，自然雜 志，2001 年，第 414 卷第 212 頁)；Eriksen et al. (2003) J Clin Invest. 112，440 (Eriksen 等人，臨床研究雜志，2003 年，第 112 卷第 440 頁)；Yan etal. (2003) J Neurosci. 23, 7504 (Yan等人，神經(jīng)科學雜志，2003年，第23卷第7504頁)。常規(guī)合成
具體實施例方式以下的一般描述僅用作示例性目的，決非意在限制本發(fā)明。其中Ri、R2、R3和R4如式I中所定義的式I化合物(可以通過酯II在標準酸性或 堿性水解條件下的水解獲得，這些條件包括在室溫下與NaOH在適當?shù)娜軇┗旌衔锶缢⑺?氫呋喃(THF)和甲醇中反應(yīng)幾個小時。
其中烷基包括甲基和乙基的化合物II，可以通過化合物III與芐基溴、芐基氯、甲 苯磺酸芐酯或甲磺酸芐酯在典型芐基化條件下(例如在存在堿如碳酸鉀或碳酸銫的二甲 基甲酰胺(DMF)或四氫呋喃(THF)中，溫度范圍25-120攝氏度)的烷基化反應(yīng)制得。化合 物II也可以通過化合物III與芐醇在Mitsnobu條件下(例如在存在偶氮二甲酸二乙酯和 三苯基膦的THF或甲苯中)的反應(yīng)獲得。
化合物III可以通過使化合物IV在醇(例如MeOH或EtOH)中在Pd-C存在下進 行氫化使其去芐基化來制備。去芐基化也可以采用其他方法實現(xiàn)，例如BBr3在DCM中、NaCN 在 DMSO/120-200°C 中或 LiCN 在 DMF/120_200°C 中。 化合物IV可以由化合物V與仲丁基溴或仲丁烯基溴的烷基化反應(yīng)制備而得。將化 合物V在THF或另一種非質(zhì)子溶劑中用堿(例如雙-(三甲基甲硅烷基)氨基鋰、雙-(三 甲基甲硅烷基)氨基鈉或二異丙基氨基鋰)在_78°C下進行處理，然后通過仲丁基溴或仲丁 烯基溴的加成，得到烷基化的化合物IV。 化合物V可以由化合物VI通過與芳基硼酸在Suzuki條件(碳酸鈉水溶液，DME 中，Pd(PPh3)4存在下)下的偶合反應(yīng)制備而得。 中間體化合物VI可以由化合物VII與三氟甲磺酸酐在DCM中在一當量吡啶存在 下在o°c下反應(yīng)制備而得。 中間體酚酯VII可以由化合物VIII的單去芐基化制備而得?；衔颲III的選擇 性單去芐基化可以通過在Parr搖動器中用1. 1當量的堿(例如氫氧化鈉或氫氧化鉀)在 乙醇或甲醇溶液中在Pd-C催化劑存在下在氫氣氛條件(<60psi)下處理來實現(xiàn)。讓該反 應(yīng)進行到一當量的氫消耗完為止。 中間體VIII可以容易地由3，5_ 二羥苯基乙酸甲酯(可商購獲得)與芐基溴和碳 酸鉀在DMF中在室溫下反應(yīng)而制備而得。化合物I在羧基> α位具有手性中心，可以以二種對映體之一(或其混合物，其 中可以存在或不存在對映體過量)的形式存在。示出了對映體Ia(R對映體)和Ib(S對 映體)。純對映體Ia和Ib可通過采用手性柱進行手性分離而獲得。對映體Ia和Ib也 可以通過拆分進行分離，此拆分由分級重結(jié)晶形成手性胺鹽來進行。對映體Ia和Ib也可 以由相應(yīng)酯的外消旋物的動力學拆分獲得，此動力學拆分是采用脂肪酶(例如AmanoAk、 Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶A、Amano脂肪酶M、Amano脂肪酶F_15、Amano脂肪酶G (得 自Biocatalytics Inc))在含水有機溶劑(例如含水DMF、DMS0、叔丁基乙基醚或Triton X-100水溶液)中進行?；衔颕的兩種對映體都可以通過手性合成來制備?；衔颕a和Ib可以通過用 氫氧化鋰在含水THF中在過氧化氫存在下將手性輔助基團分別從化合物IXa和IXb中移除
而獲得。 化合物IXa和IXb可以通過化合物Xa和Xb與芐基溴、芐基氯或甲苯磺酸芐酯或 甲磺酸芐酯在典型堿性條件下(例如在DMF或THF中在堿(例如碳酸鉀或碳酸銫)存在 下，溫度范圍25-120攝氏度)進行偶合獲得?；衔颕Xa和IXb也可以通過化合物Xa和 Xb與芐基醇在Mitsnobu條件下(例如在THF或甲苯中在偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦存
在下)的偶合反應(yīng)獲得。 化合物Xa和Xb可以通過化合物XIa和XIb分別進行去芐基化而獲得，所述去芐 基化是通過在醇溶劑(例如MeOH或EtOH)中在Pd-C存在下進行氫化而實現(xiàn)。 化合物XIa和XIb可以分別通過化合物XIIa和XIIb與仲丁基溴或仲丁烯基溴 的烷基化反應(yīng)制備得到。將化合物XIIa和XIIb在THF或其他非質(zhì)子溶劑中用堿(例 如雙_(三甲基甲硅烷基)氨基鋰、雙_(三甲基甲硅烷基)氨基鈉或二異丙基氨基鋰) 在-78°C下進行處理，然后通過親電體(仲丁基溴或仲丁烯基溴)的加成，分別得到烷基化 的化合物XIa和XIb。 化合物XIIa和XIIb可以由普通中間體XIII通過與4_芐基-噁唑烷酮的R異 構(gòu)體XIVa或4-芐基-噁唑烷酮的S異構(gòu)體XIVb以Evans法進行偶合制備而得?？墒怪?間體XIII在THF中在堿(例如三乙胺或N-甲基嗎啉)存在下與三甲基乙酰氯、乙二酰氯 或氯甲酸異丙酯進行反應(yīng)，得到混合的酸酐或?；?，然后使混合的酸酐或?；扰cXIVa 或XIVb的鋰鹽在THF中進行反應(yīng)。在手性合成中也可以使用其他手性輔助基團，例如經(jīng)由 A. G. Myers 條件(J. Am. Chem. Soc. 1994，116，9361-9362 (美國化學會會志，1994 年，第 116 卷第9361-9362頁))獲得的偽麻黃堿。用羧酰氯或羧酸酐處理偽麻黃堿的兩種對映體中 的任何一個將得到酰胺衍生物XV。用強堿(例如二異丙基氨基鋰)在氯化鋰存在下處理酰 胺，然后通過烷基化劑的加成以產(chǎn)生相應(yīng)的烷基化產(chǎn)物。然后可以采用酸水解的方式移除 手性輔助基團，從而得到手性目標化合物。 中間體化合物XIII可以通過用堿在醇水溶液中，例如用LiOH或NaOH在甲醇水溶 液中，將化合物V進行酯水解來獲得。合成工藝所有的反應(yīng)均在惰性氣氛下進行，除非另有指明。NMR波譜由Bruker dpx400測定 獲得。方法A的LCMS在安捷倫1100上實施，采用ZORBAX SB-C18，4.6X75_，3. 5微 米色譜柱。色譜柱流速為lml/min，所用溶劑為水和乙腈(0. TFA)，進樣體積為10 μ 1。 波長為254和210nm。手性純度分析采用手性色譜柱進行?？s寫 SM實例1(R) 2-「5- (3，5- 二氟芐氧,某)_4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯_3_某1 ~4~甲某戊膽 外消旋合成和手性分離a) (3,5- 二芐氧,某苯某)-乙酸甲酯 使(3，5_ 二羥基苯基)-乙酸甲酯(得自Aldrich，70g，0. 385摩爾)、芐基溴 (137mL，1. 16摩爾)、碳酸鉀(160g, 1. 16摩爾)和DMF(1. 5L)的混合物在N2中室溫下機械 攪拌過夜。將所得反應(yīng)混合物在攪拌下倒入1. 5L的冰水混合物中。過濾獲得沉淀，隨即使用庚烷對其進行洗滌以去除芐基溴，得到棕色固體形式的 標題化合物(123. 7g)，將此固體風干后用于下一步反應(yīng)。i-NMR(⑶Cl3) =6 3. 60(s,2H), 3. 71 (s，3H)，5.05 (s，4H)，6.60 (s，3H) ,7.35-7. 50 (m，10H) ；C23H2204 (M+H)的計算值為 363. 15，測定值為363。b) (3-芐氧基-5-羥基苯基)-乙酸乙酯 取3，5-二芐氧基苯基)_乙酸甲酯50克(1.38摩爾)與Na0H(6. 6g，1. 65摩爾) 溶于1L的EtOH(存在有10%的Pd-C)中制成溶液，將此溶液置于Parr搖動器中進行氫化， 直到一當量的氫消耗完為止。用濃HC1對此混合物進行酸化，然后去除催化劑和溶劑，得到 油殘留物。粗產(chǎn)物通過ISC0硅膠柱色譜法(ISC0)進行純化，使用EtOAC-庚烷作為洗脫液 (洗脫梯度為10%到75%的EtOAc)，純化后獲得25克(收率為65%)的標題化合物(lb)。 ^-WIUCDCI》8 1. 15-1. 20(t，3H)，3. 4-(s，2H)，4. 05-4. 1 (q，2H)，4. 9 (s，2H)，5. 5 (s，1H)， 6. 4(s，2H)，6. 5(s，1H)，7. 207. 35 (m, 5H) ；C17H1804 (M+H)的計算值為 287. 3，測定值為 287。c) (3-芐氧某-5-三氟甲磺酰氧,某-苯某)_乙酸乙酯 將吡啶(62. 5mL，0. 78mol)加入到3_(芐氧基_5_羥基苯基)-乙酸乙酯(74. 4g， 0. 26mol)的二氯甲烷(700mL)溶液中。將此混合物冷卻至0°C。向此冷卻溶液中加入三氟 甲磺酸酐(65.6mL，0. 39mol)，加入時間為1. 5h，保持內(nèi)部溫度在5°C以下，再在0°C下攪拌 0. 5h。將此反應(yīng)混合物倒入IN HC1 (420mL)與濕冰(105g)的混合物中，并攪拌0. 5h。用 二氯甲烷(2X100mL)萃取水層。將各級分混合，用水(2X100mL)、飽和的NaHC03水溶液 (2X100mL)和鹽水(2X100mL)進行洗滌。對有機相進行干燥(MgS04)，并在真空中濃縮獲 得微紅色液體(108g)，此液體無需進一步純化就繼續(xù)進行下一步驟。C18H17F306S(M+H)的計算值為 419. 07，測量值為 419. 1。d) (5-芐氧某-4'-三氟甲某聯(lián)苯-3-某)_乙酸乙酯 機械攪拌(3-芐氧基-5-三氟甲磺酰氧基-苯基)_乙酸乙酯(108g，0.26mol)、 4_(三氟甲基)苯基硼酸(55.6g，0.29mol))、l，2-二甲氧基乙烷(1. 1L)和Na2C03水 溶液(2M，129mL, 0. 26mol)的混合物，同時在室溫下通入N210min。向此體系中添加 Pd(Ph3)4(480mg，0. 42mmol)并加熱回流(95°C ) 2. 5h。用 EtOAc (0. 5L)稀釋此紅棕色混合 物，并用飽和的NaHCOyjC溶液(3X200mL)和鹽水(2X200mL)進行洗滌。干燥(Na2S04)有機級分，并在真空中濃縮。粗混合物由ISC0柱色譜法進行純化，以獲得(5-芐氧基-4'-三 氟甲基聯(lián)苯-3-基)_乙酸乙酯(107g，100% )。iH-NMI^CDCl》5 1. 26 (t, 3H), 3. 66 (s, 2H), 4. 17 (q, 2H), 5. 12 (s, 2H), 6. 99 (s, 1H)，7. 12 (s, 2H)，7. 34-7. 49 (m, 5H)，7. 67 (s,4H) ；C24H21F303 (M+H)的計算值為 415. 14，測 量值為415. 2。e) 2- (5-芐氧,某-4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯某)-4-甲某~4~戊/I希酸乙酯 在-78°C的溫度下，向化合物Id(4. 9g，11. 8毫摩爾)的THF(50mL)溶液中逐滴加 A Li[N(SiMe3)2] (1N，溶于THF中，14. 2mL, 14. 2毫摩爾)。在_78°C下攪拌反應(yīng)混合物lh， 然后逐滴加入3-溴-2-甲基丙烯(1. 25mL，12. 4毫摩爾)。將此溶液緩慢加熱至_35°C，并 在-35°C下攪拌0. 5h。用NH4C1飽和溶液猝滅反應(yīng)，然后用EtOAc進行萃取。使有機萃取物 干燥(Na2S04)、濃縮，并采用柱色譜法進行純化，獲得透明油狀的化合物le(5. lg,92%),lH NMR (400MHz, CHL0R0F0RM-D) 8 ppm 1. 19-1. 29 (m，3H)，1. 74 (s，3H)，2. 47 (m，1H)，2. 85 (m， 1H), 3. 83 (m, 1H) ,4. 11 (m，2H)，4. 72 (s，1H) ,4. 77 (s, 1H)，5. 12(s，2H)，7. 03 (s, 1H)，7. 10 (s， 1H)，7. 15 (s, 1H)，7. 35-7. 48 (m, 5H)，7. 67 (s,4H) ；C28H27F303 (M+H)的計算值為 469. 19，測 量值為469。f) 2-(5-羥基-4' _三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-4-甲基戊酸乙酯 將化合物 le(5. lg，10.9 毫摩爾)、Pd/C(500mg)于 Et0H(50mL)中的 10%溶液的混 合物在Parr搖動器中在H2(40psi)下氫化20h。所得反應(yīng)混合物用硅藻土進行過濾，濃縮濾 液獲得透明油狀的化合物 If (4. 2g, 100%), 1H NMR(300MHz, CHL0R0F0RM-D) 8 ppm 0. 92 (d, J = 6. 6Hz，6H)，1. 25(m，3H)，1. 49-1. 61 (m, 1H)，1. 65-1. 70 (m, 1H)，1. 95-2. 05 (m, 1H)， 3. 67 (t, J = 7. 7Hz，lH)，4. 10-4. 29 (m，2H)，6. 91 (s，1H)，6. 97 (t, J = 2. 0Hz，lH)，7. 08 (s, 1H)，7. 65(s，4H) ；C21H23F303 (M+H)的計算值為 381. 16，測量值為 381。
g) 2-「5- (3，5- 二氟芐氧,某)-4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯某1 ~4~甲某戊,酸向化合物If (4g，10毫摩爾)的DMF溶液中加入碳酸銫(4. 9g，15毫摩爾)，然后加 入3，5_ 二氟芐基溴。所得溶液在室溫下攪拌18h，然后用水進行猝滅。用EtOAc萃取水溶 液。洗滌、干燥有機層，并蒸發(fā)獲得殘留物(5g)。然后將該粗品溶于IN K0H的Me0H(3當 量)溶液中，在室溫下過夜。用濃HC1酸化該溶液，然后用EtOAc進行萃取。然后用水洗滌 有機層，用Na2S04干燥后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，獲得粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用庚烷研磨，得到 4. 3g(收率91% )的(R)和(S)產(chǎn)物。外消旋的混合物通過Chiralpak AD色譜柱進行手性分離，采用甲醇和含有0. 1 % 甲酸的乙腈作為洗脫液，手性分離后分別獲得(R)對映體(化合物1)和⑶對映體(化合 物2)。測量發(fā)現(xiàn)(R)對映體在MeOH中具有-27. 29度的旋光度，⑶對映體在MeOH中具 有+25. 2度的旋光度。絕對立體化學中心通過與以下所述合成材料的對比進行指定。(R)-2-[5_(3，5- 二氟芐氧基)_4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊酸的手性 合成h) 5-芐氧基-4’ -三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-乙酸 向(5-芐氧基-4'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)_乙酸乙酯(120g，0. 29mol)的 THF(1. 2L)溶液中加入水(240mL)、LiOH. H20(16g，0. 32mol)，將所得混合物在室溫下攪拌 16h。過濾該溶液并在真空中濃縮除去THF。加入2N的HC1水溶液，將所得粘稠液體酸化 至PH2，然后在室溫下機械攪拌此白色懸浮液lh。過濾后，回收潮濕白色產(chǎn)物，然后將其溶 解在EtOAc (500mL)中。將有機層與水分離，干燥(MgS04)并在真空中濃縮，獲得(5-芐氧 基-4，-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-乙酸(105g，94% )。1H-NMR(d6-DMS0) 8 3. 64(s，2H) , 5. 18(s，2H) , 7. 02 (s, 1H) , 7. 24(d，2H)， 7. 34-7. 50 (m, 5H)，7. 81 (d, 2H)，7. 89 (d, 2H)，12. 25 (bs,0. 6H) ；C22H17F303 (M+H)的計算值 為387. 11，測量值為387. 1。i)4_芐基-3-「2_(5-芐氧基-4'-三氟甲基聯(lián)苯基)-乙?；鶉f唑 烷-2-酮 向-78°C下的機械攪拌的(5-芐氧基-4' _三氟甲基聯(lián)苯-3-基)_乙酸(20g， 52mmol)的THF(104mL)溶液中加入N-甲基嗎啉(NMM) (6. 3mL,57mmol)和三甲基乙酰氯 (7. OmL, 57mmol)，并保持內(nèi)部溫度在_70°C以下。在_78°C下攪拌此混合物15分鐘，然后在 0°C下攪拌lh。過濾去除白色固體，獲得濾液中的酸酐，將此濾液冷卻回_78°C。在單獨的 燒瓶中，向-78°C溫度下的(R)-(+)_4-芐基-2-噁唑烷酮(9. 6g,54. 4mmol)的THF(109mL) 溶液中逐滴加入nBuLi(1.6M，溶于己烷中，34mL，54. 4mol)，保持內(nèi)部溫度在-70°C以下， 并在_78°C下攪拌45min。將該金屬化的手性輔劑通過插管導入到_78°C下的酸酐，然后 在1. 5h時間里升溫到0°C。進一步在0°C下攪拌所得混合物30分鐘，通過加入過量的 飽和NH4C1水溶液進行猝滅。用EtOAc (200mL)稀釋該溶液，并采用飽和NaHC03水溶液 (3X100mL)和鹽水(2X100mL)洗滌有機相。用MgS04干燥該溶液，并在真空中除去溶劑。 由ISC0硅膠柱色譜法純化粗料，產(chǎn)出20.3g(72% )白色固體狀的4-芐基-3-[2-(5-芐氧 基-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-乙?；鵠-噁唑烷-2-酮。'H-NMR (CDC13) 6 2. 76 (dd, 1H)，3. 26 (dd, 1H)，4. 19 (m, 2H)，4. 35 (q, 2H)，4. 69 (m, 1H)，5. 13 (s，2H)，7. 04-7. 46 (m, 13H)，7. 67 (s,4H) ；C32H26F3N04 (M+H)的計算值為 546. 18， 測量值為546.3。i) 4-芐基-3-「2- (5-芐氧基-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-4-甲基戊烯 酰1-噁嗶烷-2-酮 向-78°C溫度下的4-芐基-3-[2-(5-芐氧基-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基)-乙 ?；鵠_噁唑烷-2-酮(6.0g，11.00mmOl)于干燥THF(22mL)中的無色溶液逐滴加入六甲 基二硅基氨基鈉(NaHMDS) (1M，THF溶液，12. llmL，12. llmmol)，保持內(nèi)部溫度在_75°C以 下。在-78°C下攪拌所得紅色溶液30分鐘。向此溶液中加入3-溴-2-甲基丙烯(4. 44mL, 44mmol)，保持溫度在-75°C以下。當加成反應(yīng)接近完成時，反應(yīng)混合物將變成綠色。此時，迅 速移去干冰浴，并更換為冰水浴，加成反應(yīng)完成。再在0°C下攪拌反應(yīng)混合物30min，用飽和NH4C1水溶液進行猝滅。用EtOAC(lOOmL)稀釋該體系，使用飽和NaHC03水溶液(3X50mL) 洗滌有機相，并對有機相進行干燥(MgS04)。在真空中除去溶劑，用ISC0硅膠柱對粗混合物 進行純化，獲得4-芐基-3- [2- (5-芐氧基-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯 酰]-噁唑烷-2-酮(6. 3g，95% )01H-NMR(CDC13) 6 1. 80(s，3H) ,2. 46 (dd, 1H) , 2. 75 (dd, 1H) , 3. 05 (dd, 1H)， 3. 32 (dd, 1H)，4. 08(m，2H)，4. 59 (m, 1H)，4. 80(d，2H)，5. 13(s，2H)，5. 48 (dd, 1H)，7. 11 (d, 2H)，7. 21-7. 49(m，11H)，7. 67(s，4H) ；C36H32F3N04(M+H)的計算值為 600.23，測量值為 600. 3。k) 4-芐基-3-「2- (5-羥基-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯基)~4~甲基戊酰基1 -噁唑 烷-2-酮 向4-芐基-3-[2-(5_芐氧基-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基)_4_甲基_4_戊烯 酰]-噁唑烷-2-酮(6. 7g, 11. 2mmol)的 Me0H(150mL)溶液中加入 10% Pd/C (670mg, 10 重 量％)。此黑色懸浮液在45-45psi壓力下氫化過夜。使用硅藻土過濾該混合物，并在真空 中除去溶劑，獲得相對較純的4-芐基-3-[2-(5-羥基-4'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)_4_甲 基戊?；鵠-噁唑烷-2-酮(5. 4g，93% ) 1H-NMR(CDC13) 6 0. 94(d，3H)，0. 98(d，3H)，1. 54 (m, 1H)，1. 74 (m, 1H) ,2. 12 (m, 1H)，2. 79 (dd, 1H)，3. 36 (dd, 1H)，4. 11 (m，2H)，4. 62 (m, 1H)，5. 25(t, 1H)，6. 97 (m, 2H)， 7. 21-7. 37(m，6H)，7. 67(s，4H) ；C29H28F3N04 (M+H)的計算值為 512. 20，測量值為 512. 3。1) 4-芐基-3- {2-「5- (3, 5- 二氟芐氧基)_4‘-三氟甲基聯(lián)苯基1 ~4~甲基戊 ?；?噁唑烷-2-酮 在5分鐘內(nèi)，向0 °C下的4-芐基-3-[2_(5-羥基-三氟甲基聯(lián) 苯-3-基)-4_甲基戊?；鵠_噁唑烷-2-酮(18. 77g，36. 73mmol)的乙腈(184mL)溶液中分批加入 1-溴甲基-3，5-二氟代苯(7.13mL，55. lOmmol)和 Cs2C03 (23 . 94g，73. 46mmol)。在 室溫下攪拌所得白色懸浮液2h。過濾去除白色固體，并在真空中除去溶劑，獲得相對較純的 4-芐基-3- {2- [5- (3，5- 二氟芐氧基)-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]-4-甲基戊?；鶀-噁 唑烷-2-酮。m) 2-「5-(3, 5-二氟芐氧基)-4' _三氟甲基聯(lián)苯基1 甲基戊酸 向4-芐基-3-{2-[5-(3，5-二氟芐氧基)-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊 ?；鶀_噁唑烷-2-酮(23. 40g，36. 73mmol)的THF(180mL)溶液中加入水(60mL)。將此體系 冷卻至0°C。向此冷卻溶液中逐滴加入LiOH. H20(1. 54g, 36. 73mmol)和30% H202 (16. 65mL, 146. 92mmol)，保持內(nèi)部溫度在5°C以下。在0°C下，攪拌所得渾濁溶液20min。加入1. 5M的 Na2S03水溶液(97. 9mL, 146. 92mmol)猝滅過量的H202，然后在室溫下攪拌15min。在真空中 去除有機溶劑。加入1N的HC1水溶液，將所得液體酸化至pH2。用Et0Ac(3X200mL)萃取 水層，通過MgS04干燥，并在真空中濃縮，獲得粗混合物，該粗混合物由ISC0硅膠柱色譜法 進行純化，產(chǎn)得(R)-2_[5-(3，5-二氟芐氧基)-4' _三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊酸 (12. 25g,70% )。1H-NMR(CDC13) 6 0. 93 (d, 6H)，1. 51 (m, 1H)，1. 72 (m, 1H)，1. 98 (m, 1H)，3. 72 (t, 1H)，5. 09(s，2H)，6. 76 (m, 1H)，6. 98(m，3H)，7. 07 (t, 1H)，7. 17 (s, 1H)，7. 66(m，4H)； C26H23F503 (M+H)的計算值為 479. 45，測量值為 479. 2。實例2(S) -2-「5- (3，5- 二氟芐氧,某)_4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯_3_某1 ~4~甲某戊,酸 a) 4-芐基-3-「2_ (5~羥基_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯基)~4~甲基戊?；? -噁唑 烷-2-酮 標題化合物由4-芐基-3-[2_(5-芐氧基-4'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基)-4-甲 基-4-戊烯酰]-噁唑烷-2-酮按照與實例1中(k)部分相同的合成工藝制備而得。0. 941H-NMR(CDC13) 6 0. 94(d,3H) ,0. 98(d，3H)，1. 54 (m, 1H)，1. 74 (m, 1H) ,2. 12 (m, 1H)，2. 79 (dd, 1H)，3. 36 (dd, 1H)，4. 11 (m，2H)，4. 62 (m, 1H)，5. 25(t, 1H)，6. 97 (m, 2H)， 7. 21-7. 37(m，6H)，7. 67(s，4H) ；C29H28F3N04 (M+H)的計算值為 512. 20，測量值為 512. 3。b) 4-芐基-3- {2-「5- (3, 5- 二氟芐氧基)_4‘-三氟甲基聯(lián)苯基1 ~4~甲基戊 酰基丨-噁唑烷-2-酮 向室溫下的4-芐基-3-[2-(5-羥基-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基)_4_甲基戊酰 基]-噁唑烷-2-酮(0.400g，0. 78mmol)的乙腈(3mL)溶液中加入1_溴甲基_3，5-二氟 代苯(0. 243g，1. 17mmol)和 Cs2C03(0 . 508g, 1. 56mmol)。攪拌所得白色懸浮液 lh。過濾 去除白色固體，并在真空中除去溶劑，獲得相對較純的4-芐基-3-{2-[5-(3，5- 二氟芐氧 基)-4'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊?；鶀_噁唑烷-2-酮。c) 2-「5- (3，5- 二氟芐氧,某)_4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯某1 ~4~甲某戊,酸 向4-芐基-3-{2-[5-(3，5-二氟芐氧基)-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]_4_甲基戊?；鶀_噁唑烷-2-酮(0. 425g,0. 67mmol)的THF(IOmL)溶液中加入水(3. 5mL)。將該體 系冷卻至0°C。向此冷卻溶液中逐滴加入LiOH. H2O (0. 028g，0. 67mmol)和30% H202(304mL, 2. 68mmol)，保持內(nèi)部溫度在5°C以下。在0°C下，攪拌所得渾濁溶液20min。加入1. 5M的 Na2SO3水溶液(1.79mL，2.68mm0l)猝滅過量的H2O2，然后在室溫下攪拌5min。在真空中中 去除有機溶劑。加入IN的HCl水溶液，將所得液體酸化至pH2。用EtOAc (3 X 25mL)萃取水 層，并將其干燥(MgS04)。在真空中濃縮該混合物以獲得粗混合物，該粗混合物由ISCO硅膠 柱色譜法進行純化，產(chǎn)得(S)-2-[5-(3，5-二氟芐氧基)-4'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲 基戊酸(0. 295g,92% )。1H-NMR(CDCl3) δ 0. 93 (d, 6H)，1. 51 (m, 1H)，1. 72 (m, 1H)，1. 98 (m, 1H)，3. 72 (t, 1H)，5. 09(s，2H)，6. 76 (m, 1H)，6. 98(m，3H)，7· 07 (t, 1H)，7. 17 (s, 1H)，7. 66(m，4H)； C26H23F503 (M+H)的計算值為 479. 45，測量值為 479. 2。實例3(R) -2- Γ5- (4-氟三氟甲某芐氧,某)_4 ‘-三氟甲某聯(lián)苯某1 甲某戊, a)4-芐基-3-{2-「5_(4-氟_2_三氟甲基芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián) ^ -3-某1-4-甲某戊,酰某1-噁P半烷-2-酮向4-芐基-3-[2-(5-羥基-4'-三氟甲基聯(lián)苯_3_基)_4_甲基戊酰基]-噁唑 烷-2-酮(如實例1的(k)步驟中所制備)(0. 400g,0. 78mmol)的乙腈(3. 9mL)溶液中加 入 1-溴甲基-4-氟-2-三氟甲基苯(0. 181mL，l. 17mmol)和 Cs2CO3 (0. 508g，1. 56mmol)。在 室溫下攪拌所得白色懸浮液Ih。過濾去除白色固體，并在真空中除去溶劑，獲得相對較純的 4-芐基-3- {2- [5- (4-氟-2-三氟甲基芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯_3_基]-4-甲基戊酰 基}_噁唑烷-2-酮。
b)2-「5_(4-氟-2-三氟甲基芐氧基-三氟甲基聯(lián)苯基1_4_甲基戊酸 向4-芐基-3-{2-[5-(4_氟_2_三氟甲基芐氧基)_4'-三氟甲基聯(lián) 苯-3-基]-4-甲基戊?；鶀_噁唑烷-2-酮(0. 535g,0. 78mmol)的THF(9mL)溶液中加入 水(3mL)。將此體系冷卻至0°C。向此冷卻溶液中加入LiOH. H2O(33mg，0.78mmol)和30% H2O2 (0. 354mL，3. 12mmol)，并在 O °C 下攪拌 20min。加入 1. 5M 的 Na2SO3 水溶液(2. 08mL, 3. 12mmol)猝滅過量的H2O2，然后在室溫下攪拌5min。在真空中去除有機溶劑。加入IN的 HCl水溶液，將所得液體酸化至pH2。用Et0Ac(3X50mL)萃取水層，并將其干燥(MgSO4)。 在真空中濃縮此混合物以獲得粗混合物，該粗混合物由ISCO硅膠柱色譜法進行純化，產(chǎn)得 (R) -2- [5- (4-氟-2-三氟甲基芐氧基)-4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]_4_甲基戊酸(3 IOmg)。1H-NMR(CDCl3) δ 0. 92(d，6H)，1. 52 (m, 1H)，1. 71 (m, 1H)，1. 99 (m, 1H) ,3. 73 (t， 1H)，5· 27(s，2H)，6· 98 (bs, 1Η)，7· 06 (bs，1Η)，7· 17 (bs，1Η)，7· 29 (m, 1Η)，7· 42 (m, 1Η)， 7. 68(m，5H) ；C27H23F703 (M+H)的計算值為 529. 46，測量值為 529.2。實例 42-「4'-氯-5-(3, 5-二氟-2-芐氧基)-3' _三氟甲基聯(lián)苯基1 甲基戊 a) 2- (3,5-雙芐氧,某苯某)甲某_4_戊,烯酸甲酯
在-78 °C下，在氮氣氛中，在12min內(nèi)，向LDA于THF-庚烷-乙苯(21. 5mL， 43. Ommol)中的2M溶液中逐滴加入攪拌下的(3，5-雙芐氧基苯基)乙酸甲酯(已在實例 1的步驟(a)中制備)(13.0g，35.9mmOl)于THF(80mL)中的溶液。將溫度保持在_7(TC以 下再持續(xù)50min，然后一次加入3-溴-2-甲基丙烯(4. OmL, 39. 7mmol)，并將反應(yīng)混合物升 溫至0°C。2h后，在真空中濃縮該混合物，用飽和的NH4Cl水溶液(IOOmL)進行稀釋，并用 EtOAc(IOOmL)萃取。用鹽水(IOOmL)洗滌有機層，并將其干燥(MgSO4)，在真空中濃縮，然 后采用快速色譜法(二氧化硅，0-10% EtOAc的石油醚溶液)進行純化，得到黃色油狀的標 題產(chǎn)物(14. Ig,94% ) ο1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 7. 42—7. 25 (m，10H)，6. 58 (s，2H)，6. 52 (s，1H)，5. 02 (s， 4H)，4. 74 (s，1H)，4. 66 (s, 1H)，3. 74 (t, 1H)，3. 64 (s,3H)，2. 79 (dd, 1H)，2. 38 (dd, 1H)， 1. 70(s，3H)。b) 2- (3-芐氧基-5-羥基苯基)-4-甲基戊酸乙酯 在N2 下，向中間體 4a(20g,48mmol)、NaOH(2. 3g,57mmol)于 Et0H(500mL)中的混 合物加入0. 5g Pd-C(10 %擔載在活性炭上)，使該混合物在40psi壓力下氫化30min，此 時LC/MS指示原料已消耗完。濾出催化劑并蒸發(fā)EtOH。通過柱色譜法(0-40%Et0Ac/庚 烷)得到了 11. 8g(收率75%)的無色油狀物，為甲酯和乙酯以及未還原雙鍵酯的混合物。 MH+341(具有未還原雙鍵的乙酯)；343 (具有還原的異丙基支鏈的乙酯)；327 (具有未還原 雙鍵的甲酯)。
將乙酯(與甲酯混合)4b(5g，15mmol)、K2C03(4.lg，30mmol)和 3，5_ 二氟芐基溴 (2. 9mL,22mmol)于DMF(70mL)中的溶液加熱至80°C，保持一小時。由真空除去DMF，所得粗 產(chǎn)物由柱色譜法(0-30% EtOAc/庚烷)進行純化，獲得4. 5g產(chǎn)物(收率66% )。MH+453. 1 和其他分子離子(甲酯以及相應(yīng)的烯烴)。d) 2-Γ3- (3,5- 二氟芐氧,某)_5_三氟甲磺酰氧,某-苯某1 ~4~甲某戊,酸乙酯 在隊下，向中間體4c(4.5g，IOmmol)的MeOH(IOOmL)溶液中加入0. 45g Pd-C(10% 擔載在活性炭上)，使該混合物在20psi的壓力下進行氫化2小時。濾出催化劑，并蒸發(fā) 掉MeOH。通過柱色譜法(0-50% EtOAc/庚烷)得到了 3. Og無色油狀的苯酚，將其溶解于 50mL的DCM中，并冷卻至0°C。加入吡啶(2mL，40mmol)和三氟甲磺酸酐(2mL，12mmol)。在 0°C下攪拌此溶液一小時，然后將其倒入IN HCl溶液中(20mL)，用DCM(200mL)萃取，并用 NaHC03/NaCl水溶液洗滌。將DCM層用Mg2SO4干燥并蒸發(fā)，獲得4. Og黃色油狀物(兩個步 驟收率 78% )。MH+511. 2Θ)2-「4'-氯-5-(3, 5-二氟芐氧基)-3' _三氟甲基聯(lián)苯基1 甲基戊酸 乙酯 將3-CF3-4-Cl-苯硼酸(3. 6g，16mmol)、三氟甲磺酸鹽 4d(4g，7. 8mmol)、 (PPh3)4Pd(0. 5g，0. 4mmol) ,K2CO3 (2. 2g, 16mmol)溶于甲苯 /Et0H/H20(20/10/5mL)中制成溶 液，將此溶液置于密封的反應(yīng)管中，并加熱至80°C，保持一小時。加入EtOAc (200mL)并用鹽水洗滌。將EtOAc層用Mg2SO4干燥并蒸發(fā)。使用柱色譜法(0-20% /EtOAc/己烷)獲得 3. 05g 無色油狀物(74% )。1^541. 3f)2_「4'-氯-5-(3, 5-二氟-2-芐氧基)-3' _三氟甲基聯(lián)苯基1 甲基 戊酸將中間體4e(3g，5. 5mmol)、1N NaOH(16mL)溶于 THF/Me0H(50/50mL)中制成溶液， 在室溫下攪拌此溶液一天。濃縮該溶液，然后加入EtOAc (500mL)。用IN HCl和鹽水洗滌之 后，將EtOAc層用Mg2SO4干燥并蒸發(fā)。通過柱色譜法(0-30% /EtOAc/己烷)獲得2. 7g白 色固體(71%)。隨后將此固體溶解于EtOAc (IOOmL)中，并加入到INNaOH(5. 26mL，5mmol) 中，在室溫下攪拌lOmin。然后真空除去溶劑，獲得鈉鹽形式的化合物。MH+513.2(弱峰)。 1H NMR(300MHz, CD3OD) δ 0. 94(d，6H，J = 6. 51Hz)，δ 1. 5-1. 67 (m, 2H)，δ 1. 9_2· 0 (m，1Η)， δ 3. 67 (t, 1H, J = 7. 85Hz), δ 5. 2(s ,2H), δ 6· 89 (m，1Η)，δ 7. 1 (m, 4Η), δ 7. 27 (s, 1Η), δ 7. 68 (d, 1Η, J = 8. 42Ηζ)，δ 7. 85 (m, 1Η)，δ 7. 97 (d, 1Η, J = 2. OHz)。本發(fā)明化合物對環(huán)加氧IlDMiS-2 (Cox-KCoX-2)的作用的測丨定。采用Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA.)提供的環(huán)加氧酶抑制劑比 色篩選分析法(商品目錄號760111)，按照制造商說明書測定對Cox-I和Cox-2的抑制作 用。本發(fā)明的實例1在100 μ M下顯示出< 50%的抑制作用。本發(fā)明化合物的Y-分泌酶調(diào)節(jié)活件的篩詵采用生長于DMEM/NUT-mix F12 (HAM)中的攜帶有野生型APP695的SKNBE2細胞實 施篩選，其中DMEM/NUT-mix Fl2 (HAM)由Gibco提供(商品目錄號31330-38)，其含有5% 血清/Fe，補充有的非必需氨基酸。細胞生長至接近鋪滿狀態(tài)。采用如Citronet al (1997)Nature Medicine 3 :67 (Citron等人，自然醫(yī)學雜志， 1997年，第3卷第67頁)中所描述的測定法進行篩選。 比較起來， (其特征既沒有選定的R1值和R2值，也沒有仲丁基)在上述WTAPP細胞測定中顯 示出 2. 5μΜ 的 IC500體內(nèi)效能的證明本發(fā)明的Αβ42降低劑可以用于治療哺乳動物(例如人類)的AD，或者在動物模 型(例如(但不限于)小鼠、大鼠或豚鼠)中顯示效能。該哺乳動物可能沒有診斷出患有 AD，或可能不具有AD的遺傳傾向，但是可以進行轉(zhuǎn)基因，使得其以類似于患有AD的人類所表現(xiàn)出的方式過度生產(chǎn)并最終沉積Aβ?？梢酝ㄟ^使用任何標準方法，將Αβ 42降低劑以任何標準形式給予。例如(但不 限于)，Αβ42降低劑可以采用以口服或注射方式給予的液體、片劑或膠囊劑等劑型。Αβ42 降低劑可以采用足以使血液、血漿、血清、腦脊髓液(CSF)或大腦中Αβ 42含量顯著降低的 任何劑量進行給予。為確定A β 42降低的急性給予是否會降低體內(nèi)的A β 42含量，采用了非轉(zhuǎn)基因的 嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)?；蛘?，可以使用兩到三個月大的Tg2576小鼠，此小鼠表達含 有“Swedish”變體的 APP695，或者使用由 Fred Van Leuven 博士(K. U. Leuven，比利時)及 其同事建立的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，此模型具有人類淀粉樣前體蛋白的臨床突變型[V717I]的 神經(jīng)元特異性表達(Moechars et al.，1999J. Biol. Chem. 274，6483 (Moechars 等人，生物化 學雜志，1999年，第274卷第6483頁))。幼齡轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中具有高含量的Aβ，但沒 有可檢測的Αβ沉積。在大約6-8月齡時，轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦中開始呈現(xiàn)出自發(fā)的、進行性 β-淀粉樣(Αβ)累積，最終在下托區(qū)、海馬體和皮質(zhì)中生成淀粉樣斑塊。將對用Αβ 42降 低劑治療的動物進行檢查，并與未治療的動物或使用介質(zhì)治療的動物進行比較，采用標準 技術(shù)(例如，使用ELISA法)對大腦中可溶性A β 42和總A β的含量進行定量。治療周期 可以從幾小時到幾天不等，一旦可以確立開始起作用的時間進程，將根據(jù)Αβ 42降低的結(jié) 果調(diào)整治療周期。文中顯示了體內(nèi)測定Αβ 42降低的典型方案，但這僅是可以用于優(yōu)化可檢測的 Αβ的含量的多種變型中的一種。例如，將游離酸或鈉鹽形式的降Αβ42的化合物配制于 5% solutol水溶液，或20%的羥丙基β環(huán)糊精。在(例如)處死動物(由經(jīng)驗確定 )進 行分析前三到四小時，將Αβ 42降低劑作為單一 口服劑量給予或者通過任何可接受的給藥 途徑給予，或作為另外一種選擇，可以在數(shù)天的療程中給藥，并在給予最終劑量三到四小時 后處死動物。用氯胺酮(克他命)、隆朋(安耐寧2% )和阿托品的混合物(2:1:1)麻醉小 鼠，并使用生理血清在4°C經(jīng)心臟灌注。在處死時收集血液。在麻醉期間用EDTA處理過的 收集管通過心穿刺術(shù)進行血液收集。使血液在4°C、4000g條件下離心5分鐘，回收血漿，然 后將其快速凍結(jié)，用于后續(xù)分析。將大腦從腦殼中取出，并在冠/額狀面上剖切分離前腦和 后腦。取出小腦并保留用于試驗化合物含量的定量分析。通過正中矢狀面剖切將前腦均勻 地分成左半球和右半球。立即將兩個半球浸入液氮中并在-70°C保存，直到均化用于生物化學檢測分析。將小鼠大腦重懸于10體積的含蛋白酶抑制劑(Roche-11948699)的0. 4% DEA (二 乙胺)/50mM NaCl pHIO (用于非轉(zhuǎn)基因動物)中或0. 1 % CHAPS的TBS溶液(用于轉(zhuǎn)基因 動物)中，其中所述體積按組織克數(shù)計算，例如對于0. 158g大腦而言，加入1. 58ml的0. 4% DEA。所有樣品在冰上以30%的功率輸出超聲處理30秒鐘。使勻漿在355，000Xg下離心 30min。隨后將所得高速上清液轉(zhuǎn)移至新管中，用于后續(xù)的純化或立即進行檢測分析。所得上清液用Water Oasis HLB 反相柱(Waters Corp. (Milford，ΜΑ))進行純 化，以便在后續(xù)的Αβ檢測前，將非特異免疫反應(yīng)性物質(zhì)從大腦溶解物中去除。采用真空 歧管使所有溶液以每分鐘大約ImL的速度通過柱，因此在整個過程中真空壓應(yīng)相應(yīng)地進 行調(diào)節(jié)。用ImL的100% MeOH對柱進行預(yù)調(diào)理，然后用ImLWH2O進行平衡。將非中和的大腦溶解物加載到柱上。然后使用lmL的5% MeOH對加載的樣品進行兩次第一沖洗， 再用lmL的30% MeOH進行第二沖洗。最后，用90% MeOH與2% NH40H相配的溶液將A3 從柱上洗脫到100X30mm的玻璃管中。然后將洗脫液轉(zhuǎn)移至1. 5mL管中，并在加速真空 濃縮器(speed-vacconcentrator)中以高溫濃縮約2小時。然后將濃縮的A0重懸于 UltraCULTURE通用無血清培養(yǎng)基(Cambrex Corp. (ffalkersville, MD))中，培養(yǎng)基中有根 據(jù)制造商的建議加入的蛋白酶抑制劑。使用商購的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Irmotest ^ -淀粉樣肽(1_42) (Innotest ^ -Amyloid(1_42))，Innogenetics N. V. (Ghent, Belgium 比利時))，對大腦 勻漿的可溶部分中A0 42的數(shù)量進行定量。基本上根據(jù)制造商的方案進行A0 42ELISA。 簡單地說，在隨試劑盒一起提供的96-孔聚丙烯預(yù)涂布板(Nunc-Immuno MaxiSorp, A/S Nunc (Denmark丹麥))上制備標準品(合成A0 1-42的稀釋液)和樣品。最終濃度為1000、 500、250、125、62. 5,31. 3和15. 6pg/ml的標準品稀釋液以及樣品在樣品稀釋劑(隨ELISA 試劑盒一起提供)中制備，最終體積為60 yl。將樣品、標準品和空白(50 yl)加入到抗 A3 42涂布板上(捕捉抗體能選擇性識別抗原的C端)?？墒拱逶?°C中溫育過夜，以便形成 抗體_淀粉樣肽復合體。在此溫育步驟和后續(xù)的洗滌步驟之后，加入選擇性抗A 3抗體綴合 物(生物素?；臋z測抗體，例如生物素?；?G8(Covance ResearchProducts (Dedham, MA)))并溫育最少1小時，以使得形成抗體-淀粉樣肽_抗體復合物。在溫育步驟和適當?shù)?洗滌步驟之后，加入鏈霉親和素_過氧化物酶綴合物，30分鐘后加入TMB/過氧化物混合物， 使得底物轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物。加入硫酸(1M)終止該反應(yīng)，然后使用帶有450nm濾光片的酶標 儀(ELISA-reader)通過光度測定法測定顏色強度。通過將吸光度與用合成的A0 1_42所作 標準曲線進行對比，對樣品中A0的含量進行定量?；蛘?，可以根據(jù)制造商說明書(Pierce Corp. (Rockford，II))，使用PierceQuantBlu過氧化物酶熒光底物和檢測試劑(Pierce QuantBlu FluorogenicPeroxidase Substrate and Detection reagents)進行檢測。與未治療的動物相比，在此類模型中A0 42降低至少20%將是有利的。體內(nèi)數(shù)據(jù)在第4小時時間點口服30mg/kg
34 比較起來， 需要服用100mg/kg(每日2次)的劑量，才能將小鼠體內(nèi)的A 3 42血漿含量降低 40%。雖然上述說明書以提供實例用于說明目的方式教示了本發(fā)明的原理，但應(yīng)當理解 本發(fā)明的實施涵蓋了落入如下權(quán)利要求和它們的等同物范圍內(nèi)的所有常見變型形式、修改和/或修飾形式。 在上述說明書中所公開的所有出版物據(jù)此以引用方式全文并入本文。
權(quán)利要求
式I的化合物(式I)其中R1為F、Cl或CF3；R2為F、Cl或CF3；R3為F、Cl或CF3；R4為H、F、Cl或CF3；及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。FPA00001138920900011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中 R1 為F;R3 為 CF3 ；及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其選自由以下化合物組成的組(R) -2- [5- (3，5- 二氟芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊酸、 (S) -2- [5- (3，5- 二氟芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊酸、 2- [5- (4-氟-2-三氟甲基芐氧基)_4 ‘-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊酸、 2-[4'-氯-5-(3，5-二氟芐氧基)-3'-三氟甲基聯(lián)苯-3-基]-4-甲基戊酸、 及其溶劑化物、水合物、酯和可藥用的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物，其用作藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物用于制備調(diào)節(jié)分泌酶的藥物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物用于制備治療與A042產(chǎn)生量提高相 關(guān)的疾病的藥物的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物用于制備治療阿爾茨海默病的藥物的 用途。
8.藥物組合物，其包含與惰性載體相混合的根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化 合物。
9.制備藥物的方法，其包括以下步驟a)制備根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物；以及b)配制包含所述化合物的藥物。
10.治療哺乳動物以調(diào)節(jié)分泌酶的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利 要求1至3中任何一項所述的化合物給予所述哺乳動物。
11.治療哺乳動物中與A042產(chǎn)生量提高相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括將治療有 效量的根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的化合物給予所述哺乳動物。
12.治療哺乳動物中阿爾茨海默病的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要 求1至3中任何一項所述的化合物給予所述哺乳動物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其為基本上純的堿。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其為分離的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及由通式(I)表示的化合物和/或它們的鹽或酯，其中R1、R2、R3和R4的定義在說明書中給出。此外，本發(fā)明涉及所述化合物用于治療阿爾茨海默病的用途，以及用于調(diào)節(jié)g-分泌酶活性的用途。
文檔編號A61K31/192GK101861297SQ200880116649
公開日2010年10月13日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者C·Y·候 申請人:詹森藥業(yè)有限公司