專利名稱：舞茸提取物以及含有其的用于促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)產(chǎn)生的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及舞茸提取物以及含有其的用于促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)產(chǎn)生的組合 物。
背景技術(shù)：
作為舞茸的乙醇提取物，迄今為止已知有酪氨酸酶抑制效果、a-淀粉酶抑制效 果、潤膚效果、抑制免疫下降效果(專利文獻(xiàn)1 3)。本發(fā)明者對(duì)干燥舞茸子實(shí)體的純乙醇提取物在人以及倉鼠皮脂腺顯示起因于皮 質(zhì)生物合成促進(jìn)而引起的皮質(zhì)產(chǎn)生 分泌促進(jìn)作用、以及對(duì)干皮癥患者具有皮膚病態(tài)的臨 床改善效果提出了專利申請(qǐng)。即，對(duì)如下內(nèi)容提出了專利申請(qǐng)干燥舞茸子實(shí)體的純乙醇提 取物由于促進(jìn)皮脂產(chǎn)生而改善皮膚屏障功能，不僅對(duì)日常的護(hù)膚有效，而且對(duì)疾病預(yù)防 治 療也有效。另一方面，對(duì)于皮膚的抗衰老而言，皮膚結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)即膠原蛋白、賦予肌膚柔軟性 和彈性的彈性蛋白以及擔(dān)負(fù)肌膚的保濕功能的透明質(zhì)酸等的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)關(guān)聯(lián)分子 的生物合成調(diào)節(jié)很重要(非專利文獻(xiàn)1)。進(jìn)而，眾所周知，這些細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)關(guān)聯(lián)分子 的主要產(chǎn)生細(xì)胞是存在于皮膚真皮的纖維芽細(xì)胞。但是，關(guān)于干燥舞茸子實(shí)體的純乙醇提取物對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)關(guān)聯(lián)分子的表達(dá) 調(diào)節(jié)，迄今為止全然不知。為此，在正常人皮膚纖維芽細(xì)胞中，在基因水平上對(duì)干燥舞茸子 實(shí)體的純乙醇提取物調(diào)節(jié)膠原蛋白、彈性蛋白以及透明質(zhì)酸的產(chǎn)生進(jìn)行了分析，結(jié)果令人 驚奇地發(fā)現(xiàn)干燥舞茸子實(shí)體的純乙醇提取物會(huì)促進(jìn)透明質(zhì)酸合成酶的表達(dá)，即促進(jìn)透明 質(zhì)酸(玻尿酸)的產(chǎn)生。專利文獻(xiàn)1 日本特開平2-121905號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開2000-319192號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開平11-263732號(hào)公報(bào)__ t 禾[I 文■ 1 :Baumarm L. Skin ageing and its treatment. J. Pathol. 211 241-251，200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供更有效地促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)的產(chǎn)生的舞茸提取物以及含有它的 組合物。本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干燥舞茸的純乙醇提取 物(來自舞茸的乙醇提取物)具有優(yōu)異的促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生的效果，最終完成了本發(fā)明。8口，本發(fā)明如下所述。(1)用純乙醇提取干燥舞茸而得到的舞茸提取物。(2)根據(jù)⑴所述的舞茸提取物，其中，干燥舞茸的含水量為8重量％以下。
(3)根據(jù)(1)或⑵所述的舞茸提取物，其中，純乙醇含有99.0容量％以上的乙(4)促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生的組合物，其含有(1) (3)中任一項(xiàng)所述的舞茸提取物。(5)根據(jù)(4)所述的組合物，其為化妝品形態(tài)。(6)根據(jù)(4)所述的組合物，其為醫(yī)藥品形態(tài)。(7) Rf值滿足1. 0彡Rf值> 0. 45和/或0. 07 > Rf值彡0的透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn) 洗脫物的制造方法，其包括(a)將上述(1)所述的舞茸提取物在氯仿-甲醇(19 1)中 溶解；(b)將上述舞茸提取物的溶解液添加到用氯仿-甲醇(19 1)平衡后的正相硅膠柱 中；(c)按氯仿-甲醇(19 1)、氯仿-甲醇(9 1)、氯仿-甲醇(4 1)、甲醇的順序依 次洗脫；(d)用薄層硅膠將洗脫物的一部分用氯仿-甲醇(9 1)展開；以及(e)得到Rf 值為1. 0彡Rf值> 0. 45和/或0. 07 > Rf值彡0的洗脫物。(8)用上述(7)所述的制造方法得到的Rf值為1. 0彡Rf值> 0. 45和/或0. 07 > Rf值彡0的透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)洗脫物。本發(fā)明能有效地促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)的產(chǎn)生，因此能有效地改善伴隨著透明 質(zhì)酸(玻尿酸)的減少而產(chǎn)生的皮膚的損傷 異常及疾病、伴隨著透明質(zhì)酸(玻尿酸)的 減少而產(chǎn)生的關(guān)節(jié)的損傷 異常及疾病、伴隨著透明質(zhì)酸(玻尿酸)的減少而產(chǎn)生的眼睛 的損傷 異常及眼疾病。
圖1所示為在人皮膚纖維芽細(xì)胞中舞茸提取物促進(jìn)透明質(zhì)酸合成酶(HAS)的基因 表達(dá)。* 對(duì)未處理組(p < 0. 05)。圖2所示為在人皮膚纖維芽細(xì)胞中舞茸提取物對(duì)I型膠原蛋白a lmRNA表達(dá)的作 用。對(duì)未處理組(P < 0. 001)。圖3所示為舞茸提取物對(duì)人皮膚纖維芽細(xì)胞的彈性蛋白mRNA表達(dá)的作用。* 對(duì) 未處理組(p < 0. 05)。圖4所示為舞茸提取物對(duì)人皮膚纖維芽細(xì)胞的透明質(zhì)酸(HA)產(chǎn)生的促進(jìn)作用。 4MU(4-甲基傘形酮、HAS抑制劑)。*和** 對(duì)未處理組(p < 0. 05和0. 01)。##和### 對(duì)舞茸提取物(100 u g/ml)處理組(p < 0. 01和0. 001)。圖5所示為舞茸提取物的組分成分(Ml M5)對(duì)人皮膚纖維芽細(xì)胞的透明質(zhì)酸 (HA)產(chǎn)生的促進(jìn)作用。IL-l(interleukin U10ng/ml)。*和** 對(duì)未處理組(p < 0. 05和 0. 01)。圖6所示為舞茸提取物及其組分成分對(duì)人皮膚纖維芽細(xì)胞中的proMMP-1及 TIMP-2基因表達(dá)的作用。用舞茸提取物及其組分成分(M1-M5) (n = 1/處理)將人纖維芽 細(xì)胞處理24小時(shí)。對(duì)回收得到的細(xì)胞中的proMMP-1 (A)以及TIMP_2mRNA表達(dá)(B)進(jìn)行 定量。舞茸提取物促進(jìn)proMMP-lmRNA表達(dá)，但抑制TIMP-2基因表達(dá)。M5對(duì)proMMP-1以 及TIMP-2mRNA表達(dá)幾乎沒有影響。另一方面，M2和M3促進(jìn)proMMP-1基因表達(dá)，Ml抑制 TIMP-2 基因表達(dá)。此外，interleukin la (IL-1) (10ng/ml)促進(jìn) proMMP-lmRNA 表達(dá)，但對(duì) TIMP-2基因表達(dá)沒有影響。圖7所示為舞茸提取物對(duì)人皮膚纖維芽細(xì)胞中的pro MMP-1 (A)以及TIMP-2⑶的產(chǎn)生的促進(jìn)作用。IL-l(interleukin l、10ng/ml)。*和** 對(duì)未處理組(p < 0. 05和 0. 01)。圖8對(duì)將人纖維芽細(xì)胞用舞茸提取物M5組分成分(M5-1-M5-8) (n = 1/處理)處 理24小時(shí)得到的細(xì)胞中的培養(yǎng)液中透明質(zhì)酸量進(jìn)行定量。在M5-3 M5-8中，觀察到透明 質(zhì)酸量的增加。IL-l(interleukin l、10ng/ml)。圖9是用含舞茸提取物的膏劑治療的受試者5的治療前后的皮膚的照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用純乙醇提取干燥舞茸而得到的舞茸提取物。本發(fā)明的舞茸是指多孔菌科樹花菌屬(polyporaceae Grifola)的菌，可以例示舞 茸(Grifola frondosa)、白舞茸(Grifola albicans)、豬苓(Grifolaumbellatus)、亞舞茸 (Grifola gigantean)等。本發(fā)明的舞茸優(yōu)選為Grifolafrondosa。舞茸可以是子實(shí)體和 菌絲體的任一種，但優(yōu)選子實(shí)體。提取原料的干燥舞茸是指具有10重量％以下的含水量的舞茸。干燥舞茸具有優(yōu) 選為8重量％以下、更優(yōu)選為7重量％以下的含水量。干燥舞茸可以采用任意方法(例如 日光干燥、加熱干燥、真空干燥、冷凍干燥等)將生舞茸進(jìn)行脫水 干燥來得到。干燥舞茸 優(yōu)選為粉末形態(tài)。本發(fā)明的純乙醇是指在15°C下含有98. 0容量％以上乙醇的乙醇。純乙醇含有優(yōu) 選為99. 0容量％以上、更優(yōu)選為99. 5容量％以上的乙醇。關(guān)于干燥舞茸利用純乙醇進(jìn)行的提取，通過在作為原料的干燥舞茸中添加純乙醇 后，再在常溫下或加熱下攪拌一定時(shí)間來進(jìn)行。加熱溫度通常為乙醇的沸點(diǎn)以下的溫度，但 在密閉容器中也可以為120°C以下的溫度。優(yōu)選的提取溫度為常溫(室溫)。提取時(shí)間沒 有特殊限制，例如為5分 10小時(shí)左右。提取可以進(jìn)行1次或2次以上。關(guān)于提取中相對(duì)于干燥舞茸的純乙醇的用量，相對(duì)于干燥舞茸100重量份，純乙 醇為100 1000重量份，優(yōu)選為200 600重量份，更優(yōu)選為300 500重量份。提取處理后，可以通過利用濾紙或?yàn)V布的過濾或離心分離等分離方法得到純乙醇 提取液。本發(fā)明的舞茸的純乙醇提取物可以是上述乙醇提取液的狀態(tài)?；蛘撸円掖继崛?物也可以是用常法從提取液中全部或部分除去乙醇后得到的提取濃縮物的狀態(tài)。也就是 說，還可以是實(shí)質(zhì)上不含乙醇的提取粉末或含有1 50重量％乙醇的提取濃縮物的狀態(tài)。 含有10 15重量％乙醇的提取濃縮物由于保存性好，因而成為優(yōu)選方式。純乙醇提取物的 收率相對(duì)于干燥舞茸為2 10重量％、進(jìn)一步特定為3 5重量％ (以固體成分的形式)。 純乙醇提取物中的有效成分不明，但純乙醇提取物含有磷脂、植物性類固醇。本發(fā)明包含含有上述提取物的用于促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)產(chǎn)生的組合物。透明質(zhì)酸是糖胺聚糖(黏多糖)的一種，具有結(jié)合了 N-乙酰基-D-葡糖胺與D-葡 萄糖醛酸的二糖重復(fù)的結(jié)構(gòu)，可由下式表示。另外，透明質(zhì)酸也被稱為玻尿酸?！不?〕COONeCHjOH(式中，n為1以上的整數(shù))本發(fā)明的組合物包括食品、尤其是用于促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生的食品的形態(tài)。本發(fā)明的組合物由于促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生，因此能保持皮膚的保濕性，賦予皮膚水 潤性和柔軟性及彈性，并能對(duì)紫外線引起表皮的損傷進(jìn)行防御、修復(fù)、以及皮膚再生。因此， 本發(fā)明包括化妝品形態(tài)的、含有上述提取物的用于促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生的組合物?；瘖y品形態(tài)的本發(fā)明的組合物可含有配合于化妝品中的常用載體、賦形劑、添加 物等。可作為防止肌膚粗糙、改善肌膚紋理、改善肌膚柔軟性、改善肌膚彈性、改善肌膚皺 紋和松弛、改善肌膚保濕性等的化妝品使用。作為化妝品的劑型，可以列舉洗臉用(洗面 霜 泡沫洗面奶 啫喱洗面奶化妝品等)、整肌用(化妝水 美容液等)、保護(hù)用(乳液 護(hù) 膚霜等)、面膜 推油 按摩化妝品、隔離化妝用(粉底液 白粉等防曬霜 防曬黑化妝 品等)、局部化妝用(口紅 眼影 眼線液等)、沐浴用(肥皂 洗浴香波 洗浴用化妝品 等)、防曬用(防曬霜 防曬黑化妝品等)、生發(fā) 護(hù)發(fā)用(生發(fā)品 生發(fā)液等)。在這些化 妝品中配合以有效量、例如濃縮物(實(shí)質(zhì)不含乙醇狀態(tài)的舞茸提取物)換算為0. 1 99. 9 重量％、優(yōu)選1 99重量％的舞茸提取物。剩余部分配合常用載體、賦形劑或添加劑等。此外，本發(fā)明的提取物對(duì)伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn)生減少而引起的皮膚損傷或皮膚病有 改善效果。另外，本發(fā)明的提取物對(duì)伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而引起的關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié) 疾病也具有改善效果。另外，本發(fā)明的提取物對(duì)伴隨著透明質(zhì)酸的減少而引起的眼睛損 傷 異常和眼疾患也具有改善效果。因此，本發(fā)明包含治療或預(yù)防上述伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn) 生的減少而引起的損傷或疾患的醫(yī)藥品形態(tài)的組合物。伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而引起的皮膚損傷或皮膚病可以列舉干皮癥(干燥 肌)、魚鱗癬、光老化、干癬、特應(yīng)性皮炎、褥瘡(bedsores)和燒傷引起的皮膚功能不全癥 等。最適用于光老化、干癬、特應(yīng)性皮炎、褥瘡(bedsores)和燒傷引起的皮膚功能不全癥。伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而引起的關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)疾病可以列舉變形性關(guān)節(jié) 病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。最適合變形性關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。伴隨著透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而引起的眼睛損傷或眼疾患可以列舉角膜上皮損傷、 眼睛疲勞和干眼等。優(yōu)選干眼。干眼是指由于眼淚不足或眼淚成分變化而在眼睛表面產(chǎn)生 損傷的狀態(tài)，包括淚液分泌減少癥和干性角膜結(jié)膜炎。本發(fā)明中使用的治療和預(yù)防的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、貓等的寵物、羊、豬、 雞等的家畜動(dòng)物，特別優(yōu)選人。醫(yī)藥品形態(tài)的本發(fā)明組合物可含有醫(yī)藥品中配合的慣用的載體、賦形劑、添加劑 等。醫(yī)藥品的劑型例如可以列舉膏劑、舌下劑、按摩油、溶液、懸濁液、洗劑、軟膏、凝膠、片 劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿、栓劑等。在這些醫(yī)藥品中按有效量計(jì)例如0. 1 99. 9重量％、 優(yōu)選1 99重量％來配合舞茸提取物(實(shí)質(zhì)不含乙醇的狀態(tài))。剩余部分配合常用載體、 賦形劑或添加劑等。
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化妝品或醫(yī)藥品中配合的慣用載體、賦形劑或添加劑等可以列舉溶劑、植物油 (例如杏仁油、蓖麻油、可可脂、椰子油、玉米油、棉籽油、亞麻仁油、橄欖油、棕櫚油、花生油、 罌粟子油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油及茶籽油等食用油)、礦物油、脂肪油、液體石 蠟、緩沖劑、保存劑、潤濕劑、螯合劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、凝膠形成劑、軟膏 基質(zhì)、栓劑基質(zhì)、滲透促進(jìn)劑、芳香劑及皮膚保護(hù)劑等。溶劑可以列舉水、醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液體聚烷基硅氧烷以及它們的混合 物等，但不限于這些。緩沖劑可以列舉檸檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、磷酸氫鹽、二乙胺以及它們的混合物 等，但不限于這些。潤濕劑可以列舉甘油、丙二醇、戊二醇、山梨糖醇、乳酸、尿素、BG(1，3_ 丁二醇)、 大豆留醇以及它們的混合物等，但不限于這些。螯合劑可以列舉EDTA鈉、檸檬酸以及它們的混合物等，但不限于這些?？寡趸瘎┛梢粤信e丁基羥基茴香醚(BHA)、抗壞血酸及其衍生物、生育酚及其衍生 物、半胱氨酸、以及它們的混合物等，但不限于這些。乳化劑可以列舉天然橡膠(例如刺槐膠)、黃蓍膠、黃原膠；天然磷脂(例如大豆 卵磷脂)；山梨糖醇酐單油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛醇；山梨糖醇酐酯；單甘油酯；脂肪醇 (例如二十二醇)；脂肪酸酯(例如三(辛酸/癸酸)甘油酯、硬脂酸甘油酯(SE)等脂肪酸 三甘油酯)；以及它們的混合物等，但不限于這些。懸浮劑可以列舉纖維素及其衍生物(例如羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基 纖維素、羥丙基甲基纖維素等)、角叉膠、刺槐膠、阿拉伯膠、黃蓍膠以及它們的混合物，但并 不限定于這些。凝膠基質(zhì)以及增粘成分可以列舉液體石蠟、聚乙烯、脂肪油、膠體二氧化硅或鋁、 鋅皂、甘油、丙二醇、黃蓍膠、羧乙烯基聚合物、硅酸鎂-鋁、親水性聚合物(例如淀粉、羧甲 基纖維素、羥乙基纖維素以及其他纖維素衍生物等纖維素衍生物)、水膨潤性親水膠體、角 叉膠、透明質(zhì)酸鹽(例如選擇性含有氯化鈉的透明質(zhì)酸凝膠)、精氨酸酯(例如精氨酸丙二 醇酯)以及它們的混合物等，但不限于這些。軟膏基質(zhì)可以列舉蜂蠟、石蠟、鯨蠟醇、棕櫚酸鯨蠟酯、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、硬脂酸聚甘油-10、硬脂酸、硬脂酸PEG-150、植物油、脂肪酸的山梨糖醇酐酯、聚 乙二醇、脂肪酸的山梨糖醇酐酯與氧化乙烯之間的縮合產(chǎn)物(例如單油酸聚氧乙烯山梨糖 醇酐)以及它們的混合物等，但不限于這些。疏水性軟膏基質(zhì)可以列舉石蠟、植物油、動(dòng)物脂、合成甘油酯、蠟、羊毛脂、液體聚 烷基硅氧烷以及它們的混合物等，但不限于這些。親水性軟膏基質(zhì)可以列舉固體聚乙二醇(polyethyleneglycol)等，但不限于此。 此外，慣用的載體、賦形劑或添加劑等可以列舉三十碳烷” > )、卵磷脂、氫化卵磷 脂、四己基癸酸抗壞血酸酯、尿囊素、甘氨酸2K、糖基海藻糖、水解氫化淀粉、水解膠原蛋白、 玫瑰提取物、甲基聚硅氧烷(dimethicone)、辛二醇、甜菜堿、硬脂酰谷氨酸鈉、野玫瑰油、鯊 肝醇、羥丙氧基脯氨酸等。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物還包含用于治療或預(yù)防因透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而產(chǎn)生的疾 病或障礙的藥劑。
本發(fā)明使用的、對(duì)于治療或預(yù)防因透明質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而產(chǎn)生的疾病或障礙有效 的給藥量，因疾病或障礙的程度、給藥方法而不同，只要是對(duì)于促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生有效的量 即可，沒有限制，舞茸提取物(實(shí)質(zhì)上不含乙醇的提取粉末的形態(tài))的量為0. 1 lOOOmg/ 體重kg 日，優(yōu)選為1 500mg/體重kg 日，更優(yōu)選為10 lOOmg/體重kg 日。本發(fā)明采用的給藥可以是全身給藥、局部給藥，全身給藥、局部給藥可以是經(jīng)皮給 藥、舌下給藥、口服給藥、經(jīng)腸給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、靜脈給藥、經(jīng)鼻給藥、滴眼等給 藥形態(tài)。優(yōu)選經(jīng)皮給藥、舌下給藥、滴眼。因此，本發(fā)明涉及用于制造上述醫(yī)藥組合物的舞茸提取物的使用。另外，本發(fā)明還 涉及包含向哺乳動(dòng)物給予上述醫(yī)藥組合物的、通過促進(jìn)透明質(zhì)酸產(chǎn)生而治療或預(yù)防因透明 質(zhì)酸產(chǎn)生的減少而產(chǎn)生的疾病或障礙的方法。實(shí)施例1以下，通過實(shí)施例等來說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。1、舞茸提取物的制造在舞茸的滅菌干燥粉末(含水量6重量％、豪庫特(*々卜)株式會(huì)社制的舞 茸)1000g中加入純乙醇(水分量99. 5容量％以上)4000g，在20°C的溫度下攪拌18小時(shí) 進(jìn)行提取。通過離心分離除去殘?jiān)脼V紙過濾所得到的上清液。從得到的濾液蒸發(fā)除去 乙醇，得到舞茸的純乙醇提取物(收量43. 2g，其中固體成分37. 2g和乙醇6. Og)。2、人纖維芽細(xì)胞的培養(yǎng)和處理方法正常人纖維芽細(xì)胞NB1RGB (RCB0222)從(德)理化學(xué)研究所生物資源中心購入， 使用含10% (v/v)胎牛血清(FBS)的達(dá)爾伯克氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)，從Invitrogen購入)進(jìn)行培養(yǎng)。另外，在不存在血清的情況下 實(shí)施了舞茸提取物處理。即，將在60mm dish中培養(yǎng)的匯合的人纖維芽細(xì)胞利用含有舞茸 提取物或細(xì)胞外基質(zhì)合成促進(jìn)因子transforming growth factor 0 (TGF-0 ) (20ng/ml、 從 R&D Systems 購入)的 0.2% (v/v)水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate (LAH)，從 Sigma Aldrich 購入)/DMEM 培養(yǎng)了 24 小時(shí)。3、 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time reverse transcriptase-polymerasechain reaction(real-time RT-PCR))法(1)總RNA的提取關(guān)于細(xì)胞的總RNA的提取，使用等基因(Isogen、從Nippon Gene購入)，按下述 操作法進(jìn)行。即，向利用舞茸提取物或TGF-0培養(yǎng)的細(xì)胞中添加等基因(0.8ml)將細(xì)胞 溶解，再在該溶解液中添加氯仿(0.16ml)并進(jìn)行混合。離心分離(10000轉(zhuǎn)/分鐘、10分 鐘)后，回收上層的水層組分，然后添加與回收的水層同容量的異丙醇并進(jìn)行混合。離心分 離(10000轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘)后，除去上清液，回收沉淀的RNA。在回收的RNA中進(jìn)一步添 加75容量％的乙醇(0.8ml)并進(jìn)行混合。離心分離(10000轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘)后，將上清 液全部除去，將RNA風(fēng)干。將提取到的總RNA溶解于不含核酸分解酶的滅菌蒸餾水中，使用 分光光度計(jì)(UV-1600、島津制作所制)測定260nm下的吸光度，由此進(jìn)行定量。另外，該總 RNA的提取可以不使用等基因，而根據(jù)Chomczynski P and Sacchi N的報(bào)告(Chomczynski， P. and Sacchi, N. Single—step method of RNA isolation byacid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 : 156-159(1987))中
8記載的方法來實(shí)施。(2)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)使用QuantiTectK Reverse Transcription Kit (從 QIAGEN 購入)，按下述操作法 進(jìn)行。即，在總RNA(lii g)中加入7xg DNA ffipeout Buffer使總量為14 yl，再在42 °C下進(jìn) 行2分鐘基因DNA除去反應(yīng)。然后，在該基因DNA除去反應(yīng)液總量中添加5x Quantiscript RT Buffer > RT Primer Mix 禾口 Quantiscript Reverse Transcriptase (RT),使總量為 20 iU，再在42°C下進(jìn)行15分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。接著，通過95 °C、3分鐘的熱處理停止反應(yīng)，合 成單鏈cDNA。另外，該逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)可以不使用QuantiTectK Reverse TranscriptionKit，而根 據(jù)以下方法來實(shí)施。即，在提取的RNA溶液中混在的DNA可以通過在DNase反應(yīng)溶液(40mM Tris-HCl,2mM MgCl2,0. 3mM CaCl2, pH7. 9)中與脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease) (5unist)反應(yīng)來除去。另外，在含有提取的RNA(1 u g)的水溶液11 u 1中，加入5x反應(yīng)溶 液(250mMTris-HCl，200mM KCl,30mM MgCl2,50mM dithiothreitol, pH8. 3)4u 1、脫氧核苷 酸混合(deoxyribonucleotide mixture)溶液(含有 dATP，dGTP，dCTP，dTTP 各 lOmM) 2 ii 1、 寡dT引物(oligo dT primer) (50pmol/u 1) 1 u l、RNase抑制劑(20units/u 1) 1 u 1、RT(逆 轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)、50units/ii 1) 1 u 1，使總量為 20ii 1，再在 37°C下反應(yīng) 1 小時(shí)，即可合成互補(bǔ)的DNA(cDNA)。(3)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)以通過RT反應(yīng)合成的單鏈cDNA為模板，使用人透明質(zhì)酸合成酶(HAS)引物試劑 盒(QuantiTect (注冊(cè)商標(biāo))Primer Assays、從QIAGEN購入)、或?qū)θ薎型膠原蛋白a 1特 異的引物、對(duì)人彈性蛋白特異的引物以及對(duì)人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)特異的引物 進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。即，用滅菌蒸餾水將RT反應(yīng)溶液稀釋40倍，在該稀釋液2 yl中加 入滅菌蒸餾水 3iil、SYBR (注冊(cè)商標(biāo))Premix Ex Taq II (從 Takara Bio 購入)6. 25 yl、 HAS引物試劑盒1. 25 yl，使總量為12. 5 iil，在使用Thermal CyclerDice (注冊(cè)商標(biāo))實(shí)時(shí) 系統(tǒng)(Real Time System) (Takara Bio 制)，進(jìn)行 45 個(gè)循環(huán)(1 循環(huán)94°C下 5 秒；60°C下 30秒)的PCR反應(yīng)。對(duì)于人I型膠原蛋白a 1、人彈性蛋白或人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，代替 HAS引物試劑盒，而分別添加上游引物(各lOiiM;序列號(hào)1、3、5)0. 625 iU和下游引物(各 10iiM ；序列號(hào)2,4,6)0. 625 iil，進(jìn)行同樣操作。結(jié)果通過以GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因、采用比較Ct法(A A Ct法)相對(duì)地進(jìn)行定量。 A ACt法是指基于只要知道擴(kuò)增DNA產(chǎn)物達(dá)到某一量所需的循環(huán)數(shù)即可算出初始量這一 理論的方法，可以將成為PCR模板的互補(bǔ)DNA(cDNA)的初始量表示為循環(huán)數(shù)。該方法采用 1個(gè)循環(huán)的檢測差異是2倍的基因量的差的理論(2-A ACt)。因此，在A ACt法中，與作 為基準(zhǔn)的基因(內(nèi)標(biāo)基因)比較，從未知檢測體的循環(huán)數(shù)的增減對(duì)未知檢測體的基因量進(jìn) 行相對(duì)定量。除購入的人HAS (商品目錄號(hào)QT00027510)引物試劑盒之外還使用的引物如下所述。人I型膠原蛋白a 1 (Accession No. NM 000088. 3)上游引物(序列號(hào)1)、 5，-CAGCAGATCGAGAACATCCG-3，以及下游引物(序列號(hào) 2)、5，-TCTTGAGGTCACGGCAGTG-3，；
人彈性蛋白(Accession No. M36860. 1) 上游引物(序列 號(hào)3)、5，-TGGACTTGGAGTTGGTGTCG-3， 以及下游弓丨物(序列號(hào)4)、 5， -CAGGCACTGCTGCTCCATATTT-3，；人GAPDH (Accession No. M33 197. 1)上游 弓| 物(序歹lj 號(hào)5)、5，-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3， 以及下游弓丨物(序列號(hào)6)、 5’ -GGCAACAATATCCACTTTACCAGA-3’。這些引物委托Operon Biotechnology株式會(huì)社合成而制作。另外，該實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)可以不使用QuantiTect (注冊(cè)商標(biāo))PrimerAssays， 而根據(jù)下述記載的PCR法來實(shí)施。即，在RT反應(yīng)后的含cDNA的溶液(2iU)中，加入10x PCR 反應(yīng)溶液(100mM Tris-HCl, 15mM MgCl2,500mM KCl，pH8. 3) 5 u 1、脫氧核苷酸混合溶液 (含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10mM) 2 yl、上游引物(10 y M) 2 yl、下游引物(10uM)2u 1, TaqDNA聚合酶(lOOunits/yl) 0. 5 yl、滅菌蒸餾水36. 5 yl，使總量為50 yl，實(shí)施PCR法。 PCR反應(yīng)以92°C下40秒、60°C下40秒、72°C下60秒為一個(gè)循環(huán)，實(shí)施35 45個(gè)循環(huán)。合 成的DNA通過采用含有0. 5 u g/ml的溴乙錠的2重量％瓊脂糖凝膠的電泳來進(jìn)行分離，并 將通過紫外線照射合成的DNA進(jìn)行比較定量。另外，人透明質(zhì)酸合成酶(HAS)引物可以使用以下序列的引物代替試劑盒的引 物。HAS 上游引物(序列號(hào) 7) :5，-GTGTTATACATGTCGAGTTTACTTCC-3，HAS 下游引物(序列號(hào) 8) :5，-GTCATATTGTTGTCCCTTCTTCCGC-3，(Yamada, Y . , Itano, N. , H a t a , K . , Ueda, M. , and Kimata, K.Differentialregulation by IL-lbeta and EGF of expression of three different hyaluronansynthases in oral mucosal epithelial cells and fibroblasts and dermal fibroblasts -quantitative analysis using real-time RT-PCR. J. Invest. Dermatol. 122 :631_639，2004.)(4)統(tǒng)計(jì)處理采用費(fèi)希爾(Fisher)的多變量分散分析法，測定各處理間的顯著差。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)發(fā)現(xiàn)在正常人纖維芽細(xì)胞中，舞茸提取物濃度依賴性地促進(jìn)HASmRNA表達(dá)(圖 1)。S卩，HAS mRNA量在100 u g/ml的舞茸提取物時(shí)顯著增加5. 4倍，在200 u g/ml時(shí)顯著 增加22. 4倍，在400 u g/ml時(shí)顯著增加23. 0倍。另外，TGF-3 (20ng/ml)也促進(jìn)HASmRNA 表達(dá)增加9. 3倍。(2)如圖2所示，舞茸提取物不會(huì)影響I型膠原蛋白a 1鏈的基因表達(dá)。另一方 面，TGF- 3 (20ng/ml)顯著促進(jìn)該mRNA表達(dá)(2. 4倍)。(3)如圖3所示，舞茸提取物不會(huì)影響彈性蛋白mRNA表達(dá)。另一方面， TGF- 0 (20ng/ml)顯著促進(jìn)該mRNA表達(dá)(4. 9倍)。5.考察首次發(fā)現(xiàn)在正常人皮膚纖維芽細(xì)胞中，舞茸提取物雖然不會(huì)影響皮膚結(jié)構(gòu)蛋白 質(zhì)的膠原蛋白和彈性蛋白的基因表達(dá)，但會(huì)促進(jìn)作為賦予肌膚水潤性的透明質(zhì)酸的合成 酶的HAS基因表達(dá)。因此，明確提示舞茸提取物是通過促進(jìn)內(nèi)因性保濕因子透明質(zhì)酸(Carruthers J, Carruthers A. Hyaluronic acid gel in skin rejuvenation. J. Drugs Dermatol. 5 =959-964,2006.)的生物合成來增強(qiáng)肌膚的水潤性的透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)物質(zhì) (透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)劑)。另外，還期待舞茸提取物通過作用于纖維芽細(xì)胞使其活化，從而 發(fā)揮抗衰老效果即從體內(nèi)補(bǔ)充隨著年齡增長而減少的透明質(zhì)酸。此外，還期待舞茸提取物 的透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)作用對(duì)于隨著透明質(zhì)酸下降而產(chǎn)生的變形性關(guān)節(jié)病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 以及干眼的預(yù)防、治療也有效。實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)方法1、來自實(shí)施例1制備的舞茸提取物的組分成分的制備通過采用正相硅膠(BW-300、富士硅化學(xué)株式會(huì)社制；使用內(nèi)徑35mmX 280mm的玻 璃制空心柱)的柱色譜法，將實(shí)施例1中制備的舞茸提取物(8. 88g)在15ml的氯仿-甲 醇(19 1)中溶解，添加到正相硅膠后，依次改變流動(dòng)相(氯仿-甲醇(19 1、使用 1000ml)—氯仿-甲醇(9 1、使用800ml)—氯仿-甲醇(4 1、使用800ml)—甲醇(使 用1000ml))進(jìn)行分離，分取各約60ml。將分取的第1份餾分作為Frl，共分離出60份餾分。 接著，從分離的總餾分(Frl-60)中取出一部分，在薄層硅膠(TLC)板(lOcmX lOcnuSilica gel 60F254#1. 05715. 0009、默克制)中使用展開溶劑(氯仿-甲醇(9 1))展開(展開 距離8cm)。對(duì)TLC板照射UV(254nm)后，噴霧10%硫酸試劑，然后進(jìn)行加熱，由此來檢測分 離成分。其結(jié)果是，得到由同一成分組構(gòu)成的以下5組分(Ml M5)(表1)。S卩，將相對(duì)比 移值(Rf值)為0. 98彡Rf值彡0. 50的餾分作為M1，將Rf值為0. 45彡Rf值彡0. 29的餾 分作為M2，將Rf值為0. 28彡Rf值彡0. 16的餾分作為M3，將Rf值為0. 13彡Rf值彡0. 07 的餾分作為M4，將Rf值為0. 07 > Rf值> 0的餾分作為M5。各組分成分通過凈重法算出 減壓干燥后的收量。另外，用100%Et0H將各成分調(diào)節(jié)至400mg/ml，添加到細(xì)胞培養(yǎng)體系 中。表1舞茸提取物的5組分成分
組分對(duì)應(yīng)餾分收量(mg)MlFrl-5 (0. 98 彡 Rf 值彡 0.50)6115M2Fr6-13 (0. 45 彡 Rf 值彡 0. 29)481M3Frl4-22 (0. 28 彡 Rf 值彡 0. 16)255M4Fr23-47 (0. 13 彡 Rf 值彡 0. 07)425M5Fr48-60 (0.07 > Rf 值彡 0)1260實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)方法1、來自實(shí)施例2制備的舞茸提取物組分5 (M5)的組分成分的制備
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通過采用正相硅膠(BW-300、富士硅化學(xué)株式會(huì)社制；使用內(nèi)徑40mmX 300mm的玻 璃制空心柱)的柱色譜法，將實(shí)施例2中制備的舞茸提取物組分5 (M5) (1. 2g)在20ml的氯 仿-甲醇-水(4 1 0. 1)中溶解，添加到正相硅膠后，依次改變流動(dòng)相(氯仿-甲醇-水 (4:1: 0. 1、使用1700ml)—甲醇(使用300ml))進(jìn)行分離，分取各約50ml。將分取的第 1份餾分作為Frl，共分離出38份餾分。接著，從分離的總餾分(Frl-38)中取出一部分，在 薄層硅膠(TLC)板(10cmX10cm、Silica gel60F254#l. 05715. 0009、默克制)中使用展開溶 劑(氯仿-甲醇-水(4 1 0. 1))展開(展開距離8cm)。對(duì)TLC板照射UV(254nm)后， 噴霧10%硫酸試劑，然后進(jìn)行加熱，由此來檢測分離成分。其結(jié)果是，得到由同一成分組構(gòu) 成的以下8組分(M5-1 M5-8)(表2)。S卩，將相對(duì)比移值(Rf值)為0. 32彡Rf值彡0. 12 的餾分作為M5-1，將Rf值為0. 24彡Rf值彡0. 11的餾分作為M5-2，將Rf值為0. 39彡Rf 值彡0. 11的餾分作為M5-3，將Rf值為0. 39彡Rf值彡0. 15的餾分作為M5-4，將Rf值為 0. 20彡Rf值彡0. 15的餾分作為M5-5，將Rf值為0. 19彡Rf值彡0. 05的餾分作為M5-6， 將Rf值為0. 11 > Rf值> 0. 05的餾分作為M5-7，將Rf值為0的餾分作為M5-8。各組分 成分通過凈重法算出減壓干燥后的收量。另外，用100% EtOH將各成分調(diào)節(jié)至200mg/ml， 添加到細(xì)胞培養(yǎng)體系中。表2舞茸提取物組分5 (M5)的組分成分 實(shí)施例4人纖維芽細(xì)胞的培養(yǎng)和處理方法 正常人纖維芽細(xì)胞NB1RGB(RCB0222)從(德)理化學(xué)研究所生物資源中心購入， 使用含10% (v/v)胎牛血清(FBS)的達(dá)爾伯克氏改良依格爾培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)。另 外，在不存在血清的情況下實(shí)施舞茸提取物及其組分成分(Ml M5、M5-1 M5-8)的處理。S卩，將在24wellmultiplate或60mm dish中培養(yǎng)得到的匯合的人纖維芽細(xì)胞在含有舞 茸提取物(25-400 iig/ml)、其組分成分(100-400 iig/ml)、或白細(xì)胞介素la (lOng/ml、DS Pharma Biomedical制)的0.2% (v/v)水解乳蛋白(LAH)/DMEM中處理24小時(shí)或48小時(shí)。為了分析HA(透明質(zhì)酸)生物合成調(diào)節(jié)，在HAS抑制劑4-甲基傘形酮(4MU) (0. 1-lmM、Sigma-Aldrich制)的存在下同樣進(jìn)行舞茸提取物處理。2、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)法(1)總RNA的提取關(guān)于細(xì)胞的總RNA的提取以及總RNA的定量按實(shí)施例1中3的(1)所述來進(jìn)行。(2)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)使用得到的總RNA，按實(shí)施例1中3的(2)所述合成單鏈cDNA。(3)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)以通過RT反應(yīng)合成的單鏈cDNA為模板，使用人前體膠原蛋白酶 1 (procollagenasel/proMMP-1 引物試劑盒(QuantiTect (注冊(cè)商標(biāo))PrimerAssays、商品 目錄號(hào)QT00014581、從QIAGEN購入)、人基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2 (TIMP-2)引物試劑盒 (QuantiTect (注冊(cè)商標(biāo))Primer Assays、商品目錄號(hào)QT00017759、從QIAGEN購入)以及對(duì) 人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(序列號(hào)5、6)特異的引物，如實(shí)施例1中3的(3)所述 那樣，通過SYBR(注冊(cè)商標(biāo))Premix Ex Taq II (從Takara Bio購入)，按照所附的操作 方法進(jìn)行45個(gè)循環(huán)(1循環(huán)94°C下5秒；60°C下30秒)的PCR，將各cDNA擴(kuò)增。結(jié)果是， 以GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因，采用A A Ct法相對(duì)地進(jìn)行定量。關(guān)于人前體膠原蛋白酶Kprocollagenasel/proMMP-l)、人基質(zhì)金屬蛋白酶組織 抑制因子2(TIMP-2)的PCR，使用上述引物試劑盒代替實(shí)施例1中3的(3)中的人HAS引 物試劑盒，與實(shí)施例1中3的(3)同樣進(jìn)行。另外，也可以代替引物試劑盒，添加以下的 各自的上游引物(各10iiM;序列號(hào)9、ll)0.625iU和下游引物(各10iiM;序列號(hào)10、 12)0. 625 iil，與實(shí)施例1中的3的(3)同樣操作。關(guān)于人proMMP-1引物，代替試劑盒的引物，使用以下序列的引物來實(shí)施。proMMP-1 上游引物(序列號(hào) 9) :5，-GGTGATGAAGCAGCCCAG-3，proMMP-1 下游引物(序列號(hào) 10) :5，-CAGTAGAATGGGAGAGTC-3，(Lin, N. , Sato, T. , Takayama, Y. , Mimaki, Y. , Sashida, Y. , Yano, M. , and Ito, A. Novel anti—inflammatory actions of nobiletin, a citruspolymethoxy flavonoid, on humansynovial fibroblasts and mousemacrophages. Biochem. Pharmacol. 65 2065-2071,2003.)關(guān)于人TIMP-2引物，可以代替試劑盒的引物，而使用以下序列的引物來實(shí)施。TIMP-2 上游引物(序列號(hào) 11) :5，-GGTACCAGATGGGCTGCGAG-3，TIMP-2 下游引物(序列號(hào) 12) :5，-TTGGAGGCCTGCTTA-3，(Hirata, M. , Saro, T. , Tsumagari, M. , Shimada, A. , Nakano, H. , Hashizume, K., and Ito A. Differential regulation of the expression of matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases by cytokines andgrowth factors in bovine endometrial stromal cells and trophoblast cell lineBT-1 in vitro. Biol. R印rod. 68 :1276_1281，2003.)
13
3、DNA 定量關(guān)于細(xì)胞內(nèi)DNA 量，根據(jù) Johnson-Wint 和 Hollis 的方法(Johnson-Wint，B.，and Hollis,S. Arapid in situ deoxyribonucleic acid assay for determiningcell number in culture and tissue. Anal. Biochem. 122 :338_344，1982.)進(jìn)行測定。即，使用 0.25% (w/v) trypsin/0. 02% (w/v)EDTA溶液(1.5ml)進(jìn)行各處理來回收上述1中處理得到的 細(xì)胞。將得到的細(xì)胞懸浮液在冰冷卻下采用密閉式超聲波細(xì)胞破碎裝置(Cosmo Bio制) 以5分鐘的間隔進(jìn)行200W、6秒的超聲波處理，制成樣品溶液。將樣品溶液(100 yl)與 160 ill 的 3，5-二氨基苯甲酸二鹽酸鹽(3,5-diaminobenzoic acid dihydrochloride)溶 液(400mg/ml) (Sigma-Aldrich制)混合后，在60°C下反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，添加1N 鹽酸1.5ml，使用微孔板分析儀(Infinite F200,Tecan日本制)測定樣品溶液中的熒光強(qiáng) 度(激發(fā)波長430nm、熒光波長535nm)。另外，DNA量通過使用來自鮭精巢的DNA (和光純 藥工業(yè)制)同樣制成的校正曲線來算出。4、HA 定量上述1的24小時(shí)或48小時(shí)培養(yǎng)之后回收的培養(yǎng)液中的HA量，采用HA ELISA試 劑盒(由生化學(xué)工業(yè)購入)根據(jù)所附的操作方法進(jìn)行定量。即，使回收的各處理的培養(yǎng)液 中的HA與在附于購入試劑盒的微孔上固相化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白質(zhì)(HABP)結(jié)合后，添加 過氧化物酶結(jié)合HABP使其反應(yīng)。接著，加入四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，用微孔板分析儀 (InfiniteF200、Tecan日本制)測定450nm下的吸光度。HA量通過使用標(biāo)準(zhǔn)HA溶液同時(shí) 制成的校正曲線來算出。另外，各處理中單位細(xì)胞產(chǎn)生的HA量是將測得的各處理的HA量 除以上述3中定量得到的各處理的DNA量得到的值(ng/ u gDNA)。另外，HA定量也可以不使用HA ELISA試劑盒，而采用以下方法來實(shí)施。S卩，在使 用碳酸鹽緩沖溶液(PH8-9)將重組體人HABP(rHABP) (Cosmobio制)固相化得到的96孔板 中，添加回收得到的培養(yǎng)液，使結(jié)合的HA進(jìn)一步與生物素結(jié)合rHABP(C0Sm0bi0制)結(jié)合。 接著，添加過氧化酶結(jié)合抗生素蛋白，形成生物素-抗生素蛋白復(fù)合體。然后，加入四甲基 聯(lián)苯胺和過氧化氫，用微孔板分析儀(Infinite F200,Tecan日本制)測定450nm下的吸光 度。HA量通過使用標(biāo)準(zhǔn)HA溶液(50-800ng/ml)同時(shí)制成的校正曲線來算出。5、蛋白質(zhì)印跡法在上述1的24或48小時(shí)培養(yǎng)后回收得到的細(xì)胞培養(yǎng)液中，添加最終濃度3. 3% (w/v)的三氯乙酸，在4°C下靜置一晚，不要使蛋白質(zhì)溶解。通過離心分離(10000轉(zhuǎn)/分 鐘、10分鐘)使不溶性蛋白質(zhì)沉淀后，使沉淀物在含有(v/v)2-巰基乙醇的SDS-PAGE sample buffer中溶解，使用12.5% (w/v)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE。泳動(dòng)結(jié)束后，將 凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，按規(guī)定方法將硝基纖維素膜浸漬于粘連溶液[5% (w/v)fatty-free dry milk/80mM Na2HP04/100mM NaCl/0. 1 % (v/v)Tween-20(pH7. 5)], 進(jìn)行 1 小時(shí)的粘連。用蒸餾水和 PBS-T buffer[80mMNa2HP04/100mM NaCl/0. 1 % (v/v) Tween-20 (pH7. 5)]分別洗滌2 3次后，在用1 % (w/v) BSA/PBS (_)稀釋了的一次抗 體[she印 anti-(humanproMMP-l)或 anti_(human TIMP—2) IgG、分另ij 來自國立倫敦大 學(xué)永瀨秀明教授]溶液中浸漬，室溫下緩慢振動(dòng)8小時(shí)以上。一次抗體結(jié)合后，用蒸餾 水和PBS-T buffer分別洗滌2 3次，在用1 % (w/v)BSA/PBS (-)稀釋了的二次抗體 [peroxidase-conjugated goat anti- (sheep IgG) IgG、Sigma Aldrich 制]溶液中于室溫下浸漬 1 小時(shí)。二次抗體結(jié)合后，在 ECL-Western BlottingDetection kit 的 ECL-Western B lotting Detection Reagents (從 AmershamBiosciences 公司購入)中浸漬,準(zhǔn)確反應(yīng) 1 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，通過熒光圖像分析儀LAS-lOOOplus (富士膠片公司制)對(duì)proMMP-1和 TIMP-2量進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)印跡法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的實(shí)驗(yàn)方法，在公知的實(shí)驗(yàn)書例如神谷美 智子的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(竹繩忠臣編)羊土社、p. 152-157、2003等中有詳細(xì)記載。另外，抗體可以不使用上述抗體，而使用市售品的下述抗體來實(shí)施。一次抗體1)抗人MMP-1單克隆抗體(商品號(hào)F_67、第一精細(xì)化學(xué)制)2)抗人TIMP-1單克隆抗體(商品號(hào)F_26、第一精細(xì)化學(xué)制)二次抗體peroxidase-conjugated rabbit anti- (mouse IgG) IgG (Sigma Aldrich 制)6、統(tǒng)計(jì)處理采用費(fèi)希爾的多變量分散分析法，測定各處理間的顯著差。7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)正常人纖維芽細(xì)胞NB1RGB(RCB0222)正常產(chǎn)生HA，舞茸提取物(25-100 y g/ ml)使HA的產(chǎn)生增強(qiáng)(圖4)。即，關(guān)于HA量，在未處理組中為15. 37 士 1. 56 y g/ y gDNA,而在 25 u g/ml 的舞茸提取物中為 24. 79 士 2. 75 u g/u gDNA, ^ 50 u g/ml 下為 26. 08 士 2. 19 u g/ ygDNA，在 lOOiig/ml 下為 20. 57 士 1. 46 y g/y gDNA。因舞茸提取物(100 u g/ml)而增加了 的HA的生成被HAS抑制劑的4MU(0. 1-lmM)濃度依賴性抑制。舞茸提取物因促進(jìn)HAS基因 表達(dá)而促進(jìn)HA產(chǎn)生。(2)為了鑒定有助于促進(jìn)HA產(chǎn)生的舞茸提取物成分，探討舞茸提取物組分成分的 HA產(chǎn)生調(diào)節(jié)。其結(jié)果是，在Ml和M5組分中，檢測出濃度依賴性HA產(chǎn)生促進(jìn)作用(圖5)。 另外，關(guān)于相對(duì)的促進(jìn)活性，M5比Ml高。即，關(guān)于HA量，在未處理組中為580. 21 士70. 65ng/ ml，而在Ml 的 25 ii g/ml 下為 883. 49士 159. 21ng/ml，在 50 ii g/ml 下為 1237. 28士405. 80ng/ ml，在 100 ii g/ml 下為 1488. 19士527. 23ng/ml，在M5 的 25 ii g/ml 下為 1041. 44士 186. 71ng/ ml，在 50 ii g/ml 下為 1587. 83士298. 10ng/ml，在 100 u g/ml 下為 2304. 25士499. 97ng/ml。 此外，M2-M4組分雖然在低濃度下促進(jìn)HA產(chǎn)生，但在高濃度下反而抑制其產(chǎn)生。(3)為了探討舞茸提取物促進(jìn)HA產(chǎn)生的特異性，探討舞茸提取物及其組分成分對(duì) 正常人纖維芽細(xì)胞正常表達(dá)的已知ECM代謝相關(guān)基因即proMMP-1和TIMP-2的基因表達(dá)的 作用。舞茸提取物濃度依賴性地促進(jìn)proMMP-lmRNA表達(dá)及其產(chǎn)生(圖6A以及圖7A)。但 是，舞茸提取物不影響TIMP-2mRNA表達(dá)及其產(chǎn)生(圖6B和圖7B)。另一方面，舞茸提取物 組分成分為M5組分不影響proMMP-lmRNA表達(dá)(圖6A)。在M2-M4中觀察到proMMP-1基 因表達(dá)增加(圖6A)。對(duì)于TIMP-2mRNA表達(dá)，Ml組分顯示出了抑制傾向，但在所有組分中 均幾乎沒有變化(圖6B)。因此，暗示了可能各不相同的舞茸提取物成分促進(jìn)舞茸提取物的 HA產(chǎn)生以及proMMP-1基因表達(dá)。(4)為了更詳細(xì)闡明舞茸提取物的M5組分的HA產(chǎn)生促進(jìn)作用，將M5組分進(jìn)一步 分成8個(gè)成分(M5-1 M5-8)，探討HA產(chǎn)生調(diào)節(jié)。其結(jié)果是，在M5-3 M5-8組分中觀察到 HA產(chǎn)生促進(jìn)(圖8)。
8、考察在正常人皮膚纖維芽細(xì)胞中，舞茸提取物促進(jìn)賦予肌膚水潤性的HA的合成。因 此，暗示舞茸提取物會(huì)促進(jìn)因重要的水潤性成分HA的合成而帶來的肌膚的活化和改善(例 如皮膚的水分保持功能的改善)。此外，還暗示舞茸提取物的HA產(chǎn)生促進(jìn)可能由各不相同 的成分來調(diào)節(jié)。皮膚ECM的酶的代謝促進(jìn)在創(chuàng)傷治愈等皮膚再建中具有重要作用。認(rèn)為MMP與 TIMP的量的平衡對(duì)于該ECM代謝很重要。此外，過度的MMP產(chǎn)生亢進(jìn)引起的皮膚ECM的分 解增強(qiáng)會(huì)引起皺紋等皮膚粗糙化(皮膚老化)。首次闡明在人皮膚纖維芽細(xì)胞中舞茸提取 物會(huì)促進(jìn)proMMP-lmRNA及其產(chǎn)生。但是，令人感興趣的是，顯示proMMP-1表達(dá)促進(jìn)作用的舞茸提取物組分(M2-M4) 與具有HA產(chǎn)生促進(jìn)作用的組分(M5)不同。經(jīng)鑒定顯示HA產(chǎn)生促進(jìn)作用的M5組分成分為 M5-6和M5-7。即，可期待通過將舞茸提取物的成分分離使用，能減輕皮膚老化作用，進(jìn)一步 特殊增強(qiáng)肌膚的水潤性。極大地暗示我們舞茸提取物是通過促進(jìn)內(nèi)因性保濕因子HA的生物合成來增強(qiáng)肌 膚水潤性的新型的來源于天然物的素材。此外，還可期待舞茸提取物通過作用于纖維芽細(xì) 胞使其活化，從而發(fā)揮抗衰老效果即從體內(nèi)補(bǔ)充伴隨著年齡增加而減少的HA。
0163]實(shí)施例50164]按下面的配合制作含有舞茸提取物的化妝膏。0165]成分名配合量(重量％)0166]舞茸提取物2. 00167]橄欖油10. 00168]三(辛/癸_甘油酯 10.00169]生育酚1. 00170]精制水77. 00171]合計(jì)100. 00172]實(shí)施例60173]按下面的配合量制作含有舞茸提取物的醫(yī)藥用膏。0174]成分名配合量(重量％)0175]舞茸提取物10. 00176]橄欖油10. 00177]三(辛/癸_甘油酯 10.00178]生育酚1. 00179]精制水69. 00180]合計(jì)100. 00181]實(shí)施例70182]舞茸提取物對(duì)人干皮癥的效果0183]使用實(shí)施例5所示的含有2重量％的舞茸提取物的膏劑，探討對(duì)干皮癥的效果。0184]試驗(yàn)方法0185]受試對(duì)象老人保健設(shè)施“goodwell”內(nèi)患干皮癥而具有脫屑(是指皮膚變成角質(zhì)
16狀脫落的癥狀)的患者(76 97歲)12名(男性6名、女性6名)實(shí)施期間2006年12月 2007年1月方法以脫屑(是指皮膚變成角質(zhì)狀脫落的癥狀)為基準(zhǔn)分為3個(gè)階段(3 重癥、 2:中癥、1 輕癥)對(duì)受試者的皮膚狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)在受試者的皮膚上適量涂布含舞茸 提取物的膏劑。涂布部位為右下腕、左下腕、右下腿、左下腿，對(duì)各部位進(jìn)行評(píng)價(jià)判定。結(jié)果以下所示為涂布開始1周期間的受試者的皮膚狀態(tài)的診斷評(píng)價(jià)度(3 重癥、2 中 癥、1:輕癥)。另外，診斷評(píng)價(jià)度0表示治愈。受試者1
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿
2006；,12/42122
2006；/12/61111
2006；/12/81111
2006；/12/111011
受試者2
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿
2007；/1/171121
2007；/1/191111
2007；,1/220011
2007；/1/240011
受試者3
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿
2006；/12/62223
2006；,12/112212
2006；/12/131000
受試者4
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿
2006；,12/151111
2006；/12/180100
2006；/12/200100
2006；/12/220000
受試者5
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿
2007；/1/52233
2007；,1/81122
2007；,1/100022
2007；/1/120022
受試者6
診斷 涂布日右下腕左下腕右下腿左下腿2006/12/18
2006/12/20
2006/12/25
受試者7
診斷 涂布日
2006/12/18
2006/12/20
2006/12/22
2006/12/25
受試者8
診斷 涂布日
2006/12/29
2006/12/30
2007/1/4
受試者9
診斷 涂布日
2007/1/5
2007/1/8
2007/1/10
2007/1/12
受試者10
診斷 涂布日
2006/12/20
2006/12/22
2006/12/25
2006/12/26
2006/12/27
受試者11
診斷 涂布日
2006/12/4
2006/12/6
2006/12/8
2006/12/11
受試者12
診斷 涂布日
2006/12/18
2006/12/20
2006/12/22
2006/12/25
0 0 0
1 0 0
2 1 1
右下腕左下腕右下腿左下腿
1 0 0 0
右下腕 2 1 1
右下腕 0 0 0 0
1 0 0 0
左下腕 3 2 0
左下腕
0
0
0
0
1 1 1 0
右下腿 3 2 2
右下腿 2 2 2 1
1 1 1 1
左下腿 3 2 1
左下腿 3 1 1 1
右下腕左下腕右下腿左下腿
右下腕 1 0 0 0
右下腕 0 0 0 0
1 0 0 0 0
左下腕 1 1 1 1
左下腕 1 0 0 0
2 2 1 1 1
右下腿 2 1 1 0
右下腿 2 1 1 1
2 2 1
左下腿 1 1 1 0
左下腿 1 1 1 0
18
如上所述，涂布開始后的受試者1 12的皮膚狀態(tài)的診斷評(píng)價(jià)度顯示為改善。另 外，在涂布后1 3天確認(rèn)到由涂布含舞茸的提取物膏所帶來的顯著的癥狀改善效果。圖9是用含舞茸提取物的膏劑治療的受試者5的治療前后的皮膚照片。證明通過 涂布含舞茸提取物的膏劑來進(jìn)行治療，可改善干皮癥狀。這些結(jié)果表明舞茸提取物的含量為2重量％的膏對(duì)干皮癥有治療效果。工業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的提取物促進(jìn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，因此本發(fā)明的組合物可作為解決因透明質(zhì) 酸產(chǎn)生減少引起的皮膚異常 損傷及疾病的化妝品或醫(yī)藥品、解決關(guān)節(jié)或眼的異常 損傷 及疾病的醫(yī)藥品使用。
權(quán)利要求
一種舞茸提取物，其是用純乙醇提取干燥舞茸而得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的舞茸提取物，其中，干燥舞茸的含水量為8重量％以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的舞茸提取物，其中，純乙醇含有99.O容量％以上的乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的舞茸提取物，其中，相對(duì)于干燥舞茸100重量 份，純乙醇為100 1000重量份。
5.一種透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)劑，其含有權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的舞茸提取物。
6.一種組合物，其含有權(quán)利要求5所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)生促進(jìn)劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其為化妝品的形態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其為醫(yī)藥品的形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供更有效地促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)的產(chǎn)生的舞茸提取物以及含有它的組合物。用純乙醇提取干燥舞茸得到的舞茸提取物以及含有它的用于促進(jìn)透明質(zhì)酸(玻尿酸)產(chǎn)生的組合物。
文檔編號(hào)A61K36/07GK101854943SQ20088011581
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
發(fā)明者伊東晃, 佐藤隆, 高橋雅夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社海瑪特;高橋雅夫;伊東晃;佐藤隆