Foxm1肽和包含foxm1肽的藥劑的制作方法

專利名稱：：Foxm1肽和包含foxm1肽的藥劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及作為針對高表達叉頭框Ml(FOXMl)的癌癥(如膽管癌、肺癌和胰腺癌)的疫苗有用的新肽，和包含這些肽的用于治療和預防腫瘤的藥物。
背景技術：
：在日本，膽管癌(膽囊癌和膽管癌)死亡的數目正在增加，在2005年，有16，586人死于此癌。在大多數膽管癌病例中，在早期不存在主觀癥狀。與消化道腔體內形成的癌癥(如胃癌和結腸癌)相比，膽管癌的準確的顯示和診斷顯影(diagnosticimaging)是困難的。因此，膽管癌難以早期檢測，當膽管癌被發現時，癌癥往往已經發展并無法切除。除外科治療之外，還進行放療和化療以治療膽管癌，但它們療效不佳，因此亟需建立新的治療方法。在日本，肺癌死亡的數目也在增加，在2005年，有62，063人死于此癌。目前日本癌癥死亡中肺癌占19.0%，并已成為2000年以來癌癥死亡的首要原因。吸煙被認為是肺癌發生的最大原因。除吸煙外，吸入石棉或氡氣也被認為引起肺癌。作為預防肺癌的措施，人們倡導戒煙和進行健康檢查。然而，盡管吸煙人群在日本正在減少，但2005年仍估計有大約3千萬人。此外，最近已證明，健康檢查中廣泛進行的簡單胸部X-光顯影和痰液測試對于肺癌的早期檢測無效，而且它們并不導致癌癥死亡的減少。考慮到上述情況，預期肺癌死亡的數目在未來會持續增加。肺癌的癥狀包括咳嗽、血痰、呼吸急促和胸痛，但在大多數情況下，癥狀在早期不存在。在很多病例中當癥狀出現時癌癥已經發展。為此，當最先發現癌癥時，一半以上的患者是不能手術治療的，因此肺癌被看作難治性癌癥中的一種。手術后恢復率不像其他癌癥那么好，而且手術后的總的五年存活率僅不及50%。在近年來，隨著以手術切除為中心，結合放療、化療等的多科性治療的進步，早期肺癌的五年存活率正在增加；然而，晚期肺癌的治療效果沒有很大的改進，而且亟需建立新的治療策略。在日本，胰腺癌死亡的數目正在增加，在2005年，有22，927人死于此癌。目前，日本癌癥死亡中胰腺癌占7.0%，在肺癌、胃癌、結腸癌和肝癌后排名第五位。胰腺癌沒有特異性的癥狀，而且在很多病例中，當癥狀出現時，癌癥已經發展。即使是診斷顯影發展的今天，全日本胰腺癌患者中大約40%屬于具有遠端轉移的晚期病例，而且發現很多患者具有不能切除的局部發展的癌癥。因此，患者總的五年存活率是5%以下，而且診斷后的預后非常差。由于診斷中的難度，胰腺癌發病作為癌癥死亡的原因特別是發達國家中正逐漸增加。當先，雖然以手術切除為中心，結合放療、化療等的多科性治療正在開展，但是在治療效果方面沒有明顯的改進，亟需建立新的治療策略。已顯示胰腺癌的發病要因涉及多種因素，如生活習慣(包括吸煙、肥胖、飲食、飲酒和喝咖啡)，以及慢性胰腺炎、糖尿病、遺傳因素等。在另一個方面，分子生物學和腫瘤免疫學的近期發展闡明，細胞毒性(殺傷)T細胞和輔助τ細胞可識別癌細胞中特異性高表達的蛋白質被降解而產生、并經由HLA分子被呈遞到癌細胞或抗原呈遞細胞的表面的肽，并引起免疫反應以破壞癌細胞。此外，已經鑒定了許多源自這些細胞的、能刺激這樣的免疫反應以攻擊癌癥的腫瘤抗原蛋白質和肽，而且抗原特異性腫瘤免疫治療正在得到臨床應用。HLAI類分子在身體的所有有核細胞的表面上表達。它結合于細胞質或細胞核中產生的蛋白質在胞內降解所產生的肽，并表達在細胞表面。在正常細胞的表面，源自正常自體蛋白質的肽結合于HLAI類分子，并且不被免疫系統的T細胞識別和破壞。在另一個方面，在形成癌癥的過程中，癌細胞有時大量表達在正常細胞中幾乎不表達或略微表達的蛋白質。此時HLAI類分子結合于癌細胞內特異性高表達的蛋白質胞內降解而產生的肽，然后在癌細胞的表面上表達肽，于是殺傷T細胞識別并僅破壞癌細胞。通過將所述癌癥-特異性抗原或肽施用于個體，可破壞癌細胞且可抑制癌生長而不傷害正常細胞。這稱為使用癌癥-特異性抗原的癌癥免疫療法。HLAII類分子主要在抗原呈遞細胞的表面上表達。所述分子結合于源自癌癥_特異性抗原的肽，其通過胞內降解由細胞外并入抗原_呈遞細胞的癌癥_特異性的抗原而產生，然后在細胞的表面上表達肽。識別它們的輔助T細胞被活化，并通過產生活化其他免疫活性細胞的多個細胞因子來誘導或增強針對腫瘤的免疫反應。因此，如果開發靶向在癌癥中特異性高表達的抗原的免疫療法，這樣的療法可有效地僅僅消滅癌癥，而不引起對正常自體組織的任何有害事件。還期望的是療法可用于其他治療均無能為力的任何末期癌癥患者。此外，通過將癌癥特異性抗原和肽作為疫苗預先施用于具有發生癌癥的高風險的個體，可預防癌癥的發生。本發明人首先使用cDNA微陣列對27，648個人基因進行了全基因組基因表達分析，以研究這些基因在25個肝內膽管癌病例中和在多個正常器官(包括它們在胚胎期)的表達譜(expressionprofile)。結果，本發明人發現叉頭框Ml(FOXMl)(GenBank登錄號NM_202003)在許多肝內膽管癌病例的組織中非常高度表達。類似于且除肝內膽管癌之外，還發現FOXMl在幾乎所有的肺癌、膀胱癌和胰腺癌病例中高度表達。此外，FOXMl的高表達見于多種癌癥如子宮頸癌(cervicalcancer)、卵巢癌、惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝細胞癌、結腸癌和慢性髓細胞性白血病的40%以上病例中。這些事實提示FOXMl可在多種癌癥中作為癌癥-特異性抗原。FOXMl在胚胎肝中并在正常成人器官中表達，其在消化道如胃、小腸和大腸、胸腺和睪丸中輕微表達；然而，表達水平明顯低于癌部分。提示FOXMl與癌癥發病和細胞增殖調節有關的文件的實例包括非專利文件1至10。然而，這些文件都沒有描述FOXMl作為針對癌癥的疫苗的用途。[非專利文件IjYoshidaY,WangI-C,YoderHM,DavidsonNO,CostaRH.:TheforkheadboxMltranscriptionfactorcontributestothedevelopmentandgrowthofmousecolorectalcancer.Gastroenterology132:1420-1431,2007.[非專利文件2]GusarcovaGA,WangI-C,MajorML,KalinichenkoW,AckersonT,PetroviV,CostaRH.:Acell-penetratingARFpeptideinhibitorofF0XM1inmousehepatocellularcarcinomatreatment.J.Clin.Invest.117:99-lll,2007.[非-專利文件3]RadhakrishnanSK,BhatUG,HughesDE,WangI-C，CostaRH,GartelAL.!IdentificationofachemicalinhibitoroftheoncogenictranscriptionfactorforkheadboxMl.CancerRes.66:9731_9735，2006.[非一專禾Ij文件4]TakahashiK,FurukawaC,TakanoA,IshikawaN,KatoΤ,HamayaS,SuzukiC,YasuiW,InaiK,SoneS,ItoΤ,NishimuraH,TsuchiyaΕ,NakamuraY,DaigoY.:TheneuromedinU-growthhormonesecretagoguereceptorlb/neurotensinreceptor1oncogenicsignalingpathwayasatherapeutictargetforlungcancer.CancerRes.66=9408-9419,2006.[非-專利文件5]KimI-M,AckersonΤ,RamakrishnaS,TretiakovaM，WangI_C，KalinTV,MajorML,GusarovaGA,YoderHM,CostaRH,KalinichenkoVV.:Theforkheadboxmltranscriptionfactorstimulatestheproliferationoftumorcellsduringdevelopmentoflungcancer.CancerRes.66:2153_2161,2006.[非一專禾O文件6]WonseyDR,FolletieΜ.=LossoftheforkheadtranscriptionfactorFoxMlcausescentrosomeamplificationandmitoticcatastrophe.CancerRes.65:5181_5189,2005.[非一專禾Ij文件7]ObamaK，UraK,LiΜ,KatagiriΤ,TsunodaΤ,NomuraΑ,SatohS,NakamuraY,FurukawaY:Genome_wideanalysisofgeneexpressioninhumanintrahepaticcholangiocarcinoma.Hepatology41:1339-1348,2005.[非一專禾Ij文件8]LaoukiIiJ,KooistraMRH,BrasA,KauwJ,KerkhovenRM,MorrisonA,CleversH,MedemaRH.:Foxmlisrequiredforexecutionofthemitoticprogrammeandchromosomestability.NatureCellBiol.7:126_136,2005.[非-專利文件9]KalinichenkoW,MajorΜ,WangX，PetrovicV,KuechleJ,YoderHM,ShinB,DattaA,RaychaudhuriP,CostaRH.:Foxmlbtranscriptionfactorisessentialfordevelopmentofhepatocellularcarcinomasandisnegativelyregulatedbythepl9ARFtumorsuppressor.GenesDev.18:830-850,2004.[非一專禾O文件10]WangX,KiyokawaH,DennewitzMB,CostaRH.=TheforkheadboxmlbtranscriptionfactorisessentialforhepatocyteDNAreplicationandmitosisduringmouseliverregeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9916881-16886,2002.
發明內容[本發明要解決的問題]本發明要實現的目標是開發一種手段，用來實施通過增強癌癥患者的抗癌免疫力來抑制癌癥生長的免疫治療，作為一種新型治療方法來治療難以通過外科手術治療、化療和放療等作為膽管癌、肺癌、胰腺癌等的治療方法治療的轉移性或難治性癌癥。更具體地，本發明的一個目的是鑒定源自在癌癥中特異性高表達的蛋白質、并且能誘導癌癥患者中針對所述癌癥的強免疫反應而不導致不良反應的肽，并在腫瘤免疫治療中應用這些肽。本發明識別源自在上述癌癥中特異性高表達的蛋白質并經由HLA-A2呈遞于殺傷T細胞的肽，從而使免疫治療能夠用于大約30%的患有上述癌癥的日本人患者。[解決問題的手段]在本申請中，本發明人通過將人⑶8陽性殺傷T細胞與經具有HLA-A2結合基序的人F0XM1肽沖激(pulsed)的、源自人外周血單核細胞的樹突細胞共培養來體外刺激人CD8陽性殺傷T細胞，從而誘導F0XM1肽特異性殺傷T細胞。是否存在對每種F0XM1肽特異性的殺傷τ細胞的誘導作用，是通過使用ELISPOT測定法檢測由識別通過HLA-A2呈遞的肽而活化的殺傷T細胞所產生Y-干擾素(IFN-γ)來檢查的。結果，鑒定了新型FOXMl肽，它們可以成為免疫治療的潛在候選靶抗原。此外還發現，使用上述肽誘導的FOXMl-反應性CTL針對表達內源性FOXMl和HLA-A2分子的癌細胞具有特異性的細胞毒性。而且所述CTL以HLAI類限制性的方式識別靶細胞。更具體地，本發明提供了如下[1]下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO:1至3中任一氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO:1至3中任一氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性。[2][1]的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[3][1]的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。[4]誘導針對癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[5]用于治療和/或預防癌癥的藥劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[6]用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[7]用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含編碼[1]的肽的一種或多種多核苷酸作為活性成分。[8]用于誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[9]針對[1]的肽的抗體。[10]使用[1]的肽誘導的細胞毒性(殺傷)T細胞、輔助T細胞或包含它們的免疫細胞群體。[11]抗原呈遞細胞，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復合物。[12][11]的抗原呈遞細胞，其是通過[6]或[7]的藥劑誘導的。[13]一種外來體，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復合物。[14][13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A*0201)。[15]誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將抗原呈遞細胞與[1]的肽接觸的步驟。[16]誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將編碼[1]的肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞的步驟。[17]誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的方法，其包括將T細胞與[1]的肽接觸的步馬聚ο本發明還提供如下[18]誘導針對癌癥的免疫力的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步驟。[19]用于治療和/或預防癌癥的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步驟。[20][1]的肽在制備用于誘導針對癌癥的免疫力的藥劑中的用途。[21][1]的肽在制備用于治療和/或預防癌癥的藥劑中的用途。[22][1]的肽，用于誘導針對癌癥的免疫力。[23][1]的肽，用于治療和/或預防癌癥。附圖簡述圖1顯示的是ELISP0T測定法和細胞毒性測試的結果。從HLA-A2陽性健康個體和乳腺癌患者的外周血分離⑶8陽性T細胞。針對用以每種FOXMl肽沖激過的源自單核細胞的樹突細胞刺激而獲得的殺傷T細胞，進行ELISP0T測定法檢查，確定它們是否與FOXMl肽特異性反應而產生IFN-γ。此外，通過細胞毒性測試檢查是否表達FOXMl的細胞以HLA-A2限制性方式特異性地受到損害。將T2-A2細胞用作ELISP0T測定法中的靶細胞。T2-A2細胞是通過將HLA-A2基因引入TAP基因表達缺陷的小鼠T2細胞系而產生的細胞系。由于T2-A2細胞中的TAP缺陷，只有當外源添加的肽具有與HLA-A2分子結合的能力時，該肽與HLA-A2分子形成的復合物才會在細胞表面上表達。將Panc-I細胞(其為HLA-A2陽性的且表達F0XM1)和PK-8細胞(其為HLA-A2陰性和FOXMl日性的)用于評價細胞毒活性。結果，來自兩個健康個體的使用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導的殺傷T細胞識別結合于HLA-A2并表達在T2-A2細胞上的F0XM1362-370、373_382和640-649肽而產生IFN-γ。此外，來自乳腺癌患者的使用上述肽誘導的殺傷T細胞，它們顯示針對panc-Ι細胞的強細胞毒活性，但不顯示針對PK-8細胞的細胞毒活性。因此，發現被誘導出來的殺傷T細胞特異性識別F0XM1，以HLA-A2限制性方式顯示針對癌細胞系的強細胞毒活性。由此可見，F0XM1362-370、373-382和640-649肽可以通過HLA-A2限制性的方式誘導FOXMl-特異性人殺傷T細胞，而且這樣的殺傷T細胞可損害表達FOXMl的癌細胞。[實施本發明的方式]除非另外限定，本申請中使用的所有技術和科學術語具有的含義與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義相同。本發明的肽是限制于HLA-A2的表位，HLA-A2是一種多見于日本人群和白種人群的HLA等位基因。利用與HLA-A2的結合親和力作為指標，選擇了源自FOXMl的候選HLA-A2結合肽。來自兩個健康個體的使用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導的殺傷T細胞識別結合于HLA-A2并表達在T2-A2上的F0XM1362-370肽(YLVPIQFPV(SEQIDNO:1))、F0XM1-373-382肽(SLVLQPSVKV(SEQIDNO:2))和F0XM1-640-649肽(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))而產生IFN-γ。來自乳腺癌患者的使用上述肽誘導的殺傷T細胞顯示針對panc-1細胞的強細胞毒活性，但不顯示針對PK-8細胞的細胞毒活性。因此，證實了所誘導的殺傷T細胞是以HLA-A限制性方式特異性識別FOXMl，并顯示針對癌細胞系的強細胞毒活性。因此，揭示了F0XM1-362-370(YLVPIQFPV(SEQIDNO1))、F0XM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQIDNO:2))和F0XM1-640-649(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))中任一個肽均能以HLA-A2限制性方式誘導FOXMl-特異性人殺傷T細胞，而且這樣的殺傷T細胞能傷害表達FOXMl的癌細胞。除肝內膽管癌之外，發現FOXMl在肺癌、膀胱癌和胰腺癌的幾乎所有病例中也與肝內膽管癌類似地高度表達。此外，FOXMl在多種癌癥如子宮頸癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝細胞癌、結腸癌和慢性髓細胞性白血病的40%以上病例中高表達。這些事實顯示FOXMl作為多種癌癥的免疫治療的靶標是有用的。(1)本發明的肽和包含所述肽的用于誘導抗癌免疫力的試劑本發明的肽是下述㈧至⑶中的任一個。(A)包含SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列的肽。(B)包含SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞-誘導活性。(C)(B)的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(D)(B)的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。在本申請中，“顯示誘導殺傷T細胞的活性的肽”是指“具有刺激殺傷T細胞(細胞毒性T細胞/CTL)的T細胞-誘導活性的肽”。本發明的肽是具有少于40個氨基酸，優選少于20個氨基酸，更優選少于個15氨基酸，包括SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列，并顯示誘導殺傷T細胞的活性的肽(表位肽)。或者，本發明的肽(表位肽)可包括包含SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸，只要保留誘導殺傷T細胞的能力即可。被取代、缺失、插入和/或添加的殘基數目通常為五個氨基酸或更少，優選四個氨基酸或更少，更優選三個氨基酸或更少，甚至更優選一個氨基酸或兩個氨基酸。已知變體肽(即，包含通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸殘基修飾原始氨基酸序列而獲得的氨基酸序列的肽)保留原始生物活性(MarkDF等，(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:5662_6；ZollerMJ禾口SmithΜ,(1982)核酸Res106487-500；Dalbadie-McFarlandG等(1982)ProcNatlAcadSciUSA79:6409_13)。氨基酸修飾優選保留原始氨基酸側鏈的性質。氨基酸側鏈的性質的實例顯示如下疏水氨基酸側鏈(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；親水氨基酸側鏈(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；和共同具有如下官能團或特征的側鏈脂族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基側鏈(S、T、Y)；含硫原子側鏈(C、M)；含羧酸和酰胺側鏈(D、N、E、Q)；含堿側鏈(R、K、H)；和含芳環側鏈(H、F、Y、W)。括號中的字母顯示氨基酸的單字母代碼。在一個優選的實施方案中，本發明的肽(免疫源性肽)是九肽(9-聚物)或十肽(10-聚物)。為了獲得具有高結合親和性和殺傷T細胞誘導活性的肽，可通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸來修飾天然存在的FOXMl的部分肽的氨基酸序列。在本申請中，術語“數個”指五個以下，優選三個以下，更優選兩個以下。此外，由于與HLA抗原具有高親和性的肽序列的規律性是已知的(KuboRT，等，(1994)J.Immunol.，152,3913-24；RammenseeHG，等，(1995)Immunogenetics.41178-228；KondoA，等(1995)J.Immunol.155:4307_12)，可依據該規律性來修飾本發明的肽(表位肽)，從而增強它們與HLA抗原的親和力。例如，可通過用賴氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起第二個氨基酸來獲得具有高HLA-A2結合親和力的肽。類似地，還可通過用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸來獲得具有高HLA-A2結合親和力的肽。當表位肽的序列與具有不同功能的內源或外源蛋白的氨基酸序列的部分相同時，可引起副作用如自身免疫病或針對特定物質的變態反應癥狀。為了避免這樣的副作用，修飾的表位肽不應與已知蛋白質的氨基酸序列相同。為此，需要使用可用的數據庫進行同源性檢索以確認不存在與修飾的表位肽顯示100%同源性且具有不同功能的內源或外源蛋白質。通過此步驟，可以避免由上述用于增加與HLA抗原的結合親和力和/或用于增加殺傷T細胞誘導活性的氨基酸序列修飾引起的風險。雖然上述與HLA抗原具有高結合親和力的肽預期非常有效地作為癌癥疫苗，但需要檢查使用高結合親和力作為指標選擇的候選肽是否實際上具有殺傷T細胞誘導活性。殺傷T細胞誘導活性可通過如下確認誘導具有人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如，B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞)，更具體地，誘導源自人外周血單核白細胞的樹突細胞；用目標肽刺激它們；然后將它們與CD8陽性細胞混合；再測量對于靶細胞的細胞毒活性。反應系統可使用表達人HLA抗原的轉基因動物(如在，例如，BenMohamedL，等(2000)Hum.Immunol.61(8):764_79，RelatedArticles,Books，禾口Linkout中所描述的)。例如，可用51Cr等放射標記靶細胞，然后可依據靶細胞釋放的放射性計算細胞毒活性。或者，可通過在具有固定化肽的抗原呈遞細胞存在的條件下測量由殺傷T細胞產生和釋放的IFN-γ；并使用抗-IFN-γ單克隆抗體在培養基中顯現IFN-γ產生區，來檢查靶細胞。如實施例所示，檢查肽的殺傷T細胞誘導活性的結果顯示，與HLA抗原具有高結合親和力的肽不一定具有高誘導活性。然而，含有F0XMl-362-370(YLVPIQFPV(SEQIDNO:1)),F0XM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQIDNO2))和F0XM1640-649(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))中任一個的氨基酸序列的九肽顯示特別高的殺傷T細胞誘導活性。如上所述，本發明提供顯示殺傷T細胞誘導活性的肽，更具體地，包括SEQIDNO1至3中任一個的氨基酸序列和其變體(即，取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸的氨基酸序列)的肽。優選地，包括SEQIDNO:1至3中任一個的九個氨基酸或其變體的肽的氨基酸序列與其他內源蛋白質的氨基酸序列不同。特別地，具有高HLA-A2結合親和力的肽可通過如下獲得用亮氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起的第二個氨基酸，和/或用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸。本發明的肽可包括修飾如糖基化、側鏈氧化和磷酸化，只要肽不丟失它們的誘導殺傷T細胞活性。其它修飾包括，例如，D-氨基酸和其它氨基酸類似物，它們可用于增加肽的血清半衰期。用于獲得和產生本發明的肽的方法沒有特定的限制。它們可以是化學合成的肽或通過基因重組技術產生的重組肽。本發明的化學合成的肽可根據化學合成方法如Fmoc方法(芴甲氧羰基(fluorenylmethyIoxycarbony1)方法)禾口t_Boc方法(叔丁氧幾基(t-butyloxycarbonyl)方法)來合成。本發明的肽還可以利用多種商業上可得到的肽合成儀來合成。可通過獲得具有編碼肽的核苷酸序列的DNA，或其變體或同源物，并將它們引入合適的表達系統，來以重組蛋白質的形式產生本發明的肽。使用的表達載體可優選為任何能夠在宿主細胞中自主復制，或可整合入宿主細胞的染色體，并在合適的位置含有啟動子以允許表達編碼肽的基因的載體。可通過將上述表達載體引入宿主來產生具有編碼本發明的肽的基因的轉化體。宿主可為任何細菌、酵母、動物細胞和昆蟲細胞，且可根據宿主的不同使用已知技術將表達載體引入宿主。在本發明中，可通過培養如上所述制備的轉化體，在培養物中產生并積累肽，并由培養物收集本發明的肽，從而分離重組肽。當轉化體是原核細胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細胞如酵母時，用于這些微生物的培養基可為天然或合成培養基，只要它包含碳源、氮源、礦物質等，可以被微生物利用，并允許有效率地培養轉化體。培養條件可以是常規用于培養微生物的那些。培養后，可使用常規的肽分離和純化方法來從轉化體的培養物中分離和純化本發明的肽。本領域的技術人員基于關于編碼SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列的DNA核苷酸序列的信息可適當地產生或獲得包含在SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一個、兩個或數個氨基酸的氨基酸序列的肽。具體地，編碼包含在SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸的氨基酸序列并顯示殺傷T細胞誘導活性的肽的基因可通過本領域的技術人員已知的任何方法產生，如化學合成、遺傳工程技術和誘變。例如，作為一種遺傳工程技術，定點誘變方法是有用的，因為它可將特定的突變引入特定的位置。其可根據MolecularCloning:AlaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.，1989(下文中稱為MolecularCloning，第2版)禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,JohnWiley&Sons(1987-1997)(下文中稱為CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的方法來進行。本發明的上述肽可誘導針對癌癥的免疫力，如在下面的實施例中所示。因此，本發明提供包含本發明的一種或多種肽作為活性成分的、用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑。本發明誘導免疫力的藥劑可制備成將兩種以上表位肽組合的混合制劑。通過組合多種肽而配制的、能誘導免疫力的藥劑，可以是雞尾酒(cocktail)，或者也可以是使用標準技術相互結合的。要組合的表位肽(印itopepeptides)可以是這樣的肽，它們具有源自同一基因的不同氨基酸序列；或者也可以是這樣的肽，它們具有源自不同基因的氨基酸序列。當施用本發明的肽時，施用的肽被以高密度呈遞給抗原呈遞細胞的HLA抗原，隨后，誘導出可與被施用的肽和HLA抗原之間形成的復合物特異性反應的殺傷T細胞。或者，通過將由受試者收集的樹突細胞與本發明的肽接觸(或通過用本發明的肽沖激由受試者收集的樹突細胞)，可獲得將本發明的肽呈遞于其細胞表面的抗原呈遞細胞。通過將這些抗原呈遞細胞施用回受試者，可在受試者體內誘導殺傷T細胞，結果，可增強呈遞本發明的肽的靶細胞的免疫反應。當體外或體內(優選體外)使用時，本發明用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑可誘導輔助T細胞、殺傷T細胞或包括這些細胞的免疫細胞群體，從而提供針對癌癥的免疫力。(2)本發明用于治療和/或預防癌癥的藥劑(癌癥疫苗)實施例中顯示，本發明的肽可在體內誘導對癌細胞特異性的殺傷T細胞。在另一方面，先前的發明顯示，F0XM1在肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性髓細胞性白血病、惡性淋巴瘤、宮頸癌、骨肉瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤和結腸癌等的大多數病例中高表達。因此，我們預期，包括一種或多種本發明的肽作為活性成分的誘導免疫力的試劑，可以有效地用作治療和/或預防癌的藥劑。就是說，可以預期，通過將本發明的肽連同合適的佐劑注入體內，或通過用肽沖激抗原呈遞細胞如樹突細胞后將它們注入體內，可以誘導和活化攻擊腫瘤的殺傷T細胞。因而，結果是，可預期產生抗癌效果。此外，可將編碼本發明的肽的基因摻入合適的載體。呈遞人抗原的細胞(樹突細胞等)和用重組DNA轉化的細菌如BCG結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，或基因組中整合有編碼本發明的肽的DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作治療和/或預防人癌癥的活疫苗。用于癌癥疫苗的劑量和施用方法與用于常規天花疫苗和BCG疫苗的那些相同。在本發明中，術語“疫苗”(亦稱為“免疫原性組合物”)指當被接種于動物時能誘導抗腫瘤免疫力或抑制多種癌癥的物質。本發明提示，包括SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽，其可誘導針對FOXMl呈遞細胞的特異性的強免疫應答。因此，本發明也包括用于通過使用包含SEQIDNO:1至3中任一個的氨基酸序列或其包括取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸的變體的肽來誘導抗腫瘤免疫力的方法。通常，抗腫瘤免疫力包括如下免疫應答(1)針對含有FOXMl-表達細胞的腫瘤的殺傷T細胞的誘導，(2)識別含有FOXMl-表達細胞的腫瘤的抗體的誘導，和(3)抗腫瘤細胞因子的產生的誘導。當特定的肽通過接種動物而誘導出這些免疫應答中的任一種時，確定該肽具有誘導抗腫瘤免疫力的作用。肽的誘導抗腫瘤免疫力的作用可通過觀察宿主中的免疫系統對于肽的體內或體外應答來加以檢測。例如，用于檢測誘導殺傷T細胞的方法是熟知的。侵入活體的外源物質通過抗原呈遞細胞(APC)的作用被呈遞于T細胞和B細胞。T細胞以抗原特異性的方式應答于抗原呈遞細胞所呈遞的抗原，通過抗原的刺激作用分化成殺傷T細胞(還稱為細胞毒性T細胞或CTL)，然后增殖。在本申請中，此過程被稱為T細胞的“活化”。特定的肽對殺傷T細胞的誘導作用，可通過利用該肽沖激過的抗原呈遞細胞將肽呈遞于T細胞，然后檢測殺傷T細胞的誘導來進行評價。此外，抗原呈遞細胞具有活化CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞(eosinophil)和NK細胞的作用。由于CD4+T細胞在抗腫瘤免疫中是重要的，因此可將對于這些細胞的活化的影響作為指標，用來評價肽的抗腫瘤免疫力誘導作用。對于使用樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞誘導的殺傷T細胞而言，評價它們的誘導效果的方法是本領域公知的。在抗原呈遞細胞中，DC具有最強的殺傷T細胞誘導效果。在此方法中，首先，將測試肽與DC接觸，然后將DC與T細胞接觸。從與DC接觸過的T細胞中檢測出對靶細胞具有細胞毒作用的T細胞。如果T細胞顯示針對靶細胞的細胞毒活性，則意味著測試肽具有誘導細胞毒T細胞的活性。例如，可使用51Cr-標記的腫瘤細胞的裂解作為指標，檢測殺傷T細胞針對靶細胞如腫瘤的活性。或者，可使用3H-胸腺嘧啶攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評價腫瘤細胞損害的程度。通過這些方法確認表現殺傷T細胞誘導活性的測試肽，是表現DC-活化作用和隨后的殺傷T細胞誘導活性的肽。因此，表現誘導針對腫瘤細胞的殺傷T細胞的活性的肽可用作針對呈遞FOXMl的癌癥的疫苗。此外，已通過與肽接觸而獲得了誘導針對癌癥的殺傷T細胞之能力(活性)的抗原呈遞細胞，可用作針對癌癥的疫苗。此外，通過抗原呈遞細胞呈遞肽而獲得了細胞毒性的殺傷T細胞還可用作針對癌癥呈遞FOXMl的疫苗。利用抗原呈遞細胞和殺傷T細胞進行抗腫瘤免疫，使用這樣的抗腫瘤免疫的癌癥治療方法稱為細胞免疫療法(cytoimmunotherapy)。通常，當使用肽進行細胞免疫療法時，可通過組合具有不同結構的多個肽來增強誘導殺傷T細胞的效率。因此，當用蛋白質片段刺激DC時，使用多個類型的肽片段的混合物是有利的。肽對抗腫瘤免疫力的誘導還可通過觀察針對腫瘤的抗體產生的誘導來評價。例如，當在用肽免疫的實驗室動物中誘導出針對肽的抗體，而這些抗體抑制腫瘤細胞的生長、增殖和/或轉移時，則確定該肽可誘導抗腫瘤免疫力。可通過施用本發明的疫苗來誘導抗腫瘤免疫力，而為治療和/或預防癌癥提供可能。治療癌癥和/或預防癌癥發生的效果可包括抑制癌細胞生長、癌細胞的退行(regression)和癌細胞產生的抑制。患癌癥的個體的死亡率降低、血中的腫瘤標志物減少、和與癌癥有關的可檢測癥狀的減少也包括在治療和/或預防癌癥的效果中。優選地，疫苗針對癌癥的治療和/或預防效果與無疫苗施用的對照的情況相比是統計學上顯著的。例如，優選效果是以5%以下的顯著性水平觀察到的。統計學方法如Studentt_檢驗、Mann-WhitneyU檢驗、ANOVA等可用于確定統計顯著性。在本發明中，受試者優選是哺乳動物。哺乳動物的實例包括人、非人靈長類(non-humanprimate)、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛(cattle)，但不限于此。本發明的肽可體內或回體(exvivo)施用于受試者。此外，為了產生用于治療和/或預防癌癥的免疫原性組合物，可使用本發明的免疫原性肽，也就是，選自SEQIDN0:1至3的氨基酸序列的九肽和其突變肽。更具體地，本發明提供用于治療腫瘤或預防腫瘤生長、轉移等的藥劑，其包括一種或多種本發明的肽作為活性成分。本發明的肽特別有用于治療腫瘤如胰腺癌、膽管細胞癌、胃癌、結腸癌、非小細胞肺癌、睪丸癌、子宮頸癌、骨肉瘤和軟組織肉瘤。本發明的肽可作為通過常規配制方法配制的藥劑直接施用于受試者。這樣的配制物除了本發明的肽之外，可根據需要包含可藥用的載體、賦形劑等。本發明的藥劑可用于治療和/或預防多種腫瘤。此外，為了有效地建立細胞免疫力，包含一種或多種本發明的肽作為活性成分的用于治療和/或預防腫瘤的藥劑中可混入佐劑。所述藥劑可與其他活性成分(如抗腫瘤劑)一起共施用。適當的制劑還包括顆粒。適當的佐劑描述于文獻(JohnsonAG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.,7277-89)中。佐劑的實例包括弗氏不完全佐劑、BCG、海藻糖二霉酚酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)、脂多糖(LPS)、硫酸鋁鉀佐劑、硅石佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬(alum)，但不限于此。此外，可方便地使用脂質體配制物、其中藥物結合于具有數微米直徑的珠子的顆粒制劑和其中脂質結合于上述肽的制劑。施用方法可為口服施用、皮內注射、皮下注射、靜脈注射等，并可包括全身施用(systemicadministration)和靶腫瘤附近的局部施用。本發明的肽的劑量可根據要治療的疾病、患者的年齡和體重、施用方法等而適當地調節。劑量通常為0.OOlmg至lOOOmg，優選0.Olmg至lOOmg，更優選0.Img至10mg。優選地，幾天一次到幾個月一次進行施用，但本領域的技術人員可容易地選擇適當的劑量和施用方法；而且這些參數的選擇和優化完全在常規技術的范圍內。制劑的形式沒有特定的限制，可以是為通過加入賦形劑(如糖)而粒化的或冷凍干燥的。可加入本發明的藥劑用于增加殺傷T細胞誘導活性的助劑(auxiliaryagent)包括BCG細菌等的菌體組分，包括胞壁酰二肽(MDP)；Nature,vol.344,p873(1990)中描述的ISCOMJ.Immunol,vol.148，pl438(1992)中描述的皂苷系列(saponinseries)的QS-21；脂質體和氫氧化鋁等。此外，還可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香菇多糖(Ientinan)、西佐喃(sizofiran)和溶鏈菌(picibanil)作為助劑。還可以使用增強T細胞的生長和分化的細胞因子等，如IL-2、IL-4、IL-12、IL-I、IL-6和TNF，以及活化NK-T細胞的α“半乳糖基神經酰胺，以及通過結合于Toll-樣受體來活化天然免疫系統的脂多糖(LPS)和CpG，等等，作為助劑。本發明的疫苗組合物包含引發殺傷T細胞的組分。脂質已被鑒定為用于針對病毒抗原進行體內初次刺激(priming)的物質。例如，可將棕櫚酸殘基結合于賴氨酸殘基的ε-氨基和α-氨基，然后與本發明的免疫原性肽連接。脂質化的肽可通過摻入膠束或顆粒，或封裝入脂質體，或在佐劑中乳化來直接施用。脂質初次刺激的另一個實例是用大腸桿菌脂蛋白如三棕櫚酰-S-甘油基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycery1-cysteinyl-seryl-serine)(P3CSS)當將其共價結合于合適的肽時進行引發(DeresK.，等，(1989)Nature342:561_4)。本發明的免疫原性肽可通過病毒載體或細菌載體表達。適當表達載體的實例包括無毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如，可以使用痘苗病毒作為載體來表達編碼所述肽的核苷酸序列。將重組牛痘病毒引入宿主細胞，表達出免疫原性肽，弓丨發免疫應答。也可以使用例如在美國專利No.4，722，848中描述過的使用牛痘載體的免疫方法。也可以使用卡介苗(BacilleCalmette-Guerin)(BCG)。StoverCK等，(1991)Nature31456-60中描述了BCG載體。其他多種可用于治療性施用或免疫的載體在本領域內是已知的，這些載體包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒樣桿菌(傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi))載體和脫毒的炭疽毒素載體。參見，例如，ShataMT等，(2000)Mol.Med.Today666-71；ShedlockDJ和WeinerDB等，(2000)J.Leukoc.Biol.68793-806；和HippJD等，(2000)InVivo14:571-85。可通過如下方式在患者體內有效地誘導殺傷性T細胞在體外將抗原肽添加至從患者收集的細胞或來自另一個與之共有部分HLA等位基因的個體的細胞(同種異體細胞(allogeneiccell))，并呈遞抗原，然后將這些細胞血管內施用給患者或局部施用到腫瘤處等。或者，通過將肽添加至患者的外周血淋巴細胞并在體外培養它們而在體外誘導殺傷T細胞，而后可將這些細胞可以血管內施用給患者或局部施用到腫瘤處等。這樣的細胞轉移治療已經被實施作為癌癥治療，并且是本領域技術人員中熟知的一種方法。本發明的癌癥類型無特別限制，具體的例子包括食道癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結腸癌、胰腺癌、惡性黑素瘤(黑素瘤)、惡性淋巴瘤、骨肉瘤、嗜鉻細胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、腦腫瘤、慢性髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、肉瘤等。適合應用本發明的癌癥的實例包括膽管癌、肺癌、胰腺癌和膀胱癌。(3)本發明的抗體本發明還涉及能夠識別作為表位(抗原)的本發明上述的肽的一部分或完整的肽的抗體，并涉及通過使用該蛋白或該肽體外刺激而誘導的殺傷T細胞。通常，殺傷T細胞顯示出比抗體更強的抗腫瘤活性。此外，與本發明的肽相似，本發明抗體可用作針對表達F0XM1的癌癥的預防劑和/或治療劑，只要這些抗體能抑制F0XM1癌癥抗原的活性。在實際應用中，本發明的肽或抗體可以按原樣施用，或通過與可藥用載體和/或稀釋劑，視需要加上佐劑，一起注射施用。或者，它們可以通過噴霧方法等經粘膜通過透皮吸收施用。更具體地，在本申請中，人血清白蛋白是載體的實例；而PBS、無菌水等是稀釋劑的實例。本發明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并可以用本領域技術人員已知的方法來生產。例如，多克隆抗體可通過如下獲得用本發明的肽作為抗原免疫哺乳動物或鳥類物種，并從哺乳動物或鳥類物種收集血液，從收集的血液中分離和純化抗體。例如，可免疫哺乳動物，如小鼠、倉鼠、豚鼠、家禽(Chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊和牛、或鳥類物種。免疫的方法是本領域技術人員已知的，抗原可例如在例如7到30天的間隔施用2到3次。劑量可以是，例如，每次施用約0.05毫克到2毫克的抗原。對施用途徑沒有特定限制，且可以合適地選自皮下施用、皮內施用、腹膜內施用、靜脈內施用、肌肉內施用等。此外，抗原可以在溶解于適當的緩沖液，例如，含常規的佐劑如弗氏完全佐劑或氫氧化鋁的緩沖液后施用。將經免疫的哺乳動物或鳥類物種飼養一段時間后，當抗體效價增加時，可將另外用例如100微克到1000微克的抗原對它們進行免疫。最后施用后一到兩個月，可從經免疫的哺乳動物或鳥類物種收集血液，血液可以通過常規方法來分離，來獲得識別本發明肽的多克隆抗體作為多克隆抗血清，所述的常規方法如離心、用硫酸銨或聚乙二醇沉淀、層析如凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。在另一方面，單克隆抗體可以通過制備雜交瘤獲得。例如，雜交瘤細胞可以通過將產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞系的細胞融合而獲得。產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤可以通過細胞融合方法獲得，如下文所示的方法。使用來自于經免疫動物的脾細胞、淋巴結細胞、B淋巴細胞等作為產生抗體的細胞。將本發明的肽用作抗原。可用小鼠和大鼠等動物作為免疫動物，將抗原施用于這些動物可通過常規方法來進行。例如，通過將作為抗原的本發明的肽的懸浮液或乳劑與佐劑如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑以靜脈內、皮下、皮內、腹膜內等施用于動物幾次來免疫動物。從經免疫動物中獲得產生抗體的細胞，如脾細胞，并可以通過已知方法(G.Kohler等，Nature,256，495(1975))將它們與骨髓瘤細胞融合來產生雜交瘤。對于小鼠，用于細胞融合的雜交瘤細胞系的實例包括，例如，P3X63Ag8、P3U1、Sp2/0等。將融合促進劑如聚乙二醇和仙臺病毒用于細胞融合，而且在細胞融合后將次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培養基用于通過常規方法選擇雜交瘤。通過細胞融合獲得的雜交瘤可以通過有限稀釋法等進行克隆。根據需要，產生特異識別本發明肽的單克隆抗體的細胞系可以通過使用本發明的肽在以酶免疫測定方法的篩選中獲得。除上述方法之外，可以通過使用本發明的肽、表達所述肽的細胞、或其裂解物體外刺激人淋巴細胞(如感染了EB病毒的淋巴細胞)來調節免疫細胞。可與本發明的肽結合的人抗體可以通過將經免疫的淋巴細胞與人來源的骨髓瘤細胞如U266(特開昭63-17688(未審查、已公開的日本專利申請))進行融合來獲得。為了從這樣獲得的雜交瘤產生需要的單克隆抗體，可以用常規培養方法或腹水形成方法培養雜交瘤，并可以從培養物上清液或腹水中純化單克隆抗體。從培養物上清液或腹水中純化單克隆抗體可以通過常規方法進行。例如，可將硫酸銨分級、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等合適地組合和使用。可以使用本發明肽，表達所述肽的細胞、或其裂解物來免疫具有一組人抗體基因的轉基因動物。可以從經免疫的轉基因動物中收集產生抗體的細胞，并將它們與上述骨髓瘤細胞系融合以獲得雜交瘤。然后可以從雜交瘤中產生需要的單克隆抗體(W092/03918;W094/02602；W094/25585；W094/33735；W096/34096)。此外，也可以使用癌基因使產生抗體的免疫細胞(如經免疫的淋巴細胞)永生化，并用來制備單克隆抗體。這樣獲得的單克隆抗體也可以使用基因操作技術(Borrbaeck和Larrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies)進行調節。例如，可通過從產生抗體的細胞(如雜交瘤和經免疫的淋巴細胞)克隆編碼抗體的DNA，將其插入合適的載體，和將后者引入宿主細胞來制備重組抗體。本發明的抗體還可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它們可與本發明的肽結合即可。抗體片段可以是Fab、F(ab，)2、FV、或單鏈Fv(SCFv)，其中其中scFv中源自H和L鏈的Fv片段以合適的接頭連接在一起(Huston等，(1998)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具體地，可通過用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co等，(1994)JImmunol152:2968-76;Better禾口Horwitz，(1989)MethodsEnzymol178:476_96；Pluckthun禾口Skerra，(1989)MethodsEmzymol178:497_515;Lamoyi(1986)MethodsEnzymol121652-63；Rousseaux等，(1986)MethodsEnzymol121663-9；Bird和Walker,(1991)TrendsBiotech9132-7)處理抗體來制備抗體片段。本發明的抗體包括通過將抗體與多種分子如聚乙二醇(PEG)結合而獲得的修飾抗體。可通過本
技術領域：
已知的常規的化學修飾方法來進行修飾抗體。本發明的抗體包括嵌合抗體和人源化抗體，嵌合抗體包含源自非人抗體的可變區和源自人抗體的恒定區，人源化抗體包括源自非人抗體的互補決定區(CDR)、源自人抗體的框架區(FR)和源自人抗體的恒定區。這樣的抗體可以用本
技術領域：
已知的常規方法制備。人源化抗體通過用具有需要的結合活性的嚙齒動物的CDR區取代人抗體的CDR序列區而獲得(Verhoeyen等，(1988)Science239:1534-6)。因此，與嵌合抗體相比，人源化抗體是其中人抗體的較小區域被非人來源的相應區域取代而獲得的抗體。還可以制備除人源框架區和恒定區外還具有人源可變區的完整人抗體。例如，在一種體外方法中，可以使用展示人抗體片段的噬菌體重組文庫來進行篩選(Hoogenboom和Winter，(1992)JMolBiol227:381-8)。類似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座引入內源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉基因動物來產生人抗體(US6，150，584、US5,545，807、US5,545，806、US5,569，825、US5,625，126、US5,633，425和US5,661，016)。如上所述獲得的抗體可通過本領域的常規方法純化至均質。例如，可以使用普通的蛋白質分離和純化方法。可通過柱層析法如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等的組合來分離和純化抗體；然而，分離和純化方法不限于此(Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow禾口DavidLane，(1988)ColdSpringHarborLaboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。蛋白A柱用的實例包括HyperD、P0R0S禾口SepharoseRF(Pharmacia)0除了親和層析外，層析的實例包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層|1τ>吸附M·(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.等)。液相色譜如HPLC和FPLC也可以用于層析。本發明抗體的抗原結合親和力可使用，例如，吸光度測量、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)和免疫熒光測定法來測量；然而，方法不限于此。對于ELISA，將本發明的抗體固定在平板上，加入本發明的肽，然后加入含有產生抗體的細胞的培養物上清液或純化抗體的樣本。隨后，加入可識別并檢測其抗原結合親和力待測的抗體的標記的第二抗體。洗滌平板后，加入用于檢測第二抗體的標記的試劑，并測量吸光度等。例如，酶如堿性磷酸酶可以用作第二抗體的標記物，酶底物如磷酸對硝基苯酯可用作檢測試劑。BIAcOre(Pharmacia)也可以用于評估抗體活性。本發明的抗體可檢測包含在樣品中的本發明的肽。具體地，例如，可通過將癌組織的活檢樣本與本發明的抗體接觸來確認本發明的肽在癌組織中的存在。在將本發明肽用于癌癥的治療性和/或預防性處理之前，可能的是通過使用本發明的抗體評價本發明肽在將待治療的癌癥中的表達，在治療開始前預測效果在測試受試者中是否有希望。此外，由于本發明抗體識別FOXMl肽片段，而該肽的表達在多種癌細胞中增加，所以預期它們的應用不僅可用于診斷中而且還用于治療。(4)輔助T細胞，殺傷T細胞，或包含它們的免疫細胞群本發明還涉及通過用本發明的肽體外刺激誘導的殺傷T細胞和輔助T細胞，或包含殺傷T細胞和輔助T細胞的免疫細胞群。例如，當使用本發明肽在體外刺激外周血淋巴細胞或腫瘤浸潤性淋巴細胞時，可誘導出腫瘤反應性的活化T細胞，這些活化T細胞可有效地用于過繼免疫治療(adoptiveimmimotherapy)，其中將所述細胞血管內施用于癌癥患者、局部施用于腫瘤等。或者，作為強力的抗原呈遞細胞，樹突細胞也可以用本發明肽進行沖激或經遺傳轉化以表達所述肽，并可通過使用這些樹突細胞在體內或體外刺激T細胞來誘導抗腫瘤免疫應答。優選通過使用本發明的肽和佐劑進行體內或體外刺激，來誘導殺傷T細胞、輔助T細胞或包含它們的免疫細胞群。本申請使用的佐劑的實例包括礦物油、氫氧化鋁、結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)制劑、溶血性鏈球菌屬(hemolyticStreptococcus)制劑、多孔菌科(Polyporaceae)制劑、其他佐劑、細胞生長因子和細胞因子。可通過輸注由此獲得的輔助T細胞、殺傷T細胞或包含它們的免疫細胞群，包括將它們向癌癥患者血管內、向腫瘤局部輸注等，來抑制腫瘤并且預防和/或治療癌癥。如上所述可抑制腫瘤的殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群，可使用本發明的肽來產生。因此，本發明提供含有本發明肽的細胞培養基。可使用細胞培養基制備能抑制腫瘤的殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群。此外，本發明提供用于生成殺傷T細胞、輔助T細胞，或包含它們的免疫細胞群的細胞培養試劑盒，包括上述細胞培養基和細胞培養容器。(5)抗原呈遞外來體本發明進一步提供一種稱為“外來體”(exosome)的細胞內小泡，該外來體將由本發明肽和HLA抗原形成的復合物呈遞到其表面。外來體可以使用例如在第平11-510507號(對應于非日語國際公開的未審查的日本國家階段公布)和第2000-512161號中公開的日語譯文中詳細描述的方法進行制備。優選地，可使用從治療和/或預防的受試者獲得的抗原呈遞細胞來制備外來體。可將本發明的外來體以與本發明肽相似的方式作為癌癥疫苗進行注射。在本發明中使用的HLA抗原類型應該與需要治療和/或預防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如HLA抗原類型是HLA-A2，并優選為HLA-A2(HLA_A*0201)。“HLA-A2”表示蛋白，而“(HLA-A*0201)”表示與該蛋白的區段相對應的基因(因為目前沒有表示該蛋白區段的術語)。(6)誘導抗原呈遞細胞和殺傷T細胞的方法本發明提供使用一種或多種本發明的肽誘導抗原呈遞細胞的方法。可通過使一種或多種本發明的肽接觸由外周血單核細胞誘導的樹突細胞以刺激樹突細胞，從而誘導抗原呈遞細胞。當對受試者施用本發明的肽時，可以在受試者體內誘導出在其表面呈遞本發明的肽的抗原呈遞細胞。或者，可使用回體方法，其中將抗原呈遞細胞與本發明的肽接觸(或用本發明的肽沖激抗原呈遞細胞)，然后將細胞作為疫苗施用于受試者。例如，回體施用方法可包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細胞；和(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細胞接觸本發明的肽(或用本發明肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細胞)。可將步驟(2)中獲得的抗原呈遞細胞作為疫苗施用于受試者。本發明還提供誘導顯示殺傷T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法。這種方法包括用包含編碼一種或多種本發明肽的多核苷酸的基因體外轉染抗原呈遞細胞的步驟。要轉染的基因可以是DNA或RNA。對于轉染，可合適地使用本領域常規進行的多種方法，如脂質轉染、電穿孔和磷酸鈣方法，但所述方法不限于此。更具體地，轉染可如ReevesME等，(1996)CancerRes.,56:5672_7；ButterfieldLH等，(1998)J.Immunol.，161:5607_13；BoczkowskiD等，(1996)JExp.Med.，184465-72；和公開的W02000/509281日語譯文中所述進行。當基因轉染入抗原呈遞細胞時，它們在細胞內被轉錄和翻譯。隨后所得的蛋白質經由MHCI類或II類途徑進行加工，并經過抗原呈遞途徑作為部分肽呈遞在抗原呈遞細胞的表面。本發明還提供使用一種或多種本發明肽誘導殺傷T細胞的方法。通過將一種或多種本發明肽施用于受試者，可在受試者體內誘導出殺傷T細胞，從而加強靶向在腫瘤組織中呈遞FOXMl的癌細胞的免疫系統。或者，可通過在體外使來自受試者的抗原呈遞細胞和CD8陽性細胞與一種或多種本發明肽接觸，并通過在體外使外周血單核白細胞與抗原呈遞細胞接觸來刺激細胞，從而誘導活化的殺傷T細胞。在回體治療方法中，可通過將活化的殺傷T細胞回輸(return)入受試者體內來增強靶向受試者癌組織中呈遞FOXMl的癌細胞的免疫系統。例如，此方法包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細胞；(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細胞接觸本發明的肽(或用本發明的肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細胞)；(3)將步驟(2)中的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合并共培養來誘導細胞毒性T細胞；和(4)從步驟(3)的共培養物中收集⑶8+T細胞。從步驟(4)中獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗施用于受試者。本發明還提供用一種或多種本發明的肽誘導的分離的殺傷T細胞。優選地，通過本發明的方法誘導的殺傷T細胞源自接受治療和/或預防的受試者。可將所述細胞與其他包含呈遞本發明一種或多種肽的抗原呈遞細胞或外來體的藥劑組合施用。獲得的殺傷T細胞對于呈遞與誘導所用的肽相同的肽的靶細胞是特異性的。靶細胞是內源性表達FOXMl的細胞或者是用FOXMl基因轉染的細胞。通過用本發明的肽進行刺激，在其表面呈遞本發明的肽的細胞，如來自胰腺癌、膽管細胞癌、胃癌、結腸癌、非小細胞肺癌、睪丸癌、子宮頸癌、骨肉瘤和軟組織肉瘤的癌細胞，可以是攻擊的目標。本發明還提供呈遞以HLA抗原和一種或多種本發明肽形成的復合物的抗原呈遞細胞。優選從接受治療和/或預防的受試者收集表達一種或多種本發明的肽或編碼這些肽的核苷酸的抗原呈遞細胞。本發明的肽、呈遞此肽的抗原呈遞細胞、外來體、或活化的殺傷T細胞，可以作為疫苗與其他藥劑組合施用。將參考下面的實施例進一步說明本發明；然而，不應理解為受限于這些實施例。本說明書中引用的所有現有技術參考文件均通過提述并入本文。實施例[實施例1](1)選擇顯示與HLA-A2有親和力的FOXMl肽使用BIMAS系統分析人FOXMl的氨基酸序列，并選擇了預計與20種以上HLA-A2具有結合親和力的23種。[表1-1]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在本發明中鑒定的HLA-A2限制性人殺傷T細胞表位加有下劃線。[實施例2]通過HLA-A2結合性FOXMl肽誘導人殺傷T細胞(1)血液收集經知情同意從健康個體和正在熊本大學醫學部附屬醫院(KumamotoUniversityMedicalSchoolHospital)經受治療的HLA-A2陽性乳腺癌患者收集血液樣品(50ml)。然后，根據先前報道的方法(Nakatsura,Τ.等，Eur.J.Immunol.32，826-836，2002)使用Ficoll-Conray密度梯度離心方法分離外周血單核細胞。(2)從外周血單核細胞分離CD8陽性細胞和誘導殺傷T細胞由分離的外周血單核細胞誘導FOXMl肽特異性殺傷T細胞。根據KomorLH.等的報道(Komori,H.等，Clin.Cancer.Res.12:2689_2697，2006)誘導殺傷T細胞。首先，使用MACS分離外周血單核細胞中的CD8陽性細胞。在GM-CSF(100ng/mL)和IL_4(20ng/mL)存在的條件下將CD8陰性細胞培養四天用于分化成樹突細胞。此后，加入0K-432(0.IKE/mL)用于樹突細胞的成熟。在第七天，加入每種FOXMl肽(1(^10，然后在11^-7(101^/!^)存在的條件下將樹突細胞與CD8陽性細胞一起共培養。在與CD8陽性細胞一起共培養兩天后，加入IL-2(20IU/mL)。用源自自體CD8陰性細胞的樹突細胞進行的抗原刺激，以一周為間隔重復三次，來誘導肽特異性殺傷T細胞。(3)通過ELISP0T測定法檢查FOXMl-特異性殺傷T細胞活性使用ELISP0T測定，考察由FOXMl肽誘導的殺傷T細胞是否確實特異性地與這些源自FOXMl的肽反應而產生IFN-γ。ELISP0T測定通過先前報道的方法(Komori，H.等，Clin.Cancer.Res.12:2689_2697，2006)進行。結果，對于用F0XM1362-370,373-382和640-649肽誘導的殺傷T細胞觀察到F0XM1肽特異性的殺傷T細胞活化(圖1)。圖1顯示分析F0XM1肽誘導的殺傷T細胞所得到的代表性結果。(4)通過細胞毒性測試檢查殺傷T細胞的細胞毒活性通過細胞毒性測試來檢查誘導的F0XM1肽-特異性殺傷T細胞的細胞毒活性，使用HLA-A2陽性且表達F0XM1的細胞系panc-Ι和HLA-A2陰性且表達F0XM1的胰腺癌細胞系PK-8作為刺激細胞。使用細胞毒性測試通過鉻釋放測定法評價殺傷T細胞的細胞毒活性。使用先前報道的方法(Monji，M.等，Clin.Cancer.Res.10=6047-6057,2004)進行鉻釋放測定。結果，對于用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導的殺傷T細胞，觀察到HLA-A2限制性和F0XM1-特異性細胞毒活性(圖1)。工業實用性在本發明中，通過鑒定可結合于HLA-A2并活化癌細胞-損害性殺傷T細胞的F0XM1肽，開發了可靶向大約30%的患有高表達F0XM1的膽管癌、肺癌、胰腺癌等的日本人癌癥患者的癌癥肽疫苗。如果通過HLA-A2呈遞于殺傷T細胞的F0XM1肽的有效性可以在探索醫療中證實，那么可改進臨床應用于白種人的可能性。通過鑒定由HLA-A2(其在白種人中的陽性頻率很高)呈遞于殺傷T細胞的肽，可將肽不僅施用于大約30%的患有高表達F0XM1的癌癥的日本患者，而且還可施用于很多白種人癌癥患者。權利要求下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO1至3中任一氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO1至3中任一氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸，并且其中所述肽顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性。2.權利要求1的肽，其中自N末端起第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。3.權利要求1的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。4.一種用于誘導針對癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種權利要求1的肽作為活性成分。5.一種用于治療和/或預防癌癥的藥劑，其包含一種或多種權利要求1的肽作為活性成分。6.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權利要求1的肽作為活性成分。7.一種用于誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種編碼權利要求1的肽的多核苷酸作為活性成分。8.一種用于誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權利要求1的肽作為活性成分。9.針對權利要求1的肽的抗體。10.使用權利要求1的肽誘導的細胞毒性(殺傷)T細胞、輔助T細胞或包含它們的免疫細胞群體。11.一種抗原呈遞細胞，其呈遞包含權利要求1的肽及HLA抗原的復合物。12.權利要求11的抗原呈遞細胞，其是通過權利要求6或7的藥劑誘導的。13.—種外來體，其呈遞包含權利要求1的肽及HLA抗原的復合物。14.權利要求13的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA_A2*0201)。15.一種誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將抗原呈遞細胞與權利要求1的肽接觸的步驟。16.一種誘導顯示細胞毒性(殺傷)T細胞誘導活性的抗原呈遞細胞的方法，其包括將編碼權利要求1的肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞的步驟。17.一種誘導細胞毒性(殺傷)T細胞的方法，其包括將T細胞與權利要求1的肽接觸的步驟。18.一種誘導針對癌癥的免疫力的方法，其包括將權利要求1的肽施用于受試者的步馬聚o19.一種治療和/或預防癌癥的方法，其包括將權利要求1的肽施用于受試者的步驟。20.權利要求1的肽用于制備誘導針對癌癥的免疫力的試劑的用途。21.權利要求1的肽用于制備治療和/或預防癌癥的藥劑的用途。22.權利要求1的肽，其用于誘導針對癌癥的免疫力。23.權利要求1的肽，其用于治療和/或預防癌癥。全文摘要本發明的目的是通過如下提供對于日本約30％的以高水平表達叉頭框M1(FOXM1)的各種類型的癌癥患者實現癌癥免疫治療的手段鑒定可結合于HLA-A2的源自FOXM1的肽以活化可殺死癌細胞的人殺傷T細胞。具體公開的是選自如下(A)或(B)項的肽(A)包括SEQIDNO1至3中任一個所示的氨基酸序列的肽，和(B)在包括SEQIDNO1至3中任一個所示的氨基酸序列的肽中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數個氨基酸殘基并且具有誘導細胞毒(殺傷)T細胞的活性的肽。文檔編號A61K38/00GK101835792SQ20088011238公開日2010年9月15日申請日期2008年8月12日優先權日2007年8月20日發明者中村佑輔,橫峰和典,西村泰治,角田卓也申請人:腫瘤療法科學股份有限公司