專利名稱：Mmp-9的調節劑及其用途的制作方法
MMP-9的調節劑及其用途發明領域與背景本發明涉及MMP-9的調節劑，更具體地講，涉及靶向其OG結構域的調節劑。基質金屬蛋白酶(MMP)的生理作用和病理作用是多方面的。MMP家族的成員不僅 通過使胞外基質(ECM)組分進行分解代謝而且還通過加工各種可溶性介質，來參與炎性細 胞和癌細胞通過結締組織遷移的多個方面，加重許多疾病狀態。雖然所有MMP都有同樣的 催化部位，但是在其底物特異性方面觀察到顯著差異，這至少部分是由于非催化性蛋白結 構域上存在的額外底物結合部位所引起的。因此，不同的MMP具有不同的生物功能。MMP-9， 亦稱明膠酶B，由于其組織損傷作用和對可溶性蛋白的促炎加工(包括蛋白酶抑制劑、趨化 因子和細胞因子)，因此是炎癥性疾病的原型靶標(prototypical target)。相比之下，據推測MMP-2或明膠酶A通過使炎性趨化因子失活，并通過調節結締組 織更新，從而主要具有抗炎功能和穩態功能。這就意味著可以識別這些高度相似的酶的選 擇性抑制劑，對于無副作用的有效抗炎療法十分重要。從這一點來看，可以靶向區分MMP-2 和MMP-9的酶的其它非催化部分，來產生選擇性抑制劑。有趣的是，MMP-9和MMP-2之間的主要結構差異是在MMP-9中存在大量的O-糖基 化(OG)結構域[Opdenakker，G.等 Q001)，TrendsImmunol. 22，571-579 ；Van den Steen, P. Ε. ^ (2006) J Biol Chem. 281，18626-18637]。MMP-9 中的其它結構域也存在于 MMP-2 中，包括負責保持潛伏狀態的肽原結構域(pro-p印tide domain)、其中插入3個纖連蛋白 重復序列的催化結構域以及構成外結合位點(exosite)的C端結構域(亦稱血紅素結合蛋 白樣結構域)，所述外結合位點用于與內源MMP-9和MMP-2抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑 1 (TIMP-I)結合。盡管MMP-9在許多疾病中以及在與MMP-2相比之下極為重要，但是可獲得 的有關MMP-9的結構信息只限于其兩個末端結構域，而不是全長酶。含有催化結構域前體 (pro-catalytic domain)的 N端部分的 X 射線結構[Elkins 等，2002，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58，1182-1192]顯示它具有基質蛋白酶折疊。C端血紅素結合蛋白樣結 構域由具有假四折疊對稱(pseudo-four-fold symmetry)的4片β-螺旋漿葉片式結構組 成[Cha 等，2002，J Mol Biol 320，1065-1079]。圖 IA 表示 pro-MMP-9 的催化結構域前體 和血紅素結合蛋白樣結構域的晶體結構。結構域由代表64個氨基酸長的接頭(含有22個 脯氨酸殘基、6個甘氨酸殘基和大約12-14個0-聯聚糖)的虛線連接而成[Van den Steen 等，2001，Biochim Biophys Acta 1528,61-73] 重要的是，pro-MMP-9 的接頭結構域比 MMP 家族的膠原酶、溶基質蛋白酶和明膠酶A的接頭區長2-3倍，對于MMP家族，典型的接頭長 度跨距的范圍僅僅為21-27個氨基酸殘基。已經證實，要使pro-MMP-9的接頭結構域單獨或與其它蛋白質結構域一起結晶十 分困難。在甘氨酸的情況下缺乏大的側鏈，而且在脯氨酸的情況下存在內嵌轉角(built-in bend)，妨礙了二級結構的形成，并且常常形成環或松散區(unstructured region)。此外， 作為0-聚糖連接點的聚簇絲氨酸和蘇氨酸的存在可能產生會阻礙晶體堆積的位阻效應。 該結構域由于其與V型膠原具有序列相似性還一直被稱為V型膠原樣結構域，最近才被重 新命名為0-糖基化(OG)結構域。OG結構域在血紅素結合蛋白結構域的定向中具有活性，使得能夠進行外結合位點相互作用。然而，完全不了解有關OG結構域對MMP-9整個3D結 構及其生物物理學性質的影響。美國專利第20040175817號教導了根據MMP-9催化亞基的晶體結構對MMP_9調節 劑進行鑒定。然而，由于MMP—般在其催化部位都有共同的高序列同源性，因此設計靶向催 化部位的調節劑可能沒有對于MMP-9的選擇性。發明概述存在對MMP-9特異性調節劑的需求。一方面，提供調節金屬蛋白酶9(MMP_9)活性的方法，該方法包括使MMP-9與同 MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物(agent)接觸，從而調節MMP-9的活性。另一方面，提供鑒定能夠特異性調節MMP-9的調節物的方法，該方法包括確定該 調節物是否能夠與MMP-9的OG結構域進行相互作用，所述調節物是推定的MMP-9特異性調 節劑。再一方面，提供治療MMP-9介導的醫學病癥的方法，該方法包括給予有需要的受 治療者治療有效量的與MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物，從而治療MMP-9 介導的疾病或病癥。另外再一方面，提供能夠特異性調節MMP-9活性的分子，其中該分子與MMP-9的OG 結構域相互作用，前提條件是該分子不是非人源化抗體。另外一方面，提供包含與MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的抗原識別結構 域的人源化抗體。另外又一方面，提供包含能夠特異性調節MMP-9活性的分子作為活性成分和藥學 上可接受的載體的藥物組合物，其中該分子與MMP-9的OG結構域相互作用，前提條件是該 分子不是非人源化抗體。按照一個實施方案，所述MMP-9是天然MMP-9。按照又一個實施方案，所述活性是溶膠原活性(collagenolyticactivity)。按照又一個實施方案，所述活性是溶明膠活性(gelatinolyticactivity)。按照又一個實施方案，所述調節是增量調節。按照又一個實施方案，所述調節是減量調節。 按照又一個實施方案，所述調節物包括多肽調節物。按照又一個實施方案，所述多肽調節物包括抗體。按照又一個實施方案，所述調節物包括小分子。按照又一個實施方案，所述確定是通過將調節物的結構與MMP-90G結構域的結構 進行比較來實現的。按照又一個實施方案，所述確定是通過使所述調節物與分離的MMP-9的OG結構域 接觸來實現的。按照又一個實施方案，所述調節物包括多肽。按照又一個實施方案，所述多肽包括抗體。按照又一個實施方案，所述調節物包括小分子。按照又一個實施方案，所述調節物按照本文所述方法進行鑒定。按照又一個實施方案，所述調節物包括小分子或多肽調節物。
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按照又一個實施方案，所述多肽調節物包括抗體。按照又一個實施方案，所述分子包括人源化抗體，所述人源化抗體包含與所述 MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的抗原識別結構域。附圖簡述本文僅通過實施例并參考附圖對本發明進行描述。要強調的是，就現在具體參考 附圖細節而言，僅通過實施例，而且僅為了說明性地論述本發明的優選實施方案而給出細 節，并且是為了提供我們認為是對本發明的原理和構思方面最有用和最易理解的描述而提 供這些細節。在這點上，我們沒有試圖以比基本理解本發明所必需的更為詳細的方式來說 明本發明的結構細節，附圖中的說明，可使本領域技術人員了解本發明的幾種形式如何具 體體現在實踐中。附圖中圖IA-D是表征pro-MMP-9的計算機生成模型和各類圖。圖IA表示末端結構域的 晶體結構。Pro-MMP-9的N端結構域(PDB代碼1L6J)包含肽原(綠色)、3個纖連蛋白II 型重復序列(藍色)和催化結構域(紅色)與含鋅活性部位(灰色球)。OG結構域(虛 線)含有未知結構的64個殘基片段，它使N端結構域與由4個螺旋漿葉片(青色)組成的 C端血紅素結合蛋白樣結構域(PDB代碼1ITV)連接在一起。圖IB是表示大小排阻層析法 的曲線圖，表示pro-MMP-9的寡聚體種類(峰1，15. 8分鐘；峰2，22. 7分鐘)和單體(峰 3,25. 1分鐘)形式的洗脫分布曲線。插圖具有已知斯托克斯半徑(Stokes radii)的蛋 白質標準溶液的Porath曲線[57]用來標定superdex 200柱(從左到右甲狀腺球蛋白85 A、鐵蛋白61 A、過氧化氫酶52.2 A、醛縮酶48.1 A、白蛋白35.5 A)。將Kd的立方根對每 種蛋白質的斯托克斯半徑作圖，并給出線性最小二乘方擬合。圖IC是明膠酶譜的照片。為 了將單體與制備量的較高寡聚體結構分離開來，采用了甘油沉降。對明膠酶譜中每個流分 的等分量進行了分析。流分1-3中存在高寡聚體結構。流分3含有全部寡聚體形式的混合 物。流分4-7主要含有單體形式。圖ID是用來計算沉降系數分布的分析型超速離心沉降 速度分析。插圖由是時間和距轉動軸距離的函數的實驗數據(點)按模型繪制的沉降分 布曲線(線圖)。殘差圖見上方的小圖。為了清楚起見，只顯示分析中所用的每一個的第十 條分布曲線。圖2A-E是計算機生成模型和表示pro-MMP-9結構分析的各類圖。圖2A曲線圖 表示溶液中pro-MMP-9的SAXS數據。應用CHADD將X射線強度實驗數據(黑點)與最可 能模型(灰線)相比較。插圖SAXS實驗數據的對分布函數。圖2B表示通過CHADD重構 的ftx)-MMP-9模型。由SAXS數據獲得的模型用半徑為5 A的白球表示。每個模型以0°和 90°沿垂直軸旋轉。N端和C端結構域的對接晶體結構(dockedcrystal structure) [22、 24]分別用藍色帶狀結構和紅色帶狀結構表示。圖2C是通過PONDR[37]預測的pro-MMP-9 的序列中的長無序區(long-disorder region)(粗黑線)和相應的結構域組構(上條形 柱PR0-肽原，CAT+FN-催化結構域和3個纖連蛋白II型重復序列，0G-0-糖基化結構域， PEX-血紅素結合蛋白樣結構域)。圖2D表示具有重構OG結構域的全長pro-MMP-9的計算 散射曲線與實驗數據的擬合。最佳的3個模型的計算曲線用綠線、青線和黃線表示。實驗 數據用黑點表示。運用CHADD模型內的RAPPER[38、39]計算出OG結構域的3個最佳模型。 圖2E表示OG結構域的結構重構。最佳的3個模型用綠色、青色和黃色的帶狀結構表示。
圖3A-F是野生型和突變型pro-MMP-9的曲線圖和AFM圖像。戊二醛用作表面上 的胺與蛋白質之間的共價接頭(covalent linker)。全部掃描都采用一個尖釘觸頭(spike tip)。圖3A-C 野生型pro-MMP-9的半干模式掃描。圖3D-F pro-MMP-9 Δ OG突變體的半 干模式掃描。圖3Α和圖3D是2D圖像。圖;3Β和圖3Ε是3D圖像。圖3C和圖3F是沿圖3Α 和圖3D中所顯示的短劃線的)(Ζ橫切面。有關樣品制備和成像條件見正文。高度比例尺用 靠右的比例尺表示，其中Z軸的范圍為0-50 A (由深到淺)。圖4A-F是通過AFM測定的野生型(左)和pro-MMP-9 Δ OG(右)的粒徑分布直 方圖。所有直方圖的y軸都是通過計數除以總體得到的歸一化頻度。圖4A和4B-高度分 布。圖4C和4D-寬度分布。寬度值如實驗方法部分中所述方法校正。圖4E表示野生型 pro-MMP-9的波瓣與波瓣之間(lobe-to lobe)的分布。無法分辨pro-MMP-9 Δ OG中波瓣 之間的分離情況。圖4F表示按模型制作pro-MMP-9的構象狀態。將根據波瓣間AFM數據 計算得到的標準差9.5 A減去(左)或加上(右)通過SAXS結構重構獲得的平均化結構 (中)的結構域間分離。N端和C端結構域[22、24]分別用藍色卡通圖(blue cartoon)和 紅色卡通圖表示。OG結構域通過RAPPER重構[38、39]，并用綠色C ？示蹤表示。圖5A-B表示通過SAXS獲得的重構pro-MMP-9模型。圖5A是GASBOR模型。圖5B 是CHADD模型。半徑5人的白球表示所獲得的模型。N端和C端結構域的對接晶體結構分 別用藍色卡通圖和紅色卡通圖表示。每個模型沿垂直軸以0°和90°旋轉。圖6A-C是pro-MMP-9的AFM圖像。戊二醛用作表面上的胺與蛋白質之間的共價 接頭。全部掃描都采用一個尖釘觸頭，只是圖6A的使用氧化物削磨的氮化硅觸頭。圖6A: 緩沖溶液中的野生型pro-MMP-9。圖6B 野生型酶的干燥樣品在環境條件下掃描。圖6C 進行相同固定化步驟但未使用酶的空白樣品。箭頭表示在IX 1 μ m2掃描下觀察到的單個 粒子。高度比例尺用靠右的比例尺表示，其中Z軸的范圍為0-50人(由深到淺)。圖7A-B 圖7A表示表達分泌性MMP-9的HT1080細胞的原位酶譜圖(in situ zymography) 0檢出綠色熒光表示具有IV型膠原的蛋白水解活性。藍色表示核染色 (Hoechst)。圖7B表示HT1080細胞與抗MMP孵育(9小時)，然后用綴合Oregon綠的IV型 膠原覆蓋。細胞周圍缺乏明顯綠色熒光表示細胞周圍的蛋白水解被MMP-9抑制。優選實施方案的描述本發明涉及MMP-9的調節劑，更具體地講，涉及靶向其OG結構域的調節劑。參考附圖和隨附說明可以更好地理解本發明的原理和操作。在詳細說明至少一個本發明的實施方案之前，應該了解本發明在其申請中并不限 于以下說明中所描述的細節或者實施例中所例舉的細節。本發明能夠有其它實施方案，或 者能夠以各種方式實施或實現。同樣，還應了解本文所采用的措辭和術語是為了說明目的， 不應視為限制。金屬蛋白酶(MMP)家族的成員參與炎性細胞和癌細胞通過結締組織遷移的多個 方面，加重許多疾病狀態。雖然所有MMP都有同樣的催化部位，但是其底物結合部位卻不 同。因此，不同的MMP具有不同的生物功能。例如，MMP-9加重組織損傷和炎癥，而MMP-2則 主要涉及抗炎功能和穩態功能。這就意味著可以識別這些高度相似的酶的選擇性抑制劑， 對于無副作用的有效抗炎療法至關重要。在構思本發明的同時，本發明的發明人認識到MMP-9和MMP-2之間的主要結構差異是在MMP-9中存在大量的0-糖基化(OG)結構域。然而，可獲得的有關MMP-9的結構信 息只限于其兩個末端結構域，沒有包括這一 OG結構域。因此，沒有有關OG結構域對MMP-9 整個3D結構及其生物物理學性質的影響的信息。在將本發明付諸實施時，本發明的發明人將小角度X射線散射(SAXS)與單分子原 子力顯微鏡(AFM)成像結合起來進行了一項新的結構分析，首次表征了 pro-MMP-9全長結 構及其0-糖基化接頭結構域的分子特征。SAXS之后通過圖像分析和結構重構分析提供了 全長pro-MMP-9的分子形狀，代表其在溶液中的平均構象(圖2A-E)。該結構得到了高分 辨AFM成像(圖3A-F和4A-E)和生物物理測量值的支持，顯示出帶有OG結構域的細長蛋 白質在兩個末端結構域之間用作長為30 A的柔性接頭(圖5A-B)。由通過單分子成像檢 測的各種蛋白質構象對OG結構域柔性度進行了統計學評價(圖4F)。pro-MMP-9的全長結 構-動態模型為了解蛋白質結構域柔性在MMP-9活性所必需的在調節底物、配體和受體的 識別、結合和加工中的作用提供了新的視野。在將本發明進一步付諸實施時，本發明的發明人用原位酶譜表明能夠與MMP-9的 OG結構域特異性相互作用的抗體阻斷其溶膠原活性，但卻不阻斷其溶明膠活性(圖7A-B)。 因此，本發明的發明人提出了調節OG結構域柔性的調節物用途可用來控制該酶的病理活 性。因此，本發明一方面，提供調節金屬蛋白酶9(MMP_9)活性的方法，該方法包括使 MMP-9與同MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物接觸，從而調節MMP-9的活性。本文所使用的術語“MMP-9”(多結構域鋅內肽酶基質金屬蛋白酶-9，亦稱明膠 酶B)是指哺乳動物(例如人)MMP_9多肽的前體或活性形式(EC 3. 4. 24. 35 ；Swiss Prot No. P14780)，包括同源物(homolog)、直向同源物(ortholog)及其同工型(isoform)。MMP-9 通常包含3個結構域一催化結構域、底物結合結構域及兩者中間的接頭結構域。接頭結構 域，本文亦稱V膠原樣結構域或0-糖基化(OG)結構域，包含64個氨基酸和大約12-14個 0-聯聚糖，其中，64個氨基酸中有22個是脯氨酸殘基，6個是甘氨酸殘基。按照本發明這一方面的一個實施方案，MMP-9是天然的，即不是變性的。按照本發 明這一方面的另一個實施方案，MMP-9是有活性的，優選為有完全活性。MMP-9的活性包括但不限于溶明膠活性；天然I型膠原、III型膠原和XI型膠原的 降解(溶膠原活性)；彈性蛋白、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、層粘連蛋白A鏈和髓鞘堿性蛋 白的降解。本文所使用的術語“調節”是指減量調節或增量調節。應當了解的是，抑制OG結構 域柔性的調節物可減量調節需要呈柔性的OG結構域的MMP-9的功能，例如其溶膠原活性。 相比之下，通過與OG結構域相互作用的調節物可增量調節需要MMP-9的特定3D結構卻不 需要OG結構域柔性的活性。這類活性的一個實例是其溶明膠活性或與受體和/或生長因 子相互作用的能力。正如所提及的一樣，通過使MMP-9與能夠與其OG結構域進行特異性相互作用的調 節物接觸，來實施本發明的方法。本文所使用的術語“接觸”是指在允許調節物與MMP-9的OG結構域相互作用(例 如與OG結構域結合)的條件(即時間、溫度、緩沖液)下，使MMP-9能夠與該調節物發生接 觸并影響其剛性。應當了解的是，接觸可在體內、離體或體外進行。
本文所使用的術語“特異性相互作用”是指與MMP-9的其它結構域(例如催化結 構域或底物結合結構域)相對比，對MMP-9的OG結構域的親和力增高，并且對MMP-9的OG 結構域的親和力相對于對其它金屬蛋白酶(例如MMP-2)的OG結構域的親和力增高。最小 親和力的一個實例可能為10_%。優選調節物與MP-9的OG結構域相互作用的親和力比上 述親和力至少高3倍，更優選親和力至少高5倍，更優選親和力至少高10倍以上。應當了 解的是，因為MMP-9的OG結構域的氨基酸序列是MMP-9特異性的(與在MMP-9和MMP-2之 間是高度同源的催化結構域的氨基酸序列相對比)，因此，能夠與MMP-9的OG結構域發生特 異性相互作用的調節物能夠特異性調節MMP-9。本發明所提出的能夠與MMP-9的OG結構域相互作用的調節物(即分子)包括但 不限于多肽調節物(例如包含與MMP-9的OG結構域特異性相互作用的抗原識別結構域的 抗體)、肽和小分子。應當了解的是，該調節物可根據特定的氨基酸序列識別和/或構象識 別與OG結構域相互作用。識別MMP-9的OG結構域的抗體調節物是市售的，例如可獲自Sigma、Chemicon和 Abcam公司。本發明使用的術語“抗體”包括完整分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab' )2和 Fv，它們能夠與特定線粒體蛋白結合。較小的抗體片段可能具有優于完整抗體的優勢，因為 它們能夠更容易地滲入組織，并且更快地從機體中清除掉。這對于體內使用MMP-9特異性 抗體尤為重要。同樣，抗體片段的其它優勢是它們可以在細菌或酵母中產生。通過使用包含OG結構域的肽，可實現針對MMP-90G結構域的抗體的產生。抗體可 使用其它MMP-9結構域作為陰性對照進行篩選。用于實施本發明的合適抗體片段包括免疫球蛋白輕鏈(本文亦稱“輕鏈”)的互補 決定區(CDR)、免疫球蛋白重鏈(本文亦稱“重鏈”)的互補決定區、輕鏈可變區、重鏈可變 區、輕鏈、重鏈、Fd片段以及包含輕鏈和重鏈兩者的基本完整可變區的抗體片段，例如Fv、 單鏈 Fv、Fab、Fab，和 F(ab，)2。同時包含輕鏈和重鏈的完整或基本完整可變區的功能性抗體片段定義如下(i)Fv，定義為含有表達成2條鏈的輕鏈可變區和重鏈可變區的遺傳工程片段；(ii)單鏈Fv( “scFv”)，包括輕鏈可變區和重鏈可變區通過合適的多肽接頭連接 而成的遺傳工程單鏈分子。(iii)Fab，一種含有抗體分子的單價抗原結合部分的抗體分子片段，可通過用酶 即木瓜蛋白酶處理完整抗體得到一條完整的輕鏈和一條重鏈的Fd片段而獲得，該Fd片段 由可變區及其CHl結構域組成；(iv)Fab’，一種含有抗體分子的單價抗原結合部分的抗體分子片段，可通過用酶 即胃蛋白酶處理完整抗體后經還原而獲得(每個抗體分子可獲得兩個Fab’片段)；和(v)F(ab' )2，一種含有抗體分子的單價抗原結合部分的抗體分子片段，可通過用 酶即胃蛋白酶處理完整抗體而獲得(即兩個Fab’片段通過兩個二硫鍵連接在一起的二聚 體)。抗體(即單克隆抗體和多克隆抗體)的制備方法是本領域眾所周知的。抗體 可以通過本領域已知的若干方法中的任一種來制備，這些方法可采用誘導體內產生抗體 分子，篩選免疫球蛋白文庫(Orlandi D. R.等，1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 3833-3837 ；Winter G.等，1991. Nature 349 :293-299)，或者由培養物中的連續細胞系產 生單克隆抗體分子。這些包括但不限于雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術和EB病毒(EBV) 雜交瘤技術(Kohler G.等，1975. Nature 256 :495-497 ；Kozbor D.等，1985. J. Immunol. Methods 81 :31-42 ；Cote RJ. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 80 :2026-2030 ；Cole SP.等，1984. Mol. Cell. Biol. 62 :109-120)。如果靶抗原太小，在當在體內產生抗體時不能引起適當的免疫原性反應 (immunogenic response)，則可將這類抗原(半抗原)與抗原中性載體(antigenically neutral carrier)例如匙孔M^I藍蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)] 載體偶聯(參見美國專利號5，189，178和5，239，078)。半抗原與載體的偶聯可以采用本 領域眾所周知的方法實現。例如，可實現與氨基直接偶聯，并任選接著使所形成的亞氨基鍵 還原。或者，可以采用縮合劑(例如二環己基碳二亞胺)或其它碳二亞胺脫水劑使載體偶 聯。接頭化合物也可用于實現偶聯；同雙官能和異雙官能接頭均可獲自Pierce Chemical Company, Rockford, 111 ο然后，可將所得免疫原性復合物注射到小鼠、兔等合適的哺乳動物 受治療者體內。合適的方案包括按照加強血清中抗體產生的時間表，在佐劑存在下重復注 射免疫原。應用本領域眾所周知的免疫測定法，可容易地測定出免疫血清的效價。所獲得的抗血清可以直接使用，或者按照上文中所述獲得單克隆抗體。可以應用本領域眾所周知的方法，獲得抗體片段[(參見例如Harlow和Lane， "Antibodies :A Laboratory Manual，，，Cold Spring HarborLaboratory, New York, (1988)]。例如，可以通過抗體的蛋白水解，或者通過抗體片段的編碼DNA在大腸桿菌 (E. coli)或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞培養物或其它蛋白質表達系統)中的表 達，來制備本發明的抗體片段。或者，可以通過常規方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得抗體片段。 如上所述，可通過用胃蛋白酶對抗體進行酶促切割得到5S片段，從而產生(Fab’)2抗體片 段。還可以使用巰基還原劑，任選使用由二硫鍵裂解所產生的巰基的封端基團，使該片段進 行進一步裂解產生3.5S Fab'單價片段。或者，使用胃蛋白酶進行酶促切割來直接產生2 個單價Fab'片段和Fc片段。本領域技術文獻提供了實施這類方法的大量指導(例如參 見:Goldenberg，美國專利號 4，036，945 和 4，331，647 ；Porter, RR.，1959. BioChem. J. 73 119-126)。切割抗體的其它方法，例如重鏈分離形成單價輕鏈-重鏈片段，進一步切割片 段，或者還可以使用其它酶技術、化學技術或遺傳技術，只要該片段與被完整抗體識別的抗 原結合。如上所述，Fv由重鏈可變區和輕鏈可變區配對組成。這種締合可以是非共價的 (參見例如 hbar 等，1972. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69 :2659-62)。或者，如上所述，可變 區可通過分子間二硫鍵連接形成單鏈Fv，又或者這些鏈可用化學試劑(例如戊二醛)交聯。Fv優選為單鏈Fv。單鏈Fv通過構建結構基因來制備，該結構基因包含由編碼肽接頭的寡核苷酸連 接的重鏈可變區和輕鏈可變區的編碼DNA序列。將該結構基因插入表達載體中，隨即將表 達載體導入宿主細胞，例如大腸桿菌。重組宿主細胞合成具有橋接2個可變區的接頭肽的 單一多肽鏈。本領域技術文獻中提供了用于產生單鏈Fv的大量指導(例如參見Whitlow 和 Filpula, 1991. Methods, 2 :97-105 ；Bird 等，1988. Science242 :423-426 ；Pack 等，1993.
9Bio/Technology 11 :1271-77 ；以及 Ladner 等，美國專利第 4，946，778 號)。分離的互補決定區肽可以通過構建目標抗體互補決定區的編碼基因獲得。這類基 因可通過例如抗體生成細胞mRNA的RT-PCR制備。本領域技術文獻提供了實施這類方法的 大量指導(例如參見 Larrick 和 Fry，1991. Methods 2 :106-10)。應當了解的是，對于用于人的療法，優選使用人源化抗體。人源化形式的非人類 (例如鼠)抗體是遺傳工程嵌合抗體或抗體片段，其具有衍生自非人類抗體的部分(優選 最小部分)。人源化抗體包括這樣的抗體，其中人抗體的互補決定區(受體抗體)被小鼠、 大鼠或兔等非人類物種互補決定區(供體抗體)的具有所需官能團的殘基置換。在某些情 況下，人抗體的Fv構架殘基被相應的非人類殘基置換。人源化抗體還可包括既不存在于 受體抗體，又不存在于輸入的互補決定區或構架序列中的殘基。一般而言，人源化抗體基 本上所有都可包含至少一個、通常兩個可變區，其中所有或基本上所有的互補決定區都相 當于非人類抗體互補決定區，所有或基本上所有的構架區都相當于有關人共有序列的構架 區。人源化抗體最好還包括至少一部分通常衍生自人抗體的抗體恒定區，例如Fc區(參見 例如 Jones 等，1986. Nature321 :522-525 ；Riechmann 等，1988. Nature 332 :323-329 ；以及 Presta, 1992. Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596)。使非人類抗體人源化的方法是本領域眾所周知的。人源化抗體一般具有一個或多 個從非人類來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常常被稱為輸入性殘基 (imported residue)，通常取自輸入性可變區。基本上可按照文獻方法(參見例如Jones φ, 1986. Nature321 :522-525 ；Riechmann 等，1988. Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen 等， 1988. Science 239 :1534-1536 ；美國專利第4，816，567號)，通過用相應的嚙齒動物互補決 定區取代人互補決定區來進行人源化。因此，這類人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上不超 過一個完整的人可變區被得自非人類物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常可 以是其中一些互補決定區殘基及可能的一些構架殘基被得自嚙齒動物抗體相似位點的殘 基取代的人抗體。還可以采用本領域已知的各種技術制備人抗體，包括噬菌體展示文庫[參見例如 Hoogenboom 和 Winter，1991. J. Mol. Biol. 227 :381 ；Marks 等，1991. J. Mol. Biol. 222 :581 ； Cole 等，"Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，，，Alan R. Liss,第 77 頁(1985)； Boemer等，1991. J. Immunol. 147 :86-95)]。還可以將人免疫球蛋白基因座編碼序列導入 轉基因動物中，來制備人源化抗體，轉基因動物例如其中內源免疫球蛋白基因已部分或完 全鈍化的小鼠。在抗原攻擊時，在這類動物中觀察到人抗體的產生，這些抗體在包括基 因重排、鏈裝配和抗體譜在內的所有方面都與在人體內觀察到的十分相似。本領域技術 文獻中提供了實施這類方法的大量指導(例如參見美國專利號5，545, 807,5, 545, 806、 5，569，825、5，625，126、5，633，425 禾口 5，661，016 ;Marks 等，1992. Bio/Technology 10 :779-783 ；Lonberg 等，1994.Nature 368 :856-859 ；Morrison,1994. Nature 368 812-13 ；Fishwild 等，1996. NatureBiotechnology 14 :845-51 ；Neuberger,1996. Nature Biotechnology 14 :826 ；Lonberg 禾口 Huszar,1995. Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93)。為了鑒定能夠特異性調節MMP-9的推定調節物，可對調節物就其與MMP-9的OG結 構域相互作用的能力進行評價。因此，本發明一方面，提供確定調節物是否是MMP-9的特異性調節劑的方法，該方法包括確定該調節物是否能夠與MMP-9的OG結構域進行相互作用，所述調節物是推定的 MMP-9特異性調節劑。通過精確的實驗，本發明的發明人揭示了全長pro-MMP-9的3D結構。本文所描述 的完整MMP-93D結構可用于合理設計調節(優選抑制)MMP9作用的藥物。這些MMP9調節 劑可用來防止或處理MMP9活性的不良物理和藥理性質。因此，按照本發明這一方面的一個 實施方案，可通過將調節物的結構與MMP-90G結構域的結構進行比較，來對該調節物特異 性調節MMP-9的能力進行評價。這可通過應用全長MMP-9的計算機模型進行，例如通過本 發明的發明人借助例如GASBOR和CHADD等程序生成的計算機模型。該方法可能特別適于 鑒定肽調節物和小分子。一旦獲得了調節物的結構，就可以設計與OG結構域3D結構契合并可望穩定 (stanilize)或破環它的肽。可以篩選出這類特異性結合OG結構域的肽/小分子。如上所述，可采用各種方法，包括例如展示技術，來進行肽模擬物的制備。構建這類展示文庫的方法是本領域眾所周知的。這類方法可參見例如^img AC 等，“The three-dimensional structures of a polysaccharidebinding antibody to Cryptococcus neoformans and its complex with apeptide from a phage display library amplications for the identification ofpeptide mimotopes (抗新生隱球菌 的多糖結合抗體及其與得自噬菌體展示文庫的肽的復合物的三維結構用于鑒定肽模擬表 位的意義)”JMol Biol 1997 年 12 月 12 日；274 ) :622-34 ;Giebel LB 等，‘、creening ofcyclic peptide phage libraries identifies ligands that bind streptavidin withhigh affinities(環肽噬菌體文庫的篩選鑒定出以高親和力結合鏈霉抗生物素 蛋白的配體)"Biochemistry 1995 年 11 月沘日；3407) :15430-5 ；Davies EL 等， "Selection of specific phage-display antibodies usinglibraries derived from chicken immunoglobulin genes (采用衍生自雞免疫球蛋白基因的文庫對特異性噬菌體 展示抗體進行篩選)”J ImmunolMethods 1995 年 10 月 12 日；186 (1) 125-35 Jones C RT 等，‘‘Currenttrends in molecular recognition and bioseparation (分子識別禾口 生物分離的最新趨勢)” J Chromatogr A 1995 年 7 月 14 日；707(1) 3-22 ；Deng SJ 等， "Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chainantibodies from synthetic gene libraries (用于選擇得自合成基因文庫的改進的糖結合單鏈抗 體的基礎)”Proc Natl Acad Sci USA 1995 年 5 月 23 日；92 (11) :4992-6 ；以及 Deng SJ 等，"Selection of antibodysingle-chain variable fragments with improved carbohydrate-binding byphage display(通過噬菌體展示選擇具有改進的糖結合的抗體 單鏈可變區片段)”J Biol Chem 1994年4月1日；269 (13) :9533_8，所述文獻通過引用結 合到本文中。應用計算生物學還揭示了肽模擬物。例如，可以運用下文實施例部分中所描述 的各種三維計算工具，對各種化合物結合OG結構域的能力進行計算分析。用于顯示三維 結構模型的軟件程序，例如 RIBBONS (Carson，M.，1997. Methods in Enzymology 277，25)、 0(Jones, ΤΑ. ^,1991. Acta Crystallogr. A47,110) > DINO(DIN0 =VisualizingStructural Biology (2001) www. dino3d. org)；以及 QUANTA, INSIGHT、SYBYL、MACR0M0DE、I CM、M0LM0L、 RASMOL 和 GRASP (有關綜述見 Kraulis，J.，1991. Appl Crystallogr. 24，946)，可用來模擬OG結構域和預期的肽模擬物之間的相互作用，從而鑒定出與OG區的結合具有最高可能 性的肽。蛋白質-肽相互作用的計算建模已成功用于合理的藥物設計，有關詳情參見Lam 等，1994. Science 263，380 ;Wlodawer 等，1993. Ann Rev Biochem. 62, 543 ；Appelt, 1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1,23 ；Erickson,1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1,109 以及 Mauro MJ.等，2002. J Clin Oncol. 20，325—34。按照本發明這一方面的另一個實施方案，可以通過將調節物與分離MMP-9 —起孵 育，來對調節物特異性調節MMP-9的能力進行評價。因為MMP-9的氨基酸序列是已知的，因 此包含OG結構域的分離MMP-9或其片段可應用標準重組DNA技術或通過化學合成產生。可 以應用標準蛋白質標記技術測定調節物與靶標的結合。標記可以是直接(例如用S35標記 MMP-9)或間接的，例如使用第二抗體。標準免疫學法(ELISA、免疫測定法)和生物化學法 (例如凝膠過濾)可以用于評價調節物結合。一旦鑒定出推定調節物，便可以對其調節MMP-9功能的能力及其針對MMP-9的選 擇性的能力進行測定。這類測定法的一個實例是下文實施例7中描述的溶膠原活性的原位 酶譜分析法。正如所提及的一樣，已知由于MMP-9的組織損傷作用和對可溶性蛋白的促炎加工 (包括蛋白酶抑制劑、趨化因子和細胞因子)，因而MMP-9是炎癥性疾病中的原型靶標。因 此，能夠減量調節MMP-9活性的調節物都可用來治療MMP-9相關疾病。因此，本發明一方面，提供治療MMP-9介導的醫學病癥的方法，該方法包括給予有 需要的受治療者治療有效量的與MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物，從而治 療MMP-9介導的醫學病癥。本文所使用的術語“有需要的受治療者”是指哺乳動物，優選人類受治療者。本文所使用的術語“治療”是指預防、治愈、逆轉、減輕、減緩、抑制或停止MMP-9介 導的疾病或病癥的有害作用或者使該病的有害作用降到最低。術語“MMP-9介導的醫學病癥”是指其中MMP-9可能是造成其發生或發展的疾病或 病癥。MMP-9介導的醫學病癥的一個實例為癌癥，例如乳腺癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、胰腺癌和 前列腺癌等轉移性癌癥。除了在癌癥中起作用以外，MMP-9還涉及其它病理，例如涉及關節炎或神經變性性 疾病，例如多發性硬化(Firestein，Curr. Opin. Rheumatol. 4 :348-354(1992) ；Gijbels 等， J. Neuroimmunol. 41 :29-34 (1992))。例如與健康患者或骨關節炎患者相比，在炎癥性關節 炎(例如類風濕性關節炎)患者的血清和滑液中檢出高水平的MMP-9 (Ahrens等，Arthriti s & Rheumatism 39 1576-87(1996) ；Gruber 等，Clin. Immunol. & Immunopathol. , 78 161-171(1996))。此外，有研究報告了關節的關節炎活動性評分(arthritic activity score)與吸出的滑液中MMP-9的量的關聯性(Koolwijk等，J. Reumatology, 22 385-393(1995))。在神經系統疾病中也檢測到MMP-9的表達。例如，與正常腦組織相比，脫髓鞘病 變的反應性星形細胞和巨噬細胞中存在大量的MMP-9表達(Cuzner等，J. Neuropathol. Exp. Neurol, 55 :1194-1204(1996))。MMP-9在以下情況下升高在腦脊髓炎中 (Gijbels 等，J. Neuro. Res. 36 :432-440 (1993) ；Proost 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 192 :1175-1181 (1993))、在多發性硬化患者的腦脊液中(L印pert等，Brain 121 2327-2334(1998) ；Rosenberg 等，Brain Res.，703 151-155 (1995))；以及在 AIDS 相關癡 呆患者中(Conant 等，AnnalsofNeurology 46:391-398(1999))。此外，在肌萎縮性側索 硬化患者中，MMP-9表達存在于運動皮質的錐形神經元和脊髓的運動神經元中(Lim等， J. Neurochem.，67 :251-259(1996))。MMP-9還與各種其它炎癥性疾病有關。例如，高水平的MMP-9活性存在于主動 脈瘤血管壁中(Freestone 等，Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology, 15 :1145-1151 (1995) ；Newman φ, Connective Tissue Research,30 :265-276, (1994)； Sakalihasan 等，J. Vascular Surgery, 24 127-33 (1996)) 此外，巨細胞性動脈炎患者的 MMP-9水平升高，MMP_9mRNA存在于發炎血管中層基質內碎裂的彈性組織區域的平滑肌細 胞和成纖維細胞中(Sorbi 等，Arthitis &Rheumatism，；35 1747-1753 (1996))。MMP-9 水平 增高也存在于囊性纖維化患者的痰和支氣管擴張患者的支氣管肺泡灌洗液中(Delacourt 等，Amer. J. Respiratory & Critical Care Med. , 152 :765-764 (1995) ；Sepper 等，Chest, 106 :1129-1133(1994))。高水平的MMP-9還存在于大皰性類天皰瘡患者皮損的水皰液中 (Stahle-Backdahl 等，J. Clinical Invest. ,93 :2022-2030 (1994))。MMP-9表達還涉及若干種其它疾病的發病機制。例如，MMP-9涉及多囊性腎病 (Murray 等，Conn. Tissue Res. ,33 :249-256 (1996))、膜性腎病(McMillin 等，J. Clin. Invest. ,97 :1094-1101(1996))和阿爾茨海默病(Alzheimer ‘ s disease) (Lim 等， J. Neurochem. ,68 :1606-1611(1997))。因此，本發明包括使用能夠與MMP-9的OG結構域進行選擇性相互作用的調節物治 療所有上文提及的疾病或病癥。將本發明的調節物本身或作為藥物組合物的組成部分給予受治療者，所述藥物組 合物還包括生理上可接受的載體。藥物組合物的目的是有利于將活性成分給予生物體。本文所使用的“藥物組合物”是指一種或多種本文所述活性成分及生理上適宜的 載體和賦形劑等其它化學組分的制劑。藥物組合物的目的是有利于將化合物給予生物體。本文所使用的術語“活性成分”是指負責預期生物效應(即減量調節MMP-9活性) 的調節物。下文中，術語“生理上可接受的載體”和“藥學上可接受的載體”可以互換使用，是 指不會對生物產生明顯刺激性并且不會削弱所給予化合物的生物活性和性質的載體或稀 釋劑。佐劑包括在這些術語內。包括在藥學上可接受的載體中的成分之一可為例如聚乙二 醇(PEG)、多種同時可溶于有機介質和水性介質的生物相容性聚合物[Mutter等(1979)]。本文術語“賦形劑”是指加到藥物組合物中以進一步促進活性成分給藥的惰性物 質。賦形劑的實例包括而不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明膠、 植物油和聚乙二醇。藥物的制備和給藥技術可參見 “Remington，s PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，該文獻通過引用結合到本文中。合適的給藥途徑可包括例如口服、直腸、經黏膜(尤其是經鼻、經腸)或胃腸外遞 送，包括肌內、皮下和髓內注射以及鞘內、直接腦室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。或者，可以按局部方式而不是按全身方式給予制劑，例如通過將制劑直接注射到 患者身體的特定部位。
本發明的藥物組合物可通過本領域眾所周知的方法制備，例如通過常規的混合、 溶解、制粒、制錠(dragee-making)、研碎、乳化、包膠囊、包封或凍干步驟。用于本發明的藥物組合物可以按常規方式，使用一種或多種生理上可接受的載體 來配制，所述載體包括賦形劑和助劑，有助于將活性成分加工成可以藥用的制劑。合適的劑 型取決于所選擇的給藥途徑。對于注射，可以在水溶液中，優選在生理上相容的緩沖液(例如Hank溶液 (Hank' s solution)、林格液(Ringer' s solution)或生理鹽緩沖液)中配制本發明的 活性成分。對于經黏膜給藥，在劑型中使用適于待穿過屏障的滲透劑。這類滲透劑一般為 本領域所知。對于口服給藥，藥物組合物可容易地通過將活性化合物與本領域眾所周知的藥學 上可接受的載體相混合來制備。這類載體能夠使藥物組合物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊 劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，以用于患者口服攝取。可以使用固體賦形 劑，任選將所得混合物研磨，并對顆粒混合物進行加工，如有需要在加入合適的助劑之后， 得到片劑或錠劑芯，從而制備口服使用的藥物制劑。合適的賦形劑特別為填充劑，例如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯 淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可 接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解劑，例如交聯聚乙烯吡 咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。錠劑芯與合適的包衣材料一起提供。為此，可以使用濃糖溶液，它可任選含有阿 拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普膠、聚乙二醇、二氧化鈦、清漆溶液(lacquer solution)和合適的有機溶劑或溶劑混合物。還可將染料或顏料加到片劑或錠劑包衣材料 中以區分或鑒別活性化合物劑量的不同組合。可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的兩節式膠囊劑(push-fit capsules)以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊劑。兩節式膠囊 劑可含有活性成分與以下成分相混合填充劑，例如乳糖；粘合劑，例如淀粉類；潤滑劑，例 如滑石粉或硬脂酸鎂；以及任選穩定劑。在軟膠囊劑中，可將活性成分溶于或懸浮于合適液 體例如脂肪油、液狀石蠟或液態聚乙二醇中。另外，可加入穩定劑。用于口服給藥的所有劑 型都應為適于所選擇的給藥途徑的劑量。對于口腔給藥，組合物可以呈按常規方式配制的片劑或糖錠劑形式。對于通過經鼻吸入給藥，本發明所用的活性成分適宜以氣霧劑噴霧提供的形式由 使用合適拋射劑的加壓包裝或噴霧器遞送，合適的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷或二氧化碳。在壓縮氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門遞送計量的用量來 確定劑量單位。用于分配器的諸如明膠的膠囊和針筒，可以制成裝有化合物和合適粉末基 料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。可以配制本文所述制劑用于胃腸外給藥，例如通過推注注射或連續輸注。用于注 射的劑型可呈單位劑型，例如安瓿或多劑量容器，任選加入防腐劑。組合物可以是油性或水 性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并可含有調配劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩 定劑和/或分散劑。胃腸外給藥的藥物組合物包括水溶性形式的活性制劑的水溶液。另外，活性成分
14的混懸劑可制備成合適的油基或水基注射混懸劑。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油 (例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂質體。水性注射混懸劑可 含有增加混懸劑粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選混懸劑還可含有 合適的穩定劑或增加活性成分溶解度的物質供制備高度濃縮的溶液劑。或者，活性成分可以是粉針劑的形式，用前與合適的溶媒(例如無菌無熱原水基 溶液)重配。本發明的藥物組合物還可以使用例如常用的栓劑基料(例如可可脂或其它甘油 酯)配制成直腸用組合物，例如栓劑或滯留型灌腸劑。適用于本發明這個方面的藥物組合物包括這樣的組合物，其中所包含的活性成分 的有效量可達到預期目的。更準確地講，“治療有效量”是指活性成分(例如核酸構建體) 的量可有效地預防、減輕或改善疾病癥狀(例如局部缺血)或延長待治療的受治療者的存 活時間。治療有效量的確定盡在本領域技術人員掌握之中，尤其是根據本文所提供的詳細 的公開內容。對于用于本發明方法的任何制劑，劑量或治療有效量可從體外實驗和細胞培養實 驗中作出初步估計。例如，可以在動物模型中配制劑量以獲得所需要的濃度或效價。可以 用這類信息更準確地確定在人體中的有益劑量。可通過體外標準藥學方法，在細胞培養物或實驗動物中確定本文所述活性成分的 毒性和治療功效。在制定人用劑量范圍時，可以利用從這些體外實驗和細胞培養實驗及動 物研究中獲得的數據。劑量可根據所使用的劑型和所采用的給藥途徑而變化。確切的劑型、 給藥途徑和劑量可由各名醫師考慮患者狀況后做出選擇(參見例如Fingl E.等(1975)， “The Pharmacological Basis of Therapeutics，，，第 1 章，第 1 頁)。可以個別調節用量和給藥間隔以提供誘導或抑制生物效應的活性成分的足夠血 漿水平或腦水平(即最低有效濃度，MEC)。各種制劑的MEC可以不同，但是可以通過體外數 據估計。要達到MEC所需要的劑量將取決于個體特征和給藥途徑。可采用檢測實驗來測定 血漿濃度。根據待治療疾病的嚴重程度和反應性，給藥可以是單次給藥或多次給藥，其中療 程持續數天至數周，或者直到實現治愈，或者達到減輕疾病。待給予的組合物的量必然將取決于待治療的受治療者、疾病的嚴重程度、給藥方 式、處方醫師的判斷等等。如有需要，本發明的組合物可以用包裝或分配裝置提供，例如經FDA核準的藥盒， 藥盒可裝有一種或多種含有活性成分的單位劑型。例如，包裝可包括金屬箔或塑料薄片 (plastic foil)，例如泡罩包裝。包裝或分配裝置可隨附用藥說明書。包裝或分配裝置還 可隨附由監管藥品生產、使用或銷售的政府機構規定格式的批文，該批文反映出組合物的 形式已獲政府機構批準用于人用或獸用給藥。例如，這類批文可以包括經美國食品與藥物 管理局(U. S. Food and Drug Administration)批準的處方藥物的標識或核準藥品插頁的 標識。還可制備包含在藥學上可接受的載體中配制的本發明制劑的組合物，將其裝入合適 容器中，貼上治療適應癥的標簽，有關更多詳情見上文。根據以下實施例，本發明的其它目的、優勢和新的特征對于本領域普通技術人員而言是顯而易見的，這些實施例并不是限制性的。另外，上文所述的本發明各個不同的實施 方案和各個方面，以及所附權利要求書部分所要求保護的范圍都可以在下述實施例中找到 實驗支持。
實施例下面參考以下實施例并結合上述說明書，以非限制性方式對本發明進行說明。一般而言，本文所用術語和本發明所采用的實驗室方法包括分子學、生物化學、微 生物學和重組DNA技術。文獻中全面闡述了這類技術。參見例如“Molecular Cloning =A laboratory Manual"Sambrook^, (1989) ；"Current Protocols in Molecular Biology", 第 I-III 卷，Ausubel，R.M.編著(1994) ；Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology，，, John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989) ；Perbal,“A PracticalGuide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons, New York(1988) ；Watson 等，"Recombinant DNAScientific American Books, New York ；Birren 等(編著)"Genome Analysis A Laboratory Manual Series，，,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；美國專利號 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和 5，272，057 中 公開的方法；“Cell Biology :A Laboratory Handbook”，第 I-III 卷，Cellis，J. Ε.編著 (1994) ；"Current Protocols in Immunology”第 I-III 卷，Coligan J. E.編著(1994)； Stites 等(編著)，"Basic and Clinical Immunology，，(第 8 版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell 和 Shiigi (編著),"Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co. , New York(1980)；專利和科技文獻中大量披露了可 應用的免疫測定法，參見例如美國專利號3，791，932,3, 839，153,3, 850，752,3, 850，578、 3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533,3，996，345, 4，034，074,4, 098，876,4, 879，219,5, 011，771 禾口 5，281，521 ；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M. J.編著(1984) ；"Nucleic AcidHybridization^ames,B. D.和Higgins S. J.編著(1985) ；"Transcriptionand Translation，，Hames, B. D.禾口 Higgins S. J.編 著(1984) ；"Animal CenCulture”Freshney，R. I.編著(1986) ；"Immobilized Cells and Enzymes，，IRL Press, (1986) ；"A Practical Guide to Molecular Cloning，，Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology"第 1-317 卷，Academic Press ；"PCRProtocols :A Guide To Methods And Applications，，，Academic Press, SanDiego, CA(1990) ；Marshak
"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；所有文獻都通過引用結合到本文中，正如本文中全部 引用的一樣。還提供貫穿本文的其它一般性參考文獻。我們認為文獻方法是本領域眾所周 知的，僅為了方便讀者而在此提供。所有包括在其中的資料都通過弓I用結合到本文中。通用材料與方法MMP-9的表達通過用攜帶人proMMP_9cDNA的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，使重 組pro-MMP-9進行表達[19]。將數公升量的細胞培養液離心、過濾后用明膠瓊脂糖凝膠層 析法純化為均質[52]。將材料在 IOOmM Tris (pH 7. 4)、IOOmM NaClUOmM CaCl2 (緩沖液 C) 中充分透析后進行進一步處理，在本研究中使用大約20mg材料。按同樣方法制備缺乏OG 結構域的突變體(MMP-9 ？ 0G) [19]。
小角度X 射線散射根據標準規程，在 Synchrotron RadiationSource (Daresbury Laboratory, UK)工作站2. 1 [53]內，在溶液中進行了 SAXS實驗。蛋白質溶液以13，000 Xg 離心5分鐘后，在4°C下進行了測定。散射曲線用二維多線比例計數器采集，樣品至檢測器 距離為 lm(7mg/ml、100y 1)和4. 25m(0. 8mg/ml、l. 6mg/ml、2. 5mg/ml、100y 1)，波長(λ )為
1.54 A，覆蓋的動量傳遞范圍為0.008 < q <0.78 A"1 (q = 4 π sin θ / λ，其中2 θ為散 射角)。在30個連續的1分鐘幀(frame)內收集數據，然后歸一化至入射光束強度，在60° 扇面內徑向求積分，對幀數求平均值，并歸一化至檢測器響應。然后減去緩沖液的散射，低 角曲線與高角曲線在q為0.05-0.15 A^的范圍內匯合。作為時間函數的強度再現性表明 單體pro-MMP-9樣品沒有輻射損傷。利用Guinier近似法I (q) = I (0) exp (_q2Rg2/3)(對 于明8< 1.3) [54]，以及用間接傅里葉變換程序GNOM的完整散射曲線[55]，來估算回轉半 徑(艮)。GNOM還提供定義為其中ρ (r)變為零的點的顆粒的距離分布函數p(r)及其最大 尺寸Dmax。為了求出P (r)，首先，設p(0) =0，P(Dmax)任意賦值，以判斷所選擇的r間距是 否正確。Dmax是產生最小正ρ (Dmax)的最小值。在設定Dmax后，將p(0)和P(Dmax)設置為零。 然后在低角區與高角區截取(cut)數據直到p(r)函數收斂。為了計算兩個MMP-9結構域(N端催化結構域和C端血紅素結合蛋白樣結構域) 相應的理論散射曲線，運用程序CRYS0L[36]對兩個MMP-9結構域的晶體結構進行了分析。 將此再進行傅里葉變換，求出理論上的對分布函數，同時計算得出Dmaj^PIig值。SAXS曲 線的從頭建模(Ab initio modeling)的詳述見下文。結構圖用PyMOL(DeLano，W. L. The PyMOL Molecular Graphics System(PyMOL分子制圖系統M2002)DeLano Scientific,San Carlos, CA, USA. www. pymol. org)繪制。為了進一步證實模型的準確性，運用HYDR0PR0[34]計算出其溶液流體動力學特 性，然后與實驗值進行了比較。殼形微珠(shellminibead)的半徑從2.2 A到4.2 A按6個 增量變化。運用SEDNTERP[27]計算出溶劑密度和粘度，以及蛋白質微分比容。流體動力殼 模型(hydrodynamic shell model)的球體半徑在3.8 ~ 5.3 A之間變化。SAXS模型中假殘 基(dummy residue, DR)的半徑為3.8 Α。然而，由于蛋白質水合作用所致，殼模型的實際尺 寸略微較大，但是增大的程度難以確定[34]。以前的研究指出，DR半徑增加1.5 A時將水合 作用考慮在內較可靠[56]。原子力顯微鏡成像成像采用配備了 E-掃描儀的多模式原子力顯微鏡(MMAFM Veeco/Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA)進行,最大掃描范圍為 14Χ14μπι2。 使用輕敲模式，使空氣或緩沖液中的樣品成像。為了從假吸附物中獲得不含人為產物(主 要是鹽沉積物)的樣品，需要極充分的漂洗步驟。通過使用經胺修飾的硅烷表面和交聯步 驟，有可能制成除去幾乎所有本底的表面(如用空白操作測定的一樣)，而同時保持可觀的 蛋白質表面濃度。為使所施加的力量最小，調節幅度設定點至給出穩定示蹤的最大值。使用得自 Mikromasch(Estonia)的“尖釘”觸頭-DP14 "HI' RES ”探頭，獲得空氣中生物樣品的高 分辨圖像。這些探頭的共振頻率約為160kHz，力常數約為5N/m，額定曲率半徑為Inm以下， 但是只適于測量rms糙度小于20nm的表面，因為存在可能在粗糙表面上引起多次接觸的額 外“尖釘”。標稱半徑為20nm的DNP-S探頭(Veeco)用于液體測量，這在標準MMAFM液體池中進行。從橫切面分析確定蛋白質分子的大小。通過減去典型高分辨SEM圖像中所觀察到 的觸頭包絡(tip envelope)，來校正通過觸頭加寬的寬度值。大小排阻層析法將pro-MMP-9的寡聚體混合物加到預平衡并在4°C下操作的 Superdex-200 柱(300X 10mm，Amersham Biosciences)上。樣品體積為 100 μ 1 1. Img/ ml pro-MMP-9，流速為0.5ml/分鐘。通過^Onm下的吸光度監測洗脫情況。同時利用 Porath 曲線及 Laurent 和 Killander 曲線[Siegel, L. M.和 Monty，K.J. (1966). Biochim BiophysActa 112，346-362]，通過分析相對于校準曲線的洗脫時間，來確定斯托克斯半 徑。用于校準曲線的已知斯托克斯半徑的5種標準蛋白質(Amersham Biosciences)是 甲狀腺球蛋白(85 A)、鐵蛋白(61 A nm)、過氧化氫酶(52.2 A)、醛縮酶(48.1 A)和白蛋白 (35.5 A)。用藍色葡聚糖測量的空體積的保留時間、為16. 23分鐘；用維生素B-12測定的 總體積的保留時間fT為39. 44分鐘。由這些數值，如下計算給定蛋白質的分配系數Kd =Kd =(te-tQ)/(tT-tQ)，te為給定蛋白質的保留時間。從Porath曲線及Laurent和Killander 曲線得到非常相似的結果。三組重復實驗的保留時間的不確定性平均起來為0.5%。對于 Porath曲線及Laurent和Killander曲線兩者的線性最小二乘方擬合的相關系數為r2 = 0. 97。甘油梯度沉降使純化的pro-MMP-9樣品(0. 2mg)在4個裝有10_45%甘油梯 度(在GradientMaster BioComp 中制備)的緩沖液的異質同晶聚合物管(polyallomer tube)中分層。然后將各管在SW41轉子中于37，000rpm、4°C下離心63小時。然后將梯度 液分級分離成0.5ml樣品，通過明膠酶譜法(gelatin zymography)測定樣品中存在的單體 結構和其它寡聚體結構[Masure，S.，Proost, P.，Van Damme, J.和 Opdenakker，G. (1991). Eur J Biochem. 198,391-398]。合并含有均質單體結構的流分，經緩沖液透析除去過量甘 油。使用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)測定蛋白質濃度。分析型超速離心用配備An_50Ti轉子的Beckman Optima XL-A分析型超速離心 法進行沉降速度實驗。實驗在緩沖液C中于20°C進行。將蛋白質濃度為O.^ig/ml的樣品 加載到12mm光程吸收池中，以50，OOOrpm離心。每160秒鐘記錄^Onm下的吸光度，采用 在徑向范圍6-7. 3cm內徑向間距為0. OOlcm0運用可供評價沉降系數的軟件SEDFIT [Schuck，P. (2000). Biophys J. 78， 1606-1619]對沉降分布圖進行了分析。分析了 130條實驗曲線，獲得在該區分辨率為200 步進，網格大小(grid size)為500點時介于0.3 50S之間沉降系數c(s)的分布。參 數化法的置信水平設定為0. 9。運用軟件SEDNTERP[Laue，Τ. Μ.，Shah, B. D.，Ridgeway, Τ. Μ.禾口 Pelletier, S. L. (1992). Analytical Ultracentrifugation in Biochemistryand Polymer Science (生物化學和聚合物學科中的分析型超速離心法)(Cambridge，U.K. Royal Society of Chemistry)]估算溶劑密度(P )為 1. 0062g/cm3，粘度(η)為 1. 045cP。 根據氨基酸和聚糖組成計算蛋白質微分比容( )為0. 73^cm7g，其中利用Kharakoz的氨基 酸參數[Kharakoz, D. P. (1997). Biochemistry. 36，10276-10285]。用于AFM成像的胺官能化基底制備針對與戊二醛相互作用的具有高濃度伯胺基 對這些表面進行選擇，其中戊二醛使蛋白質交聯并與之結合。戊二醛與胺表面基團形成酰 胺鍵。戊二醛的游離胺通過共價相互作用自發地使蛋白質與普遍存在于蛋白質外表面的胺基交聯。因此，為了將蛋白質附加在該表面上，不需要工程改造或修飾。此外，該方法僅最 低限度地干擾蛋白質構象的隨機分布和在表面上的取向。文獻中簡要描述了用于與蛋白質特異性結合的胺官能化基底的制備和表征 (Veeco Metrology, Inc Santa Barbara, CA 部分編號 FSUB-11)。從拋光的 <111> 晶 片 international Wafer Servive INC.-Denmark)上切下 Icm2 的硅片。通過等離子 體增強化學氣相沉積GtilState, LLC, Belmont, CA)，用胺封端的硅烷對硅片進行修飾，以 制成胺官能化基底。在胺官能化之前和之后，采用具有單色Al k X射線源的Kratos Axis Ultra (Kratos, Manchester, UK)在 1486. 6eV 下，通過 X 射線光電子能譜法(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)對該基底的表面組成進行了分析。只在胺官能化之 后，在XPS光譜中由氮峰表示的胺基存在于該表面上。通過應用輕敲模式的原子力顯微 鏡(AFM)，在空氣中用OTESP探頭(VEECO)，測出經處理基底的均方根(RMS)表面糙度為 1.8人。采用辣根過氧化物酶(HRP)測定法測定胺官能化基底的結合潛力。通過戊二醛交聯 劑將HRP標記的抗體固定在胺官能化基底上。該基底經超聲處理去除了所有未結合抗體， 然后用 SureBlueReserve TMB IComponent 過氧化物酶底物(Kirkegaard 禾口 Perry Labs, Maryland)進行了分析。通過450nm下讀取吸光度來測定結合活性。蛋白質固定化方法將胺化模具(aminized die)保持在4°C的干燥器中。臨使用 前，按照以下方法步驟通過戊二醛交聯劑將pro-MMP-9固定在胺官能化基底上將1. 25% 戊二醛的0. IM碳酸鈉溶液(pH 9)在胺官能化基底上孵育過夜。然后，該基底用碳酸鈉溶 液充分漂洗以除去未結合的戊二醛。然后，將體積為100 μ 1含有0. lmg/ml經分級分離含 有單體形式的pro-MMP9 Δ OG突變體或野生型pro-MMP-9的單分散溶液的樣品，在該模具上 孵育3小時。樣品依次用2X 200 μ 1緩沖液和5X 200 μ 1 Milli-Q水輕輕漂洗，最后在氮 氣流下干燥。戊二醛用作蛋白質與胺化表面的共價交聯劑。這確保了在漂洗和后續成像期 間蛋白質分子與表面的穩固連接。對于在緩沖液中進行的AFM實驗，使樣品保持連續水合。SAXS 曲線的從頭建模程序 GASBOR[Svergun, D. I.，Petoukhov，Μ. V.和 Koch， Μ. H. (2001). Biophys J 80,2946-2953]和 CHADD[Petoukhov，Μ. V.，Eady, N. Α.，Brown, K. A. ^P Svergun, D. I. (2002). Biophys J 83，3113-3125]用來生成低分辨模型。考慮 pro-MMP-9上的糖基化，假設根據其電子密度和長度，單個聚糖相當于 1. 6個氨基酸殘 基[Receveur, V. , Czjzek, M. , Schulein, M. , Panine, P.禾口 Henrissat, B. (2002). J Biol Chem. 277,40887-40892]。研究還發現，該值表示聚糖和殘基的平均分子量之間的關系。然 后根據以前表征過的氨基酸序列和聚糖組成，計算得出DR的總數[Van den Steen, P. Ε., Van Aelst, I. , Hvidberg, V. , Piccard, H. , Fiten, P. , Jacobsen, C. , Moestrup, S. K. , Fry, S.，Royle，L.，Wormald，M. R.，Wallis，R. , Rudd, P. M.，Dwek，R.A.和 Opdenakker，G. (2006). J Biol Chem. 281，18626-18637]。為了通過隨機Monte-Carlo擬合程序檢查模型與唯一方案的收斂性，生成用于 各種方法的相同輸入參數的若干模型。為了選出最可能的方案，利用DAMAVER[Volkov， V. V.禾口 Svergun，D. I. (2003). Journalof Applied Crystallography 36,860-864]對模型 進行了檢查，并計算出平均歸一化間隙差異(normalized spatial discrepancy, NSD)值 (參見補充數據結果)。然后運用軟件 SUPC0MB [Kozin，Μ. B.和 Svergun，D. I. (2001). Journal of Applied Crystallography 34，33-41]，將末端結構域的晶體結構[Elkins，P. A.，Ho，Y. S. , Smith, W. W. , Janson, C. A. , D' Alessio, K. J. , McQueney, Μ. S. , Cummings, Μ. D.禾口 Romanic, A.M. (2002).ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 58,1182-1192 ；Cha, H., Kopetzki, Ε. , Huber, R. , Lanzendorfer, Μ.禾口 Brandstetter, H. (2002). J Mol Biol 320, 1065-1079]在代表性模型中進行對接。溶膠原活性的原位酶譜分析法通過將人纖維肉瘤HT1080 (CCL-121 ；ATCC, Rockville, MD)細胞與60nM抗MMP9hr或用于對照的相應緩沖液以及450nM標記的膠原 (作為分子內猝滅的Oregon綠標記的IV型膠原-Molecular probes公司)一起在37°C下 孵育16小時，來進行原位酶譜分析[DeShane，2003]。膠原的降解產生綠色熒光，這表示凈 溶膠原活性。在成像之前，樣品用Hoechst 33258 (Molecularprobes公司)以3. 8 μ g/ml 的最終濃度染色用于核標記。檢查樣品，并用配備了 Plan Fluor物鏡的熒光顯微鏡(E600 ； Nikon, Tokyo, Japan)與CCD照相機(DMX1200F ；Nikon)連接來拍照。實驗重復進行6次。 圖像應用 Adobe Photoshop (Adobe systems, San Jose, CA)進行編輯。實施例1單體形式的pro-MMP-9的分離和表征pro-MMP-9單體的分子大小和形狀測定、結構重構及單分子圖像的分析都需要單 分散的均質蛋白質樣品。下面的實施例描述了結合各種方法來表達、分離和表征單體形式 的pro-MMP-9。利用分子半徑的表征來證實光譜形狀測定。結果按以前報告的方法[19]，由桿狀病毒感染的Sf9細胞表達重組pro-MMP-9并進行 純化(參見材料與方法)。該酶形成單體和其它較高寡聚體種類的混合物[20]。圖IB表示通過分析型大小排阻層析法(SEC)測定的pro-MMP-9單體與其寡聚體 種類的相對分子比。層析圖中主峰(3號)包含斯托克斯半徑為45.4 A的pro-MMP-9單體 (見插圖)。采用常規方法，根據相應的保留時間來測定斯托克斯半徑。通過甘油梯度沉降法[26]，實現從制備量的較高寡聚體種類中分離出pro-MMP-9 單體。圖IC表示各個流分的酶譜分析。將分離的單體流分進行分析型超速離心法(AUC) 用于再次估算其斯托克斯半徑(
圖1D)。在此沉降速度實驗中，使均勻的pro-MMP-9溶液受 重力場作用。這在彎液面附近造成溶質排空，并在排空區和均勻濃縮的沉積溶質之間形成 鮮明的界線(圖1D，插圖)。可以測定這一界線的移動速率，由此測定沉降系數，進而測定 有效大小和形狀，沉降系數與顆粒質量成正比，與摩擦比成反比。研究發現ftx)-MMP-9單體作為單一種類沉降，其中主峰表示樣品中91%總蛋白 質的歸一化沉降系數s°2“為4. 4S (圖1D)。此值與最新的測量值一致[19]。利用計算出 的微分比容為0. 73^cm7g，通過程序SEDNTERP[27]，用計算機計算得到斯托克斯半徑為 44.1 A。基于AUC的形狀分析(利用實驗性摩擦比)表示為橢圓形狀，其a/b軸比為1 6。 通過AUC獲得的分子半徑結果與通過SEC (45.4人)獲得的值一致。此外，使用pro-MMP-9 分子質量及氨基酸和聚糖組成，通過SEDNTERP進行的半徑理論估值，得到分子的當量球形 半徑為28.7Λ。此值與實驗性斯托克斯半徑的偏差再次說明為非球形形狀，或為細長形或包 含了空腔。實施例2通過小角度X射線散射(SAXS)進行的pro-MMP-9分子形狀分析揭示了細長的三結構域結構結果通過SAXS對pro-MMP-9單體在溶液中的球形構象進行了研究。在SAXS中，由隨 機取向分子的總體(entire ensemble)得到散射圖，產生有關其平均構象的信息(大約1 納米)。因此，SAXS不同于需要難以得到的大分子高品質晶體的晶體學結構分析法，是為數 不多的研究溶液中蛋白質結構的技術之一。該方法利用因靶分子電子引起的入射X射線光 子的彈性散射。分子中由原子排列支配的電子密度分布形成干涉圖。然后，從散射圖重構 分子的三維形狀[28]。在對應于d-間距范圍l4<r<785 A的動量傳遞范圍0.008^0.4611內，觀察
到散射強度(圖2A)。較低值(14人)鎖定了在測量中可獲得的倒數第一位的分辨率。散射 強度在小-q區中為線性(散射圖見圖2A)，通過Guinier定律進行精確擬合。觀察到斜率 與蛋白質濃度呈弱相關。這就意味著既不是聚集也不是顆粒間干涉對信號產生顯著作用。 通過測量得到的回轉半徑(Rg)為50士2.7 A。函數P (r)表示分子內原子間距離的分布(對 分布函數-圖2A，插圖)。由得自p(r)的艮開方(extraction of Rg from p(r))得出與 之相當的數值49.2人,這就表明準確的初步數據分析(在擬合方法之前)。最大原子間距離 (Dfflax)為160人。P ω的形狀表示細長的橢圓體結構(參見例如[29-31])。pro-MMP-9的三維重構模型運用程序GASB0R[32]和CHADD[33]獲得。理論散射 曲線模擬表示蛋白質殘基的球形中心(或假殘基)的三維排列，這些殘基聯合起來形成總 體蛋白質形狀。通過將模擬的理論曲線與實驗數據重復擬合，來確定最終的蛋白質形狀。 CHADD的優勢是利用獲自可獲得的分離結構域晶體結構的現有知識以將約束因素導入數據 分析方法。相比之下，通過GASBOR生成的模型是在無任何現有知識的情況下計算出來的。 CHADD與GASBOR之間的詳細比較見下文實施例3。圖2B表示pro-MMP-9的三維重構結構。運用程序HYDR0PR0 [34]計算得到 pro-MMP-9重建結構的斯托克斯半徑。這一計算出的半徑范圍介于44.9 A和47.1 A之間， 這與分別通過SEC和AUC得到的測量值45.4 A和44.1人一致。此外，SAXS模型和AUC獲得 的軸比參數皆表明為細長形狀。因此，由實驗性SAXS圖中復原的重構形狀與由SEC和AUC 兩者獲得的流體動力學測量數據一致。這一結構的模擬曲線擬合分析見圖2A(灰色曲線)。催化結構域前體α碳主鏈 的定位在結構重構分析中用作約束條件，而OG和血紅素結合蛋白樣結構域采用CHADD重 構。最后，運用軟件SUPC0MB[35]，使催化結構域前體[22]和血紅素結合蛋白樣結構域[24] 的晶體結構相繼對接到等密度線上(圖2B)。其余密度屬于將兩個末端結構域分隔開達 ~30人的OG結構域。運用軟件CRYS0L[36]，根據分離N端和C端結構域的晶體結構計算 理論P ω曲線，進一步驗證了此值。計算出的這些結構域的Dmax值分別為80 A和50入。從 全長pro-MMP-9的實驗值Dmax (160 減去這些值，進一步證實了其中末端結構域被分開 ~ 30入的重構結構。檢查OG和血紅素結合蛋白樣結構域所占體積，表明了它們有同樣的體積。然而， OG結構域(包括0-聚糖)的計算分子量卻大約是血紅素結合蛋白樣結構域的一半。運用 PONDR[37]對OG結構域進行的計算序列分析表明，該區比起其它結構域明顯雜亂無序(圖
212C)。因此，盡管觀察到其致密構象，但是該富含脯氨酸的OG結構域具有相對低密度的無序 結構。因此，SAXS檢測到OG結構域相對較大的電子密度，表示在溶液中由此接頭肽保持的 多種構象。這就表明OG接頭結構域是柔性的。應用結構建模程序RAPPER[38、39]來生成 可與所觀察到的散射圖和密度圖相符的可能的接頭構象。準確地講，500種計算構象異構體 中有8種符合接頭的SAXS模型。計算得出(運用SAXS程序CRYSOL [36])總體pro-MMP-9 模型結構的理論散射曲線。圖2D和圖2E表示同時符合pro-MMP-9的實驗性散射曲線和 SAXS密度圖的最佳接頭模型。OG接頭似乎具有多個推定的松散構象。實施例3用于SAXS數據分析的建模軟件的比較結果運用程序GASBOR[Svergun，D. I.，Petoukhov, Μ. V.和 Koch，Μ. H. (2001). Biophys J 80,2946-2953]禾口 CHADD[Petoukhov，Μ. V.，Eady, N. Α.，Brown, K. Α.禾口 Svergun， D.I. (2002). Biophys J 83,3113-3125]生成pro-MMP-9的低分辨模型。兩個程序通過使測 量的散射曲線再現的球形散射中心的3D排列，給出蛋白質圖像。CHADD的優勢是利用了由 分離結構域的晶體結構確定的一部分Ca定位的現有知識，同時分子的其余部分則是建模 的，而GASBOR無需引用現有知識來對整個結構建模。在各個程序中，對若干獨立計算結果 進行比較以分析溶液結構的收斂性。8次獨立的GASBOR運行收斂到細長總體構象的唯一方案，其中一端尺寸較大， 可容納N端結構域的晶體結構，而另一端呈圓盤樣形狀，可以容納C端結構域的晶體結構 (圖 5A)。運用程序 SUPCOMB [Kozin, Μ. B.和 Svergun，D. I. (2001). Journal of Applied Crystallography34，33-41]，將末端結構域對接在GASBOR模型上。其余密度屬于將末端結 構域分隔達50 A的OG結構域，視為OG結構域長度。8次計算內的歸一化間隙差異(NSD)的 范圍為1. 42 1. 57。NSD值衡量了溶液結構之間的相似性較低值對應于較好的重疊。運用 DAMAVER[Petoukhov, Μ. V.禾口 Svergun，D.I. (2003). Journal of AppliedCrystallography 36，540-544]，計算出NSD值，這還能夠選出最可能的方案(χ 2 = 1. 38)，并確定異常值。
在利用已知結構信息的替代性建模方案中，運用CHADD重構全長pro-MMP-9結構。 對11次獨立運行用計算機進行了計算，結果顯示NSD值為1. 59-1. 75，而且沒有異常值， 這表明了各種方案收斂到單一模型。最可能的方案(χ2 = 1.66)見圖5B。該模型表明細 長的三結構域結構，該結構顯示帶有圓盤樣結構域的大雙峰形狀，通過相對低密度的OG結 構域連接。運用軟件 SUPCOMB [Koz in，Μ. B.和 Svergun, D.I. (2001). Journal of Applied Crystallography 34，33-41]，將催化結構域前體和血紅素結合蛋白結構域的晶體結構相 繼對接在等密度線上。其余密度屬于將兩個末端結構域分隔開達~ 30 A的OG結構域，此值 與通過CRYSOL計算的OG結構域理論尺寸十分相符。 通過兩種獨立的建模算法所獲得的兩種結構是若干計算結果收斂到唯一方案的 結果。檢驗GASBOR和CHADD模型之間相似性得到的NSD值為1. 68，這表明了模型之間十分 一致。雖然GASBOR模型相當細長(0G結構域為50人，而不是30 A )，但是兩個模型共同有 著非常相似的特征，即通過接頭連接的兩個基本為球形的結構域(橢圓形N端通過OG接頭 與C端血紅素結合蛋白連接)導致形成總體上細長的結構，該結構由兩個基本球形的結構 域通過接頭連接組成。OG結構域的尺寸與CRYSOL計算值一致，且總體形狀與AFM的相似性結果使本發明的發明人選擇CHADD作為更可靠的模型。實施例4通過單分子成像對pro-MMP-9的形狀和結構域柔性進行表征結果為了進一步證實SAXS分析，本發明的發明人設計了直接觀察pro-MMP-9形狀和評 價其OG結構域的分子性質的實驗，如圖2B和圖2E中的預測。準確地講，本發明的發明人應 用原子力顯微鏡(AFM)，對野生型pro-MMP-9和pro-MMP-9的OG缺失突變體(pro-MMP-9 ？ 0G)進行了單分子成像分析。在AFM成像之前，通過使蛋白質樣品與Si (111)表面上胺修飾 的硅烷化層交聯，獲得單一 pro-MMP-9分子的可再現圖像(圖3)。使樣品在緩沖溶液中以及在空氣中成像(圖6A-C)。使用“尖釘”觸頭，以半干模 式獲得最佳圖像。圖3A-C表示固定在經修飾的Si (111)表面上的野生型pro-MMP-9的單分 子圖像。與所報告的SAXS分析結果一致，蛋白質圖像具有細長的多結構域結構。表示高度 與寬度的圖像橫切面(圖3C)揭示兩個間隔開的蛋白質結構域假定通過OG接頭連接。相 比之下，缺乏64個殘基的OG結構域的pro-MMP-9 ？ OG突變體有幾分球形的形狀，無可分 辨的結構域間隔(圖3D-F)。實施例5pro-MMP-9的原子力顯微鏡(AFM)成像的條件和對照的選擇結果使樣品在緩沖溶液中以及在空氣中成像。雖然前一模式接近生理條件，但是圖像 質量差(圖6A)。圖像質量差可能由以下幾個因素造成(1)設計用于潮濕條件的觸頭比 起用于環境條件的“尖釘”觸頭具有顯著較大的半徑。( 完全水化的樣品可能較軟，較易 在觸頭壓力下變形。( 蛋白質與表面的結合在完全水化條件下仍可能允許某種程度的移 動。因此，為了改進圖像質量，采用了環境條件，其中樣品經漂洗后，通過2-3分鐘輕緩的氮 氣流除去過量的水分。此步驟可在樣品上留下薄薄的水化層，因此稱為“半干模式”。為了 檢查在任何水化層不存在時蛋白質的形狀，我們采用了徹底干燥法(圖6B)，這使得精細特 征喪失，蛋白質收縮，并導致橫切面的圖像噪聲。在這些半干測量中，主要困難是從假吸附物中獲得不含人為產物(主要是鹽沉積 物)的樣品。需要極充分的漂洗步驟以除去這些吸附物，但是同樣會導致除去大量蛋白質。 通過采用經胺修飾的硅烷表面和交聯步驟，就可能制備除去幾乎全部本底的表面(如空白 操作所測定的一樣)，同時又保持了可觀的蛋白質表面濃度，與在完全水化條件下所觀察到 的類似。在與樣品相同條件但是沒有pro-MMP-9時孵育制備的空白對照(圖6C)，通常在 1 μ m2圖像上含有的特征不超過一個。與具有pro-MMP-9的樣品進行的比較表明，平均起來 5%以下所觀察到的特征可能是由碎片或無水鹽分所引起的人為產物。AFM圖像的統計學分析對野生型pro-MMP-9和pro-MMP-9 ？ OG的高度、寬度和波 瓣間距離(lobe-to-lobe distance)進行了統計學分析。這些數據在圖4A-E中用直方圖表 示，并概括于下面的表1中。因為兩個亞群的存在可能對平均值造成偏差，因此只報告了最 可能的值。括號內為標準差。數值相當于野生型pro-MMP-9 (η = 90)和pro-MMP-9 Δ OG突變 體(η = 120)。測量了 )(Z橫切面上各峰之間的波瓣間距離。只有當蛋白質在表面上的取向 可供鑒定兩個截然不同的結構域時，才能推導出(extract)該值(n = 83)。pro-MMP-9 Δ OG中波瓣之間的間距可能無法區別開。表 權利要求
1.一種調節金屬蛋白酶9 (MMP-9)活性的方法，該方法包括使MMP-9與同MMP-9的OG 結構域進行特異性相互作用的調節物接觸，從而調節MMP-9的活性。
2.權利要求1的方法，其中所述MMP-9是天然MMP-9。
3.權利要求1的方法，其中所述活性是溶膠原活性。
4.權利要求1的方法，其中所述活性是溶明膠活性。
5.權利要求1的方法，其中所述調節是增量調節。
6.權利要求1的方法，其中所述調節是減量調節。
7.權利要求1的方法，其中所述調節物包括多肽調節物。
8.權利要求1的方法，其中所述多肽調節物包括抗體。
9.權利要求1的方法，其中所述調節物包括小分子。
10.一種鑒定能夠特異性調節MMP-9的調節物的方法，該方法包括確定該調節物是否 能夠與MMP-9的OG結構域進行相互作用，所述調節物是推定的MMP-9特異性調節劑。
11.權利要求10的方法，其中所述確定是通過將所述調節物的結構與MMP-9的OG結構 域的結構進行比較來實現的。
12.權利要求10的方法，其中所述確定是通過使所述調節物與分離的MMP-9的OG結構 域接觸來實現的。
13.權利要求10的方法，其中所述調節物包括多肽。
14.權利要求13的方法，其中所述多肽包括抗體。
15.權利要求10的方法，其中所述調節物包括小分子。
16.一種治療MMP-9介導的醫學病癥的方法，該方法包括給予有需要的受治療者治療 有效量的與MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物，從而治療MMP-9介導的醫學病癥。
17.權利要求16的方法，其中所述調節物按照權利要求7進行鑒定。
18.權利要求16的方法，其中所述調節物包括小分子或多肽調節物。
19.權利要求18的方法，其中所述多肽調節物包括抗體。
20.一種能夠特異性調節MMP-9活性的分子，其中所述分子與MMP-9的OG結構域相互 作用，前提條件是所述分子不是非人源化抗體。
21.一種人源化抗體，所述人源化抗體包含與MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用 的抗原識別結構域。
22.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的權利要求20的分子和藥學 上可接受的載體。
23.權利要求22的藥物組合物，其中所述分子包括人源化抗體，所述人源化抗體包含 與所述MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的抗原識別結構域。
全文摘要
本發明公開了調節金屬蛋白酶9(MMP-9)活性的方法。該方法包括使MMP-9與同MMP-9的OG結構域進行特異性相互作用的調節物接觸。本發明還公開了能夠與OG結構域進行特異性相互作用的分子、鑒定所述分子的方法、包含所述分子的藥物組合物及其用途。
文檔編號A61K38/17GK102083455SQ200880112385
公開日2011年6月1日 申請日期2008年8月7日 優先權日2007年8月15日
發明者G·羅森布盧姆, I·薩吉 申請人:耶達研究及發展有限公司