制備和使用流感蛋白質的組合物和方法

專利名稱：制備和使用流感蛋白質的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及病毒領域，特別地涉及流感病毒和含有多種流感蛋白質的組合物。這 些組合物對誘導針對流感的免疫應答、降低來自流感感染的風險、和/或改善流感病毒感 染的癥狀是有用的。
背景技術：
如由世界衛生組織(WHO)規定，甲型流感病毒和乙型流感病毒二者均是急性呼吸 疾病的常見原因。盡管兩類病毒都可引起相當大的發病率和死亡率的流行病，乙型流感感 染通常局限于局部的爆發，然而甲型流感病毒是大流行病的主要原因，包括遍及世界的大 流行病。流感病毒是正黏病毒家族的成員，且具有廣泛的個體范圍，包括人、馬、狗、鳥類和 豬。它是由編碼10種病毒蛋白質的8個RNA區段產生的有包膜、負義RNA病毒。病毒在受 感染的個體細胞的核中復制。流感病毒對年紀小的個體和老年個體或者免疫應答能力低下 的個體是最危險的。病毒可在雞蛋中繁殖成高滴度，所述雞蛋作為用于流感疫苗生產的病 毒產生的載體。目前使用兩種類型的流感疫苗。較常規的疫苗是滅活疫苗(含有死病毒)，其通過 注射給予，一般注射于臂中。最常見的人疫苗是含有來自三種病毒株的純化和滅活物質的 三價流感疫苗(TIV)。一般來說，這種疫苗包括來自兩種甲型流感病毒亞類和一種乙型流 感病毒株的物質。第二種疫苗，稱為鼻噴霧流感疫苗(有時稱減毒活流感疫苗為LAIV)，于 2003年得到批準且含有通過鼻噴霧施用的減毒(弱毒)活病毒。甲型流感病毒的表面抗原經歷頻繁的改變，然而乙型流感病毒改變較不頻繁。由 一種毒株感染引起的免疫可能不會完全地保護以抵抗后來的抗原變體。因此，每年需要 設計針對流感的新疫苗以對抗最可能引起下次流行的流行毒株。所以，WHO每年收集基于 人與人之間傳播的最流行的流感毒株的監測數據，并為流感疫苗組合物提供建議。當前， 在疫苗中，疫苗包括兩種甲型流感病毒的亞類和一種乙型流感病毒。該疫苗一般保護約 50% -80%的健康成人免于臨床疾病。盡管流感疫苗的有效性，但是在兒童、老年人和某些高風險群體中的患病率仍然 顯著，且在發展中國家，接種疫苗可能是時有時無的或者是不存在的。在發達國家，生產足 夠的流感疫苗以提供給接受群體由于生產困難、使用現行技術產生疫苗所需的高費用和時 間而受到阻礙。此外，新病毒株的威脅和未來大流行病的可能性產生了對更有效的流感疫 苗以及更高效率產生流感疫苗的興趣。多個小組已經對一些流感蛋白質進行了研究，如基質，以確定其免疫原性以及用 作針對流感的疫苗的部分的可能。參見，如Filette等人，Vaccine，24 =6597-601 (2006)和 Liu等人，Vaccine，23 366-371 (2004)。然而，到目前為止，缺乏針對流感的通用疫苗，特別 是缺乏在個體中誘導體液和細胞免疫應答的通用疫苗。因此，需要針對流感病毒的多個毒 株提供持久和有效保護的改良流感疫苗。發明的簡要概述本發明提供了包含流感蛋白質的組合物和疫苗以及制備和使用它們的方法。在一些實施方案中，組合物和疫苗額外地包含含有免疫刺激序列(ISS)的免疫調節化合物 (IMC)。在一個方面，本發明提供了包含流感基質蛋白胞外結構域(M2e)的多聚體的組合 物，所述多聚體以多聚體展示而呈遞給免疫系統并能在個體中誘導免疫應答。在一些例子 中，多聚體展示通過與非蛋白質載體締合來實現。在一個實施方案中，多聚體包含至少兩個 拷貝的M2e。在另一實施方案中，M2e多聚體與IMC締合。在其它方面中，M2e多聚體或M2e/IMC多聚體額外地包含核蛋白(NP)。在一個實 施方案中，多聚體是包含NP和M2e的融合蛋白質。在另一實施方案中，M2e與NP共價地或 者離子地連接。在一些實施方案中，M2e位于NP的羧基端側。在其它實施方案中，M2e位于 NP的氨基端側。在其它實施方案中，M2e位于NP的氨基端側和羧基端側兩者。在其它實施 方案中，M2e位于NP內部。在另一實施方案中，M2e/IMC多聚體與NP締合。在另一實施方 案中，M2e/IMC多聚體與NP/IMC締合。在其它實施方案中，M2e/NP多聚體與IMC締合。在 一些實施方案中，IMC選自1018、B型寡核苷酸、嵌合的免疫調節化合物和C型寡核苷酸。在另一方面，本發明提供了額外地包含載體的上述任一組合物。在一些實施方案 中，載體選自礬、微粒、脂質體和納米顆粒(nanoparticle)。在另一方面，本發明提供了包含以多聚體展示呈遞給免疫系統且能在個體中誘導 免疫應答的M2e多聚體的組合物的疫苗。在一些實施方案中，組合物進一步包含IMC、佐劑 或載體。在其它實施方案中，組合物進一步包含NP。在其它實施方案中，組合物是包含至 少2個拷貝的M2e和NP的融合蛋白質。在其它實施方案中，上述任一組合物進一步包含 IMC。在其它實施方案中，疫苗進一步包含選自礬、微粒、脂質體和納米顆粒的載體。在其它 實施方案中，疫苗包含選自1018IMC、B型寡核苷酸、嵌合的免疫調節化合物和C型寡核苷 酸的IMC。在另一實施方案中，上述任一疫苗進一步包含至少一種三價滅活流感疫苗(TIV) 的一種或多種成分。在一些實施方案中，TIV選自Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、 FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax。在另一方面，本發明提供了通過向個體施用包含以多聚體展示呈遞給免疫系統的 流感基質蛋白胞外結構域(M2e)的多聚體的疫苗來改善個體中與流感病毒感染相關的一 種或多種癥狀的方法，且其中所述多聚體能在個體中誘導免疫應答。在一個實施方案中，疫 苗進一步包含NP。在一些實施方案中，疫苗進一步包含IMC。在另一方面，本發明提供了用于降低個體中感染流感病毒的可能性的方法，所述 方法包括向個體施用(a)包含至少兩個拷貝的M2e的疫苗和(b) TIV的一種或多種組分。 在一個實施方案中，疫苗進一步包含NP。在其它實施方案中，疫苗進一步包含IMC。在其它
TIV it 自 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac
和 Fluvax0在另一方面，本發明提供了用于降低個體中感染流感病毒的可能性的方法，所述 方法包括向個體施用(a)包含至少兩個拷貝的M2e的疫苗和(b)單價滅活疫苗的一種或 多種組分。附圖簡述

圖1描述了人、豬和禽類的共有M2e序列，以及多株甲型流感分離株中M2e表位的 保守性。對流感病毒的不同毒株也顯示了共有序列的變體。
圖 2 描述了 1990-2005 共有 NP 序列與 A/ 波多黎哥(Puerto Rico)/8/34 (HlNl) 的NP序列的比較。基于氨基酸相似性矩陣，將保守改變如虛框所示進行突出，中性改變是 單線框和非保守改變是雙線框。發明詳述本發明提供了包含流感蛋白質的組合物和/或疫苗以及制備和使用它們的方法。 這些組合物和疫苗對誘導流感病毒感染的個體中的免疫應答是有用的。此外，組合物和疫 苗對改善與流感病毒感染相關的癥狀以及降低流 感病毒感染的風險是有用的。一般方法除非另外說明，本發明的實施將使用本領域技術范圍內的分子生物學(包括重 組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學的常規技術。這類技術在 文獻中是充分說明的，如 Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第二版(Sambrook 等 人，1989 年)禾口 MolecularCloning :A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 禾口 Russel, 2001 年)，(在本文中聯合地或分別地稱為“Sambrook”)。Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait 編輯，1984 年)；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編輯，1987 年)；Handbook of Experimental Immunology (D. Μ· Weir&C. C. Blackwell 編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller&M. P. Calos 編輯，1987 年)；Current Protocols in Molecular BiologY(F. M. Ausubel 等人編輯，1987 年，包括 2001 年期間的副刊)；PCR ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis 等人編輯，1994 年)；Current Protocolsin Immunology(J. Ε. Coligan 等人編■，1991 年)；The ImmunoassayHandbook(D. Wild ^m 輯，Stockton Press,紐約，1994 年)；BioconjugateTechniques(Greg Τ· Hermanson 編 輯，Academic Press,1996 年)；Methodsof Immunological Analysis(R. Masseyeff, W. H. Albert 和 N.A.Staines 編輯，Weinheim :VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993 年),Harlow 禾口 Lane (1988 年)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications, M^],以及Harlow禾口 Lane (1999年)Using Antibodies :ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Mitl (在本文中聯合 地或分別地稱為“Harlow 和 Lane” )，Beaucage 等人編輯，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons 公司，紐約，2000 年)；禾口 Agrawal 編輯，Protocols forOligonucIeotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press 公司，New Jersey,1993 年)。^X如本文中所用，“疫苗”是用于誘導個體中免疫應答的抗原制備物。疫苗可具有多 種抗原成分。如本文中所用，“多聚體展示”指分子，如基質(M2e)呈遞的方式。在一個實施方 案中，其指分子展示給個體的免疫系統的方式。多聚體展示包括但不限于，與聚合物、或具 有或者不具有間隔區的線性(如末端到末端)展示的分子的重復單元、和以非線性方式展 示(如徑向展示、分子的隨機取向等)的分子的多重單元締合。可將多重單元通過與載體 或者任一類型的平臺分子締合來進行物理展示，所述載體或任一類型的平臺分子包括但不 限于其它流感蛋白質(如核蛋白)、非流感蛋白質或非蛋白質平臺分子如微載體、鋁鹽、其 它無機鹽、微粒、納米顆粒、病毒樣顆粒、樹狀聚體、微團、天然的或合成的聚合物和脂質體。
如本文中所用，“非蛋白質載體”是不為蛋白質的且可用于實現流感基質和/或核 蛋白的多聚體展示的載體。如在本文中可互換的使用，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括單鏈 DNA (ssDNA)、雙鏈DNA (dsDNA)、單鏈RNA (ssRNA)和雙鏈RNA (dsRNA)、經修飾的寡核苷酸和 寡核苷、或它們的組合。核酸可以是線性構型的或環形構型的，或者寡核苷酸可含有線性區 段和環形區段二者。核酸是連接的核苷的聚合物，如通過磷酸二酯鍵或備選鍵如硫代磷酸 酯連接。核苷由與糖連接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)或者其衍生物)堿基或嘧啶 (胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或者其衍生物)堿基組成。在DNA中，四種核苷 單元(或堿基)稱做脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。核苷酸是核苷的磷酸酯。本文中所用的術語“ISS”或“免疫刺激序列”指在體外、體內和/或間接體內(ex Vivo)測量時，影響可測量的免疫應答的多核苷酸序列。可測量的免疫應答的例子包括但 不限于抗原特異的抗體生產、細胞因子的分泌、淋巴細胞群體如NK細胞、CD4+T淋巴細胞、 ⑶8+T淋巴細胞、B淋巴細胞等的活化或擴增。優選地，ISS序列優先地活化Thl型應答。本 發明中所用的多核苷酸含有至少一個ISS。如本文中所用，“ISS”也是含ISS的多核苷酸的 簡寫術語。本文中所用的術語“免疫調節化合物”或“ IMC"指具有免疫調節活性且包含含有 免疫刺激序列或ISS的核酸部分的分子。IMC可由包含多于一種ISS的核酸部分組成、由 ISS組成，或者其自身不具有免疫調節活性。IMC可由寡核苷酸組成(“寡核苷酸IMC”)或 者其可以包含額外的部分。因此，術語IMC包括摻入有兩個或多個核酸部分的嵌合的免疫 調節化合物(“《(”)，其中至少一個核酸部分包含序列5’-06-3’，共價地與非核苷酸間隔 部分連接。術語“免疫調節的”可指微粒組合物和/或多核苷酸。因此，本發明的免疫 調節組合物可顯示出免疫調節活性，即使當組合物中含有的多核苷酸具有當僅以多核 苷酸呈遞時不顯示出可比較的免疫調節活性的序列。在一些實施方案中，當本發明 的免疫調節組合物的多核苷酸單獨呈遞時，不具有“分離的免疫調節活性(isolated immunomodulatory activity) "" χ δ(inferior isolated immunomodulatoryactivity)，，(即，當與微粒組合物比較時)。多核苷酸的“分離的免疫調 節活性”通過使用指示免疫應答的至少一個方面的標準測定法，如由本文中所描述的那些， 測量具有相同核酸骨架(如硫代磷酸酯、磷酸二酯、嵌合的)的分離的多核苷酸的免疫調節 活性來確定。術語“綴合物”指復合物，其中IMC與多聚體是連接的。這類綴合鍵合包括共價鍵 合和/或非共價鍵合。術語“與......締合”可指共價相互作用以及非共價相互作用二者。例如，M2e可
通過與IMC共價鍵合以及與IMC非共價相互作用來與IMC締合。“佐劑”指當添加至免疫原性劑如抗原時，在暴露于該混合物的受試者個體中非特 異性提高或增強對該免疫原性劑的免疫應答的物質。術語“微載體”指不溶于水的且具有小于約150 μ m、120 μ m或100 μ m,更通常地小 于約50-60 μ m,且可能小于約10 μ m或甚至小于約5 μ m大小的微粒組合物。微載體包括 “納米載體”，所述“納米載體”是具有小于約1 μ m，優選地小于約500nm大小的微載體。微載體包括固相顆粒，此類顆粒由生物相容的天然存在的聚合物、合成的聚合物或合成的共 聚物形成，雖然由瓊脂糖或交聯的瓊脂糖形成的微載體可能包括或者排除于本文所定義的 微載體以及本領域已知的其它生物可降解材料。固相微載體是由在哺乳動物生理條件下不 易蝕的和/或不可降解的聚合物或其它材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、二氧化硅、陶瓷、聚丙烯 酰胺、金、乳膠、羥磷灰石和鐵磁材料和順磁材料形成。生物可降解的固相微載體可以由在 哺乳動物生理條件下可降解的聚合物(如聚(丙醇酸)、聚(乙醇酸)和其共聚物如聚(D， L-丙交酯-共-乙交酯)或易侵蝕的聚合物(如聚(原酸酯)例如3，9-二亞乙基-2，4， 8，10-四氧雜螺[5. 5]十一烷(DETOSU)或聚(酐)如癸二酸的聚(酐))形成。微載體一 般是球形的形狀，但偏離球形的微載體也是可接受的(如橢圓形的、桿狀的等)。由于它們 的不可溶性質，一些固相微載體是從水和基于水的(含水的)溶液中可濾過的(如使用0. 2 微米濾器)。微載體也可是液相(如基于油或基于脂質)，如脂質體、iscorns (免疫刺激復 合物，其是膽固醇、磷脂和佐劑活性皂苷(adjuvant-active saponin)的無抗原的穩定復合 物)或在水包油乳劑或油包水乳劑中發現的小滴或者微團如MF59。生物可降解的液相微載 體一般摻入到生物可降解的油中，其中許多是本領域已知的，包括鯊烯和植物油。如本文中 所用的術語“非生物可降解的”指在正常哺乳動物的生理條件下不降解或不腐蝕的微載體。 一般來說，如果在37°C、正常人血清中孵育72小時后，微載體不降解(即，損失少于其質量 或平均聚合物長度的5% )，則認為其是非生物降解的。“個體”或“受試者”是脊椎動物，如禽類，優選地是哺乳動物，如人。哺乳動物包 括但不限于人、非人靈長類、農場用動物、運動用動物、實驗動物、嚙齒類動物(如小鼠和大 鼠)和寵物。物質的“有效量”或“足夠量”是足以實現期望的生物學效應，如有利的結果包括臨 床結果的量，且，因此，“有效量”取決于使用其的情況。在本發明的情況下，包含流感基質蛋 白胞外結構域(M2e)的多聚體的組合物的有效量的例子是足以誘導個體中免疫應答的量。 有效量可以以一次或多次施用進行施與。本文所用的術語“共施用”指在時間上足夠接近地施用至少兩種不同物質以調節 免疫應答。優選地，共施用指同時施用至少兩種不同的物質。免疫應答如體液免疫應答或細胞免疫應答的“刺激”意指應答的增加，其可產生自 引發應答和/或增強應答。如本文中所用，且由本領域完全理解，“治療”是用于獲得有利的或期望的結果，包 括臨床結果的方法。為了本發明的目的，有利的或期望的臨床結果包括但不限于，可檢測或 不可檢測地減輕或改善一種或者多種癥狀、減小感染的程度、穩定(即，不惡化)感染的狀 態、改善或減緩感染狀態、和(部分或全部)緩和。“治療”也可意指與如果不接受治療的預 期存活相比較而言延長的存活。流感蛋白質的組合物基質蛋白Ml和基質蛋白M2由甲型流感病毒的第7基因組編碼。這種甲型流感M2 蛋白質的胞外部分也稱為M2e且是23個氨基酸長度。其在感染和常規的接種期間是最小 免疫原性的，且在所有人甲型流感毒株中具有高的序列保守性。M2e作為抗原的一個優點是 其序列的保守性，所述M2e的序列自1933年分離了第一個流感病毒以來幾乎沒有改變，盡 管經歷了許多次流行和數次大流行。
本發明提供了包含流感基質蛋白胞外結構域(M2e)的多聚體的組合物，其中所述 多聚體能誘導個體中的免疫反應。在一個方面，M2e蛋白質的多聚體包含至少兩個拷貝的 M2e。不被理論所束縛，因為M2e的多拷貝允許M2e以多聚體展示呈遞給個體的免疫系統， 所以M2e的多拷貝對誘導個體中的免疫應答是重要的。因此，在一個實施方案中，組合物包 含兩個拷貝的M2e。在其它實施方案中，組合物包含3個、4個或5個拷貝的M2e。又在其 它實施方案中，組合物包含6個、7個或8個拷貝的M2e。又在其它實施方案中，組合物包含 9個、10個、11個或12個拷貝的M2e。又在其它實施方案中，組合物包含多于12個拷貝的 M2e。如本文中更詳細地描述，M2e多聚體也可與包含免疫刺激序列(IMC)的IMC連接。多 聚體也可通過本領域技術人員已知的任一方法制備，包括但不限于使用平臺分子。實施例 闡述了本領域技術人員如何能制備和使用本發明多聚體的一些實施方案。本發明也提供了包含多種序列M2e的多聚體的組合物。多聚體可包括相同序列 或不同序列的M2e拷貝。人M2e的共有序列是SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO :7)。 豬M2e的共有序列是SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(SEQ ID NO :8)。禽類M2e的共有序列是 SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO :9)。圖1顯示了這些共有序列以及豬和禽類動物的 共有序列。然而，如圖1所描述，在甲型流感中存在許多分離株，且在一些分離株中存在共 有序列的一個或多個氨基酸變異。本發明考慮了使用任一這些分離株的組合以在組合物中 產生M2e的多聚體(任選地與IMC —起產生)。然后，如本文中所描述，可將組合物制劑以 用作疫苗和/或以合適的形式用來向個體施用。具體而言，組合物可包含具有來自重大公 共衛生利益的分離株的序列的M2e蛋白質。在一個方面，本發明提供了包含來自H5W毒株 M2e的多聚體的組合物以在需要其的個體中誘導免疫應答。這些組合物可預防地使用以降 低禽流感病毒感染的可能性或治療與禽流感病毒感染相關的癥狀。在本發明的其它方面，組合物包含M2e和核蛋白(NP)的一個或多個多聚體。圖2 顯示了核蛋白和其變體的共有序列。在存在于GenBank中的815種全長人流感NP序列中， 76%源自1990年-2005年間分離的病毒。在這段時間，82% (503種序列)來自H3N2分離 株。共有NP序列是基于來自1990-2005分離株的所有全長人NP序列產生的(圖2)。將 A/波多黎哥/8/34(Hmi)序列與1990后的共有序列比較發現存在92%的氨基酸序列同一 性。A/波多黎哥/8/34(HlNl)NP序列與該共有序列具有98%的序列相似性。基于Blosum 45氨基酸相似性矩陣，發現了 12個氨基酸差異是非保守的或中性替代。共有H3N2序列在 98位置處、146位置處和197位置處具有3個獨特的氨基酸替代，在每種情況下，替代是保 守的。考慮了 NP可用單拷貝或以多拷貝進行表達。在一個實施方案中，NP表達為二聚體。 在另一實施方案中，NP締合成高級結構，如三聚體。在另一方面，M2e拷貝和NP表達為融合蛋白質。可將M2e多核苷酸序列克隆入任 一合適的表達載體中并用于表達對組合物是期望的蛋白質序列。實施例公開了用M2e和NP 構建的融合蛋白質的多核苷酸序列和蛋白質序列二者，其可用于實施本發明的這一方面。 組合物也可以以非融合蛋白質的方式，如通過共價鍵合、離子鍵合或通過其它物理力(如 范德瓦耳斯力)相互締合來包含M2e和NP。本發明也提供了包含以不同方向排列的M2e和核蛋白(NP)的一個或多個多聚體 的組合物和融合蛋白質。這些融合蛋白質可在其羧基端額外地包含一個或多個組氨酸殘基 (“his標簽”)，優選地是六個組氨酸殘基。在一個方面，一個或多個M2e蛋白質位于NP的氨基端側。在另一方面，一個或多個M2e蛋白質位于NP的羧基端側。在另一方面，一個或 多個M2e蛋白質位于NP的氨基端側和羧基端側二者。在其它方面，M2e位于NP序列的內 部。又在其它方面，M2e與NP相互交替。在特別優選的實施方案中，4個或8個拷貝的M2e 蛋白質位于NP的氨基端或者羧基端。在一個特別優選的實施方案中，4個拷貝的M2e蛋白 質位于NP的氨基端和羧基端二者。在所有的實施方案中，在一個或多個拷貝的M2e蛋白質 后任選地包括間隔序列。不被理論所束縛，使用NP能幫助誘導可有助于控制流感感染的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答和干擾素(如IFN γ)應答。M2e能幫助誘導針對流感病毒的抗體應答。CTL 應答和抗體應答能協同作用以提高個體的免疫到比任何單獨一個應答更大的程度。此外， NP也可提供可以導致提高M2e抗體應答的輔助T淋巴細胞表位。作為多聚體M2e或多聚體M2e/NP的本發明的組合物可額外包含含有免疫刺激序 列的免疫調節化合物(IMC)，這將在下文中進行更詳細的描述。在一個優選的實施方案中， 多聚體表達為融合蛋白質。多聚體任選地與IMC締合。將M2e和NP表達為融合蛋白質且將 融合蛋白質與IMC綴合的一個優點是更易于生產。將兩種蛋白質同時表達并與IMC綴合，而 不是將每一種流感蛋白質表達為單獨的蛋白質并分別地綴合它們，因此簡化了生產過程。免疫調節化合物(IMC)和免疫刺激序列(ISS)本發明的組合物和方法可利用包含免疫刺激序列(IMC)的任一類型的免疫調節 化合物(IMC)。本文中所用的術語“IMC”指在體外、體內和/或間接體內測量時，影響可測量 的免疫應答的寡核苷酸序列。IMC含有非甲基化的胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸序列(如“CpG” 或含有胞嘧啶隨后是鳥苷且通過磷酸酯鍵連接的DNA)并刺激免疫系統。確定免疫系統的 刺激的多種方法描述如下。免疫刺激序列和/或免疫刺激核酸已經描述于本領域中。例 如，免疫刺激核酸已經描述于美國專利號6，194, 388 ；6，207，646和6，239，116中。IMC已 經描述于多個公開物中。參見，如美國公開號20060058254 ;W0 2004/058179 ；美國專利號 6，589，940 ；美國公開號 20040006034 ；美國公開號 20070027098 ；WO 98/55495。此外，稱為 嵌合的免疫調節化合物(CIC)的這一類免疫刺激核酸也可與本發明的多聚體一起使用。參 見，如美國專利號7，255，868 ；美國公開號20030199466 ；美國公開號20070049550 ；美國公 開號 20030225016 ；美國公開號 20040132677 和 WO 03/000922。一般來說，IMC可是大于8個堿基或堿基對的任一長度。在其它實施方案中，IMC 是至少10個、15個或20個堿基長度或堿基對長度。在一些實施方案中，IMC是最多30個、 50個、60個、80個或100個堿基長度或堿基對長度。IMC含有通式5'-X1X2CGX3X4I'代表的 〇 6基序，其中^2、&和\是核苷酸。在一個方面，本發明的IMC可以包括a)含有至少1 個CG 二核苷酸的至少8個堿基長度的回文序列和b)在或靠近多核苷酸的5’末端的至少一 個TCG三核苷酸。IMC含有含至少一個CG 二核苷酸的至少8個堿基長度的至少一個回文序 列。IMC也可在或靠近多核苷酸的5’末端含有至少一個TCG三核苷酸序列(即，5’-TCG)。 在一些例子中，回文序列和5’-TCG由IMC中的0個、1個或2個堿基隔開。在一些例子中， 回文序列包括所有或部分5’ -TCG。這些IMC更詳細地描述于美國公開號20060058254和 WO 2004/058179 中。在另一方面，本發明的IMC包含八聚體IMC，其包含含有CG的通常八聚體序列 5’ -嘌呤、嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、(胞嘧啶或鳥嘌呤)_3’的序列。為本領域技術人員顯而易見的，這類序列包括如下序列GACGTTCC ；GACGCTCC ；GACGTCCC ； GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；AACGTCCC； AACGCCCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC ；GGCGCCCC ；GACGTTCG ；GACGCTCG ；GACGTCCG ； GACGCCCG ；AGCGTTCG ；AGCGCTCG ；AGCGTCCG ；AGCGCCCG ；AACGTTCG ；AACGCTCG；AACGTCCG； AACGCCCG ；GGCGTTCG ；GGCGCTCG ；GGCGTCCG ；GGCGCCCG。IMC 也可包含選自 AACGTTCC、 AACGTTCG、GACGTTCC和GACGTTCG的八聚體。在一個實施方案中，IMC八聚體包含5’-嘌呤、 嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤_3’或IMC八聚體包含5’ -嘌呤、嘌呤、胞 嘧啶、鳥嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、胞嘧啶-3’。IMC八聚核苷酸也可包含5’-GACGTTCG-3’、 5， -GACGTTCC-3，、5， -AACGTTCG-3，或 5， -AACGTTCC-3，。在另一方面，包含1018IMC或由1018IMC組成的IMC可與本發明的M2e或M2e/ NP多聚體(共價或非共價)締合來使用。1018IMC的結構已經公開于多篇科學文章以及 專利中。參見，如 Hessel 等人(2005) J. Exp. Med. ,202(11) :1563。一般來說，1018IMC 是 (5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，) (SEQ ID NO 10)。IMC如嵌合的免疫調節化合物(“CIC”)也可與本發明的M2e或M2e/NP多聚體一 起使用。CIC一般包含一個或多個核酸部分以及一個或多個非核酸部分。具有多于一個核 酸部分的CIC中的核酸部分可以是相同的或不同的。具有多于一個非核酸部分的CIC中的 非核酸部分可以是相同的或不同的。因此，在一個實施方案中，CIC包含兩個或多個核酸部 分和一個或多個非核酸間隔部分，其中至少一個非核酸間隔部分與兩個核酸部分是共價連 接的。在一個實施方案中，至少一個核酸部分包含序列5’ -CG-3’。在一個實施方案中，至 少一個核酸部分包含序列5’ -TCG-3’。M2e或M2e/NP多聚體的遞送在一個實施方案中，M2e或M2e/NP多聚體通過其自身遞送到個體中。在另一實施 方案中，多聚體與一種或多種IMC—起遞送。在一個實施方案中，多聚體與作為綴合物的 IMC進行共施用。在另一實施方案中，多聚體與IMC在分別的載體中進行施用。多聚體的施 用可與IMC同時或同步。下文討論IMC的遞送也考慮了多聚體與IMC —起的遞送。流感多聚體和/或多聚體/IMC也可與其它流感疫苗一起施用以增強流感疫苗的 功效。考慮的與流感多聚體和/或多聚體/IMC —起使用的流感疫苗的類型包括但不限于
(whole virus vaccine)、>t __i￡l& (split virus vaccine) 的病毒疫苗、重組亞單位病毒疫苗和重組病毒疫苗。此外，多聚體或多聚體/IMC也可與多價流感疫苗(如，單價流感疫苗、二價流感疫 苗或三價流感疫苗)的一種或多種組分一起遞送。在一個方面，多聚體或多聚體/IMC的組 合物與三價滅活流感疫苗(TIV)的一種或多種組分一起遞送。TIV的標準組分包括來自三 種不同流感病毒株的血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶。可使用的TIV的例子包括但不限于 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0 TIV 使用的 量已經通過食品和藥品管理局(FDA)批準使用。二價流感疫苗(DIV)可含有來自兩種不同 流感毒株的血細胞凝集素。單價流感疫苗(MIV)可含有來自僅一種流感毒株如H5W的血 細胞凝集素和神經氨酸酶。TIV、DIV、MIV也可僅含有來自不含有神經氨酸酶組分的三種、 兩種或一種流感毒株的血細胞凝集素。此外，多聚體或多聚體/IMC也可與含有來自多于三 種分別的流感毒株的血細胞凝集素和神經氨酸酶的流感疫苗(四價流感疫苗或更高價的流感疫苗)一起遞送。這些TIV、DIV和MIV可與多聚體或多聚體/IMC組合物一起同時施 用或者在施用多聚體或多聚體/IMC組合物之前或者之后隔一段時間地施用。在一個方面， 可將多聚體或多聚體/IMC在施用TIV、DIV或MIV之前施用給個體以增強對含血細胞凝集 素的疫苗的應答。在一個實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在TIV、DIV或MIV前約1天施 用。在其它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在TIV、DIV或MIV前約2天、3天、4天、5天 或6天施用。在其它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在TIV、DIV或MIV前約1周施用。 在其它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在TIV、DIV或MIV前約1. 5周或2周施用。在其 它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在TIV、DIV或MIV前約2. 5周、3周、3. 5周 或4周施 用。多聚體或多聚體/IMC也可與單價滅活疫苗(MIV)，如針對H5W毒株的單價滅活疫 苗一起施用。MIV含有來自僅一種流感毒株的血細胞凝集素和神經氨酸酶。這些MIV可與 多聚體或多聚體/IMC組合物一起同時施用或者在施用多聚體或多聚體/IMC組合物之前或 者之后隔一段時間地施用。在一個方面，可將多聚體或多聚體/IMC在施用MIV前施用給個 體以增強MIV的應答。在一個實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在MIV前約1天施用。在 其它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在MIV前約2天、3天、4天、5天或6天施用。在其 它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在MIV前約1周施用。在其它實施方案中，多聚體或 多聚體/IMC在MIV前約1. 5周或2周施用。在其它實施方案中，多聚體或多聚體/IMC在 MIV前約2. 5周、3周、3. 5周或4周施用。M2e、M2e/NP、M2e/IMC和M2e/NP/IMC構建體可摻入到遞送載體如質粒、黏端質粒、 病毒或反轉錄病毒中，其可順序地編碼治療上有利的多肽，如細胞因子、激素和抗原。將IMC 摻入到此種載體中沒有不利地影響它們的活性。膠態分散系統可用于靶向地遞送組合物到發炎的組織，如鼻膜。膠態分散系統包 括高分子復合物、納米膠囊、微球體、珠和包括水包油乳劑、微團、混合微團和脂質體在內的 基于脂質的系統。在一個實施方案中，本發明的膠態系統是脂質體。脂質體是在體外和體內用作遞送運載體的人工膜小泡。已經顯示，大小為 0.2μπι-4.0μπι的大單層脂質體(LUV)能包封相當高百分數的含有大高分子的含水緩 沖液。可將RNA、DNA和完整病毒體包封在含水的內部并以生物學活性形式遞送給細胞 (Fraley等人，Trends Biochem. Sci.，6 :77，1981)。除哺乳動物細胞外，脂質體也已經用于 在植物、酵母和細菌細胞中的多核苷酸遞送。為了使脂質體成為有效的基因轉移運載體，應 當存在以下表征(1)高效地包封編碼反義多核苷酸的基因但不損害其生物學活性；(2)與 非靶細胞比較，優先地并基本上與靶細胞結合；(3)高效地遞送運載體的含水內含物給靶 細胞；和(4)準確的和有效的表達基因信息(Mannino等人，Biotechniques，6 :682，1988)。脂質體的組合物通常是磷脂的組合，特別是高相變溫度磷脂的組合，通常是與類 固醇組合，尤其是與膽固醇組合。也可使用其它磷脂或其它脂質。脂質體的物理特征取決 于PH、離子強度和二價陽離子的存在。在脂質體產生中有用的脂質的例子包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽 堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經節苷脂。特別有用的脂質的例子是二 酰磷脂酰甘油，其中脂質部分含有14個至18個碳原子，特別地含有16個至18個碳原子， 且是飽和的。闡示性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿和二硬脂酰基磷脂酰膽堿。脂質體的靶向可基于解剖學的因素和機理的因素進行分類。解剖學的分類是基于 選擇性例如器官特異的、細胞特異的和細胞器特異的水平。機理的靶向可基于靶向是被動 的還是主動的來區別。被動靶向使用脂質體的天然趨向來散播給含有竇狀毛細血管的器官 中網狀內皮系統(RES)的細胞。在另一方面，主動靶向涉及通過將脂質體與特異性配體如 單克隆抗體、糖類、糖脂或蛋白質偶聯或者通過改變組合物或者脂質體的大小來改變脂質 體，以達到靶向不是天然存在的定位位置的器官和細胞類型。靶向的遞送系統的表面可以以多種方式進行修飾。在脂質體靶向遞送系統的情 形時，可將脂質基團摻入到脂質體的脂質雙層中，以維持靶向配體與脂質體雙層的穩定締 合。多種熟知的連接基團可用于脂質鏈與靶向配體的結合(參見，如Yanagawa等人，Nuc. Acids Symp. Ser. , 19 189 (1988) ；Grabarek ^A,Anal. Biochem. , 185 131 (1990) ；Staros 等人，Anal. Biochem.，156 220(1986)和 Boujrad 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5728(1993))。多聚體或多聚體/IMC的靶向遞送也可通過將IMC與病毒表面和非病毒重組 表達載體、與抗原或其它配體、與單克隆抗體或者與具有期望的結合特異性的任一分子綴 合來達到。本領域普通技術人員也熟悉或能容易地確定在制備寡核苷酸-肽綴合物中有用 的方法。綴合可在IMC寡核苷酸的任一末端或在內部位置中合適的修飾的堿基(如胞嘧 啶或尿嘧啶)處完成。作為參考，用于寡核苷酸與蛋白質和與Ig的寡糖部分綴合的方法 是已知的(參見，如 0' Shannessy 等人，J. Applied Biochem. ,7 =347(1985) 另一有用的 參考文獻是 Kessler “ Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids“,在 Kricka() Nonisotopic DNA Probe Techniques(Acad. Press,1992)巾)。肽藥物與根據本發明的寡核苷酸IMC的共施用也可通過將IMC順式或反式地摻 入到編碼任一治療上有利的、可通過重組表達載體遞送的蛋白質的重組表達載體(質粒、 黏端質粒、病毒或反轉錄病毒)中來達到。如果將寡核苷酸IMC摻入到用于實踐本發明 的表達載體中是期望的，那么該摻入可使用不需要對本領域普通技術人員詳細說明的常 規技術來完成。然而，對于參考，普通技術人員可希望參考Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology,同上。簡而言之，重組表達載體(包括不編碼任一蛋白質并用作寡核苷酸IMC的攜帶者 的那些重組表達載體)的構建使用標準的連接技術。為了分析以證實構建的載體中的正 確序列，可將連接混合物用于轉化個體細胞，并根據需要，通過抗生素抗性選擇成功的轉化 體。制備來自轉化體的載體，通過限制性分析，和/或通過如Messing等人的方法(Nucleic Acids Res.，9 :309，1981)、Maxam 等人的方法(Methods in Enzymology, 65 :499，1980)或 者本領域技術人員已知的其它合適方法進行測序。剪切片段的大小分離使用常規凝膠電泳 進行，如由 Maniatis 等人，(Molecular Cloning，133 頁-134 頁，1982)所描述。個體細胞可用表達載體轉化并培養于常規的改進為適合于誘導啟動子、選擇轉化 體或擴增基因的營養培養基中。培養條件如溫度、PH等是以前用于表達挑選的個體細胞的 培養條件，且對普通技術人員是顯而易見的。如果重組表達載體是用作本發明使用的寡核苷酸IMC的攜帶者，由于質粒和黏端質粒缺乏致病性，因此它們是特別優選的。然而，質粒和黏端質粒在體內易發生比病毒更快的降解，且因此可能不會遞送足夠劑量的IMC以基本上抑制由全身施用的基因治療載體發 揮的ISS免疫刺激活性。在病毒載體備選物中，腺伴隨病毒擁有低致病性的優點。腺伴隨 病毒對外源基因插入的相對低的能力在本文的情況下不會造成困難，因為本發明寡核苷酸 IMC可以合成相對小的長度。在一個實施方案中，DNA疫苗或病毒載體用于表達M2e多聚體 或M2e/NP多聚體(任選地包括寡核苷酸IMC)。
可用于本發明的其它病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘或RNA病 毒如反轉錄病毒。反轉錄病毒載體優選地衍生自鼠反轉錄病毒、禽類反轉錄病毒或人HIV 反轉錄病毒。在反轉錄病毒載體中可插入單外源基因的反轉錄病毒載體的例子包括但不限 于莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV) 和勞斯肉瘤病毒(RSV)。許多另外的反轉錄病毒載體可摻入多個基因。所有這些載體能轉 移或摻入用于可選擇標記的基因以便鑒定和產生轉導細胞。由于重組反轉錄病毒是有缺陷的，它們需要輔助以產生感染的載體顆粒。這種輔 助可以例如通過使用含有在LTR中的調節序列控制下的編碼反轉錄病毒的所有結構基因 的質粒的輔助細胞系來提供。這些質粒缺少能使包裝機構識別用于包殼的RNA轉錄物的核 苷酸序列。已經缺失了包裝信號的輔助細胞系包括但不限于如T2、PA317和PA12。由于沒 有包裝基因組，這些細胞系產生了空的病毒體。如果將反轉錄病毒載體導入包裝信號完整、 但將結構基因用其它目的基因替換的這類輔助細胞中，載體可被包裝且載體病毒體也可產 生。通過將一個或多個目標序列與編碼如針對特定靶細胞上受體的配體的另一基因一起插 入到病毒載體中，載體能提供目標特異性。反轉錄病毒載體可通過插入如編碼糖、糖脂或蛋 白質的多核苷酸來獲得目標特異性。優選的靶向通過使用抗體來實現靶向反轉錄病毒載 體。本領域技術人員知道或者在無需進行過多實驗下能容易地確定能插入到反轉錄病毒基 因組中以允許含有寡核苷酸IMC的反轉錄病毒載體的目標特異性遞送的特異多核苷酸序 列。多聚體和多聚體/IMC的藥物組合物本發明包括包含M2e多聚體、M2e/IMC多聚體、M2e/NP多聚體、和M2e/NP/IMC多聚 體的所有藥物組合物。優選地與本發明IMC—起使用的可藥用載體可包括無菌的水溶液或 非水溶液、懸浮液和乳劑。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及可注 射的有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/含水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖 介質。腸胃外的運載體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化的林格或固 定油類。靜脈內的運載體包括流體和營養補充物、電解質補充物(如基于林格葡萄糖的電 解質補充物)等。防腐劑和其它添加劑也可以存在，例如，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑 和惰性氣體等。根據本發明，也可使用本領域熟知的方法將多聚體或多聚體/IMC低壓凍干 用于隨后的重構和用途。備選地，如果將多聚體或多聚體/IMC與以液體形式的疫苗(如， TIV)組合使用，那么多聚體或多聚體/IMC也可配制為液體。吸收促進劑、去污劑和化學刺激劑(如，角蛋白水解劑(keritinolyticagent))能 增強IMC組合物到靶組織的傳遞。對于涉及有關已經在有機藥物和基于肽的藥物的粘膜 遞送中成功使用的吸收促進劑和去污劑的一般原理的參考文獻，參見Chien，Novel Drug Delivery Systems,第 4 章(MarcelDekker, 1992)。具體來說，合適的鼻吸收促進劑表述于Chien，同上，于第5章，表2和表3 ；優選地是溫和劑(milder agent) 0在本發明的方法中用于粘膜/鼻遞送的合適試劑也描述于Chang 等人’ Nasal Drug Delivery,"Treatiseon Controlled Drug Delivery", 第9章和其表3-4B，(Marcel Dekker, 1992)中。已知的經皮膚增強藥物吸收的合適試 劑描述于 Sloan, Use ofSolubility Parameters from-Regular Solution Theory to DescribePartitioning-Driven Processes，第 5 章，"Prodrugs :Topical and OcularDrug Delivery”(Marcel Dekker, 1992)中，并描述于文中其它地方。藥物組合物也包括制劑用于誘導流感病毒的免疫應答的疫苗。在一個方面，本發 明提供了包含含有至少兩個拷貝的M2e的多聚體的組合物的疫苗。疫苗也可額外地包括 NP。在一個實施方案中，疫苗含有包含含NP和至少2個拷貝的M2e的融合蛋白質的組合 物。這些疫苗也可以以文中所述的方式任選地包括IMC。可使用的IMC的例子包括但不限 于1018ISS、7909和其它B型寡核苷酸、CIC如C295和其它、C型寡核苷酸如C792和其它。疫苗也可包括此處所述的運載體。可用的運載體的例子包括但不限于礬、微粒、月旨 質體和納米顆粒。本發明疫苗也可進一步含有單價、二價或一種三價滅活流感疫苗(TIV) 的一種或多種組分。可使用的單價疫苗的例子是H5大流行病疫苗。可使用的TIV的非限 制性例子是 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0ffl〒續本刪綠{本齡碰/IMC白妨本發明的多聚體或多聚體/IMC組合物和疫苗使用適合于藥物遞送的任一可用的 方法和途徑向個體施用。在一個優選的實施方案中，本發明的多聚體或多聚體/IMC組合物 和疫苗與其它標準的流感疫苗一樣，通過使用針的注射施用。在一個實施方案中，多聚體與 或不與IMC —起通過本領域技術人員已知的任一遞送方法遞送到上呼吸道和/或下呼吸 道。在一個優選的實施方案中，多聚體與或不與IMC—起作為疫苗遞送。任選地，多聚體與 其它單價、二價或三價流感疫苗一起施用。另一可能的遞送方法是鼻內遞送。多聚體或多 聚體/IMC另一可能的遞送方法是通過吹入法。其它施用方法包括間接體內的方法(即，遞 送用多聚體或多聚體/IMC孵育的或轉染的細胞)以及全身的或局部的途徑。本領域普通 技術人員應當理解，指導將IMC遞送到個體中的方法和途徑應該避免IMC在體內的降解。鼻內施用方法在處理呼吸疾病如流感病毒感染中特別有用。這類方法包括吸入本 發明的多聚體或多聚體/IMC組合物的噴霧懸浮液。適合于遞送多聚體或多聚體/IMC組 合物到鼻粘膜、氣管和細支氣管的噴霧器設備是本領域熟知的，且因此不在此處詳細描述。 對于關于鼻內藥物遞送的一般綜述，本領域一般技術人員可以希望參考Chien，N0Vel Drug DeliverySystems,第 5 章(Marcel Dekker,1992)。在一個方面，本發明的多聚體或多聚體/IMC組合物和疫苗以約0. 1 μ g至約5mg， 更優選地在0. 25 μ g和3mg之間，甚至更優選地在0. 5 μ g和Img之間，甚至更優選地在 0. 75 μ g和500 μ g之間，甚至更優選地在1 μ g和100 μ g之間的劑量施用給需要其的個體。用于實施本發明方法的試劑念為了用于上述方法中，本發明也提供了試劑盒。這類試劑盒可包括以下任一一種 或全部M2e、M2e/NP、M2e/IMC (綴合的或非綴合的)；M2e/NP/IMC (綴合的或非綴合的)的 多聚體；可藥用載體(可與IMC預混合)或用于重構凍干的多聚體或多聚體/IMC的懸浮基 質；額外的藥物；用于每一 IMC和額外藥物的無菌小瓶、或用于其混合物的單一小瓶、用于 向個體遞送多聚體或多聚體/IMC的設備；用于檢測所尋求的免疫調節效果在受治療的個體中已經達到的指示物的測定試劑、如何和何時施用多聚體或多聚體/IMC的說明書以及 合適的測定設備。此外，本發明也提供了包含M2e多聚體或M2e/NP多聚體(與或不與IMC綴合)和 流感疫苗(如TIV)的一種或多種組分的試劑盒。本發明的方法本發明的組合物和/或疫苗可用于誘導免疫應答以抗擊不同的流感病毒株感染。 可以是免疫應答的靶的示例性流感病毒株顯示于圖1中。人M2e、禽類M2e和豬M2e以及它 們的變體的共有序列顯示于圖1中。NP和其變體的共有序列顯示于圖2中。針對流感病毒 的免疫應答可以是體液應答或細胞免疫應答或者這兩種應答的組合。動物或細胞群體中的免疫應答可以以許多方式檢測，包括一種或多種IFN-Y、 IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5、IP-10、ISG-54K、MCP-1 的增加表達、或者 以免疫刺激為特征的基因表達譜、以及應答如B細胞增殖和樹突細胞成熟的改變。在細胞 群體中刺激免疫應答的能力具有許多用途，如用于免疫抑制劑的測定系統中。對多聚體的免疫應答的分析(定性分析和定量分析二者)可通過本領域已知的任 一方法進行，包括但不限于，測量抗原特異的抗體產生(包括測量特異性抗體+亞類)、淋 巴細胞的特異性群體如⑶4+T細胞、NK細胞或CTLs的活化、細胞因子如IFN- y、IFN- α、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-IO或IL-12的產生和/或組胺的釋放。用于測量特異性抗體應答的 方法包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)且是本領域熟知的。特定類型淋巴細胞如CD4+T細 胞的數量可用如熒光激活的細胞分選術(FACS)測量。細胞毒性測定和CTL測定可例如由 Raz 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 :9519_9523 和 Cho 等人(2000)所述進行。細 胞因子濃度可通過如ELISA進行測量。評價對免疫原的免疫應答的這些測定法和其它測定 法是本領域熟知的。參見，如 SELECTED METHODS IN CELLULARIMMUNOLOGY(1980)Mishell 禾口 Shiigi 編輯，W. H. Freeman and Co.。優選地，Thl型應答是刺激的，S卩引發的和/或增強的。關于本發明，通過與未用多 聚體或多聚體/IMC處理的對照細胞比較，測量來自用多聚體或多聚體/IMC處理的細胞的 細胞因子產生來體外或間接體內地確定刺激的Thl型免疫應答。確定細胞的細胞因子產生 的方法包括本文中所述的和本領域已知的任一那些方法。在應答多聚體或多聚體/IMC處 理中產生的細胞因子的類型表明由細胞產生的Thl型或Th2型偏向的免疫應答。如本文中 所用，術語“Thl型偏向的”細胞因子產生指與刺激不存在時與Thl型免疫應答相關的細胞 因子的產生比較，存在刺激時這類細胞因子的可測量的增加產生。這類Thl型偏向細胞因 子的例子包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-y、IFN-a和TNF-a。相反，“Th2型偏向的細胞 因子”指與Th2型免疫應答相關的那些細胞因子，且包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13。對 確定多聚體或多聚體/IMC活性有用的細胞包括免疫系統細胞、分離自個體的原代細胞和/ 或細胞系，優選地是APC和淋巴細胞(如，巨噬細胞和T細胞)以及脾細胞。刺激的Thl型免疫應答也可在用多聚體或多聚體/IMC治療的個體中測量，通過本 領域已知的任一方法確定，所述方法包括但不限于(1)在用多聚體或多聚體/IMC治療之 前和之后測量INF-γ ； (2)在用多聚體或多聚體/IMC治療之前和之后，IL-12、IL-18和/ 或IFN(a、β或Y)水平的增加；(3)與未用多聚體或多聚體/IMC治療的對照比較，在多 聚體或多聚體/IMC治療的個體中的“Thl型偏向”抗體產生。多種這些測定可通過使用本文中所述的或本領域已知的任一方法體外或間接體內測量由脾細胞、APC和/或淋巴細胞 產生的細胞因子得到。一些這些測定可通過使用本文中所述的或本領域已知的任一方法測 量流感特異性抗體的類和/或亞類來得到。對多聚體或多聚體/IMC治療應答產生的抗原特異性(即流感特異性)抗體的類 和/或亞類表明來自細胞的Thl型偏向的免疫應答或Th2型偏向的免疫應答。如文中所用， 術語“Thl型偏向的”抗體產生指與Thl型免疫應答相關的抗體(即Thl相關的抗體)的可 測量的增加產生。可測量一種或多種Thl相關的抗體。該類Thl型偏向的抗體的例子包括 但不限于人 IgGl 和 / 或 IgG3(參見，如 Widhe 等人(1998) Scand. J. Immunol. 47 :575_581 和 de Martino 等人(1999)Ann. Allergy Asthma Immunol. 83 :160_164)和鼠 IgG2a。相反， "Th2型偏向的抗體”指與Th2型免疫應答相關的抗體，且包括但不限于人IgG2、IgG4和/ 或 IgE (參見，如 Widhe 等人(1998)和 de Martino 等人(1999))和鼠 IgGl 和 / 或 IgE。作為施用多聚體或多聚體/IMC的結果發生的Thl型偏向的細胞因子誘導產生了 增強的細胞免疫應答，如由NK細胞、細胞毒性殺傷細胞、輔助性Thl細胞和記憶細胞進行的 細胞免疫應答。這些應答在用于針對多種流感病毒株的保護性或治療性接種疫苗中是特別 有利的。因此，本發明的組合物和疫苗可作為通用疫苗接種以抗多種流感病毒株。多聚體和多聚體/IMC的組合物和疫苗還可用于改善個體中與流感病毒感染相關 的一種或多種癥狀。這通過向個體施用包含流感基質蛋白胞外結構域(M2e)的多聚體的疫 苗實現，其中所述多聚體能在個體中誘導免疫應答。與流感病毒感染相關的癥狀包括但不 限于，身體疼痛(特別是關節疼痛和咽喉疼痛)、咳嗽和噴嚏、極端的寒冷和發熱、疲勞、頭 疼、受刺激的眼睛流淚、鼻塞、惡心和嘔吐、以及眼睛發紅、皮膚發紅(尤其是臉發紅)、嘴發 紅、咽喉發紅和鼻子發紅。在一個實施方案中，疫苗進一步包含NP。在本發明的其它實施方 案中，疫苗進一步包含IMC。在本發明的另一方面，本發明的組合物和疫苗提供了通過向個體施用(a)包含至 少兩個拷貝的M2e的疫苗和(b)單價滅活疫苗、二價滅活疫苗或三價滅活疫苗(TIV)的 一種或多種組分來降低個體中流感病毒感染的可能性的方法。TIV的例子包括但不限于 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0 在一些實施 方案中，疫苗進一步包含上述的NP。在其它實施方案中，疫苗進一步包含文中以任一方式描 述的并為本領域已知的IMC。提供了以下的實施例以說明本發明的方面，但并不意指以任何方式限制本發明。 實施例實施例1. 8 X (M2e)-NP~6X組氨酸標簽(組氨酸標簽的N8)的構建在大腸桿菌(E.coli)中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的8個拷貝的 基質2的胞外部分(M2e)基因的構建體。該構建體的核苷酸序列如下(下劃線序列表明用 于將基因構建體克隆入質粒載體的限制性酶位點)CATATGTCTCTGTTAACGGAAGTCGAGACACCCATCCGGAATGAGTGGGGTTCCCGTAGTAATGATAGTTCGGATAGCTTACTGACCGAGGTTGAAACACCTATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGGTCAAATGACTCGAGCGATTCGTTGTTGACCGAAGTAGAGACCCCAATCCGCAATGAATGGGGCTCCCGGAGTAACGATAGCAGCGACTCCTTACTGACGGAGGTGG
AAACGCCCATCCGTAACGAGTGGGGTTCTAGAAGTAACGATTCCTCGGATAGCTTATTAACAGAAGTCGAAACGCCTATTCGCAATGAATGGGGTTCGCGTTCGAATGATTCCAGTGATAGCCTGTTAACGGAAGTTGAAACTCCGATCCGTAATGAGTGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACACCAATCCGGAACGAATGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAA
TGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCATCACCATCACCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 1)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVK
GVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQR NLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTE11RMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 2)實施例2. 4 X (M2e)~NP~4X (M2e)~6X組氨酸標簽(組氨酸標簽的N4/C4)的構津在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的和在3’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的 M2e基因的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACCGAAGTCGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGGGCAGTCGGTCGAACGATAGCTCGGATAGCCTGCTGACGGAGGTGGAAACCCCGATCCGTAACGAGTGGGGCTCTCGTAGTAACGACTCGAGCGATAGCTTACTGACTGAAGTTGAAACTCCAATTCGCAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAATGATAGCAGTGATAGCTTATTAACGGAAGTTGAAACGCCTATCCGGAACGAATGGGGTTCTAGAAGCAACGATAGTAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAA
CGCTGAGGAATATGACAACTCTCTGTTGACTGAAGTAGAGACTCCAATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGTTCTAACGACTCTTCCGACTCTCTGCTCACCGAGGTTGAAACCCCGATTCGCAATGAATGGGGCTCGCGTTCCAATGACTCGAGCGATTCTCTCCTGACGGAGGTTGAGACGCCTATCCGTAATGAGTGGGGTTCCCGGAGCAATGATTCTTCTGATTCTCTGCTGACTGAAGTCGAAACCCCGATTCGGAACGAGTGGGGCAGTCGTTCAAATGACTCGTCGGACCATCATCATCACCATCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 3)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTE11RMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDHHHHHH(SEQ ID NO 4)實施例3. 4X (M2e)-NP~6X組氨酸標簽(組氨酸標簽的N4)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的M2e基因 的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACGGAGGTGGAAACTCCAATTCGGAATGAATGGGGTTCGCGCAGCAATGATAGCTCGGATAGCTTACTGACCGAAGTCGAAACACCCATCCGTAACGAATGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACCCCGATCCGCAATGAGTGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAATGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGAC
CATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTA
TGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGG
TAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCATCACCATCACCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 5)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 6)實施例4. 4X (M2e~間隔區)_NP_6X組氨酸標簽(組氨酸標簽的N4s)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的M2e基因 和間隔區的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGTCCCTGCTGACGGAAGTAGAAACCCCAATTCGCAATGAATGGGGCAGCCGTAGCAATGACTCTTCTGACGGTTCTGCGAGCGGTAGCTTGCTTACTGAAGTTGAAACTCCTATCCGTAACGAATGGGGTTCCCGTTCTAACGACTCGAGCGACGGCAGCGCGTCCGGTTCTCTGCTGACTGAGGTCGAGACTCCGATTCGTAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAACGATTCTTCCGATGGCTCTGCTTCTGGTTCCTTGTTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCCGCAACGAATGGGGCTCTCGCTCTAATGATAGCTCTGATGGTTCGGCTTCCGGCATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAAC
GGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCACCATCATCACCACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 7)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFffRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMM DQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 8)實施例5. 8 X (M2e)-NP (非組氨酸標簽的N8)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的8個拷貝的M2e基因 的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGTCTCTGTTAACGGAAGTCGAGACACCCATCCGGAATGAGTGGGGTTCCCGTAGTAATGATAGTTCGGATAGCTTACTGACCGAGGTTGAAACACCTATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGGTCAAATGACTCGAGCGATTCGTTGTTGACCGAAGTAGAGACCCCAATC
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GCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTA
GCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 9)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNG
DDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN(SEQ ID NO: 10)實施例6. 4X (M2e)~NP~4X (M2e)(非組氨酸標簽的N4/C4)的構津在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的和在3’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的 M2e基因的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACCGAAGTCGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGGGCAGTCGGTCGAACGATAGCTCGGATAGCC TGCTGACGGAGGTGGAAACCCCGATCCGTAACGAGTGGGGCTCTCGTAGTAACGACTCGAGCGATAGCTTACTGACTGAAGTTGAAACTCCAATTCGCAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAATGATAGCAGTGATAGCTTATTAACGGAAGTTGAAACGCCTATCCGGAACGAATGGGGTTCTAGAAGCAACGATAGTAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCT
AGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTCTCTGTTGACTGAAGTAGAGACTCCAATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGTTCTAACGACTCTTCCGACTCTCTGCTCACCGAGGTTGAAACCCCGATTCGCAATGAATGGGGCTCGCGTTCCAATGACTCGAGCGATTCTCTCCTGACGGAGGTTGAGACGCCTATCCGTAATGAGTGGGGTTCCCGGAGCAATGATTCTTCTGATTCTCTGCTGACTGAAGTCGAAACCCCGATTCGGAACGAGTGGGGCAGTCGTTCAAATGACTCGTCGGACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO: 11)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD(SEQ ID NO: 12)實施例7. 4XM2e-NP (非組氨酸標簽的N4)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的M2e基因 的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACGGAGGTGGAAACTCCAATTCGGAATGAATGGGGTTCGCGCAGCAATGATAGCTCGGATAGCTTACTGACCGAAGTCGAAACACCCATCCGTAACGAATGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACCCCGATCCGCAATGAGTGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAATGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCG
TATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCC
AGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 13)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDN(SEQ ID NO 14)實施例8. 4X (M2e~間隔區)-NP(非組氨酸標簽的N4s)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在5’的與核蛋白基因融合的4個拷貝的具有間隔 區的M2e基因的構建體。該構建體的核苷酸序列如下CATATGTCCCTGCTGACGGAAGTAGAAACCCCAATTCGCAATGAATGGGGCAGCCGTAGCAATGACTCTTCTGACGGTTCTGCGAGCGGTAGCTTGCTTACTGAAGTTGAAACTCCTATCCGTAACGAATGGGGTTCCCGTTCTAACGACTCGAGCGACGGCAGCGCGTCCGGTTCTCTGCTGACTGAGGTCGAGACTCCGATTCGTAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAACGATTCTTCCGATGGCTCTGCTTCTGGTTCCTTGTTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCCGCAACGAATGGGGCTCTCGCTCTAATGATAGCTCTGATGGTTCGGCTTCCGGCATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAAC
ACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 15)以下是融合蛋白質的蛋白質序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTE
GRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDN (SEQ ID NO 16)實施例9. NP-8X (M2e)(非組氨酸標簽的C8)的構建在大腸桿菌中制備并表達含有在3’的與核蛋白基因融合的8個拷貝的M2e基因 的構建體。以下是融合蛋白質的蛋白質序列MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQ
ANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSD(SEQ ID NO: 18)實施例10. NP、M2e和IMC的共價綴合物和非共價綴合物該實施例描述了包含制備的NP、M2e和IMC的多種共價綴合物和非共價綴合物。 “雙綴合物”通過將乙酰化M2e肽與3’硫代295ISS綴合來制備。然后，將多(包括單)拷 貝與NP蛋白質順序地綴合。將“競爭性結合綴合物"NP蛋白質同時與NHS活化的M2e肽和 NHS活化的3，295ISS綴合。通過同時添加所有反應物，IMC和M2e肽競爭地結合至NP蛋 白質上的相同部位。“離子締合綴合物”通過使用NP蛋白質中的天然RNA結合口袋非共價 地捕獲M2e-IMC綴合物的IMC組分來制備。過量的M2e_IMC綴合物與游離的NP蛋白質反 應，結果形成非共價的蛋白質綴合的肽復合物。t施例11.與IMC綴合的M2e flt用礬遞送時i秀導強的杭體應答將10只BALB/c小鼠為一組通過使用僅代表流感M2蛋白質的胞外結構域(M2e) 的合成肽(5yg)、與 1018ISS(20y g)混合的 M2e (5 μ g)、綴合到 1018ISS (約 20 μ g)的 M2e(5 μ g)、或者與礬結合的M2e-1018ISS綴合物，以兩周間隔地肌肉注射兩次進行免疫。 第二次免疫后兩周，將小鼠抽血并通過ELISA測量抗M2e肽IgGl抗體滴度和抗M2e肽IgG2a 抗體滴度。僅M2e是沒有免疫原性的且沒有誘導出可檢測的IgGl抗體或IgG2a抗體。類 似地，與1018ISS混合的M2e是沒有免疫原性的。M2e_1018ISS綴合物有免疫原性且分別 誘導了 IgGl和化62￡1的約21，000和10，000的抗M2e幾何平均滴度。與礬結合遞送的 M2e-1018ISS綴合物有極高的免疫原性且分別誘導了 IgGl和IgG2a的94，000和39，500的 抗M2e滴度。實施例12. M2e~1018ISS綴合物與礬或DOTAP遞送時是有免疫原性的且添加NP影 響Μ2θ應答將10只BALB/c小鼠為一組通過使用與1018ISS (約20 μ g)綴合的M2e (5 μ g)、或者與流感核蛋白(NP，10yg)混合的M2e-1018ISS綴合物、與礬結合的M2e-1018ISS 綴合物、與礬結合并與NP混合的M2e-1018ISS綴合物、或用陽離子脂質DOTAP遞送的 M2e-1018ISS綴合物、或者與NP混合并用DOTAP遞送的M2e_1018ISS綴合物，以兩周間隔地 肌肉注射兩次進行免疫。第二次免疫后兩周，將小鼠抽血并通過ELISA測量抗M2e肽IgGl 抗體滴度和抗M2e肽IgG2a抗體滴度。如在實施例1中，M2e-1018ISS綴合物是有免疫原 性的且分別誘導了 IgGl和IgG2a相對低的約6，600和2，000的抗M2e幾何平均滴度。與 僅M2e-1018ISS綴合物比較，與NP混合的M2e_1018ISS綴合物產生了降低的抗M2e IgGl 滴度(幾何平均值為1，000)，但產生了非常相似的IgG2a滴度(2，200)。在礬上以聚合的構型遞送M2e-IMC綴合物誘導了顯著地高于僅用M2e-1018ISS綴合物誘導的抗M2e IgGl 滴度和抗M2e IgG2a滴度二者(幾何平均值分別為21，OOO和14，000)。此外，添加NP到 M2e-1018ISS綴合物+礬制劑降低約50%的所得抗M2e IgGl滴度并2倍增加所得的抗M2e IgG2a滴度。以DOTAP制劑遞送M2e_1018ISS誘導了與M2e_1018ISS+礬制劑相似的IgGl 滴度，但誘導了顯著地低于礬制劑誘導的IgG2a應答。實施例13. M2e~1018ISS礬制劑的免疫原件將5只BALB/c小鼠為一組通過使用用礬遞送的與1018ISS (約20 μ g)綴合的M2e(5y g)、用礬遞送的與1018ISS(20y g)混合的M2e (5 μ g)、用礬遞送的 與1018ISS (20 μ g)和NP (10 μ g)混合的M2e (5 μ g)、或者與NP (10 μ g)和礬混合的 M2e-1018ISS綴合物，以兩周間隔地肌肉注射兩次進行免疫。第二次免疫后兩周，將小鼠 抽血并通過ELISA測量抗M2e肽IgGl抗體滴度和抗M2e肽IgG2a抗體滴度。用礬遞送的 M2e-1018ISS誘導了顯著地高于與1018ISS混合并用礬遞送的M2e誘導的抗M2eIgGl應答 (分別為266，000對比17，000)。添加NP到非IMC綴合的M2e+礬急劇地降低了對M2e的 IgGl (17，000到700)應答和IgG2a應答(13，000到< 600) 二者。與實施例2—致，添加NP 到M2e-1018ISS綴合物+礬制劑輕微地減少了抗M2e IgGl應答(187，000對比266，000) 并約2倍增加抗M2e IgG2a應答(40，000對比15，500)。實施例14. M2e和NP的融合蛋白質能誘導對M2e和NP 二者的抗體應答如實施例5中所述的融合蛋白質N8 (非His標簽的N8)按照其中所述進行構建。 將5只BALB/c小鼠為一組通過使用僅N8融合蛋白質(10 μ g)、最初注射用完全弗氏佐劑 (CFA)和第二次注射用不完全弗氏佐劑(IFA)遞送的N8融合蛋白質(10 μ g)、或者使用用 礬遞送的M2e-1018ISS綴合物(5 μ gM2e肽、20 μ g 1018ISS)，以兩周間隔地肌肉注射兩次 進行免疫。第二次免疫后兩周，將小鼠抽血并通過ELISA測量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗 體滴度和IgG2a抗體滴度。僅用N8融合蛋白質產生了低的但是可測量的對M2e的IgGl應答和IgG2a應答 (分別為5，600和2，000)。與僅用抗原遞送比較，當N8融合蛋白質用CFA/IFA遞送時，抗 M2e IgGl滴度增加約17倍(95，000)且抗M2e IgG2a滴度增加約4倍(9，400)。用N8M2e/ NP誘導的抗M2e IgGl滴度與用M2e肽-IMC綴合物+礬制劑產生的IgGl滴度相似，但是 IgG2a滴度約5倍降低(分別為118，000和48，000)。N8M2e/NP融合蛋白質產生了強的與 用和不用CFA/IFA佐劑相似的抗NP IgGl滴度(分別為104，000和110，000)。對于N8融 合蛋白質用或不用CFA/IFA佐劑，抗NP IgG2a應答是相似的且低于IgGl滴度約6倍。正 如預期，M2e肽-IMC綴合物+礬制劑產生了對NP的不可測量到的抗體應答。實施例15.用不同佐劑的Μ2θ/ΝΡ融合蛋白質的免疫原件將融合蛋白質N8 (非組氨酸標簽的N8)(如在實施例5中所述)和N4/C4 (非組氨 酸標簽的N4/C4)(如在實施例6中所述)按照其中所述進行構建。將5只BALB/c小鼠為一 組通過使用用礬遞送的N4/C4融合蛋白質(10 μ g)、用礬遞送的N8融合蛋白質(10yg)、用 Iscomatrix佐劑遞送的N4/C4融合蛋白質(10 μ g)、用Iscomatrix遞送的N8融合蛋白質 (10 μ g)、用礬遞送的與 1018ISS(10y g)或與 M2e 肽-1018ISS 綴合物(5 μ g M2e 肽、20μ g 1018ISS)混合的N8融合蛋白質(10 μ g)，以兩周間隔地肌肉注射兩次進行免疫。第二次免 疫后兩周，將小鼠抽血并通過ELISA測量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗體滴度和IgG2a抗體滴度。用礬或用Iscomatrix遞送的N8融合蛋白質和N4/C4融合蛋白質都產生了相似的抗M2e IgGl滴度，且這些滴度與用M2e肽-1018ISS+礬制劑產生的范圍和滴度是相同的 (45，000-56，000對比 74，500)。N8+1018ISS制劑產生了非常低的抗M2e IgGl 滴度(1，000)。 用Iscomatrix或1018ISS遞送的融合蛋白質和M2e肽-IMC+礬制劑都產生了高于融合蛋白 質+礬制劑的抗M2e IgG2a滴度(4，200到19，000對比1，500)。這與已知的Iscomatrix 和1018ISS佐劑在小鼠中誘導Thl應答來導致IgG2a產生的能力是一致的。N8+礬制劑和N4/C4+礬制劑二者均誘導了針對NP的強的IgGl應答和低的IgG2a 應答(分別為 29，000 和 49，000)。N8+Iscomatrix 制劑和 N4/C4+Iscomatrix 制劑二者均 誘導了比礬制劑更均衡的針對NP的IgGl/IgG2a應答(分別地IgGl為16，000和9，000 ；以 及IgG2a為28，000和16，000)。N8+1018ISS制劑誘導了低的針對NP的IgGl應答和IgG2a 應答。正如預期，M2e肽制劑沒有誘導出可測量到的針對NP的抗體應答。t施仿I丨16.用不同佐布丨遞送的Μ2θ/ΝΡ融合蛋白質的免,瘡原十牛將5只BALB/c小鼠為一組通過使用僅遞送N8融合蛋白質(25 μ g)、用礬遞送的 N8融合蛋白質、用MF59佐劑遞送的N8融合蛋白質、用MF59+1018ISS (25 μ g)遞送的N8融 合蛋白質、或用1018ISS(25yg)遞送的N8融合蛋白質、或者使用用礬遞送的N4/C4融合蛋 白質(25 μ g)，以兩周間隔地肌肉注射兩次進行免疫。對照組的5只小鼠僅接受PBS。第二 次免疫后兩周，將小鼠抽血并通過ELISA測量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗體滴度和IgG2a 抗體滴度。第二次免疫后四周，將小鼠處死，獲取脾并將脾細胞使用ELISP0T測定法來確定 產生IFN γ的NP特異的T細胞數量。僅用N8融合蛋白質產生了低水平的M2e特異的IgGl抗體和M2e特異的IgG2a抗 體二者(分別為2，700和< 600)。用礬遞送的N8融合蛋白質、用MF59遞送的N8和用礬 遞送的N4/C4都產生了相似的IgGl占優勢地高于IgG2a的抗M2e抗體滴度(分別地IgGl 為 33，000,21, 500 和 40，000 對比 IgG2a 為< 600,800 和 1000)。在 N8+MF59 制劑中包括 1018ISS降低了約50%的抗M2e IgGl滴度，但28倍增加IgG2a滴度(分別為10，000對比 21，000)。N8+1018ISS制劑產生了低的抗M2e IgGl滴度和抗M2eIgG2a滴度二者(900和 2，400)。僅用N8融合蛋白質產生了強的IgGl占優勢地高于IgG2a的抗NP滴度(分別為 115，000和9，000)。使用礬或MF59佐劑約2倍增加這些應答。N4/C4+礬產生的抗NP滴度 與用N8+礬產生的抗NP滴度相似。用MF59+1018ISS遞送N8誘導了抗體應答的轉變，導致 非常高的IgG2a應答和遠低于礬或MF59制劑的IgGl應答(分別為413，000和49，000)。 用1018遞送N8顯示出從IgGl向IgG2a的轉變(分別為2，600和40，000)，但總滴度遠低 于N8+MF59+1018ISS組中的總滴度。使用ELISP0T測定法，僅用N8、用N8+礬制劑、N8+MF59制劑和N8+1018ISS制劑在 用對BALB/c小鼠NP特異的⑶8肽或用涵蓋全部NP氨基酸序列的肽庫再刺激后都產生了 相似數量的IFN γ斑點形成細胞(每IO6個細胞60-90sfu)。NP特異的IFN γ斑點形成細 胞數在接受C8+MF59+1018ISS組中實質上高于其它組(每IO6個細胞180_290sfu)。實施例17.動物實驗將BALB/c小鼠(每組10只)用上面所示的NP/M2e構建體免疫兩次(例如，在0周和2周時)，將NP/M2e構建體與IMC或對照材料綴合(僅NP和M2e、NP_IMC、和M2e_IMC/ 礬)。第二次免疫后兩周，將小鼠抽血并測定血清以確定NP和M2e特異的抗體反應。獲取 小鼠的脾并將脾細胞使用IFN-Y和IL-4ELISP0T、和/或細胞因子ELISA體外測定NP特異 的細胞介導的免疫應答。實施例18.用多聚體和TIV免疫將存在流感感染風險的個體或需要誘導免疫應答的個體用一種或者多種以下組 合進行接種(l)M2e/IMC多聚體+三價滅活疫苗(TIV) ； (2)M2e/IMC和NP/IMC多聚體 +TIV ； (3)M2e/NP/IMC多聚體+TIV。個體可在接種疫苗前或后任選地監測以確定免疫應答 (如，體液應答和/或細胞應答)和/或生理反應(如，與流感感染相關的癥狀的減輕)。所 用多聚體的量是1 μ g到100 μ g之間且與TIV —起聯合使用來降低流感病毒感染的風險。
為了明確和理解的目的，盡管上述發明已經通過圖例和實施例的方式進行了詳細 地描述，對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可以對本發明實施某些改變和修改。因此， 描述和實施例不應理解為限制本發明的范圍。本文中所引用的所有專利、專利申請和出版物為了所有的目的以相同的程度以其 整體引入作為參考，就如同每一出版物、專利或專利申請被明確和單獨地引入作為參考一樣。
權利要求
組合物，其包含流感基質蛋白胞外結構域(M2e)的多聚體，其中所述M2e是以多聚體展示呈遞給免疫系統并能在個體中誘導免疫應答。
2.權利要求1所述的組合物，其中所述多聚體展示通過將至少兩個拷貝的M2e與非蛋 白質平臺分子締合來實現。
3.權利要求1或2所述的組合物，其進一步包含含有免疫刺激序列(ISS)的免疫調節 化合物(IMC)。
4.權利要求3所述的組合物，其中所述IMC與多聚體締合。
5.權利要求1至4中任一項所述的組合物，其進一步包含核蛋白(NP)。
6.權利要求5所述的組合物，其中所述多聚體展示通過將至少兩個拷貝的M2e與NP共 價地或離子地連接來實現。
7.權利要求6所述的組合物，其中所述多聚體展示通過包含至少兩個拷貝的M2e和NP 的融合蛋白質來實現。
8.權利要求7所述的組合物，其中所述M2e的拷貝位于NP的羧基末端側。
9.權利要求7所述的組合物，其中所述M2e的拷貝位于NP的氨基末端側。
10.權利要求7所述的組合物，其中所述M2e的拷貝位于NP的氨基端側和羧基端側這 兩側。
11.權利要求5至10中任一項所述的組合物，其進一步包含與NP締合的含有ISS的IMC。
12.權利要求1至11中任一項所述的組合物，其進一步包含運載體。
13.權利要求12所述的組合物，其中所述運載體選自礬、微粒、脂質體和納米顆粒。
14.疫苗，其包含權利要求1至13中任一項所述的組合物。
15.權利要求14所述的疫苗，其進一步包含佐劑。
16.權利要求14或15所述的疫苗，其進一步包含至少一種三價滅活流感疫苗(TIV)的 一種或多種組分。
17.用于改善個體中與流感病毒感染相關的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括向 個體施用權利要求14至16中任一項所述的疫苗。
18.用于降低個體中流感病毒感染的可能性的方法，所述方法包括向個體施用權利要 求14至16中任一項所述的疫苗。
19.用于降低個體中流感病毒感染的可能性的方法，所述方法包括向個體施用權利要 求14至15中任一項所述的疫苗和單價滅活疫苗的一種或多種組分。
全文摘要
本發明提供了以多聚體展示呈遞給個體的免疫系統以誘導免疫應答的流感蛋白質如基質蛋白和核蛋白的組合物。組合物任選地與任一類型的包含免疫刺激序列(ISS)的免疫調節化合物(IMC)締合。本發明進一步提供了能誘導細胞免疫應答和/或體液免疫應答的流感基質蛋白和核蛋白的組合物。本發明也提供了制備和使用這些組合物例如作為疫苗來改善與流感病毒感染相關的癥狀或用于降低流感病毒感染的風險的方法。
文檔編號A61K39/145GK101835487SQ200880112341
公開日2010年9月15日 申請日期2008年8月21日 優先權日2007年8月21日
發明者B·D·利文斯頓, D·A·希金斯, G·羅斯, G·范奈斯特 申請人:戴納瓦克斯技術公司