免疫誘導劑的制作方法

專利名稱：免疫誘導劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及作為癌的治療和/或預防劑等有用的新型免疫誘導劑。
背景技術：
癌癥是占據所有死亡原因第一位的疾病，目前進行的治療以手術療法為主，組合 使用放射療法和化學療法。近年來，盡管開發了新手術方法并發現了新的抗癌劑，但現狀 是除了部分癌癥以外，癌的治療效果仍未見提高。近年來，由于分子生物學與癌免疫學的 進步，逐漸能夠鑒定出被作用于癌的細胞毒性T細胞所識別的癌抗原及編碼該癌抗原的基 因，對抗原特異性免疫療法的期待日漸高漲(參照非專利文獻1)。在免疫療法中，為了減輕 副作用，作為其抗原被識別的肽或者蛋白質必須在正常細胞中幾乎不存在，而特異性地存 在于癌細胞中。1991年，比利時Ludwig研究所的Boon等人通過使用自身癌細胞株與癌反應 性T細胞的cDNA表達克隆法，分離出CD8陽性T細胞識別的人黑色素瘤抗原MAGEl (參照非 專利文獻2)。之后，報導了采用基因表達克隆的方法鑒別在癌癥患者體內與自身的癌反應 產生的抗體所識別的腫瘤抗原，即SEREX法(serological identifications of antigens by recombinantexpression cloning)(非專利文獻3 ；專利文獻1)，逐漸分離出各種癌抗 原(參照非專利文獻4-9)。正在開始進行以其一部分作為靶的癌癥免疫療法臨床試驗。另一方面，已知犬與貓與人類相同，有乳腺腫瘤、鱗狀上皮癌等多種腫瘤，并在犬 與貓的疾病統計中排名也較高。然而，目前針對犬與貓的癌腫尚無有效的治療藥物、預防藥 物以及診斷藥物。大部分犬與貓的腫瘤，幾乎都是在該腫瘤進行性擴大后，方為飼主察覺， 入院之后，即使經過外科手術切除并投以人類藥物(抗癌劑等)，多數情況下為時已晚，在 處理之后不久即死亡。在上述現狀下，如有可能獲取對犬與貓癌癥有效的治療藥物、預防藥 物及診斷藥物，則可以期望開拓其針對犬癌癥的用途。專利文獻1 美國專利第5698396號非專利文獻1 秋吉毅，“癌與化學療法”，1997年，第24卷，551 519頁非專利文獻2 =Bruggen P, et al.，Science, 254 1643-1647 (1991)非專利文獻3 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 11810-11813 (1995)非專利文獻4 :Int. J. Cancer, 72 :965_971 (1997)非專利文獻5 =Cancer Res.，58 1034-1041 (1998)非專利文獻6 :Int. J. Cancer, 29 :652_658 (1998)非專利文獻7 :Int. J. Oncol.，14 :703_708 (1999)非專利文獻8 =Cancer Res.，56 :4766_4772 (1996)非專利文獻9 :Hum. Mol. Genet 6 :33_39，1997非專利文獻10:井上直和，山口亮，伊 川正人蛋白質核酸酵素vol.50 No.111405-1412非專利文獻11 J Cell See. 115 1825-35非專利文獻12 =Blood. 95 1788-96
非專利文獻13 :Mol Endocrinol. 9 :243_54 (1995)非專利文獻14 J Cell Biol. 145 :83_98(1999)

發明內容
本發明的目的在于提供作為癌的治療和/或預防劑等有用的新型免疫誘導劑。本發明的發明人經努力研究，結果發現通過使用來自犬睪丸cDNA文庫以及罹癌 犬血清的SEREX法，取得cDNA，所述cDNA編碼與來自罹癌生物體血清中存在的抗體相結合 的蛋白質，并以此cDNA為基礎，制作具有序列號2所示氨基酸序列的多肽，具有序列號16 所示氨基酸序列的犬鈣鎂蛋白(Calmegin protein)，具有序列號26所示氨基酸序列的犬 中心體蛋白質(centrosomal protein,以下有時簡稱為CEP)，以及具有序列號39所示氨 基酸序列的犬甲狀腺激素受體相互作用因子11 (thyroid hormone receptor interactor 11，以下有時簡稱為“TRIP11”)。另外，以與上述序列號26所示犬CEP具有高同源性的犬 注冊基因為基礎，制作具有序列號28所示氨基酸序列的犬CEP。另外，以所得基因的人類同 源性基因為基礎，制作具有序列號4所示氨基酸序列的多肽，具有序列號18所示氨基酸序 列的人鈣鎂蛋白，具有序列號30所示氨基酸序列的人CEP，以及具有序列號41所示氨基酸 序列的人TRIP11。然后，向生物體給與這些多肽，由此可以在生物體內誘導免疫細胞，并使 已經生成的腫瘤萎縮，從而完成了本發明。S卩，本發明提供一種免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有多肽或重組載體作為有效 成分，所述多肽為具有免疫誘導活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重組載體含有編 碼該多肽的多核苷酸，能夠在生物體內表達該多肽(a)由序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個
以上氨基酸組成的多肽，(b)與(a)多肽有80%以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的多肽，(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的多肽。另外，本發明提供了一種免疫誘導方法，所述免疫誘導方法包括給與個體有效量 的多肽或重組載體，所述多肽為具有免疫誘導活性的上述(a)至(c)中的任一多肽，所述重 組載體含有編碼該多肽的多核苷酸且能夠在生物體內表達該多肽。進而，本發明提供了一 種抗原呈遞細胞的處理方法，所述處理方法包括使多肽與抗原呈遞細胞接觸，所述多肽為 具有免疫誘導活性的上述(a)至(c)中的任一多肽。進而，本發明還提供了多肽或重組載 體在免疫誘導劑制備中的應用，所述多肽為具有免疫誘導活性的上述(a)至(c)中的任一 多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸且能夠在生物體內表達該多肽。通過本發明，提供了一種作為癌的治療和/或預防劑等有用的新型免疫誘導劑。 如下述實施例中的具體說明所示，向罹癌犬給與本發明所用的多肽時，可以在該罹癌犬體 內誘導免疫細胞，進而能夠使已經生成的癌縮小或萎縮。因此，該多肽對于癌的治療和預防 有用。


[圖1]表示實施例A-I中鑒別出的基因在正常組織及腫瘤細胞株中的表達譜。標 號1 表示鑒別出的基因表達譜；標號2 表示GAPDH基因的表達譜。
[圖2]為本發明中鑒別出的犬源蛋白質經考馬斯染色被檢出的圖，所述犬源蛋白 質是在實施例A中由大腸桿菌產生并經提純的。標號3 表示本發明中犬源蛋白質的條帶。[圖3]表示在本發明中鑒別出的鈣鎂蛋白基因在正常組織及腫瘤細胞株中的表 達譜。標號1 表示鈣鎂基因的表達譜；標號2 表示GAPDH基因的表達譜。[圖4]為犬鈣鎂蛋白經考馬斯染色被檢出的圖，所述犬鈣鎂蛋白是在實施例B中由大腸桿菌產生并經提純的，為本發明中所用的多肽之一。標號3 表示犬鈣鎂蛋白的條
市ο[圖5]表示編碼CEP蛋白的基因在正常組織及腫瘤細胞株中的表達譜。標號1: 表示編碼CEP蛋白的基因表達譜；標號2 表示GAPDH基因的表達譜。[圖6]為序列號26的犬CEP經考馬斯染色被檢出的圖，所述犬CEP是在實施例C 中由大腸桿菌產生并經提純的、為本發明中所用的多肽之一。標號3:表示犬CEP蛋白的條
市ο[圖7]表示編碼TRIPll蛋白的基因在正常組織及腫瘤細胞株中的表達譜。標號 1 表示編碼TRIPll蛋白的基因表達譜；標號2 表示GAPDH基因的表達譜。[圖8]為犬TRIPll經考馬斯染色被檢出的圖，所述犬TRIPll是在實施例D中由 大腸桿菌產生并經提純的，為本發明中所用的多肽之一。標號3 表示犬TRIPll蛋白的條
市ο
具體實施例方式作為本發明免疫誘導劑中作為有效成分所含的多肽，可以舉出以下例子。需要說 明的是，在本發明中，所謂“多肽”，是指多個氨基酸通過肽鍵形成的分子，不僅包括由許多 氨基酸構成的多肽分子，而且包括由少數氨基酸構成的低分子量分子(寡肽)和全長蛋白 質，還包括在本發明中由序列號2、4、16、18、26、28、30、39或者41的全長組成的蛋白質。(a)由具有序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列的多肽 中的連續7個以上氨基酸組成的、具有免疫誘導活性的多肽。(b)與(a)多肽有80%以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的、具有免疫誘導 活性的多肽。(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的、具有免疫誘導活性的多肽。需要說明的是，在本發明中，所謂“具有氨基酸序列”，是指氨基酸殘基按照所示順 序排列。因此，例如所謂“具有序列號2所示氨基酸序列的多肽”，是指具有序列號2所示 Met Ala Ala Leu..(省略)..Ile ThrSer Pro的氨基酸序列，大小為306個氨基酸殘基的 多肽。另外，例如有時將“具有序列號2所示氨基酸序列的多肽”簡稱為“序列號2的多肽”。 “具有堿基序列”之類的表達其含義也與上述類似。在本申請中，所謂“免疫誘導活性”，是指在生物體內對分泌干擾素等細胞因子的 免疫細胞加以誘導的能力。多肽是否具有免疫誘導活性可以通過例如眾所周知的ELISP0T 法等方法來確認。具體而言，如下列實施例所述，向生物體給與需評價免疫誘導活性的多 肽，從該生物體中獲得末梢血單核細胞等細胞，將該細胞與該多肽共同培養，通過使用特異 性抗體測量來自該細胞的細胞因子生成量，可以測定該細胞中免疫細胞的數量，從而可以 評價免疫誘導活性。此外，如下述實施例所示，向罹癌生物體給與基于序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所述氨基酸序列制成的重組多肽使，亦可通過其免疫誘導活性使腫瘤退 減。因此，上述免疫誘導活性，也可以作為抑制表達序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所 述多肽的癌細胞增殖以及使癌組織(腫瘤)縮小或消失的能力(以下稱為“抗腫瘤活性”) 進行評價。多肽的抗腫瘤活性，例如如下述實施例中的具體記載所述，實際上可以在向罹癌 生物體給與該多肽后通過調查是否能使腫瘤縮小等方法來加以確認。另外，通過調查由該 多肽所激活的T細胞(即與呈遞該多肽的抗原呈遞細胞相接觸的T細胞)是否在生物體外 顯示出對腫瘤細胞的細胞毒性，亦可對該多肽的抗腫瘤活性加以評價。T細胞與抗原呈遞 細胞的接觸，如下所述，可以通過在液體培養基中將兩者共同培養來進行。細胞毒性的測定 可以通過例如Int. J. Cancer, 58 :p317，1994中記載的名為51Cr釋放法的公知方法來進行。 當該多肽用于癌的治療和/或預防時，沒有特別限定，但優選用抗腫瘤活性為指標對免疫 活性進行評價。本發明公開的序列表中序列號2所示的氨基酸序列，是一種功能未知的多肽氨基 酸序列，是使用來自犬類睪丸的cDNA文庫與罹癌犬的血清通過SEREX法，以與特異性存在 于來自罹癌犬血清中的抗體相結合的多肽的形式被分離出的(參照實施例A-1)。雖然該 多肽分別以 Accession No. XP_535343 (蛋白質)與 Accession No. XM_535343 (編碼基因) 的形式注冊于NCBI的數據庫中，但是其功能尚未有報導。另外，序列號4所示的氨基酸序 列，是如上所述已分離的序列號2的多肽的人同源因子的氨基酸序列。該人同源因子也 為功能未知的蛋白質，在NCBI的數據庫中分別以Accession No. NP_689873 (蛋白質)與 Accession No. NM_152660 (編碼基因)的形式注冊。需要說明的是，兩者在堿基序列上的同 源性為93%，在氨基酸序列上的同源性為99%。序列表中序列號16以及18分別所示的氨基酸序列是鈣鎂蛋白(Calmegin)的氨 基酸序列，該氨基酸序列是使用來自犬睪丸的cDNA文庫與罹癌犬的血清通過SEREX法，以 與特異性存在于來自罹癌犬血清中的抗體相結合的多肽及其的人同源因子的形式被分離 出的(參照實施例B-1)。鈣鎂蛋白經鑒定是一種在精細胞分化期特異性表達的蛋白質，并 在體外顯示出伴侶蛋白的活性。由于為只在睪丸內表達、在成熟精子中即消失的蛋白質，所 以一般認為其具有將精細胞分化相關蛋白質折疊的功能(非專利文獻10，井上直和，山口 亮，伊川正人蛋白質核酸酵素vol. 50 No. 11 1405-1412)。然而，目前尚無關于該蛋白質在 癌中表達、對癌癥治療與預防有用的報導。需要說明的是，犬鈣鎂蛋白基因與人鈣鎂蛋白基 因在堿基序列上的同源性為90%，在氨基酸序列上的同源性為89%。序列表中序列號26、28及30分別所示的氨基酸序列是CEP的氨基酸序列，該氨基 酸序列是使用來自犬睪丸的cDNA文庫與罹癌犬的血清通過SEREX法，以與特異性存在于來 自罹癌犬血清中的抗體相結合的多肽、與該多肽具有高同源性的犬類因子、以及該多肽的 人同源因子的形式被分離出的(參照實施例C-1)。CEP是中心體控制微管所必需的蛋白質， 也與中心體的成熟相關。已知在部分骨髓增殖性疾病中染色體易位現象屢有出現，而CEP 基因位于發生該易位的位點上，因而認為兩者之間存在某種相關性。然而，目前尚無關于 該蛋白質在癌中表達、對癌癥的治療與預防有用的報導(非專利文獻11 J Cell Sci. 115: 1825-35，非專利文獻12Blood. 95 1788-96)。需要說明的是，序列號26所示編碼CEP的犬 CEP基因與人CEP基因在堿基序列上的同源性為87%，在氨基酸序列上的同源性為84%。序列表中序列號39以及40分別所示的氨基酸序列是TRIP11蛋白質的氨基酸序列，該氨基酸序列是使用來自犬睪丸的cDNA文庫與罹癌犬的血清通過SEREX法，以與特 異性存在于來自罹癌犬血清中的抗體相結合的多肽及其的人同源因子的形式被分離出的 (參照實施例 D-l)。TRIPlKthyroid hormone receptor interactorll)最初被鑒定為與 甲狀腺激素受體β相互作用的因子，但也判定其與高爾基體及微管結合，因而認為其結合 高爾基體與微管，發揮維持這些細胞器形狀的功能。然而，目前尚無關于該蛋白質在癌中表 達、對癌癥治療與預防有用的報導(非專利文獻13Mol Endocrinol. 9 :243-54 (1995)，非專 利文獻14 J Cell Biol. 145 :83-98(1999))。需要說明的是，犬TRIPll基因與人TRIPll基 因在堿基序列上的同源性為88%，在氨基酸序列上的同源性為86%。上述(a)的多肽具有免疫誘導活性，是由具有序列號2、4、16、18、26、28、30、39或 41所示氨基酸序列的多肽中的連續7個以上、優選連續9個以上的氨基酸組成的多肽。特 別優選該多肽具有序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41的氨基酸序列。需要說明的是，在 本領域中眾所周知，為大約7個以上氨基酸殘基的多肽時，能夠發揮抗原性。因此，只要為 序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41的氨基酸序列中的連續7個以上氨基酸殘基的多肽， 即能具有免疫誘導活性，因此可以用來配制本發明所述的免疫誘導劑。但是，如果考慮到在 生物體中針對抗原物質產生的抗體為多克隆抗體，則氨基酸殘基越多時，由于能夠識別抗 原物質上的多個位點，從而能夠誘導更多種類的抗體，所以可以進一步提高免疫誘導活性。 因此，為了提高免疫誘導活性，序列號2或4的情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一 步優選為100以上，進一步優選為200以上，進一步更優選為250以上。序列號16或18的 情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為200以上，進 一步優選為400以上，進一步更優選為550以上。序列號26、28或30的情況下，氨基酸殘 基數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為300以上，進一步優選為600以 上，進一步優選為1000以上，進一步優選為1500以上，進一步更優選為2000以上。序列號 39或41的情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為300 以上更理想，進一步優選為600以上，進一步優選為1000以上，進一步更優選為1500以上。另外，作為通過給與癌抗原多肽進行免疫誘導的原理，已知為該多肽被抗原呈遞 細胞吞噬，其后在該細胞內被肽酶分解為更小的片段，呈遞于該細胞的表面上，細胞毒性T 細胞將其識別，選擇性地殺滅呈遞該抗原的細胞。呈遞到抗原呈遞細胞表面上的多肽的尺寸較小，氨基酸數為7 30個左右。因 此，從使其呈遞到抗原呈遞細胞表面上的角度來看，上述(a)的多肽，只要為由序列號2、4、 16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中的連續7 30個左右、優選9 30個左右的 氨基酸組成的多肽，即可。這些較小尺寸的多肽有時也直接呈遞于抗原呈遞細胞表面，不被 抗原呈遞細胞所吞噬。但是，如上所述，被抗原呈遞細胞所吞噬的多肽在隨機位置被該細胞內的肽酶切 斷，產生不同的多肽片段，上述多肽片段呈遞于抗原呈遞細胞表面，因此若給與如序列號2、 4、16、18、26、28、30、39或41的全長序列所示的大尺寸的多肽，則經過抗原呈遞細胞內的分 解作用，必然會產生對抗原呈遞細胞介導的免疫誘導有效的多肽片段。因此即使對于抗原 呈遞細胞介導的免疫誘導，也優選使用尺寸大的多肽。序列號2或4的情況下，氨基酸殘基 數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為200以上，進一步更優選為 250以 上。序列號16或18的情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為200以上，進一步優選為400以上，進一步更優選為550以上。序列號26、28或30 的情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一步優選為100以上，進一步優選為300以上， 進一步優選為600以上，進一步優選為1000以上，進一步優選為1500以上，進一步更優選 為2000以上。序列號39或41的情況下，氨基酸殘基數優選為30以上，進一步優選為100 以上，進一步優選為300以上，進一步優選為600以上，進一步優選為1000以上，進一步更 優選為1500以上。上述(b)的多肽，是將上述(a)的多肽中的少數氨基酸加以取代、缺失和/或添加 所得的多肽，是與原序列的同源性為80%以上、優選為90%以上、較優選為95%以上、更優 選為98%以上、且具有免疫誘導活性的多肽。一般情況下，即使在蛋白質抗原中將該蛋白質 的氨基酸序列中的少數氨基酸殘基進行取代、缺失或添加的情況下，有時也具有與原蛋白 質幾乎相同的抗原性，這一點是本領域技術人員所公知的。因此，上述(b)的多肽也可發揮 免疫誘導活性，故可用于制備本發明所述的免疫誘導劑。另外，上述(b)的多肽，也優選為 將序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示的氨基酸序列中的一個至數個氨基酸進行取 代、缺失和/或添加而得到的多肽。在此，所謂氨基酸序列的“同源性”，是將需要比較的兩個氨基酸序列的氨基酸殘 基盡可能相一致的整齊排列，以一致的氨基酸殘基數除以全部氨基酸殘基數后所得的以百 分比表示的數值。在進行上述整齊排列時，根據需要，在加以比較的兩個序列的一者或者兩 者中插入適當的間隔。可以使用諸如BLAST、FASTA、CLUSTAL W等眾所周知的程序，將上述 序列整齊排列。當有間隔插入時，在計算上述全部氨基酸殘基數時，一個間隔應作為一個氨 基酸殘基計算。如果加以比較的兩個序列用這樣方法計算出的全部氨基酸殘基數不同，則 在計算同源性(％ )時，應用兩者一致的氨基酸殘基數除以較長序列的全部氨基酸殘基數。此外，已知構成天然蛋白質的20種氨基酸可以根據性質的類似性分為以下幾組 具有低極性側鏈的中性氨基酸(Gly，lie, Val, Leu, Ala, Met, Pro)，具有親水性側鏈的中性 氨基酸(Asn，Gln，Thr，Ser，Tyr，Cys)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，堿性氨基酸(Arg，Lys，His)， 芳香族氨基酸(Phe，Tyr，Trp)，在它們間發生取代時多數情況下不會導致多肽性質的變化。 因此，取代本發明的上述(a)多肽中的氨基酸時，通過在上述各組間進行取代，維持免疫誘 導活性的可能性提高。上述(c)多肽是含有上述(a)多肽或(b)多肽作為部分序列、并具有免疫誘導活 性的多肽。即，為在(a)多肽或(b)多肽的一端或兩端附加其他的氨基酸或多肽、并具有免 疫活性的多肽。這樣的多肽也可用于本發明所述免疫誘導劑的制備。上述多肽可以按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化 學合成法合成。另外，也可以利用各種市售的肽合成儀器通過常規方法合成。另外，還可以 使用眾所周知的基因工程手段，制成編碼上述多肽的多核苷酸，將該多核苷酸整合到表達 載體上，導入宿主細胞，在該宿主細胞中使多肽合成，由此獲得目標多肽。編碼上述多肽的多核苷酸可以通過眾所周知的遺傳工程手段或使用市售核酸合成儀的常規方法很簡單地制成。例如，具有序列號1、15、25、27或38的堿基序列的DNA可 以如下制備使用犬類染色體DNA或cDNA文庫為模板，將一對引物設計成能夠分別擴增序 列號1、15、25、27或38所述的堿基序列，使用上述引物對進行PCR法，由此制成。具有序列 號3、17、29或40的堿基序列的DNA可以通過使用人染色體DNA或cDNA文庫作為上述模板同樣地制成。PCR的反應條件可以適當地設定，例如可以舉出如下條件等將由94°C下30 秒(變性)、55°C下30秒 1分鐘(退火)，72°C下2分鐘(延伸)構成的反應過程作為1 循環，例如進行30循環后，在72°C下使其反應7分鐘，但是反應條件并不限于此。此外，基 于本說明書序列表中序列號1至4、15至18、25至30、38至41所示的堿基序列與氨基酸序 列的信息，制成適當的探針或引物，并用其篩選犬或人的cDNA文庫由此，能夠分離出所期 望的DNA。上述cDNA文庫，優選用表達序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41的蛋白質的細 胞、器官或組織制成。上述探針或引物的制備，cDNA文庫的構筑，cDNA文庫的篩選，以及靶 基因的克隆等操作是本領域技術人員所公知的，例如，可以按照分子克隆第2版、現代生物 學實驗技術(Current Protocols in Molecular Biology)等記載的方法進行。用上述方 法獲得的DNA，可以得到編碼上述(a)多肽的DNA。另外，由于已知編碼各氨基酸的密碼子， 所以可以很容易地特定編碼特定氨基酸序列的多核苷酸的堿基序列。因而，也能夠容易地 特定編碼上述(b)與(c)所述多肽的多核苷酸的堿基序列，故上述多核苷酸也可以使用市 售核酸合成儀按照常規方法容易地合成。作為上述宿主細胞，只要是能夠表達上述多肽的細胞即可，作為原核細胞的例子 可舉出大腸桿菌等，作為真核細胞的例子可舉出猴腎臟細胞C0S1、中國倉鼠卵巢細胞CHO 等哺乳動物培養細胞，出芽酵母，分裂酵母，蠶細胞，非洲爪蟾卵細胞等，但并不限于以上例 子。使用原核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體使用具有可以在原核細胞中復制的 復制起點、啟動子、核糖體結合部位、DNA克隆部位、終止子等的表達載體。作為大腸桿菌用 表達載體，可以舉出pUC系列，pBlueScriptII，pET表達系統，pGEX表達系統等。將編碼上 述多肽的DNA整合到上述表達載體中，使用該載體轉化原核宿主細胞后，培養所得的轉化 細胞時，可以在原核宿主細胞中表達上述DNA編碼的多肽。在此情況下，也可使該多肽以與 其他蛋白質的融合蛋白的形式進行表達。使用真核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體使用具有啟動子，剪接區域，poly-A 附加部位等的真核細胞用表達載體。作為上述表達載體，例如可以舉出pKAl、pCDM8、pSVK3、 pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2 等。與上述相同地，將 編碼上述多肽的DNA整合到上述表達載體中，用該載體轉化原核宿主細胞后，培養所得的 轉化細胞時，可以使上述DNA編碼的多肽在真核宿主細胞中表達。當使用pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達載體時，能夠以附加有His標簽、FLAG標簽、 myc標簽、HA標簽、GFP標簽等各種標簽的融合蛋白的形式，表達上述多肽。將表達載體導入宿主細胞，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖 法等眾所周知的方法。為了從宿主細胞中分離提純目標多肽，可以組合使用眾所周知的分離手段。例如， 可以舉出使用尿素等改性劑或表面活性劑進行的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑分 步沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電聚焦電泳、離子交換色譜法、疏 水色譜法、親和色譜法、反相色譜法等方法，但并不限于此。使用以上方法所得的多肽，如上所述也可以以與其他 任意蛋白質的融合蛋白的形 式存在。例如可以舉出與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或His標簽的融合蛋白。上述以融合 蛋白形式存在的多肽也作為上述(c)多肽包含在本發明的范圍之內。進而，由轉化細胞所表達的多肽在翻譯之后，有時在細胞內進行各種修飾。上述翻譯后經修飾的多肽只要具有免疫誘導活性，則也包含在本發明的范圍內。作為上述翻譯修飾，可以舉出N末端移除蛋氨 酸、N末端乙酰化、附加糖鏈、由細胞內蛋白酶導致的限制分解、肉豆蔻酰化、異戊二烯化、磷
酸化等。如下述實施例中具體記載所述，對罹癌生物體給與上述具有免疫誘導活性的多肽 時，可以使得已經產生的腫瘤萎縮。因此，本發明的免疫誘導劑可以用作癌的治療和/或 預防劑。在此情況下，作為治療對象的癌癥，為表達編碼序列號2或者4所示多肽的基因 的癌癥，可以舉出腦腫瘤、頭部、頸部、肺部、子宮或食道的鱗狀上皮癌、黑色素瘤、肺部、乳 房或子宮的腺癌、腎癌、惡性混合腫瘤、肝細胞癌、基底細胞癌、棘細胞瘤樣齦瘤、口腔內腫 瘤、肛門周圍腺癌、肛門囊腫瘤、肛門囊頂泌腺癌、塞爾托利細胞瘤、陰道前庭癌、皮脂腺癌、 皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺 癌、腺管癌、乳腺癌、復合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血 管外皮細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺 癌、肥大細胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹腔內平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴細胞性白血病、淋巴 瘤、消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小 中細胞型淋巴瘤、腎上腺髓質腫瘤、粒層細胞瘤 (granulosa cell tomor)、嗜鉻細胞瘤、膀胱癌(移行細胞癌)、化膿性炎癥、腹腔內肝臟 腫瘤、肝癌、漿細胞瘤、惡性血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、肛門囊腺癌、口腔癌、轉移性惡性 黑色素瘤、無色素性惡性黑色素瘤、皮膚惡性黑色素瘤、惡性肌上皮瘤、惡性睪丸上皮瘤、精 原細胞瘤(seminoma)、大腸腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、頂泌腺癌(Apocrine carcinoma)、低分化型頂泌腺癌、惡性纖維組織細胞瘤、多發性骨髓瘤、間葉組織來源惡性 腫瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、軟組織肉瘤(紡錘形細胞腫瘤)、低分化肉瘤、滑 膜肉瘤、血管肉瘤、轉移性惡性上皮腫瘤、管狀乳腺腺癌、乳腺導管癌、炎癥性乳癌、生殖細 胞瘤、白血病、浸潤性毛發上皮瘤、中細胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大 細胞瘤(PatnaikII型)、肥大細胞瘤(Grade II)、平滑肌肉瘤等，但不限定于此。另外，對 象動物為哺乳動物，特別優選為人、犬和貓。本發明的免疫誘導劑向生物體的給藥途徑，可以口服也可以非口服，但優選肌肉 內給與、皮下給與、靜脈內給與、動脈內給與等非口服途徑。以治療癌癥為目的使用該免疫 誘導劑時，為了提高抗癌作用，如下述實施例所示可向靠近治療對象腫瘤的所屬淋巴結給 與。給與量只要是對免疫誘導有效的量即可，例如當用于癌癥治療和/或預防時，為對癌癥 的治療和/或預防癌癥有效的量即可。對癌癥的治療和/或預防癌癥有效的量，應根據腫瘤 大小或癥狀等適當選取，但通常情況下，對于對象動物而言每1日的有效量為0. 0001 μ g 1000 μ g，優選為0. 001 μ g 1000 μ g，可分一次或多次給與。理想情況為分數次間隔數日 至數月給與。如下述實施例具體所示，本發明的免疫誘導劑，可以使已經形成的腫瘤萎縮。 因此，對癌癥發生早期的少數的癌細胞也能發揮抗癌作用，從而用于癌癥發病前或癌癥治 療后時，可以防止癌癥的發病和復發。即，本發明所述的免疫誘導劑對癌癥治療和預防兩方 面都是有效的。本發明所述的免疫誘導劑，既可僅由多肽組成，也可適應于各種給藥方式，適當地 與藥理學上允許的填充劑，稀釋劑、賦形劑等添加劑混合后做成制劑。制劑的方法及可使用 的添加劑，在醫藥制劑的領域眾所周知，可以使用其中任何方法或添加劑。作為添加劑的具體實例，可以舉出如生理緩沖液之類的稀釋劑；如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇、甘 氨酸等賦形劑；糖漿、明膠、阿拉伯膠、山梨醇、聚氯乙烯、黃芪膠等結合劑；硬脂酸鎂、聚乙 二醇、滑石粉、二氧化硅等潤滑劑，但并不限于此。作為制劑形態，可以舉出片劑、膠囊劑、顆 粒劑、散劑、糖漿劑等口服劑，吸入劑、注射劑、栓劑、液劑等非口服劑。上述制劑可由一般所 知的制法制得。本發明的免疫誘導劑，可與能夠在生物體內增強免疫應答的免疫增強劑組合使 用。免疫增強劑既可包含在本發明的免疫誘導劑中，也可作為其他的組成物與本發明的免 疫誘導劑一并給與患者。作為上述免疫增強劑，例如可以舉出佐劑。佐劑為抗原提供儲存場所(細胞外或 巨噬細胞內)，激活巨噬細胞、并且刺激特定組的淋巴細胞，由此可以增強免疫應答，從而 可以提高抗癌作用。因此，特別指出的是當使用本發明的免疫誘導劑治療和/或預防癌 癥時，免疫誘導劑除包含上述多肽作為有效成分外，優選還包含佐劑。在本領域中多種佐 劑眾所周知，使用其中任何一種佐劑均可。作為佐劑的具體例，可以舉出MPL(SmithKline Beecham)、沙門氏菌屬Salmonella Minnesota Re 595脂多糖純化及酸解后得到的同源 物質；QS21 (SmithKline Beecham)、從 Quillja saponaria 提取物中純化所得的 QA-21 皂 苷；PCR 申請 W096/33739 (SmithKline Beecham)中記載的 DQS21 ；QS-7、QS-17、QS-18 及 QS-Ll (So 及其他 10 人，“Molecules and Cells”、1997 年，第 7 卷，pl78_186)；弗氏不完全 佐劑；弗氏完全佐劑；維生素E ;M0ntanide ；明礬；CpG寡核苷酸(例如，參見Kreig及其他 7人，“恥忉儀，，，第374卷，？546-549)；多聚IC(Poly IC)及其衍生物(如多聚ICLC等)以 及鯊烯和/或生育酚之類由可生物降解油制成的各種油包水乳劑。其中，優選弗氏不完全 佐劑、Montanide、多聚IC及其衍生物以及CpG寡核苷酸。上述佐劑和多肽的典型混合比約 為1 10 10 1，優選約為1 5 5 1，更優選約為1 1。不過，佐劑并不限于上 述例子，本領域眾所周知的上述以外佐劑在給與本發明的免疫誘導劑時也可使用(例如， 參見 Goding 著,“Monoclonal Antibodies principles and Practice”第二版，1986 年)。 多肽與佐劑的混合物或乳劑的制備方法，對于疫苗接種領域的一般技術人員來說是眾所周 知的。另外，作為上述免疫增強劑，除上述佐劑以外還可以使用刺激對象免疫應答的因 子。例如，可以將具有刺激淋巴細胞和抗原呈遞細胞的特性的各種細胞因子作為免疫增強 齊U，與本發明的免疫誘導劑組合使用。上述可增強免疫應答的細胞因子多數為本領域技術 人員所周知，作為其例，可以舉出顯示增強疫苗防御作用的白細胞介素12(IL-12)、GM-CSF、 IL-18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ及Flt3配體，但并不限于此。這些因子 也可用作上述免疫增強劑，可以包含在本發明的免疫誘導劑中或作為其他組成物與本發明 的免疫誘導劑并用給與患者。另外，通過使上述多肽與抗原呈遞細胞在體外接觸，可使抗原呈遞細胞呈遞該多肽。即，上述(a)至(c)的多肽可以用作抗原呈遞細胞的處理劑。在此，作為抗原呈遞細胞， 優選使用帶有MHC類I分子的樹狀細胞或B細胞。多種MHC類I分子已被鑒定、并周知。人 類的MHC分子稱為HLA。作為HLA類I分子，可以舉出HLA-A、HLA-B、HLA-C，更具體而言，可以 舉出 HLA-Al、HLA-A0201、HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-Al1、HLA-A24、 HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602 等。
帶有MHC類I分子的樹狀細胞或B細胞，可以使用眾所周知的方法由末梢血制得。例如，自骨髓、臍帶血或患者的末梢血中，使用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與 IL-3(或IL-4)誘導樹狀細胞，并在該培養細胞系中添加腫瘤相關肽，由此可以誘導腫瘤特 異性的樹狀細胞。通過給與有效量的樹狀細胞，可以誘導出癌癥治療所期望的應答。使用 的細胞，可以是健康者提供的骨髓或臍帶血，患者本人的骨髓或末梢血等，但使用患者本來 的自身細胞時安全性高，也可以期待避免嚴重的副作用。末梢血或骨髓使用新鮮樣品、低溫 保存樣品或冷凍保存樣品皆可。使用末梢血時，可以培養全血，也可以只分離出白細胞成分 加以培養，但從效率方面考慮，優選后者。進而，即使在白細胞成分中也可以分離單核細胞。 另外，以骨髓或臍帶血作為來源時，可以培養構成骨髓的所有細胞，也可以從中分離出單核 細胞加以培養。在末梢血或其白細胞成分、骨髓細胞中，可以包含為樹狀細胞起源的單核細 胞、造血干細胞或未成熟樹狀細胞或CD4陽性細胞等。所用的細胞因子，只要是確認具有安 全性和生理活性的物質時，則無論天然型或基因重組型等其生產方法皆可，但優選以必要 最低量使用確保能夠用于醫療的質量的標準品。添加的細胞因子的濃度只要是可誘導樹狀 細胞的濃度即可沒有特殊限定，通常細胞因子的總濃度優選為10 lOOOng/ml左右，優選 為20 500ng/ml左右。可以使用眾所周知的通常用于白細胞培養的培養基進行培養。培 養溫度只要可使白細胞增殖即可沒有特殊限定，但最優選為人體溫度的37°C左右。另外，培 養種的氣體環境只要可使白細胞增殖即可沒有特殊限定，但優選通氣5% CO2。進而，培養時 間只要是可誘導出必要數量的細胞的時間即可沒有特殊限定，但通常為3天 2周。供細 胞分離和培養所用的儀器，可使用適宜的儀器，但優選能確認醫療用安全性、且操作穩定簡 單。特別指出的是，對于細胞培養裝置，并不限于培養皿、燒瓶、燒杯等一般的容器，也可使 用層合型容器或多段式容器、滾瓶(Roller Bottle)、轉瓶(Spinner Bottle)、袋式培養起、 中空柱等。在體外使上述多肽與抗原呈遞細胞接觸的方法本身，可使用眾所周知的方法進 行。例如，可以通過在含有上述多肽的培養液中培養抗原呈遞細胞進行。培養基中的肽濃度 無特別限定，但通常為ι μ g/ml至100 μ g/ml左右，優選為5 μ g/ml至20 μ g/ml左右。培養 時的細胞密度無特別限定，但通常為IO3個細胞/ml至107個細胞/ml左右，優選為5X104 個細胞/ml至5X IO6個細胞/ml左右。優選根據常規方法在37°C下在5% CO2氛圍氣中進 行。需要說明的是，在抗原呈遞細胞表面呈遞的肽的長度，通常最大為30個氨基酸殘基左 右。因此，無特別限定，但在體外使抗原呈遞細胞與多肽接觸時，可以將該多肽制成長度為 大約30個氨基酸殘基以下。通過在上述多肽共存下培養抗原呈遞細胞，該肽被抗原呈遞細胞的MHC分子捕 獲，使其在抗原呈遞細胞表面呈遞。因此，使用上述多肽，可以制得含有該多肽與MHC分子 復合物的分離抗原呈遞細胞。上述抗原呈遞細胞在生物體內或體外，針對T細胞呈遞該多 肽，從而誘導對該多肽特異性的細胞毒性T細胞并使其增殖。通過使依照上述方法制得的含有上述多肽與MHC分子復合物的抗原呈遞細胞在 體外與T細胞接觸，能夠誘導對該多肽特異性的細胞毒性T細胞并使其增殖。其可以通過 將上述抗原呈遞細胞和T細胞在液體培養基中共存培養來進行。例如，可將抗原呈遞細胞 懸浮在液體培養基中，移入微孔板的孔等的容器中，并向其中添加T細胞進行培養，由此進 行。共存培養時的抗原呈遞細胞與T細胞的混合比例，無特別限定，但通常細胞數比率為1 1 1 100左右，優選為1 5 1 20左右。另外，液體培養基中懸浮的抗原呈 遞細胞的密度無特別限定，但通常為100 1000萬細胞/ml左右，優選為10000 100萬 細胞/ml左右。共存培養優選按照常規方法在37°C下在5% CO2氛圍氣中進行。培養時 間無特別限定，但通常為2日 3周，優選為4日 2周左右。另外，共存培養優選在例如 IL-2、IL-6、IL-7及IL-12之類的白細胞介素的一種或多種存在下進行。這種情況下，IL-2 及IL-7的濃度，通常為5U/ml到20U/ml左右，IL-6的濃度通常為500U/ml至2000U/ml左 右，IL-12的濃度通常為5ng/ml到20ng/ml左右，但均不限于上述范圍。上述共存培養，可 以追加新鮮抗原呈遞細胞一次至多次重復進行。例如，舍棄共存培養后的培養液上清，添加 新鮮抗原呈遞細胞的懸濁液進一步進行共存培養，上述操作可以重復一次到數次。各共同 培養的條件可以與上述相同。通過上述的共存培養，可以誘導對該多肽特異的細胞毒性T細胞使其增殖。因此， 使用上述多肽，可以制得選擇性結合上述多肽與MHC分子復合體的分離T細胞。如下述實施例記載所示，編碼序列號2、16、26、28、39及4、18、30、41的多肽的基 因，分別在犬以及人的癌細胞及睪丸中特異性表達。因此，一般認為序列號2、16、26、28、39 及4、18、30、41的多肽與正常細胞相比顯著多地存在于癌細胞中。癌細胞內存在的多肽的 一部分呈遞于癌細胞表面上的MHC分子上，將用上述方法制得的細胞毒性T細胞給與生物 體內時，這些細胞毒性T細胞可以以上述被呈遞的多肽為目標毒殺癌細胞。另外，由于呈遞 上述多肽的抗原呈遞細胞在生物體內也可誘導和增殖對該多肽特異性的細胞毒性T細胞， 所以即使向生物體內給與該抗原呈遞細胞，也可毒殺癌細胞。即，使用上述多肽制得的上述 細胞毒性T細胞與抗原呈遞細胞也與本發明的免疫誘導劑相同地作為癌的治療和/或預防 劑有用。在將上述分離抗原呈遞細胞或分離T細胞給與生物體時，為了避免生物體內免疫 應答將這些細胞作為異物而加以攻擊，優選如上所述使用上述(a)至(c)的多肽制備從接 受治療的患者體內采集的抗原呈遞細胞或T細胞。含有抗原呈遞細胞或分離T細胞作為有效成分的癌癥的治療劑和/或預防劑，其 給與途徑優選為靜脈內給與及動脈內給與這樣的非口服途徑。另外，給與量應根據癥狀及 給與目的等適當地選擇，但通常為1個 1兆個，優選為100萬個 10億個，優選數日至數 月給與一次上述細胞。制劑例如可以為將細胞懸浮于生理鹽水中的制劑等，也可以與其他 抗癌劑及細胞因子并用。另外，也可添加制劑領域中眾所周知的一種或兩種以上添加劑。另外，通過在對象動物體內表達編碼上述(a)至(C)多肽的多核苷酸，可以在該生 物體內產生抗體并誘導細胞毒性T細胞，獲得與給與該多肽時的同等效果。換言之，本發明 的免疫誘導劑，可以含有編碼上述(a)至(c)多肽的多核苷酸，含有可以在生物體內表達該 多肽的重組載體作為其有效成分。上述可用于表達抗原多肽的重組載體，也可被稱為基因 疫苗。用于制造基因疫苗的載體，只要是能夠在對象動物細胞中(優選哺乳動物細胞中) 表達的載體即可，沒有特別限定，質粒載體或病毒載體皆可，也可以使用在基因疫苗領域內 眾所周知的任何載體。需要說明的是，編碼上述多肽的DNA及RNA等多核苷酸，如上所述可 以使用常規方法容易地制備。另外，可用本領域技術人員眾所周知的方法將該多核苷酸整 合到載體中。基因疫苗的給與途徑，優選為肌肉內給與、皮下給 與、靜脈內給與、動脈內給與等非口服給與途徑，其給與量可以根據抗原種類等適當地選擇，但通常每Ikg體重以基因疫苗的重量計為0. 1 μ g IOOmg左右，優選為1 μ g IOmg左右。作為利用病毒載體的方法，例如可以舉出將編碼上述多肽的多核苷酸整合到逆轉 錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、疫苗病毒、痘病毒(pox virus)、脊髓灰質炎病毒、 辛德畢斯病毒(Sindbis virus)等RNA病毒或DNA病毒中，并用其感染對象動物的方法。其 中，特別優選使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疫苗病毒等的方法。作為其他方法，可以舉出將表達質粒直接給與肌肉內的方法(DNA疫苗法)、脂質 體法、Lipofectin法、微注射法、磷酸鈣法、電穿孔法，特別優選DNA疫苗法、脂質體法。為使本發明所用的編碼上述多肽的基因可實際上作為藥物使用，有將基因直接導 入體內的in vivo方法，以及從對象動物體內采集某種細胞，在體外將基因導入該細胞，然 后將該細胞放回體內的ex vitro方法(日經科學，1994年4月，p20_45 ；月刊藥事，1994 年，第36卷，第1號，p. 23-48 ；實驗醫學增刊，1994年，第12卷，第15號；及其所引用的文 獻等)。較優選in vivo方法。通過in vivo方法給與藥物時，可以按照與治療目標的疾病、癥狀等相應的適當的 給與途徑給與。例如，可以通過靜脈、動脈、皮下、肌肉內等途徑給與。通過in vivo方法給 與時，例如可以采取液劑等制劑形式，但一般而言，制成含有本發明中編碼上述多肽的DNA 為有效成分的注射劑，根據需要，可以添加常用的填充劑。另外，在含有該DNA的脂質體或 膜融合脂質體(仙臺病毒(HVJ)-脂質體等)時，可以制成懸濁劑、凍結劑、離心分離濃縮凍 結劑等的脂質體制劑形態。需要說明的是，在本發明中，當提及“序列號1所示的堿基序列”時，除序列號1實 際所示的堿基序列外，還包含其互補序列。因此，當提及“具有序列號1所示的堿基序列的 多核苷酸”時，包括具有序列號1實際所示的堿基序列的單鏈多核苷酸、具有其互補堿基序 列的單鏈多核苷酸以及由上述兩者組成的雙鏈多核苷酸。在制備編碼本發明所用多肽的多 核苷酸時，選擇適當的任一堿基序列，對于本領域技術人員來說是很容易選擇的。實施例以下，根據實施例更加具體地說明本發明。實施例A-I 通過SEREX法制取新型癌抗原蛋白質(1)構建 cDNA 文庫使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從健康犬的 睪丸組織中提取全RNA，用01igotex-dT30 mRNA purification Kit (寶酒造社制造)按照 該試劑盒所附操作說明書提純多聚A RNA。使用由此所得的mRNA (5 μ g),構建出犬睪丸cDNA噬菌體文庫。構建cDNA噬菌體 文庫時，使用 cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNASynthesis Kit，ZAP_cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社制造)按照試劑盒所附的操作說明書構建cDNA文庫。構建出 的cDNA噬菌體文庫大小為1. 3X 106pfu/ml。(2)利用血清篩選cDNA文庫用上述已構建的源自犬睪丸的cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，在 Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板中，感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF，)使其為2340克 隆，在42°C下培養3 4小時，形成溶菌斑(plaque)，在37 °C下用浸透了 IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Cellulose Nitrate Membranes) (Hybond C Extra =GE Healthecare Bio-Science公司制)覆蓋培養板4小時，從而誘導·表達蛋 白質，并使蛋白質轉印到膜上。之后，回收該膜，將其浸在含0.5%脫脂奶粉的TBSaOmM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7. 5)中，在4°C下振蕩一晚，由此抑制非特異性反應。在室溫下使 此過濾膜與稀釋500倍的患病犬血清反應2 3小時。作為上述患病犬血清，使用從患有鱗狀上皮癌的犬體內采取的血清。這些血清保 存在-80°C，在即將使用前進行預處理。血清預處理的方法按照如下方法進行。即，用未插入 外來基因的λ ZAP Express噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)后，在NZY培養板的 培養基中在37°C下培養一晚。然后，向培養板中添加含有0. 5M NaCl的0. 2MNaHC03 pH8. 3 緩沖液，在4°C下靜置15小時后，回收上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液。然后將回收所得 的大腸桿菌/噬菌體提取液通過NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制造)，將來 自大腸桿菌·噬菌體的蛋白質固定化。在此蛋白質固定化柱中使患病犬血清通過·反應， 從血清中除去吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體。用含有0. 5%脫脂奶粉的TBS將只是僅 僅通過柱子的血清餾分稀釋500倍，將其作為免疫篩選的材料。將經上述處理血清與上述融合蛋白質印跡的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS)清 洗4次之后，將用含0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories公司制造)作為第二抗體在室溫下與其 反應1小時，使用NBT/BCIP反應液(Roche公司制造)通過酶顯色反應檢出，從Φ90X 15mm 的NZY瓊脂糖平板上采集與顯色反應陽性部位相一致的菌落，使其溶解在500 μ 1 SM緩沖 液(IOOmM NaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠 pH7. 5)中。采用與上述同樣的 方法將顯色反應呈陽性的菌落反復篩選二次、三次，直至菌落單一化，篩選出與血清中IgG 反應的30940個噬菌體克隆，分離出一個陽性克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將通過上述方法分離所得的一個陽性克隆用于堿基序列解析，進行操作從噬 菌體載體轉換為質粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XL-l-Blue M RF’)制成吸光度 OD600為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與100 μ 1經提純的噬菌體溶液以及1 μ 1 ExAssist helper phage (STRATAGENE公司制造)混合后，在37°C下反應15分鐘，然后，添加3ml LB 培養基，在37°C下培養2. 5 3小時，立即置于70°C水浴中保持溫度20分鐘，之后在4°C 下以IOOOXg離心15分鐘，回收上清作為噬粒溶液。然后，將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制 成吸光度0D_為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經提純的噬菌體溶液混合后，在 37°C下反應15分鐘，取50μ1播于含有氨芐西林(終濃度50yg/ml)的LB瓊脂培養基中， 在37°C下培養一晚。采集經轉化的SOLR單菌落，用含有氨芐西林(終濃度50yg/ml)的 LB培養基在37°C下培養后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN公司制造)提純 含有目標插入片段的質粒DNA。提純所得的質粒，可以使用序列號5所記載的T3引物與序列號6所記載的T7引物，通過引物步移法(primer-walking)來解析插入片段的全長序列。通過該序列解 析獲得了序列號1所記載的基因序列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列，運行同源 性檢索程序BLAST搜索(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，進行與已知基因同源 性的檢索，結果表明所得的基因是編碼未知功能蛋白質(Accession No. XP_535343)的基因(Accession No. XM_535343)。另外，該基因的人同源因子也為編碼未知功能蛋白質 (Accession No. NP_689873)的基因(Accession No. NM_152660)(同源性堿基序列 93%， 氨基酸序列99% )。人同源因子的堿基序列如序列號3所示，氨基酸序列如序列號4所示。(4)在各種組織中的表達解析對于通過上述方法所得的基因，通過RT-PCR法(ReverseTranscription-PCR法) 研究其在犬與人的正常組織及各種細胞株中的表達。逆轉錄反應如下進行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制造)按照所附操作說明書從50 IOOmg各種組織及各種細胞株 5-10X IO6個的細胞中提取全RNA。通過Superscript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附操作說明書，用上述全RNA合成cDNA。人正常組 織(腦，海馬，睪丸，結腸，胎盤)的cDNA，使用Gene Pool cDNA (invitrogen公司制造)、 QUICK-Clone cDNA(Clontech公司制造)及Large-Insert cDNA Library (Clontech公司制 造)。PCR反應使用對獲得的犬基因及其人同源基因具有特異性的引物(如序列號7及8所 示)按照下列方法進行。即，加入各試劑和附加緩沖液使總量為25μ1，其中使通過逆轉錄 反應制得的樣品為0. 25 μ 1，上述引物各為2 μ Μ，各dNTP為0. 2mM, ExTaq多聚酶為0. 65U， 使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 94°C -30 秒、55°C -30 秒、72°C _1 分鐘為 1 循環，將該循環重復進行30次。需要說明的是，對具有上述序列號7與8所示堿基序列的 基因具有特異性的引物，是擴增下述區域的引物，所述區域是序列號1所示的堿基序列中 87 606號及序列號3所示堿基序列中173 695號堿基所在的區域，使用此引物也可以 研究犬基因及/或其的人同源基因中任一者的表達。為了比較對照，同時也使用了 GAPDH 特異性的引物(如序列號9與10所示)。其結果如圖1所示，獲取的犬基因，在健康的犬組 織中顯著表達于睪丸，另一方面，也發現該基因在犬乳癌細胞株中顯著表達。人同源基因的 表達與犬類基因相同，在人正常組織中能夠確認其表達的部位僅限于睪丸，但在人癌細胞 中則于腦腫瘤、白血病、乳癌、肺癌中均檢測出其表達，因此可以確定人同源基因也特異性 地表達于睪丸與癌細胞中。需要說明的是，在圖1中，縱軸上標號1表示上述鑒定的基因表達譜，標號2表示 作為比較對照的GAPDH基因表達譜。實施例A-2 新型癌抗原蛋白的制備(1)重組蛋白質的制備基于實施例A-I中所得的序列號1的基因，通過以下方法制備重組蛋白質。PCR 如下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，使由實施例A-I中所得的噬粒 溶液制備的供序列解析的載體為1 μ 1、使含有NdeI及XhoI限制性酶剪切序列的兩種引物 (如序列號11及12所示)各為0. 4 μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造社 制造)為 1. 25U，，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 98°C -10 秒、55°C -15 秒、 720C -1分鐘為1循環，將該循環重復進行三十次。需要說明的是，上述兩種引物是擴增下 述區域的引物，所述區域是編碼序列號2的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用瓊脂 糖凝膠對經擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制造)提 純出約930bp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-Blunt (invitrogen公司 制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌中后回收質粒，通過測序確認經擴增的基因片段與靶序列相一致。用NadI及XhoI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將 靶基因序列插入到經Ndel、XhoI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET16b(N0Vagen公 司制造)中。通過使用該載體可制得His標簽融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表達 用大腸桿菌BL21(DE3)，通過利用ImM IPTG的表達誘導，能夠使靶蛋白在大腸桿菌內表達。此外，基于序列號3的基因，使用以下方法制得人同源基因的重組蛋白質。PCR如 下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，實施例A-I制備的各種組織·細 胞cDNA中已確認通過RT-PCR法表達的cDNAl μ 1、使含有EcoRV及EcoRI限制性酶剪切序 列的兩種引物(記載于序列號13及14)各為0. 4μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合 酶(寶酒造社制造)為1. 25U，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制造)，以98°C -10秒、 550C -15秒、72°C -1分鐘為1循環，將該循環重復進行三十次。需要說明的是，上述兩種引 物是擴增下述區域的引物，所述區域是編碼序列號4的氨基酸序列全長的區域。PCR之后， 用瓊脂糖凝膠對經擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel ExtractionKit (QIAGEN公司 制造)提純出約930bp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌中后回收質粒，通過測序確認經擴增的基因片段與靶序列相一致。用EcoRV 及EcoRI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將 靶基因序列插入到經EcoRV、EcoRI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a (Novagen 公司制造)中。通過使用該載體可制得His標記融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表 達用大腸桿菌BL21(DE3)，通過利用ImM IPTG的表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。(2)重組蛋白質的提純將由上述方法獲得的、表達序列號1及序列號3所述序列的各個重組大腸桿菌在 含有100 μ g/ml氨芐西林的LB培養基中在37°C下進行培養直至600nm處吸光度為0. 7左 右，然后，添加異丙基_ β -D-I-硫代半乳糖苷至終濃度為ImM，進一步在37°C下培養4小 時。之后以4800rpm離心10分鐘集菌。將此菌體球狀物懸浮在磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進 而以4800rpm離心10分鐘，清洗菌體。將上述菌體懸浮于50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8. 0)中，在冰上進行超聲裂解。將 大腸桿菌超聲裂解液以6000rpm離心分離20分鐘，所得上清為可溶餾分，沉淀為不溶餾分。將不溶餾分懸浮于50mM Tris鹽酸緩沖液(ρΗ8. 0)中，以6000rpm離心15分鐘。 重復該操作2次，除去蛋白酶。將所得殘渣懸浮于含有6M胍鹽酸鹽、0. 15M氯化鈉的50mM Tris鹽酸緩沖液 (ρΗ8. 0)中，在4°C下靜置20小時，使蛋白質變性。變性處理后，以6000rpm離心30分鐘， 將所得可溶餾分添加到按照常用方法制得的鎳螯合柱(載體=Chelateing S印harose (商 標)Fast Flow (GEHealth Care公司)，柱容量5mL，平衡緩沖液含有6M胍鹽酸鹽、0. 15M氯 化鈉的50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0))中，進一步在4°C下靜置一晚，使其吸附到經鎳螯合 化載體上。將該柱載體以1500rmp離心5分鐘，回收上清液，將柱載體懸浮在磷酸鹽緩沖生 理鹽水中后，再次填充到柱中。將未被柱吸附的餾分用為柱容量10倍量的含0. 5M氯化鈉的0. IM醋酸緩沖液 (ρΗ4. 0)清洗處理后，立即用含0. 5M氯化鈉的0. IM醋酸緩沖液(ρΗ3. 0)洗脫，形成提純餾 分，以后將該提純餾分作為給與試驗用的材料。需要說明的是，各洗脫餾分中的靶蛋白，根據按照常用方法進行的考馬斯染色法確認。其中，目標的犬蛋白質如圖2所示。由上述方法所得的提純標準品用反應用緩沖液(50mM Tris-Hcl, IOOmM NaCl,5mMCaCl2 pH8. 0)置換后，使用 FactorXa Cleavage CaptureKit (Novagen 公司制造)按照所 附操作說明書利用FactorXa蛋白酶切除His標簽并提純靶蛋白。然后，使用超濾NAN0SEP IOK OMEGA (PALL公司制造)，將由上述方法所得的提純標準品1. 2ml進行生理用磷酸緩沖 液(日水制藥社制造)置換后，用0.22 μ m HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制造)進行無 菌過濾，用于以下的實驗。實施例A-3 對罹癌犬給與重組蛋白質的實驗(1)抗腫瘤評價評價用上述方法提純的兩種重組蛋白質對表皮患有腫瘤的兩只罹癌犬(兩只患 有乳腺腫瘤的犬)的抗腫瘤效果。在如上所述提純的重組多肽(源自犬及人)各100yg(0.5ml)中混合等量的弗氏 不完全佐劑(和光純藥社制造)，制得兩種癌癥治療劑。向膀胱附近的所屬淋巴結給與該治 療劑共計3次，給與時間分別為初次、初次給與3日后以及7日后。其結果，在給與癌癥治 療劑(源自犬及人)時大小分別為約25mm3與50mm3的腫瘤，在癌癥治療劑初次給與10日 后分別縮小至約20mm3與42mm3，20日后分別縮小至約13mm3與26mm3，30日后分別縮小至約 5mm3 與 IOmm30此外，在上述源自犬的多肽100 μ g(0. 5ml)中混合0. 5ml的弗氏不完全佐劑，將所 得的混合物按照與上述相同的間隔給與患有惡性黑色素瘤的犬的腫瘤周圍的皮內，共計給 與3次，另外同時，每次皮下給與IOMU重組型貓干擾素Intercat。其結果，在給與癌癥治療 劑時，是大小約為142mm3的腫瘤，而在癌治療劑初次使用29日后腫瘤完全萎縮。進而，在上述源自犬的多肽IOOyg(0.5ml)中混合0. 5ml的弗氏不完全佐劑，與上 述相同地將該混合物向患有鼻腺癌的犬給與三次。另外同時每次皮下給與IOOyg犬白細 胞介素12。其結果，在給與癌癥治療劑時，是大小約57mm3的腫瘤，而在癌治療劑初次使用 14日后腫瘤完全萎縮。(2)免疫誘導能力的評價在給與癌治療劑前與初次給與10日后以及30日后的各個時間點，采集在上述(1) 的給與實驗中已取得抗腫瘤效果的患病犬的血液，使用常規方法分離出末梢血單核細胞， 根據使用其的IFNy酶聯免疫斑點法(EliSpot Assay)，對給與的各重組蛋白質進行免疫 誘導能力評價。將70 %乙醇以100 μ L/孔分別添加到Mi 11 ipore公司制造的96孔培養板 (MultiScreen-IP,MAIPS4510)上，靜置5分鐘，吸取并棄去，然后用滅菌水清洗，以300 μ L/ 孔添加200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)，靜置5分鐘后，吸取并棄去，清洗培養板。然后，將添加 在200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)中的抗犬干擾素Y單克隆抗體(R&D公司制造，clonel42529, MAB781)以0.5yg/孔分別添加到培養板中，在37°C下溫育一晚，使第一抗體固相化。吸取 并棄去第一抗體后，將封閉溶液(1% BSA-5%蔗糖_200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))以300 μ L/ 孔分別添加到培養板中，在4°C下溫育一晚，封閉培養板。吸取并棄去封閉液后，以300 μ L/ 孔分別添加含有10%胎牛血清的RPMI培養基(Invitrogen公司制造)，靜置5分鐘后吸取 并棄去培養基。之后，將懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中的犬末梢血單核細胞分別以5 X IO5/孔分別添加到培養板的各個孔中，向其中以10 μ L/孔分別添加在各次給藥中使用的源自犬的多肽或源自人的多肽，在37°C、5% CO2的條件下培養24小時，從而使存 在于末梢血單核細胞中的免疫細胞產生干擾素Y。培養后，棄去培養基，用清洗液(0.1% Tween20-200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))將孔清洗6次。將用上述封閉液稀釋1000倍的兔抗犬 多克隆抗體以100μ L/孔分別添加到各個孔中，在4°C下溫育一晚。用上述清洗液將孔清洗 3次后，將用上述封閉液稀釋1000倍的HRP標記抗兔抗體以100 μ L/孔分別添加到各個孔 中，在37°C下反應2小時。用上述清洗液將孔清洗3次后，用Konica免疫顯色劑(Konica公 司制造)使其顯色，清洗孔使反應停止。反應停止后，將膜干燥，用KS Elispot (Carl Zeiss 公司制造)計算出現的斑點數。其結果，無論給與犬多肽或人多肽的患病犬，在給與多肽之前的末梢血單核細胞 中均未檢出斑點。另一方面，給與犬多肽的患病犬，在給與10天后及30天后的末梢血單核 細胞中分別檢出斑點20個、36個。另外，給與人多肽的患病犬，在給與10天后及30天后的 末梢血單核細胞中分別檢出斑點24個、36個。根據上述結果可以確認，所有施藥的患病犬，都可以誘導免疫細胞，該免疫細胞與 給與的重組蛋白質特異性地反應、產生干擾素Y，一般認為通過以上述免疫細胞為中心的 免疫反應，能夠發揮上述(1)所述的抗腫瘤效果。實施例B-I 通過SEREX法獲取新型癌抗原蛋白質(1)構建 cDNA 文庫使用酸_胍-酚_氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)自健康的犬 睪丸組織中提取全RNA，用01igotex-dT30 mRNA purification Kit (寶酒造社制造)按照 該試劑盒所附操作說明書提純出多聚A RNA。使用由此所得的mRNA (5 μ g)，構建出犬睪丸cDNA噬菌體文庫。在cDNA噬菌體文 庫的構建中，使用 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNASynthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE社制造)按照試劑盒所附的操作說明書，構建cDNA文庫。 構建出的cDNA噬菌體文庫的大小為1. 3X 106pfu/ml。(2)利用血清篩選cDNA文庫用上述構建的源自犬睪丸的cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，在 Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板中，使宿主大腸桿菌(XLl-BlueMRF，)感染使其為2340 克隆，在42°C下培養3 4小時，形成溶菌斑(plaque)，在37 °C下用浸透了 IPTG(異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Hybond C Extra =GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆蓋培養板4小時，由此誘導·表達蛋白質，并使蛋白質轉印到膜 上。之后，回收該膜，將其浸在含0.5%脫脂奶粉的TBSdOmM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7. 5) 中，在4°C下振蕩一晚，由此抑制非特異性反應。在室溫下使此過濾膜與稀釋500倍的患病 犬血清反應2 3小時。作為上述患病犬血清，使用從患有肛門近位腫瘤的犬的體內采集的血清。這些血 清保存在-80°C下，在即將使用前進行預處理。血清預處理的方法如下。用未插入外來基 因的λ ZAP Express噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’ )之后，在NZY培養板培養 基上37°C培養一晚。然后向培養板中添加含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHCO3 pH8. 3緩沖液， 在4°C靜置15小時后，將上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液加以回收。然后將回收所得的大腸桿菌/噬菌體提取液通過NHS-柱(GE HealthecareBio-Science公司制造)，將來自大 腸桿菌·噬菌體的蛋白質固定化。在此蛋白質固定化了的柱中使患病犬血清通過·反應， 從血清中除去吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體。將只是僅僅通過柱子的血清餾分用含有 0. 5%脫脂奶粉的TBS稀釋500倍，將其作為免疫篩選的材料。將經上述處理血清和上述融合蛋白質印跡的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS)清 洗4次之后，將用含0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories公司制造)作為第二抗體在室溫下使其反 應1小時，通過使用NBT/BCIP反應液(Roche公司制造)的酶顯色反應檢出，從Φ90X 15mm 的NZY瓊脂糖平板中采集與顯色反應陽性部位相一致的菌落，使其溶解在500 μ 1 SM緩沖 液(IOOmM NaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠 pH7. 5)中。采用與上述同樣的 方法反復篩選顯色反應呈陽性的菌落二次、三次，直至菌落單一化，篩選出與血清中的IgG 反應的30940個噬菌體克隆，分離出一個陽性的克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將通過上述方法分離所得的一個陽性克隆用于堿基序列解析，進行操作將噬 菌體載體轉換為質粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XL-l-Blue MRF’)制備成吸光度 OD600為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與100 μ 1經提純的噬菌體溶液以及1 μ 1 ExAssist helper phage (STRATAGENE公司制造)混合后，在37°C反應15分鐘，然后，添加3ml LB培 養基，在37°C下培養2. 5 3小時，立即置于70°C水浴中保持溫度20分鐘，之后在4°C 1000 Xg下離心15分鐘，回收上清作為噬粒溶液。然后將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制成吸 光度OD6tltl為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經提純的噬菌體溶液混合后，在37°C 下反應15分鐘，取50 μ 1播于含有氨芐西林(終濃度50 μ g/ml)的LB瓊脂培養基中，在 37°C下培養一晚。采集經轉化的SOLR單菌落，用含有氨芐西林(終濃度50 μ g/ml)的LB 培養基在37°C下培養后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN公司制造)提純含有 目標插入片段的質粒DNA。提純所得的質粒，使用序列號5所記載的T3引物與序列號6所記載的T7引物，通 過引物步移法來解析插入片段的全長序列。通過該序列解析獲得序列號1所記載的基因序 列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列，運行同源性檢索程序BLAST搜索(http://WWW. ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)，進行與已知基因的同源性檢索后，結果表明所得的基因是鈣 鎂蛋白(calmegin)的基因。犬鈣鎂蛋白的人同源因子是人鈣鎂蛋白(同源性堿基序列 90%，氨基酸序列89% )。人鈣鎂蛋白的堿基序列如序列號17所示，氨基酸序列如序列號 18所示。(4)在各種組織中的表達解析對于通過上述方法所得的基因，通過RT-PCR法(ReverseTranscription-PCR法)研究其在犬與人的正常組織及各種細胞株中的表達。逆轉錄反應如下進行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制造)按照所附的操作說明書從50 IOOmg各種組織及各種細胞 株 5-10X106 個細胞中提取全 RNA。通過 Superscript First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附的操作說明書，用上述全RNA合成cDNA。人 正常組織(腦，海馬，睪丸，結腸，胎盤)的cDNA，使用Gene Pool cDNA (invitrogen公司制 造)，QUICK-ClonecDNA(Clontech 公司制造)及 Large-Insert cDNA Library (Clontech 公司制造)。PCR反應使用對獲得基因具有特異性的引物(如序列號19與20所示)如下進 行。即，加入各試劑和附加緩沖液使總量為25μ 1，其中，使通過逆轉錄反應制得的樣品為 0. 25 μ 1，使上述引物各為2 μ Μ，各種dNTP為0. 2mM, ExTaq聚合酶為0. 65U，使用Thermal Cycler (BIORAD公司制造)，以94°C -30秒、55°C -30秒、72°C _1分鐘為一個循環，重復進行 30次。需要說明的是，上述基因的特異性的引物，是擴增下述區域的引物，所述區域是序列 號15的堿基序列(犬鈣鎂蛋白基因)中的755 1318號及序列號17的堿基序列(人鈣 鎂蛋白)中的795 1358號堿基的區域，使用此引物也可以研究犬鈣鎂蛋白基因及/或人 鈣鎂蛋白基因的任一者的表達。為比較對照，也同時使用了 GAPDH特異性的引物(如序列 號9與10所示)。其結果，如圖3所示，犬鈣鎂蛋白基因在健康的犬類組織中顯著表達于睪 丸內，另一方面，也發現該基因在犬腫瘤細胞株中顯著表達。人鈣鎂蛋白基因與犬鈣鎂蛋白 基因同樣，在人類正常組織中能夠確認其表達的部位僅限于睪丸，但在人癌細胞中則于腦 腫瘤、白血病、食道癌中均檢測出其表達，因此可以確定人同源基因也特異性地表達于睪丸 與癌細胞中。需要說明的是，在圖3中，縱軸上標號1表示鈣鎂蛋白基因的表達譜，標號2表示 作為比較對照的GAPDH基因的表達譜。實施例B-2 犬及人的鈣鎂蛋白的制備(1)重組蛋白質的制備基于實施例B-I中所得的序列號15的基因，通過以下方法制備重組蛋白質。PCR 如下進行，加入各試劑和附加緩沖液使總量為50 μ 1，其中，使由實施例B-I中所得的噬粒 溶液制備的供序列解析的載體為ι μ 1、且使含有BamHI及EcoRI限制性酶剪切序列的兩種 引物(記載于序列號21及22)各為0.4 μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造 社制造)為 1. 25U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 98°C-10 秒、55°C-15 秒、 720C _2分鐘為一個循環，將該循環反復進行三十次。需要說明的是，上述兩種引物是擴增 下述區域的引物，所述區域是編碼序列號16的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用瓊 脂糖凝膠對經擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制造) 提純出約1.9kbp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌中后回收質粒，通過測序確認了擴增出的基因片段與靶序列一致。用BamHI 及EcoRI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將 靶基因序列插入到經BamHI、EcoRI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a (Novagen 公司制造)中。通過使用該載體可制得His標簽融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表 達用大腸桿菌BL21(DE3)，通過ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。另外，基于序列號17所示的基因，使用以下方法制得人同源基因的重組蛋白質。 PCR如下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50 μ 1，其中，實施例B-I所得的各種組 織·細胞cDNA中已確認通過RT-PCR法表達的cDNAl μ 1，使含有EcoRI及XhoI限制性酶 剪切序列的兩種引物(如序列號23及24所示)各為0. 4 μ Μ,dNTP為0. 2mM、PrimeSTARHS 聚合酶(寶酒造社制造)為1. 25U，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制造)，以98°C -10 秒、55°C-15秒、72°C-2分鐘為一個循環，將該循環重復進行三十次。需要說明的 是，上述兩 種引物是擴增下述區域的引物，所述區域是編碼序列號18的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用瓊脂糖凝膠對擴增的DNA進行電泳，用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN 公司制造)提純出約1. 9kbp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其轉 化至大腸桿菌中后回收質粒，通過測序確認了經擴增的基因片段與靶序列一致。用EcorRI 及XhoI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將 靶基因序列插入到經EcoRI、XhoI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a (Novagen公 司制造)中。通過使用該載體可制得His標記融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表達 用大腸桿菌BL21(DE3)，通過ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。(2)重組蛋白質的提純 將由上述方法獲得的、表達序列號15及序列號17所述序列的各個重組大腸桿菌 在含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中在37°C下進行培養直至600nm處吸光度為0. 7 左右之后，添加異丙基- β -D-I-硫代半乳糖苷至終濃度為ImM，進一步在37°C下培養4小 時。之后以4800rpm離心10分鐘集菌。將此菌體塊懸浮在磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進一步 以4800rpm離心10分鐘清洗菌體。將所得菌體塊懸浮于20mM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)中，在冰上進行超聲裂解。將大腸 桿菌超聲裂解液以6000rpm離心分離20分鐘，所得上清為可溶餾分，沉淀為不溶餾分。將可溶組分添加至離子交換柱(載體SP S印harose (商標)Fast Flow (GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡緩沖液20mM磷酸緩沖液(pH7.0))中。以柱容量10倍量的 20mM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)清洗之后，用含有0. 3M-1. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0) 通過鹽的階段性的濃度梯度進行洗脫。分別取為柱容量6倍量的各洗脫餾分。在洗脫餾分中，將含有0. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)餾分的第1至第6 餾分、與含有1. OM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液餾分的第1餾分合并，通過二次柱，進一步提 純。二次柱使用的柱載體為Bio gel HT Type II (BioRad公司)，柱容量為5mL。用柱 容量10倍量的含有0. 3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 0)平衡化之后，添加上述洗脫餾 分。用柱容量10倍量的含有0.3M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7. 0)與0. IM磷酸緩沖 液，清洗未吸附餾分后，用0. 2M磷酸緩沖液洗脫，作為提純餾分，以后即使用此提純餾分作 為給與試驗用的材料。需要說明的是，洗脫餾分中的靶蛋白，通過根據常用方法進行的考馬 斯染色來確認。其中，犬鈣鎂蛋白如圖4所示。由上述方法所得的提純樣品中取200μ1分注到Iml反應用緩沖液(20mM Tris-Hcl,50mM NaCl,2mM CaCl2 ρΗ7· 4)中后，添加 2 μ 1 腸激酶(Novagen 公司制造) 后，在室溫下靜置一晚令其反應，切除His標簽，使用Enterokinase Cleavage Capture Kit(NoVagen公司制造)按照所附操作說明書進行提純。然后，使用超濾NAN0SEP 10K OMEGA (PALL公司制造)將1. 2ml上述方法所得的提純標準品進行生理用磷酸緩沖液(日水 制藥社制造)置換后，用0.22 μ m HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制造)進行無菌過濾， 用于以下的實驗。實施例B-3 對罹癌犬給與重組蛋白質的實驗(1)抗腫瘤評價評價用上述方法提純的兩種重組蛋白質對表皮患有腫瘤的兩只罹癌犬(兩只患有乳腺腫瘤的犬)的抗腫瘤效果。在如上所述提純的重組犬鈣鎂蛋白與人鈣鎂蛋白各100μ g(0. 5ml)中混合等量的弗氏不完全佐劑(和光純藥社制造)，作為癌癥治療劑，向膀胱附近的所屬淋巴結給與該 治療劑共3次，給與時間分別為初次、初次給與3日后以及7日后。其結果，在給與癌癥治 療劑時是大小分別約為45mm3與78mm3的腫瘤，而在癌癥治療劑初次給與10日后，分別縮 小至約27mm3與46mm3，20日后分別縮小至約15mm3與26mm3，30日后分別縮小至約7mm3與 15mm3。另外，在上述犬鈣鎂蛋白100μ g(0. 5ml)中混合0. 5ml弗氏不完全佐劑，將所得的 混合物按照與上述同樣的間隔給與患有惡性黑色素瘤的犬，總計給與三次。另外，同時每次 皮下給與100 μ g犬白細胞介素12。其結果，在給與癌癥治療劑時大小約為38mm3的腫瘤， 在癌治療劑初次使用21日后完全萎縮。(2)免疫誘導能力的評價在給與癌治療劑前與初次給與10日后以及30日后的各時間點采集在上述(1)的 給與試驗中已取得抗腫瘤效果的患病犬的血液，使用常規方法分離出末梢血單核細胞，并 將其用于IFNy酶聯免疫斑點法，對給與的各重組蛋白質進行免疫誘導能力的評價。將70 %乙醇以100 μ L/孔分別添加到Mi 11 ipore公司制造的96孔培養板 (MultiScreen-IP, MAIPS4510)中，靜置5分鐘，吸取并棄去后，用滅菌水清洗，以300 μ 1/ 孔添加200mM碳酸氫鈉(pH8.2)靜置5分鐘后，吸取并棄去，清洗培養板。然后，將添加 在200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)中的抗犬干擾素Y單克隆抗體(R&D公司制造，clonel42529, MAB781)以0.5yg/孔分別添加到培養板中，在37°C下溫育一晚，使第一抗體固相化。吸取 并棄去第一抗體后，將封閉溶液(1%BSA_5%蔗糖-200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))以300 μ 1/孔 分別添加到培養板中，在4°C下溫育一晚，封閉培養板。吸取并棄去封閉液后，以300 μ 1/孔 分別添加含有10%胎牛血清的RPMI培養基(Invitrogen公司制造)，靜置5分鐘后吸取并 棄去培養基。之后，將懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中的犬末梢血單核細胞分別 以5 X IO5/孔添加到培養板的各個孔中，以10 μ 1/孔向其中分別各次給藥中使用的犬鈣鎂 蛋白或人鈣鎂蛋白，在37°C，5% CO2的條件下培養24小時，從而使存在于末梢血單核細胞 中的免疫細胞產生干擾素Y。培養后，棄去培養基，用清洗液(0. l%Tween20-200mM碳酸氫 鈉(pH8.2))將孔清洗6次。將用上述封閉液稀釋1000倍的兔抗犬多克隆抗體以IOOyL/ 孔分別添加到各個孔中，在4°C下溫育一晚。將孔用上述清洗液清洗3次后，向各個孔中分 別添加用上述封閉液稀釋1000倍的HRP標記抗兔抗體100 μ 1，在37°C下使其反應2小時。 將孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫顯色劑(Konica公司制造)顯色，清洗孔使反 應停止。反應停止后，使膜干燥，將孔圖像化，用KS Elispot Compact System (Carl Zeiss, 德國)計算斑點形成細胞(SFC)數。其結果，無論給與犬鈣鎂蛋白或人鈣鎂蛋白的患病犬，在給與之前的末梢血單核 細胞中均未檢出斑點。另一方面，對給與犬鈣鎂蛋白的患病犬，在給與10天后及30天后的 末梢血單核細胞中分別檢出斑點15個、45個。另外，對給與人鈣鎂蛋白的患病犬，在給與 10天后及30天后的末梢血單核細胞中分別檢出斑點12個、39個。根據上述結果可以確認，所有施藥的患病犬，都可以誘導免疫細胞，該免疫細胞與 給與的重組蛋白質特異性地反應且產生干擾素Y，一般認為通過以上述免疫細胞為中心的免疫反應，能夠發揮上述(1)所述的抗腫瘤效果。實施例C-I 通過SEREX法制取新型癌抗原蛋白質(1)構建 cDNA 文庫使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從健康犬的 睪丸組織中提取全RNA，用01igotex-dT30mRNA purification Kit (寶酒造社制造)按照該 試劑盒所附操作說明書提純多聚A RNA。使用由此所得的mRNA^yg)，構建出犬睪丸cDNA噬菌體文庫。構建cDNA噬菌體 文庫時，使用 cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNASynthesis Kit，ZAP_cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE社制造)按照試劑盒所附的操作說明書構建cDNA文庫。構建出 的cDNA噬菌體文庫大小為1. 3X 106pfu/ml。(2)利用血清篩選cDNA文庫用上述已構建的源自犬睪丸的cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，在 Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板中，使宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF，)感染使其為2340 克隆，在42°C下培養3 4小時，形成溶菌斑(plaque)，在37 °C下用浸透了 IPTG(異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Hybond C Extra =GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆蓋培養板4小時，由此誘導·表達蛋白質，并使蛋白質轉印到膜 上。之后，回收該膜，將其浸在含0. 5%脫脂奶粉的TBS (IOmMTris-HCl，150mM NaCl pH7. 5) 中，在4°C下振蕩一晚，由此抑制非特異性反應。在室溫下使此過濾膜與稀釋500倍的患病 犬血清反應2 3小時。作為上述患病犬血清，使用從患有乳癌的犬體內采集的血清。這些血清保存 在-80°C，在即將使用前進行預處理。血清預處理的方法按照如下方法進行。即，用未插入外 來基因的λ ZAP Express噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’ )之后，在NZY培養板 的培養基上在37°C下培養一晚。然后向培養板中添加含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHC03pH8. 3 緩沖液，在4°C靜置15小時后，回收上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液。然后將回收的大腸 桿菌/噬菌體提取液通過NHS-柱(GEHealthecare Bio-Science公司制造)，將來自大腸桿 菌·噬菌體的蛋白質固定化。在此蛋白質固定化柱中使患病犬血清通過·反應，從血清中 除去吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體。用含有0. 5%脫脂奶粉的TBS將只是僅僅通過柱 子的血清餾分稀釋500倍，將其作為免疫篩選的材料。將經上述處理血清和上述融合蛋白質印跡的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS)清 洗4次之后，將用含0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories公司制造)作為第二抗體在室溫下反應 1小時，使用NBT/BCIP反應液(Roche公司制造)通過酶顯色反應檢出，從Φ90Χ15πιπι的 NZY瓊脂糖平板上采集與顯色反應陽性部位相一致的菌落，是其溶解在500 μ 1 SM緩沖液 (IOOmM NaCl, IOmM MgClSO4, 50mMTris_HCl，0. 01 % 明膠 ρΗ7. 5)中。采用與上述相同的方 法將顯色反應呈陽性的菌落反復篩選二次、三次直至菌落單一化，篩選出與血清中IgG反 應的30940個噬菌體克隆，分離出一個陽性克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將通過上述方法分離的1個陽性克隆用于堿基序列解析，進行操作從噬菌體載體轉換為質粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XL-l-Blue MRF')制成吸光度OD6tltl為1.0的溶液，將上述溶液200μ 1與ΙΟΟμ 1經提純的噬菌體溶液以及1μ 1 ExAssist helper phage (STRATAGENE公司制造)混合后，在37°C下反應15分鐘后，添加3ml LB培養基，在 37°C下培養2. 5 3小時，立即置于70°C水浴中保持溫度20分鐘，之后在4°C下以IOOOXg 離心15分鐘，回收上清作為噬粒溶液。然后，將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制成吸光度0D_ 為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經提純的噬菌體溶液混合后，在37°C下反應15 分鐘，取50μ 1播于含有氨芐西林(終濃度50μ g/ml)的LB瓊脂培養基中，在37°C下培養 一晚。采集經轉化的SOLR的單菌落，用含有氨芐西林(終濃度50 μ g/ml)的LB培養基在 37°C下培養后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN公司制造)提純含有目標插入片段的質粒DNA。提純所得的質粒，使用序列號5所記載的T3引物與序列號6所記載的T7引物，通 過引物步移法來解析插入片段的全長序列。通過該測序手段獲得了序列號25所記載的基 因序列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列，運行同源性檢索程序BLAST搜索(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，進行與已知基因同源性的檢索后，結果表明所得的基因 與序列號27所示的CEP基因的堿基序列 氨基酸序列均顯示99%的(其中，只計算了相重 疊的序列)同源性，判斷該基因為CEP基因。犬CEP的人同源蛋白為人CEP(與序列號25 所示的CEP基因的同源性堿基序列87%，氨基酸序列84% )。人CEP的堿基序列如序列 號29所示，氨基酸序列如序列號30所示。(4)在各種組織中的表達解析對于通過上述方法所得的基因，通過RT-PCR法(ReverseTranscription-PCR法) 研究其在犬與人的正常組織及各種細胞株中的表達。逆轉錄反應如下進行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制造)按照所附操作說明書從50 IOOmg各種組織及各種細胞株 5-10X IO6個的細胞中提取全RNA。通過Superscript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附的操作說明書，用上述全RNA合成cDNA。人正常 組織(腦，海馬，睪丸，結腸，胎盤)的cDNA，使用Gene Pool cDNA (invitrogen公司制造)， QUICK-Clone cDNA (Clontech 公司制造)及 Large-Insert cDNA Library (Clontech 公司制 造)。PCR反應使用對獲得的基因具有特異性的引物(如序列號31與32所示)按照下列 方法進行。即，加入各試劑和附加緩沖液使總量為25 μ 1，其中，通過逆轉錄反應制得的樣品 為0. 25 μ 1，使上述引物各為2 μ Μ、各種dNTP為0. 2mM、ExTaq聚合酶(寶酒造社制造)為 0. 65U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 94°C -30 秒、55°C -30 秒、72°C -30 秒 為一個循環，將該循環反復進行三十次。需要說明的是，上述基因特異性的引物，是擴增下 述區域的引物，所述區域是序列號25與27的堿基序列中的4582 5124號及序列號29的 堿基序列中的4610 5152號堿基所在的區域，也可使用此引物來研究犬CEP基因及/或 人CEP基因的任一者的表達。為了比較對照，也同時使用對GAPDH特異性的引物(如序列 號9與10所示)。其結果如圖5所示，犬CEP基因在健康的犬類組織中顯著表達于睪丸，另 一方面，也發現該基因在犬乳癌細胞中顯著表達。人CEP基因的表達與犬CEP基因相同，在 人正常組織中能夠確認其表達的部位僅限于睪丸，但在人癌細胞中則于腦腫瘤、白血病、食 道癌中均檢測出其表達，由于在白血病細胞株中特別顯著地表達，所以可以確認人CEP基 因也特異性地表達于睪丸與癌細胞中。需要說明的是，在圖5中，縱軸的標號1表示CEP基因的表達譜，標號2表示作為比較對照的GAPDH基因的表達譜。實施例C-2 犬及人CEP的制備(1)重組蛋白質的制備基于實施例C-I中所得的序列號25的基因，通過以下方法制備重組蛋白質。PCR如下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，使由實施例C-I中所得的噬粒 溶液制得的供序列解析用的載體為1μ 1，使含有BamHI及SalI限制性酶剪切序列的2種引 物(記載于序列號33及34)各為0. 4 μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造 社制造)為 1. 25U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 98°C -10 秒、55°C _5 秒、 720C _7分鐘為一個循環，將循環反復進行三十次。需要說明的是，上述2種引物，是擴增下 述區域的引物，所述區域是編碼序列號26的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用瓊脂 糖凝膠對擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制造)提純 出約7. Okbp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌后，回收質粒，通過測序確認了經擴增的基因片段與靶序列一致。用BamI 及SalI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，在用QIAquick Gel Extraction Kit提純后， 將靶基因序列插入到經BamHI、SalI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a (Novagen 公司制造)中。通過使用該載體可制得His標簽融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表 達用大腸桿菌BL21(DE3)，通過ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。同 樣，基于序列號27的基因，以犬睪丸cDNA為模板，使用含有BamHl與SalIl限制性酶剪切 序列的兩種引物(序列號33與35)，制得已注冊的犬CEP基因的重組蛋白質。需要說明的 是，上述兩種引物是擴增下述區域的引物，所述區域是編碼序列號28的氨基酸序列全長的 約7. 8kpb區域.此外，基于序列號29的基因，使用以下方法制得人同源基因的重組蛋白質。PCR如 下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，實施例C-I制備的各種組織 細胞 cDNA中已確認通過RT-PCR法表達的cDNAl μ 1，使含有BamHI及SalI限制性酶剪切序列的 兩種引物(如序列號36及37所示)各為0. 4μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTARHS聚合酶(寶 酒造社制造)為 1. 25U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 98°C-10 秒、55°C _5 秒、72°C _7分鐘為一個循環，將該循環重復進行三十次。需要說明的是，上述兩種引物，是 擴增下述區域的引物，所述區域是編碼序列號30的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用
瓊脂糖凝膠對經擴增的DNA進行電泳，用QIAquick GelExtraction Kit (QIAGEN公司制 造)提純出約7. Okbp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌后，回收質粒，通過測序確認了經擴增的基因片段與靶序列一致。用BamHI 及SalI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將 靶基因序列插入到經BamHI、SalI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a (Novagen公 司制造)中。通過使用該載體可制得His標記融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表達 用大腸桿菌BL21(DE3)，通過ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。(2)重組蛋白質的提純將上述獲得的、表達序列號25、序列號27及序列號29所示序列的各個重組大腸桿菌，用含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養基在37°C下培養直至600nm處的吸光度為0. 7 左右之后，添加異丙基-β-D-I-硫代半乳糖苷至終濃度為ImM，在37°C下培養20小時。之 后以4800rpm離心10分鐘集菌。將菌體球狀物懸浮在磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進一步以 4800rpm離心10分鐘清洗菌體。將上述菌體懸浮于磷酸緩沖生理鹽水中，在冰上進行超聲裂解。將大腸桿菌超聲 裂解液以7000rpm離心分離20分鐘，所得上清為可溶餾分，沉淀為不溶餾分。將不溶餾分 懸浮于Triton X-100溶液中，以7000rpm離心20分鐘。重復該操作2次，進行除去蛋白酶 處理。之后，將殘渣懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進行脫表面活性劑的操作。將該殘渣懸 浮于含有8M尿素的IOmM Tris鹽酸、IOOmM磷酸緩沖液(以下稱為8M尿素溶液)及蛋白 酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktails)中，在4°C下靜置20小時，使蛋白質變 性。上述變性處理后，以7000rpm離心20分鐘，將所得可溶組分添加到按照常用方 法制得的鎳螯合柱(載體Chelateing S印harose (商標)Fast Flow (GE Health Care公 司)，柱容量5mL，平衡緩沖液8M尿素溶液)中，進一步在4°C下靜置一晚。將該柱載體以 1500rmp離心5分鐘，回收上清液，柱載體用磷酸鹽緩沖生理鹽水懸浮后，再次填充到柱中。 未被柱吸附的組分用柱容量5倍量的8M尿素溶液與柱容量10倍量的含0. 5M氯化鈉的0. IM 乙酸緩沖液(PH4. 0)及含有IOmM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH8. 0)清洗處理后，立即用分 為5階段的100mM-500mM咪唑階段性的濃度梯度進行洗脫，制成提純餾分，以后將該提純餾 分作為給與試驗用的材料。需要說明的是，各洗脫餾分中的靶蛋白，通過按照常用方法進行 的考馬斯染色法進行確認。其中，序列號26所示的重組犬CEP如圖6所示。由上述方法所得的提純標準品中取200μ1分注到Iml反應緩沖液(20mM Tris-Hcl,50mM NaCl,2mM CaCl2 ρΗ7· 4)中后，添加 2 μ 1 腸激酶(Novagen 公司制造) 后，在室溫下靜置一晚令其反應，切除His標簽，使用Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen公司制造)按照所附的操作說明書進行提純。然后，將由上述方法所得的提純 標準品1. 2ml用超濾NAN0SEP 10K OMEGA (PALL公司制造)進行生理用磷酸緩沖液(日水 制藥社制造)置換后，用0.22 μ m HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制造)進行無菌過濾， 用于以下的實驗。實施例C-3 對罹癌犬給與重組蛋白質的實驗(1)抗腫瘤評價評價用上述方法提純的兩種重組蛋白質對表皮患有腫瘤的兩只罹癌犬(兩只患 有肛周腺腫瘤的犬)的抗腫瘤效果。在如上所述提純的序列號26所示的重組犬CEP及人CEP分別100 μ g(0. 5ml)中 混合等量的弗氏不完全佐劑(和光純藥社制造)，制成癌癥治療劑，向腫瘤附近的所屬淋巴 結給與上述治療劑共計3次，給與時間分別為初次、初次給與3日后及7日后。其結果，在給 與癌癥治療劑時大小分別為約87mm3與69mm3的腫瘤，在癌癥治療劑初次給與10日后分別 縮小至約69mm3與56mm3，20日后分別縮小至約24mm3與31mm3，30日后分別縮小至約IOmm3 與 8mm3。此外，在序列號26所示的犬CEP蛋白IOOyg(CXSml)中混 合0.5ml的弗氏不完全 佐劑，將所得混合物與上述相同地給與患有乳腺癌的犬共計三次。另外，同時每次皮下給與IOMU重組型貓干擾素“ Intercat”。其結果，在給與癌癥治療劑時大小約為126mm3的腫瘤，在癌治療劑初次使用26日后完全萎縮。需要說明的是，即使在使用序列號28所記載的犬 CEP時也同樣具有對罹癌犬的抗腫瘤效果。進而，在序列號26所記載的犬CEP蛋白質IOOyg (0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不 完全佐劑，將所得的混合物與上述相同地給與患有肥大細胞瘤的犬共計三次。另外，同時每 次皮下給與100 μ g犬白細胞介素12。結果，在給與癌癥治療劑時大小約為83mm3的腫瘤， 在癌治療劑初次使用18日后完全萎縮。(2)免疫誘導能力的評價在給與癌治療劑前與初次給與10日后以及30日后的各個時間點，采集在上述(1) 的給與試驗中已取得抗腫瘤效果的患有肛周腺腫瘤的犬的血液，使用常規方法分離出末梢 血單核細胞，使用其，通過IFNy酶聯免疫斑點法對已給與的蛋白質進行免疫誘導能力的 評價。將70 %乙醇以100 μ L/孔分別添加到Mi 11 ipore公司制造的96孔培養板 (MultiScreen-IP,MAIPS4510)中，靜置5分鐘，吸取并棄去，然后用滅菌水清洗，以300 μ 1/ 孔添加200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)，靜置5分鐘后，吸取并棄去，清洗培養板。然后，將添加在 200mM碳酸氫鈉中的抗犬干擾素γ單克隆抗體(R&D公司制造，clonel42529，MAB781)以 0. 5μ g/孔分別添加到培養板中，在37°C下溫育一晚，使第一抗體固相化。吸取并棄去第一 抗體后，以300 μ 1/孔分別添加封閉溶液(1 % BSA-5%蔗糖-200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))，在 4°C下溫育一晚將培養板封閉。吸取并棄去封閉液后，以300 μ 1/孔分別添加含有10%胎牛 血清的RPMI培養基(Irwitrogen公司制造)，靜置5分鐘后吸取并棄去培養基。之后，將懸 浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中的犬末梢血單核細胞分別以5X IO5/孔添加到培 養板的各個孔中，將用于施藥的序列號26所示的犬CEP或人CEP分別以10 μ 1/孔添加到培 養板的各個孔中，在37°C，5% CO2的條件下培養24小時，由此使存在于末梢血單核細胞中 的免疫細胞產生干擾素Y。培養后，棄去培養基，用清洗液(0. Tween20-200mM碳酸氫 鈉(pH8.2))將孔清洗6次。將用上述封閉液稀釋1000倍的兔抗犬多克隆抗體以IOOyL/ 孔分別添加到各個孔中，在4°C下溫育一晚。將孔用上述清洗液清洗3次后，向各個孔中分 別添加100 μ 1用上述封閉液稀釋1000倍的HRP標記抗兔抗體，在37°C下反應2小時。將 孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫顯色劑(Konica公司制造)顯色，清洗孔使反 應停止。反應停止后，使膜干燥，將孔圖像化，用KS Elispot Compact System (Carl Zeiss, 德國)計算斑點形成細胞(SFC)數。結果，無論給與序列號26所示的犬CEP或人CEP的患病犬，在給與前的末梢血單 核細胞中均未檢出斑點。另一方面，給與犬CEP的患病犬，在給與10天后及30天后的末梢 血單核細胞中分別檢出斑點23個、52個。另外，給與人CEP的患病犬，在給與10天后及30 天后的末梢血單核細胞中分別檢出斑點19個、49個。根據上述結果可以缺認，所有施藥的患病犬，都可以誘導免疫細胞，該免疫細胞與 給與的重組蛋白質特異性地反應且產生干擾素Y，一般認為通過以該免疫細胞為中心的免 疫反應，能夠發揮上述(1)所述的抗腫瘤效果。實施例D-I 通過SEREX法制取新型癌抗原蛋白質(1)構建 cDNA 文庫
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從健康犬的 睪丸組織中提取全RNA，用01igotex-dT30mRNA purification Kit (寶酒造社制造)按照該 試劑盒所附操作說明書提純出多聚A RNA。使用由此所得的mRNA^yg)，構建出犬睪丸cDNA噬菌體文庫。構建cDNA噬菌體 文庫時，使用 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNASynthesis Kit，ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE 社制 造)按照試劑盒所附的操作說明書，構建cDNA文庫。構建出的cDNA噬菌體文庫大小為 1. 3X106pfu/ml。 (2)利用血清篩選cDNA文庫用上述已構建的源自犬睪丸的cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，在 Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板中，使宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF，)感染使其為2340 克隆，在42°C下培養3 4小時，形成溶菌斑(plaque)，在37 °C下用浸透了 IPTG(異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Hybond C Extra =GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆蓋培養板4小時，由此誘導·表達蛋白質，并使蛋白質轉印到膜 上。之后，回收該膜，將其浸在含0. 5%脫脂奶粉的TBS (IOmMTris-HCl，150mM NaCl pH7. 5) 中，在4°C下振蕩一晚，由此抑制非特異性反應。在室溫下使此過濾膜與稀釋500倍的患病 犬血清反應2 3小時。作為上述患病犬血清，使用從患有乳癌的犬體內采集的血清。這些血清保存 在-80°C，在即將使用前進行預處理。血清預處理的方法如下。即，用未插入外來基因的 λ ZAP Express噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)之后，在NZY培養板的培養基 中在37°C下培養一晚。然后，向培養板中添加含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHC03pH8. 3緩沖 液，在4°C下靜置15小時后，回收上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液。然后，將回收的大腸 桿菌/噬菌體提取液通過NHS-柱(GE HealthecareBio-Science公司制造)，將來自大腸桿 菌·噬菌體的蛋白質固定化。在此蛋白質固定化的柱中使患病犬血清通過·反應，從血清 中除去吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體。將只是僅僅通過柱子的血清餾分用含有0. 5% 脫脂奶粉的TBS稀釋500倍，將其作為免疫篩選的材料。將經上述處理血清和上述融合蛋白質印跡的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS)清 洗4次之后，將用含0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories公司制造)作為第二抗體在室溫下使其 反應1小時，使用NBT/BCIP反應液(Roche公司制造)通過酶顯色反應檢出，從Φ90X 15mm 的NZY瓊脂糖平板中采集與顯色反應陽性部位相一致的菌落，使其溶解在500 μ 1 SM緩沖 液(IOOmM NaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明膠 pH7. 5)中。采用與上述同樣的 方法將顯色反應呈陽性的菌落反復篩選二次、三次，直至菌落單一化，篩選與血清中IgG反 應的30940個噬菌體克隆，分離出一個陽性的克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將通過上述方法分離所得的一個陽性克隆用于堿基序列解析，進行操作將噬 菌體載體轉換為質粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XL-l-Blue MRF')制備成吸光度 OD6c 為1.0的溶液，將上述溶液200μ 1與100 μ 1經提純的噬菌體溶液、以及1 μ 1 ExAssist helper phage (STRATAGENE公司制造)混合后，在37°C反應15分鐘，然后，添加3ml LB培養基，在37°C下培養2. 5 3小時，立即用70°C水浴溫育20分鐘，之后在4°C 1000 Xg下離心 15分鐘，回收上清作為噬粒溶液。然后，將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制備成吸光度OD6tltl為 1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經提純的噬菌體溶液混合后，在37°C下反應15分 鐘，取50μ 1播于含有氨芐西林(終濃度50μ g/ml)的LB瓊脂培養基中，在37°C下培養一 晚。采集轉化后的SOLR單菌落，用含有氨芐西林(終濃度50 μ g/ml)的LB培養基在37°C 下培養后，使用QIAGENplasmid Miniprep Kit (QIAGEN公司制造)提純含有目標插入片段 的質粒DNA。提純所得的質粒，使用序列號5所記載的T3引物與序列號6所記載的T7引物通 過引物步移法來解析插入片段的全長序列。通過該序列解析獲得了序列號38所記載的基 因序列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列，運行同源性檢索程序BLAST搜索(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，進行與已知基因的同源性檢索，結果可以判定所得的基 因為TRIPll基因。犬TRIPll的人同源因子為人TRIPll (同源性堿基序列88%，氨基酸 序列86% )。人TRIPll的堿基序列由序列號40所示，氨基酸序列由序列號41所示。(4)在各種組織中的表達解析對于通過上述方法所得的基因，通過RT-PCR法(ReverseTranscription-PCR法) 研究其在犬與人的正常組織及各種細胞株中的表達。逆轉錄反應如下進行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制造)按照所附操作說明書，從50 IOOmg各種組織及各種細胞 株 5-10 X IO6 個的細胞中提取全 RNA。通過 Superscript First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附操作說明書，用上述全RNA合成cDNA。人正常 組織(腦，海馬，睪丸，結腸，胎盤)的cDNA，使用Gene Pool cDNA (invitrogen公司制造)， QUICK-ClonecDNA (Clontech 公司制造)及 Large-Insert cDNA Library (Clontech 公司制 造)。PCR反應使用對獲得的基因具有特異性的引物(如序列號42與43所示)按照下列 方法進行。即，加入各試劑和附加緩沖液使總量為25 μ 1，其中，使通過逆轉錄反應制得的樣 品為0. 25 μ 1，使上述引物各為2 μ Μ、各種dNTP為0. 2mM、ExTaq聚合酶(寶酒造社制造) 為 0. 65U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 94°C -30 秒、55°C -30 秒、72°C -1. 5 分鐘為一個循環，將該循環反復進行三十次。需要說明的是，上述基因特異性的引物，是擴 增下述區域的引物，該區域為序列號38的堿基序列(犬TRIPll基因)中的1519 2957 號及序列號40的堿基序列(人TRIPll基因)中的1872 3310號堿基的區域，也可使用 此引物來研究犬TRIPll基因及人TRIPll基因中任一者的表達。為了比較對照，也同時使 用GAPDH特異性的引物(如序列號9與10所示)。其結果如圖7所示，犬TRIPll基因，在 健康的犬類組織中顯著表達于睪丸，另一方面，發現該基因在犬乳癌細胞株中顯著表達。人 基因的表達與犬TRIPll基因相同，在人正常組織中能夠確認其表達的部位僅限于睪丸，但 在人癌細胞中則于腦腫瘤、白血病、乳癌，肺癌，食道癌細胞株等多種癌細胞株中均檢測出 其表達，因此可以確證人TRIPll也特異性地表達于睪丸與癌細胞中。需要說明的是，在圖7中，縱軸的標號1表示TRIPll基因的表達譜，標號2表示作為比較對照的GAPDH基因的表達譜。實施例D-2 犬及人TRIPll蛋白質的制備(1)重組蛋白質的制備基于實施例D-I中所得的序列號38的基因，通過以下方法制備重組蛋白質。PCR如下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，使由實施例D-I中所得的噬粒溶 液制得的供序列解析用的載體為ι μ 1，使含有SalI及XhoI限制性酶剪切序列的兩種引物 (如序列號44及45所示)各為0. 4 μ Μ，使dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造 社制造)為 1. 25U，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制造)，以 98°C -10 秒、55°C _5 秒、 720C -6分鐘為一個循環，將該循環反復進行三十次。需要說明的是，上述兩種引物，是擴增 下述區域的引物，所述區域是編碼序列號39的氨基酸序列全長的區域。PCR之后，用瓊 脂糖凝膠對擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制造)提 純出約6. Okbp的DNA片段。
將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌后回收質粒，通過測序確認了經擴增的基因片段與靶序列一致。用SalI及 XhoI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，在用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將靶 基因序列插入到經Sail、XhoI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30b(NOVagen公司 制造)中。通過使用該載體可制得His標簽融合型重組蛋白質。將該質粒轉化至表達用大 腸桿菌BL21(DE3)，通過利用ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。另外，基于序列號40的基因，使用以下方法制得人同源基因的重組蛋白質。PCR如 下進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，實施例D-I制備的各種組織 細胞 cDNA中的已確認通過RT-PCR法表達的cDNA為1 μ 1，使含有NdeI及KpnI限制性酶剪切序 列的兩種引物(如序列號46及47所示)各為0. 4 μ Μ，使dNTP為0. 2mM、使PrimeSTAR HS 聚合酶(寶酒造社制造)為1.25U，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制造)，以98°C-10 秒、55°C-5秒、72°C-6分鐘為一個循環，將該循環反復進行三十次。需要說明的是，上述兩 種引物，是擴增下述區域的引物，所述區域是編碼序列號41的氨基酸序列全長的區域。PCR 之后，用瓊脂糖凝膠對擴增的DNA進行電泳，用QIAquickGel Extraction Kit (QIAGEN 公司制造)提純出約6. Okbp的DNA片段。將提純出的DNA片段與克隆載體pCR-BlimtGnvitrogen公司制造)連接。將其 轉化至大腸桿菌后回收質粒，通過測序確認了經擴增的基因片段與靶序列一致。用NdeI及 KpnI限制性酶處理與靶序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提純后，將靶基 因序列插入到經Ndel、KpnI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30b (Novagen公司制 造)中。通過使用該載體能夠制得His標記融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表達用 大腸桿菌BL21(DE3)中，通過利用ImM IPTG進行表達誘導，使靶蛋白在大腸桿菌內表達。(2)重組蛋白質的提純將上述獲得的、表達序列號38及序列號40所述序列的各個重組大腸桿菌用含有 30 μ g/ml卡那霉素的LB培養基在37°C下培養直至600nm處吸光度為0. 7左右之后，添加 異丙基-β-D-I-硫代半乳糖苷至終濃度為ImM，在37°C下培養20小時。之后以4800rpm 離心10分鐘集菌。將菌體塊懸浮在磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進而以4800rpm離心10分鐘 清洗菌體。將所得菌體塊懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，在冰上進行超聲裂解。將大腸桿菌 超聲裂解液以7000rpm離心分離15分鐘，所得上清為可溶餾分，沉淀為不溶餾分。將不溶餾分懸浮于4% Triton X-100溶液中，以7000rpm離心10分鐘。重復該操 作2次，進行除去蛋白酶處理。之后，將殘渣懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，進行脫表面活性劑的操作。將該殘渣懸浮于含有6M胍鹽酸鹽的20mM磷酸緩沖液(pH8. 0)中，在4°C下靜置 20小時，使蛋白質變性。變性處理后，以7000rpm離心20分鐘，將所得可溶餾分添加至按 照常用方法制得的鎳螯合柱(載體=Chelateing S印harose (商標)Fast Flow (GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡緩沖液含有6M胍鹽酸鹽的20mM磷酸緩沖液(pH8. 0))中。 將未被吸附的餾分用柱容量10倍量的含有6M胍鹽酸鹽的20mM磷酸緩沖液(pH8. 0)及含有 IOmM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH8. 0)進行清洗處理后，立即用分為4階段的50mM-500mM 咪唑階段性的濃度梯度進行洗脫，形成提純餾分，以后，使用該提純餾分作為給與試驗用的 材料。需要說明的是，洗脫餾分中的靶蛋白，根據按照常用方法進行的考馬斯染色法進行確 認。其中，犬TRIPll蛋白質如圖8所示。上述方法所得的提純標準品中取200μ1分注到Iml反應用緩沖液(20mM Tris-Hcl,50mM NaCl,2mM CaCl2pH7. 4)中后，添加 2 μ 1 腸激酶(Novagen 公司制造) 后，在室溫下靜置一晚令其反應，切除His標簽，用Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen公司制造)按照所附操作說明書提純靶蛋白。然后，將上述方法所得的提純標 準品1.2ml用超濾NANOSEP IOK OMEGA (PALL公司制造)進行生理用磷酸緩沖液(日水制 藥社制造)置換后，用0.22 μ m HT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制造)進行無菌過濾，用 于以下的實驗。實施例D-3 對罹癌犬給與重組蛋白質的實驗(1)抗腫瘤評價評價用上述方法提純的兩種重組蛋白質對表皮患有腫瘤的兩只罹癌犬(兩只患 有乳腺腫瘤的犬)的抗腫瘤效果。在如上述所述提純的重組犬TRPll及人TRIPll各100μ g(0. 5ml)中混合0. 5ml 弗氏不完全佐劑(和光純藥社制造)，作為癌癥治療劑。向腫瘤附近的所屬淋巴結給與該治 療劑共計三次，給與時間分別為初次，初次給與3日后以及7日后。其結果，在給與癌癥治 療劑時大小分別為約75mm3與102mm3的腫瘤，在癌癥治療劑初次給與10日后分別縮小至約 63mm3與85mm3，20日后分別縮小至約35mm3與42mm3，30日后分別縮小至約15mm3與19mm3。另夕卜，在犬TRPll蛋白質100 μ g(0. 5ml)中混合0. 5ml的弗氏不完全佐劑，與上 述相同地將所得混合物給與患有肥大細胞瘤的犬共計三次，另外同時每次皮下給與100 μ g 犬白細胞介素12。其結果，在給與癌癥治療劑時大小約為165mm3的腫瘤，在癌治療劑初次 使用23日后完全萎縮。(2)免疫誘導能力的評價從上述(1)的給與試驗中已經獲得抗腫瘤效果的患有乳腺腫瘤的犬中采集血液， 按照常規方法分離出末梢血單核細胞，使用其通過IFNy酶聯免疫斑點法對給與的各種重 組蛋白質進行免疫誘導能力評價。將70 %乙醇以100 μ 1/孔分別添加到Mi 11 ipore公司制造的96孔培養板 (MuliScreen-IP, MAIPS4510)中，靜置5分鐘，吸取并棄去后，用滅菌水清洗，以300 μ 1/ 孔添加200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)，靜置5分鐘后，吸取并棄去，清洗培養板。然后，將添加 在200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)中的抗犬干擾素Y單克隆抗體(R&D公司制造，clonel42529, MAB781)以0.5 μ g/ 孔分別添加到培養板中，在37°C下溫育一晚，使第一抗體固相化。吸取并棄去第一抗體后，以300 μ 1/孔添加封閉溶液(1% BSA-5%蔗糖-200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))，在4°C下溫育一晚，將培養板封閉。吸取并棄去封閉液后，以300 μ 1/孔添加含 有10%胎牛血清的RPMI培養基(Invitrogen公司制造)，靜置5分鐘，吸取并棄去培養基。 之后，將懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中的犬末梢血單核細胞以5X105/孔分 別添加到培養板中，將用于施藥的犬TRIPl 1或人TRIPl 1分別以10 μ 1/孔添加到上述培養 板的各個孔中，在37°C，5% CO2的條件下培養24小時，從而使存在于末梢血單核細胞中的 免疫細胞產生干擾素Y。培養后，棄去培養基，用清洗液(0. 1% Tween20-200mM碳酸氫鈉 (pH8. 2))將孔清洗6次。將用上述封閉液稀釋1000倍的兔抗犬多克隆抗體以100 μ 1/孔 分別添加到各個孔中，在4°C下溫育一晚。將孔用上述清洗液清洗3次后，將用上述封閉液 稀釋1000倍的HRP標記抗兔抗體以100 μ 1/孔分別添加到各個孔中，在37°C下反應2小 時。將孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫顯色劑(Konica公司制造)顯色，清洗 孔使反應停止。反應停止后，使膜干燥，將孔圖像化，用KS ElispotCompact System (Carl Zeiss，德國)計算斑點形成細胞(SFC)數。其結果，無論給與犬TRIPll蛋白還是人TRIPll蛋白的患病犬，在給與前的末梢血 單核細胞中均未檢出斑點。與之相對，給與了犬TRIPll的患病犬，在給與10天后及30天 后的末梢血單核細胞中分別檢出斑點26個、65個。另外，給與了人TRIPll的患病犬，在給 與10天后及30天后的末梢血單核細胞中分別檢出斑點31個、72個。由上述結果可以確認，所有施藥的患病犬，都能夠誘導免疫細胞，該免疫細胞與給 與的重組蛋白質特異性反應產生干擾素Y，一般認為通過上述以該免疫細胞為中心的免疫 反應，能夠發揮上述(1)所述的抗腫瘤效果。
權利要求
一種免疫誘導劑，含有多肽或重組載體作為有效成分，所述多肽為具有免疫誘導活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸且能夠在生物體內表達該多肽，(a)由序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個以上氨基酸組成的多肽，(b)與(a)多肽有80％以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的多肽，(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的多肽。
2.如權利要求1所述的免疫誘導劑，其中，所述(b)多肽為與所述(a)多肽具有95% 以上同源性的多肽。
3.如權利要求1所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為序列表中 序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個以上氨基酸組成的多肽， 或包含該多肽作為其部分序列的多肽。
4.如權利要求3所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為具有序列 表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求1至4中任一項所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有多肽作為有效 成分。
6.如權利要求5所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑是抗原呈遞細胞的處理劑。
7.如權利要求1至5中任一項所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑是癌癥的治療劑和 /或預防劑。
8.如權利要求7所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑用于人、犬或貓。
9.如權利要求7或8所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑還含有免疫增強劑。
10.如權利要求9所述的免疫誘導劑，其中，所述免疫增強劑為選自由弗氏不完全佐 齊IJ，Montanide,多聚IC及其衍生物、CpG寡核苷酸、白細胞介素12、白細胞介素18、干擾素 α，干擾素β，干擾素ω，干擾素Υ以及Flt3配體構成的組中的至少一種。
11.一種免疫誘導方法，包括給與個體有效量的多肽或重組載體，所述多肽為具有免疫 誘導活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸且能 夠在生物體內表達該多肽，(a)由序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個以上 氨基酸組成的多肽，(b)與(a)多肽有80%以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的多肽，(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的多肽。
12.一種抗原呈遞細胞的處理方法，包括使多肽與抗原呈遞細胞接觸，所述多肽為下述 (a)至(c)中的任一多肽、具有免疫誘導活性，(a)由序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個以上 氨基酸組成的多肽，(b)與(a)多肽有80%以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的多肽，(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的多肽。
13.多肽或重組載體在免疫誘導劑制備中的應用，所述多肽為具有免疫誘導活性的下 述(a)至(c)中的任一多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸且能夠在生物體內表達該多肽，(a)由序列表中序列號2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中連續7個以上氨基酸組成的多肽，(b)與(a)多肽有80%以上的同源性、由7個以上的氨基酸組成的多肽，(c)包含(a)多肽或(b)多肽作為其部分序列的多肽。
全文摘要
本發明公開了一種含有特定的多肽作為有效成分的免疫誘導劑。上述多肽，通過使用來自犬睪丸cDNA文庫以及罹癌犬血清的SEREX法，以與抗體相結合的多肽的形式被分離，所述抗體特異性地存在于來自罹癌犬的血清中。上述多肽能夠在生物體內誘導免疫，另外，能夠使罹癌生物體的腫瘤萎縮。因此，上述多肽作為癌癥的治療及/或預防劑特別有用。
文檔編號A61K38/00GK101842113SQ200880110949
公開日2010年9月22日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年10月25日
發明者岡野文義, 石橋正樹 申請人:東麗株式會社