用于治療骨關節炎的疫苗的制作方法

專利名稱：：用于治療骨關節炎的疫苗的制作方法用于治療骨關節炎的疫苗本發明涉及用于治療脊椎動物骨關節炎的疫苗，IL-Iβ和任選地TNF-α細胞因子生產該疫苗的用途和通過給予該疫苗來治療脊椎動物的骨關節炎。骨關節炎(OA)是一種主要發生在老年人和動物中的非炎性變性關節病，其特征在于關節軟骨的變性、邊緣的骨質增生和滑膜的變化。盡管該疾病可能是由于多種起因引起的，但一般認為機械力和生化力是其出現和進展的主要原因。該疾病伴隨疼痛和僵硬，特別是在長時間的活動之后。它是一種在人和動物，特別是狗和馬中泛發的疾病，因而在人以及動物健康中是嚴重的問題。患有輕微OA的患者僅用緩解疼痛的藥劑如醋氨酚就可以治療。然而，給予了許多患者非類固醇抗炎藥(NSAID)。這些NSAID不僅可緩解疼痛而且還具有潛在危險的副作用，包括誘發胃潰瘍、對日照過敏、腎障礙、神經過敏和抑郁。用直接注射入關節中的皮質類固醇來治療一些患者，以減緩OA的發展。然而，由于皮質類固醇的潛在危險的副作用，因此這不是優選的。在文獻中，還提出了使用細胞因子拮抗劑通過原位治療，即，在OA關節中來治療0A，據認為細胞因子拮抗劑在介導增加的基質變性中起著作用，所述基質變性表征OA軟骨損傷。例如，這可以從Pelletier(Arthritis&Rheumatism，Vol.40，No.6，1997年6月，pp.1012-1019)和Fernandes(Biorheology39，2002，237-246)中得知，這兩篇文獻描述了基于白細胞介素受體拮抗劑(IL-Ra)基因的關節內注射的基因治療，這可以降低實驗誘發的損傷的進展。然而，積極效果是非常短暫的，并且作為治療的適用性也有待得到證實。此夕卜，針對細胞因子自身(特別是白細胞介素6)的單克隆抗體的原位給藥從歐洲專利申請EP1715891(Warner-LambertCompany，2006年公開)中可以得知。這種治療的缺陷在于所需的高劑量這使得該治療固有地昂貴、局部(侵入性)給藥和短暫效果。本發明的目的是提供用于骨關節炎的治療，其沒有或至少在較低程度上具有已知OA治療的缺陷。這種意義上的治療包括預防0A、提供臨床病征緩解、減輕或治愈該疾病或在已經開始發展后抑制其進展的治療。為此，已經研發了根據序言部分的疫苗，其含有IL-Iβ和任選的TNF-α細胞因子或其衍生物，并且所述IL-Iβ和任選的TNF-α或其衍生物與對于脊椎動物而言不是其自體的部分結合，使得疫苗在脊椎動物體內引發對抗IL-Iβ和TNF-α自體-分子的免疫應答。任選地，該疫苗含有用于攜帶與非自體部分結合的IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物的介質。在這方面中，疫苗是適于應用于脊椎動物的構造，S卩，任何具有關節的活著的動物，如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物，包括人(從現在開始，術語“動物”用于表示任何脊椎動物)。通常，疫苗包含一種或多種抗原，如減毒的或殺滅的微生物及其亞基，或任何其他物質，如生物體的代謝產物。將疫苗給予動物時，引發了對抗抗原的免疫應答，該應答有助于預防、緩解或治療疾病或失調。通常，將抗原與用于攜帶抗原的介質結合，通常將所述介質稱為“藥物學上可接受的載體”。這樣的載體可以是在生理上與脊椎動物相容的任何溶劑、分散介質、涂層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這樣的載體介質的一些實例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、細菌培養流體、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。提供了它們的液體、半固體和固體劑型，這取決于打算的給藥方式。如所公知的，載體介質的存在對于疫苗的功效不是必需的，但其可以明顯地簡化抗原的劑量和給藥。疫苗可以另外含有非特異性免疫刺激劑，通常稱為佐劑。原則上，能夠促進或增強免疫事件級聯中的特定過程并最終導致更好的免疫應答(即，對抗原的綜合身體應答，特別是由淋巴細胞介導的并通常涉及特定的抗體或之前敏化的淋巴細胞對抗原的識別)的每種物質可以被定義為佐劑。必需注意通常對于所述將要發生的特定過程，佐劑不是必需的，但其可促進或擴大所述過程。本發明的疫苗是基于IL-Iβ(白細胞介素1β)和TNF-α(腫瘤壞死因子α)細胞因子的使用。通常，細胞因子是由細胞群接觸抗原時釋放的非抗體蛋白，其在免疫應答的產生中作為細胞間的介質。白細胞介素-ιβ是白細胞介素類的亞組，白細胞介素是一類主要由巨噬細胞和T淋巴細胞分泌的并誘導淋巴細胞和造血干細胞的生長和分化的蛋白。其是有效的免疫調節劑，其介導各種免疫和炎性應答，包括B-和T-細胞的激活。TNF-α是最為公知的“腫瘤壞死因子”家族的成員，其中該家族表示在內毒素存在下由巨噬細胞產生的并且其中通過實驗顯示出能夠攻擊并破壞癌性腫瘤的蛋白。在本發明的情況下，疫苗含有IL-Ιβ和TNF-α或其衍生物，并與對于脊椎動物而言非自體的一部分結合。在這種情況下，非自體的意思是在治療的動物中是免疫原性的，即，能夠引發免疫應答。如通常所知的，通過結合另一種分子使用非自體部分，可以提供對抗這種其他分子的免疫應答，即使這種其他分子是該動物自體的。通過選擇動物異源的IL-Iβ和TNF-α來簡單地提供結合細胞因子的非自體部分(或多個部分)。在這方面中，異源意思是不是源自相同的物種(與同源相對)。在這種情況下，細胞因子在其分子結構中固有地含有對于治療的動物為非自體的部分。例如，另一種可能是選擇治療動物同源的細胞因子，但是突變體，或通過重組技術來帶有外源蛋白。例如，提供結合細胞因子或其衍生物的非自體部分的其他方式是在物理或化學上結合一個或多個對細胞因子而言的非自體分子、非自體結構、化合物或僅僅是任何非自體構造。在任何情況下，提供了免疫構建體，其中在細胞因子或其衍生物和非自體部分之間存在可操作的連接，使得構建體能夠引發對抗自體細胞因子(即，IL-Ιβ和TNF-a)的免疫應答。如上所述，用于產生對抗自體蛋白(也稱為自身蛋白)的疫苗的技術通常是已知的，從20世紀80年代中期開始，例如，通過自體蛋白與大的外源和免疫載體蛋白結合(US4,161，519)，或通過在自體蛋白和外源載體蛋白之間制備融合構建體(W086/07383)，乃至通過在自體蛋白中取代少至一個單個的外源T-輔助子表位(W095/05849)。在這些情況下，免疫原性的構建體的非自體部分負責提供用于T-輔助淋巴細胞的表位，這使得可能的自體耐受性得到破壞。注意關于本發明的IL-Ιβ和/或TNF-α的衍生物意思是比起始細胞因子更小或更大但仍然含有一個或多個該起始細胞因子同源部分的分子，這樣的一個或多個部分構成這些細胞因子的抗原決定簇。這樣的部分可以小至一個單個的表位。使用少至一個單個的表位具有非常獨特的優勢，實際上可以引發單克隆抗體來對抗自體IL-Iβ和TNF-α。這降低乃至完全防止了與其他細胞因子交叉反應的風險。這種原理同樣是公知的，并且例如在W02005/084198、W003/084979和EP218531中有描述，其明確地公開了細胞因子的免疫原性肽(即，能夠誘導免疫應答的肽)。注意在疫苗中，可以同時使用兩種細胞因子的衍生物，但也可以一種細胞因子使用其天然形式，而另一種是其天然形式的衍生物。申請人:令人驚訝地發現了通過給予根據本發明的疫苗，可以成功地治療骨關節炎。特別地，已經發現了在發生OA之前給動物接種疫苗時，當動物真正產生OA時顯現出較少的臨床病征。疾病的臨床病征得到抑制，且沒有任何嚴重的慢性副作用。鑒于這些積極結果，毫無疑問與預期的相反，適量引發的IL-Iβ和適用的TNF-α抗體達到OA關節。已知細胞因子拮抗劑當存在于OA關節中時可抑制OA進展(參見上述的Pelletier，Fernandes和Warner-LambertCompany)，用根據本發明的疫苗治療的動物較少受到OA進展的影響。因為OA是一種漸進性的變性疾病，可以理解在開始發生OA后用根據本發明的疫苗治療動物可以獲得相應的結果。不希望受到理論的束縛，可以通過假設用根據本發明的疫苗接種沒有導致動物體內自體細胞因子IL-Iβ和TNF-α的功能完全阻斷但導致了關節中這些細胞因子的濃度降低到正常水平來解釋出乎意料的不存在嚴重的慢性副作用。注意到Goldring(ClinicalOrthopaedicsandRelatedResearch(臨床整形外科及相關研究)，No427S，ppS27-S36)提及提出了促炎細胞因子，如IL-I和TNF-α，引起軟骨細胞功能的調節異常，其可導致軟骨基質的漸進性變性和關節功能的喪失。然而，他還指出ClementsMffi白勺ff胃(Arthritis&Rheumatism，Vol.48,No.12,pp3452-3463,2003)表明了IL-Ιβ或IL-Ιβ轉化酶的基因刪除甚至加速了膝蓋骨關節炎的發展！因此，現有技術關于這些細胞因子在OA中的作用是模糊不清的。甚至連它們是否明確地刺激或抑制OA都是未知的。例如，通過最近描述了為確定細胞因子在OA發展中的作用的研究項目的論文可以了角軍該情況(Baggio,VeterinaryImmunologyandImmunopathology(獸醫免疫學和免疫病理學)107(2005)27-39)。該論文明確地提及報道了IL-I和TNF兩者都能促進0A，但仍然不清楚這些細胞因子的消除是否適于治療OA。Wildbaum(Immunity，Vol.19，679-688，2003年11月)甚至報道了中和TNF-α抑制了炎性疾病類風濕性關節炎，但沒有抑制骨關節炎。因此，本領域技術人員在探尋用于OA的治療時尚未明確IL-Iβ和任選的TNF-α抑制。此外，從現有技術中能明確地知道在使用可能幫助對抗OA的細胞因子拮抗劑的原位治療的情況下，全身性方法是不成功的(參見ΕΡ1715891；實施例3)。這與由于血液-關節屏障而使得關節相當難以研究的一般了解相一致(Bas等，BritishJournalofRheumatology,1996；35(6):548_552禾口Kushner等，ArthristisRheum，1971；14(5)560-570)。還注意到許多涉及急性炎性疾病治療的參考文獻是已知的，其中已經表明了可以通過使用含有IL-I和/或TNF-α的疫苗來引發對抗自體IL_1和/或TNF-α的免疫應答，以治療這些疾病。這樣的參考文獻的典型是W02007/039552，屬于CytosBiotechnologyAG，瑞士。在炎癥中，與OA這樣的疾病相反，細胞因子的作用非常明確下調提供緩解并因此對于治療是有效的。在所述參考文獻中，沒有公開實例形式的證明，通常建議乃至聲稱相同的治療在骨關節炎中也是有效的，因為已知IL-Iβ和TNF-α可能在該疾病中起作用。然而，如以上所解釋的，OA是一種非炎性疾病，并且因此完全不同于炎性疾病。細胞因子如IL-Iβ和/或TNF-α的作用尚不清楚，甚至看起來也不明確。因此，對于骨關節炎領域的技術人員而言，即使對于通過使用免疫原性IL-Iβ和/或TNF-α來成功治療OA的合理機會的預期，這樣的參考文獻也沒有提供合理的基礎，更別說是預期全身給予的免疫原性IL-Iβ和任選的免疫原性TNF-α提供適當的OA治療。簡而言之，為什么本領域技術人員基于可獲得的關于骨關節炎的知識仍然無法生產對抗IL-Iβ和任選的TNF-α的疫苗來治療0A，存在兩個重要的原因首先，現有技術沒有明確地教導細胞因子特別是IL-Iβ和TNF-α在OA中有什么作用，其次，即使基于相同拮抗劑的原位治療證明了是成功的，但已經證明了使用細胞因子拮抗劑來調節關節自身中細胞因子的作用的全身方法是不成功的。因此，本領域技術人員基于目前可獲得的知識，仍然沒法產生對抗自體細胞因子IL-Iβ和/或TNF-α的疫苗來治療0Α，更何況因為這意味著將存在對抗這些細胞因子的全身攻擊，這是非常不利的。例如，已知白細胞介素-ι涉及對抗微生物感染的免疫應答，能提高骨髓細胞的數量，在(口腔)傷口愈合中起重要作用，具有抗糖尿病的作用，甚至能調節懷孕后期過程中的細胞事件。因此，通常認為該細胞因子的阻斷是不利的。在一個實施方案中，IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物對于治療的脊椎動物是同源的。在這個意義上的同源意指源自相同的物種，與以上定義的異源相對。與預期的相反，已經發現了源自相同物種的抗原細胞因子在治療的脊椎動物中誘導較高的抗體滴度。在另一個實施方案中，對于脊椎動物非自體的部分含有源自微生物的抗原決定簇。在這個意義上的微生物意思是顯微鏡可見的或亞顯微大小的生物體，特別是屬于細菌、酵母、霉菌、原生動物、藻類、立克次氏體、微生物或病毒。顯而易見的是通過包括這樣的抗原決定簇，即，提供免疫活性區域的表位，該免疫活性區域結合淋巴細胞上的抗原特異性膜受體或結合分泌的抗體，可以提供對抗脊椎動物自體細胞因子的高抗體滴度。在另一個實施方案中，對于脊椎動物非自體的部分包含佐劑。如上所述的，佐劑原則上可以是任何非特異性的免疫刺激劑。可以通過任何化學或物理鍵，或以任何其他方式，將佐劑部分與IL-Ιβ和TNF-a細胞因子或其衍生物結合，只要該佐劑部分與IL_1β和TNF-α細胞因子或其衍生物可操作地連接，即，只要該佐劑部分能夠刺激對抗這些IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物，并因此也對抗脊椎動物自體IL-Iβ和TNF-α的相應抗原決定簇的免疫應答。通常，可以根據它們誘導的免疫事件來將佐劑歸類。第一類，其中包含ISC0M(免疫刺激復合物)、皂角苷(或其級分和衍生物，如QuilA)、氫氧化鋁、脂質體、cochleates、聚乳酸/乙醇酸，促進抗原攝取、轉運和APC(抗原呈遞細胞)呈遞。第二類，其中含有油乳液、凝膠、聚合物微球體、非離子嵌段聚合物和最可能還有氫氧化鋁，提供儲存作用。第三類，其中包含富含CpG的基序、單磷酰基脂質A、分枝桿菌(胞壁酰二肽)、酵母提取物、霍亂毒素，是基于保守微生物結構，即所謂病原體相關微生物模式(PAMP)，被定義為信號0的識別。第四類，其中包含油乳液表面活性劑、氫氧化鋁、缺氧，是基于刺激免疫系統分辨危險和無害的能力(其不需要與自體和非自體相同)。第五類，其中包含細胞因子，是基于APC上共刺激分子，即信號2的上調。佐劑幫助提供適當的免疫應答。因此，細胞因子或其衍生物的非自體部分已經能夠破壞自體耐受性不太重要。因此，佐劑在抗原的選擇中提供更多的自由。特別地，使用來自第1類的佐劑，例如以皂角苷、其級分和水包油型乳液(例如，脂質體)舉例說明，已經獲得了良好的結果。在再一個實施方案中，當與脊椎動物的自體IL-Iβ和TNF-a細胞因子相比時，IL-Iβ和TNF-a細胞因子或其衍生物具有降低的生物活性。降低的生物活性，即，該試劑對活的動物或對其組織降低的作用，可降低給予疫苗時急性副作用的風險。當細胞因子的生物活性沒有降低時，可能發生如嘔吐、休克、絞痛等急性副作用。可以通過各種細胞因子滅活方法，如與用于將細菌毒素轉化成類毒素相似的化學甲醛處理，可以獲得生物活性的降低。這樣的方法是疫苗
技術領域：
中公知的。在可替換的方法中，可以制得具有降低生物活性的突變細胞因子。這也是本領域公知的。注意到具有降低生物活性的細胞因子也稱為生物無活性的(盡管可能留下實質性的生物活性)。本發明還涉及IL-Iβ和任選的TNF-α細胞因子來生產用于治療脊椎動物骨關節炎的疫苗的用途和治療自身。可以通過疫苗
技術領域：
中所用的任何常規途徑來給予疫苗，特別是通過肌內途徑、皮下、皮內或粘膜下途徑或通過靜脈內途徑，例如，以可注射懸浮液的形式。可以作為單次劑量或作為在一定的時間間隔后重復一次或多次的劑量來進行給藥。合適的劑量可以尤其作為所治療個體體重的函數而改變。將通過參照以下實施例來更詳細地解釋本發明。1.材料和方法Α.誘導狗體內對抗自體IL-Iβ和TNF-α的抗體。重組犬(Ca)和馬(Ea)蛋白。使用各自從狗或馬血提取的外周血淋巴細胞(PBL)分離的RNA，使用標準分子生物學技術來克隆CaIL-Iβ、CaTNF-α、EqIL-Iβ和EqTNF-α。將Ca分子的3’端在遺傳上與來自犬瘟熱病毒融合蛋白(CDV-F)的最小(17aa)T-細胞表位融合(Ghosh等，(2001)Immunologyl04pp.58-66)。最后，將編碼IL-1β和TNF-α的CDNA片段連接至pET-載體中，使得5’端與His-標記物一起在框內(用于純化目的)。馬IL-Ιβ和TNF-α沒有⑶V-標記。所有蛋白通過大腸桿菌表達，His-標記物純化并檢測LPS含量。用作抗原的蛋白都具有LPS含量<20U/ml。SEQID1表示最小的⑶V-F標記的CaIL-Iβ的DNA。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示⑶VF-表位(17個氨基酸+終止密碼子)。SEQID2表示最小的⑶V-F標記的CaIL-Iβ蛋白自身。SEQID3表示最小的⑶V-F標記的CaTNF-α的DNA。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸535-588表示CDVF-表位(17個氨基酸+終止密碼子)。SEQID4表示最小的⑶V-F標記的CaTNF-α蛋白自身。SEQID5表示馬IL-Iβ的DNA。核苷酸1-63表示His-標記物。SEQID6表示馬IL-Iβ蛋白自身。SEQID7表示馬TNF-α的DNA。核苷酸1-63表示His-標記物。SEQID8表示馬TNF-α蛋白自身。接著上段中所提到的這些野生型分子，使用定點誘變產生了一系列生物無活性突變(mt)分子，以避免可能的全身性不良反應(注在本發明說明書中，生物活性的、野生型分子稱為或表示為t”；生物無活性的或生物“低”活性的突變分子稱為或表示為“mt”；沒有指出或表示時，意思是野生型形式)。將這些突變體在3’-末端在遺傳上與來自犬瘟熱病毒融合蛋白(CDV-F)的最小(17aa)或最大(32aa)的T-細胞表位融合(Ghosh等，(2001)Immunology104pp.58-66)，并且在5，-末端(在His-標記物之后)與來自犬細小病毒(CPV)的最大(35aa)T_細胞表位融合(Rimmelzwaan等，(1990)，J.Gen.Virology71pp.2321-2329)。基于可獲得的關于人IL-Iβ和TNF-α的科學文獻來選擇突變位點對于IL-Iβ點突變=Simon等(1993)J.Biol.Chem.268pp.9771-9779和Evans等(1995)J.Biol.Chem.270pp.11477-11483，對于TNF-點突變=Zhang等(1992)J.Biol.Chem.267pp.24069-24075。一種TNF-突變體(突變體No12，參見下文)是特定的點突變結合自發突變的衍生物。所有蛋白通過大腸桿菌表達，His-標記物純化并檢測LPS含量。用作抗原的測試蛋白都具有LPS含量<20U/ml。制得了十八個生物無活性突變體。以下列出了編碼這些突變體的DNA。突變體No1由最小的CDV-F標記的H30GCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。該DNA的核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸163C>G和164A>G表示H30G突變。突變體No2由最小的CDV-F標記的K92GCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-72表示His-標記物，核苷酸529-582表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸346A>G和347A>G表示K92G突變。突變體No3由最小的CDV-F標記的H30G加K92GCaIL-Iβ雙突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸163C>G和164A>G表示H30G突變，核苷酸349A>G和350A>G表示K92G突變。突變體No4由最小的⑶V-F標記的C7SCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸98G>C表示C7S突變。突變體No5由最小的⑶V-F標記的K8ECaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸100A>G和102G>A表示K8E突變。突變體No6由最小的⑶V-F標記的L9SCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸104T>C表示L9S突變。突變體No7由最小的⑶V-F標記的C7S加K8E加L9SCaIL-Iβ三重突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸532-585表示最小的CDV-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸98G>C表示C7S突變，核苷酸100A>G和102G>A表示K8E突變，核苷酸104T>C表示L9S突變。突變體No8由最大的CPV和⑶V-F標記的C7SCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸194G>C表示C7S突變。突變體No9由最大的CPV和⑶V-F標記的K8ECaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸196A>G和198G>A表示K8E突變。突變體No10由最大的CPV和CDV-F標記的L9SCaIL-Iβ突變體的DNA編碼。核苷酸1-75表示His-標記物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸200T>C表示L9S突變。突變體No11由最大的CPV和CDV-F標記的C7S加K8E加L9SCaIL_lβ三重突變體的DNA編碼。核苷酸1-76表示His-標記物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸194G>C表示C7S突變，核苷酸196A>G和198G>A表示K8E突變，核苷酸200T>C表示L9S突變。突變體No12由最大的CPV和CDV-F標記的K8D加L9S加QlOdelCaIL-Iβ三重突變體的DNA編碼。核苷酸1-76表示His-標記物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸625-723表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸196A>G和198G>T表示K8D突變，核苷酸200T>C表示L9S突變，與野生型序列相比，刪除了氨基酸IO(QlOdel)。突變體No13由最小的CDV-F標記的Y87SCaTNF-α突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸323A>C表示Y87S突變。突變體No14由最小的CDV-F標記的Y119NCaTNF-α突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸418T>A表示Y119N突變。突變體No15由最小的CDV-F標記的Y87S加Y119NCaTNF-α突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17個氨基酸+終止子密碼)，核苷酸323A>C表示Y87S突變，核苷酸418T>A表示Y119N突變。突變體No16由最大的CPV和⑶V-F標記的Y87SCaTNF-α突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32個氨基酸)，核苷酸631-729表示最大的CDV-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸419A>C表示Y87S突變。突變體No17由最大的CPV和CDV-F標記的Y119NCaTNF-突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32個氨基酸)，核苷酸631-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸514T>A表示Y119N突變。突變體No18由最大的CPV和CDV-F標記的Y87S加Y119NCaTNF-α雙突變體的DNA編碼。核苷酸1-63表示His-標記物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32個氨基酸)，核苷酸631-726表示最大的⑶V-F表位(32個氨基酸+終止密碼子)，核苷酸419A>C表示Y87S突變，核苷酸514T>A表示Y119N突變。疫苗佐劑。所用的佐劑是QuilA(0.OlM磷酸鹽緩沖鹽水中250g/ml，縮寫為PBS，也稱為“鹽水，，)、MatrixC(0.OlMPBS中125μg/ml)和Microsol(25%水包油型乳液)。QuilA是從南美的皂樹(薔薇科)樹皮分離的公知的皂角苷佐劑。其可以獲自BiolangJalveHave，丹麥或Roth，Karlsruhe，德國。MatrixC(免疫刺激復合物或ISC0M)是含有皂角苷、膽固醇和磷脂(磷脂酰膽堿)的疫苗佐劑，其形成通常直徑為40nm的籠狀結構。其可以獲自CSL，墨爾本，澳大利亞或Isconova,Uppsala，瑞典。Microsol是水包油型乳液，其由水中小的(通常小于1μm)礦物油液滴(ExxonMobil的Marcol52)組成，通過使用吐溫80去污劑(聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯)，獲自AcrosOrganics0實驗設計。對于生物活性(wt)細胞因子“唯一的”實驗，設計如下。用1.Oml如表1中所示的制劑在右側將五組大約4個月大的常規小獵犬s.c.接種疫苗。表1.狗實驗性接種疫苗的建立<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在第一次接種疫苗后4、8、20和24周時，狗接受了1.0ml(s.c.，在右側)的加強劑接種。在第一次接種疫苗后1=0、3、6、9、12、16、20、24、28、32和36周時采取血樣。使用血清來(1)測定對抗CaIL-10和CaTNF-a的抗體水平，使用抗原特異性ELISA；(2)用于蛋白質印跡分析；和(3)檢測中和抗體。對于混合的生物活性(wt)/生物無活性(mt)細胞因子實驗，設計如下。用1.0ml如表1A中所示的制劑在右側將六組15-18周大的常規小獵犬s.c.接種疫苗。在該實驗中，作為單種蛋白抗原或結合測試了1種突變CaIL-10蛋白(突變體No4:最小的CDV-F標記的C7SCaIL-l3突變體)和1種突變的CaTNF-a蛋白(突變體No.13最小的CDV-F標記的Y87SCaTNF-a突變體)。表1A.狗實驗性接種疫苗的建立<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在第一次接種疫苗后4、8、11、14和16周時，狗接受了1.0ml(S.c.，在右側)的加強劑接種。在第一次接種疫苗后1=0、4、8、11、14、16和17周時采取血樣。使用血清來測定對抗CaIL-10和CaTNF-a的抗體水平，使用抗原特異性ELISA(夾層-捕捉方法)。ELISA和蛋白質印跡分析。使用標準程序進行ELISA分析。為此，使用捕捉多克隆山羊-抗-犬IL-10和捕捉單克隆鼠-抗-犬TNF-a抗體來覆蓋96-孔微滴定平板。然后將C_末端His(C_His)-標記的CaIL-10或0見8-標記的0^順-0加入平板中，隨后接著連續稀釋狗血清。使用多克隆兔子-抗-犬IgG(H+L)HRP-標記的抗體檢測抗IL-10或抗-TNF-a特異性抗體的結合。IL-1P和TNF-a牛物測定的抑制。使用IL-10和TNF-a反應性的NIH-3T3NFkB螢光素酶報道細胞系來測量抑制。用lOng/mlCa和EqIL-10和TNF_a蛋白預先培養來自幾個時間點的合并的血清并測試中和活性，即，抑制受體結合的活性。以相對光單位(RLU)來定量抗體對IL-10和TNF-a的抑制作用。B.小獵犬中尿酸鹽晶體i秀發的OA1草型的歲立實驗設計。我們使用了尿酸鹽晶體誘發的骨關節炎模型(其中參見Bormeau等；RevueMed.Vet.，2005，156，4，179-181)。將兩組4只常規的小獵犬(大約5個月大)進行關節內注射，1個膝關節(后腿)注入1.0ml0.9%NaCl(對照組)或1.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體(OA模型組)。在全身麻醉下進行1.0ml溶液的關節內注射。在注射后T=0、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、30小時、48小時、72小時和96小時時，對于每只單獨的狗，進行一般行為、跛足(在站立和行走時評分)、觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)的評分。在實驗結束時，將狗安樂死并由病理學家肉眼檢查膝蓋。尿酸鹽晶體。將0.9%NaCl溶液中的10mg/ml尿酸鹽晶體(Sigma產品號U2875；批號120K5305)用于關節內注射。為此，在0.9%NaCl中制得了22g具有50mg/g濃度的尿酸鹽晶體溶液。將該溶液進行超聲處理直至獲得具有顆粒<50ym懸浮液(顯微鏡檢查)。顯微鏡圖像證實了顆粒具有彡50um的大小后，用0.9%NaCl將20g懸浮液稀釋至100g(終濃度10mg/ml)。將pH調節至pH7.0并將懸浮液高壓滅菌。就在高壓滅菌之前和之后，也檢查了懸浮液顯微鏡圖像的晶體大小(應當<50i!m)。制得后，將懸浮液存儲在2-8°C直至進一步的使用。鑒定。將狗單獨地在耳朵上編號(紋身)。圈養。將狗在天然的非限制環境下單獨地圈養在常規的狗窩中，具有戶外運動的可能性并且隨意飲水。碎屑是有限程度地獲得。表2.分組和定量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>0.9%NaCl的灃射。在全身麻醉下，給4只來自組1(對照組)的動物進行關節內注射，將1.0ml0.9%NaCl注入1個膝關節中(剃過毛的左后腿)。尿酸鹽晶體的灃射。在全身麻醉下，給4只來自組2(OA模型組)的動物進行關節內注射，將1.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體注入1個膝關節中(剃過毛的左后腿)。實驗方法和參數。觀察。在注射后T=0、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、30小時、48小時、72小時和96小時時，對于每只單獨的狗，進行一般行為、跛足(在站立和行走時評分)、觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)的評分。首先對籠子中的狗進行觀察和評分，隨后在觀察臺上對行走過程中并最終在站立時的狗進行觀察和評分。跛足評分站立評分0正常站立，全重量支撐。1異常位置，部分重量支撐。2異常位置，沒有重量支撐(3條腿3不愿意站起來。行走評分0正常行走，全重量支撐。1略有跛足，部分重量支撐。2明顯跛足，間歇的部分重量支撐。3沒有重量支撐(3條腿的狗)。4不愿意行走。小、跑步評分0正常小跑，全重量支撐。1略有跛足，部分重量支撐。2明顯跛足，間歇的部分重量支撐。3沒有重量支撐(3條腿的狗)。4不愿意小跑。觸診時疼痛的評分0沒有疼痛的表現。1輕度至中度疼痛(允許觸診但轉頭或甩開，發出聲音，消沉)。2嚴重疼痛(不允許檢查者觸診關節)。與未灃射的關節相比，膝關節積液(腫脹)的評分0無關節積液(明顯的髕韌帶可觸知)。1輕度積液(最小的滑膜填充，可感知到韌帶)。2中度積液(明顯的滑膜填充，模糊的韌帶)。3嚴重積液(韌帶不可觸知)。C.設得S群島種馬中尿酸鹽晶體i秀發的OA1草型的歲立實驗設計。我們在矮種馬中使用了相同的骨關節炎模型。將兩組2匹常規的設得蘭群島矮種馬(大約12個月大)進行關節內注射，1個膝關節(右后腿)注入5.0ml0.9%NaCl(對照組)或5.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體(OA模型組)。在光鎮靜下進行5.0ml溶液的關節內注射。在注射后T=0、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、30小時、48小時、72小時和96小時時，對于每只單獨的矮種馬，進行一般行為、跛足(在站立和行走時評分)、觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)的評分。在實驗結束時，將矮種馬安樂死并由病理學家肉眼檢查膝蓋。尿酸鹽晶體。參見B部分。鑒定。通過植入的芯片和編號的頸圈來鑒定設得蘭群島矮種馬。圈養。在天然的非限制環境下，將矮種馬單獨圈養在常規的穩定箱中，隨意食用干草和飲水，碎屑是有限程度地獲得。表3.分組和定量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0.9%NaCl的灃射。在光鎮靜下，給2匹來自組1(對照組)的動物進行關節內注射，將5.0ml0.9%NaCl注入1個膝關節中(剃過毛的右后腿)。尿酸鹽晶體的灃射。在光鎮靜下，給2匹來自組2(OA模型組)的動物進行關節內注射，將5.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體注入1個膝關節中(剃過毛的右后腿)。實驗方法和參數。觀察。在注射后T=0、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、30小時、48小時、72小時和96小時時，對于每匹單獨的矮種馬，進行一般行為、跛足(在站立和行走時評分)、觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)的評分。對穩定箱中的矮種馬進行觀察和評分，隨后在走廊對行走過程中的矮種馬進行觀察和評分。跛足評分站立評分0正常站立，全重量支撐。1異常位置，部分重量支撐。2異常位置，沒有重量支撐(3條腿的矮種馬)。3:不愿意站起來。行走評分0:正常行走，全重量支撐。1略有跛足，部分重量支撐。2明顯跛足，間歇的部分重量支撐。3沒有重量支撐(3條腿的矮種馬)。4:不愿意行走。觸診時疼痛的評分0:沒有疼痛的表現。1輕度至中度疼痛(允許觸診但轉頭或甩開，發出聲音，消沉)。2嚴重疼痛(不允許檢查者觸診關節)。與未灃射的關節相比，膝關節積丨夜(腫脹)的i平分0無關節積液(明顯的髕韌帶可觸知)。1輕度積液(最小的滑膜填充，可感知到韌帶)。2中度積液(明顯的滑膜填充，模糊的韌帶)。3嚴重積液(韌帶不可觸知)。P.預防性接種對抗IL-Iβ和TNF-α疫苗的小獵犬中OA癥狀的防止實驗件疫苗接種設計。在研究A中，對于“wt-唯一”實驗，每組接種疫苗后T=0、T=4、T=8、T=20和T=24周時，給狗接種用幾種不同的免疫增強劑配制的IL-Iβ和TNF-α(參見表1)。對于該研究，這些狗在最后一次接種疫苗后24周時再接種兩次，即，第一次接種1.Oml(s.c.右側)如表4中所示的疫苗制劑后T=48和T=54周時。在第一次接種疫苗后T=48,T=54和T=58周時采取用于血清學的血樣。將血清用于測定對抗IL-Iβ和TNF-α的抗體水平，使用抗原特異性ELISA和標準程序。表4.狗實驗性接種疫苗的建立，表1的繼續<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>對于混合的wt/mt實驗，使用了表IA中所示的實驗性疫苗接種。OA的誘發。對于wt-唯一實驗，最后一次采取血樣后一(1)周(T=59周)，將組1的狗(PBS對照組)分成2個新的組(N=2和N=4)。在該時間點，來自5組的所有狗都約為18個月大，通過關節內注射給1個膝關節(后腿)注入1.0ml0.9%妝(1(對照組1)或1.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體(OA模型組2_5)。在全身麻醉下進行1.Oml溶液的關節內注射。在注射后T=1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、32小時、48小時、72小時和96小時時，對于每只單獨的狗，進行一般行為、跛足(在站立和行走時評分)、觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)的評分。在實驗結束時，將狗安樂死并由病理學家肉眼檢查膝蓋。表5.接種疫苗的狗體內OA誘發的建立。組INI測試物質動物號~I<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>統計學分析。使用具有最小顯著性差異(L.S.D.)的方差分析(ANOVA)作為多重比較試驗進行了平均分值的比較。使用SASEnterpriseGuide2(SASInstituteInc.,Cary,NC)軟件產生了所有結果。在95%的置信水平下認為差異是顯著的(ρ<0.05)。2.結果Α.狗體內對抗自體IL-Iβ和TNF-α的抗體的誘導由疫苗接種(wt-唯一實驗)引起的副作用。初次接種(首次)后，接受了QuilA中Eq蛋白的狗的局部(皮膚)反應是明顯的。在隨后的加強接種中，我們因此在該接種組中用PBS替代了QuilA(請參閱表1)。就在第一次加強接種后不久，組2(QuilA中的Ca蛋白)、3(Matrix-C中的Ca蛋白)和4(Micr0S0l中的Ca蛋白)的大部分狗都生病了，可能是由于疫苗制劑中高濃度(游離)生物活性TNF-a的存在。通過將用于Ca和Eq蛋白的TNF-α量從50μg/劑/狗降至5μg/劑/狗，在隨后的加強接種中防止了這些急性全身性副作用。由梓種瘡苗(、混合的Wt/mt引fe的副作用。初次接種(首次)后，大部分接受了Microsol佐劑的狗(組3_6)的局部(皮膚)反應是明顯的。第一次和隨后的(加強)接種后，局部反應不太明顯。在所用的CaIL-Iβ和CaTNF-α蛋白濃度下，沒有觀察到急性全身性副作用。對抗IL-Iβ和TNF-α的抗體滴度(wt_唯一實驗)。如圖IA-D中所示，可以產生明顯的對抗自體分子CaIL-Iβ和CaTNF-α的ELISA抗體滴度。從這些圖中可以清楚抗體是交叉反應性的，即，產生了對抗識別Eq蛋白的Ca蛋白的抗體，并且反之亦然。值得注意的是所產生的對抗CaTNF-α的抗體以高于CaTNF-α蛋白的滴度識別EqTNF-α(可能是由于親和性/特異性引起的)，特別是在早期的時間點(圖IC和1D)。通常，與相應的Eq對應物相比較時，接種Ca蛋白的狗體內產生較高的整體抗體滴度。首次接種疫苗后十二周時，由于圈養限制，從實驗中除去了組1和3。總的說來，可以推斷出通過使用遺傳修飾的犬自體分子或異源馬蛋白，可以破壞對自體的免疫耐受性并誘導高抗體滴度。注意到使用突變的細胞因子，獲得了相當的結果。蛋白質印跡分析。為了證實抗-IL-Iβ和抗-TNF-α抗體的特異性，使用⑶V-標記的和未標記的蛋白進行了蛋白質印跡分析。用來自首次接種后T=9周時的血清培養蛋白質印跡。如圖2中所示的，所有抗體與Ca和EqIL-Iβ和TNF-α蛋白交叉反應。將不相關的His-標記物純化的大腸桿菌表達的蛋白，雞IL-18(ChIL-18)，用作對照并且沒有被抗體識別。抗-IL-Iβ和抗-TNF-α抗體的中和能力。盡管在狗體內誘導了對抗IL-Iβ和TNF-α的高抗體滴度，但不清楚這些抗體是否能夠中和相應蛋白的生物活性。為此，我們使用了IL-Iβ和TNF-α反應性NIH-3T3NFκB螢光素酶報道細胞系。用來自幾個時間點的合并的血清預先培養Ca和EqIL-Iβ和TNF-α并測試中和活性，即，抑制受體結合的活性。從圖3Α和3Β中所示的結果看，可以推斷出來自首次接種后24周的合并的血清含有最高的抗-CaIL-Iβ和抗-EqIL-Iβ中和抗體。與其他血清相比較時，以相對光單位(RLU)測量的CaIL-Iβ和EqIL-Iβ的生物活性明顯降低。盡管沒有那么明顯，但對于CaTNF-α和EqTNF-α的生物活性的抑制也是這種情況(圖3C和3D)。來自首次接種后6周和9加12周的合并的血清含有少量的中和IL-Iβ抗體，但含有顯著量的中和TNF-α抗體。結論最后，我們提供了明顯的證據我們可以通過活性免疫來產生對抗最小的⑶V-標記的野生型和突變的CaIL-Iβ和CaTNF-α自體分子的抗體。B.小獵犬中尿酸鹽晶彳本i秀發的OAlt型的歲立。流體灃入膝關節中。通常，將1.Oml0.9%NaCl或1.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體注入膝關節中，而沒有任何嚴重的副作用。臨床評估跛足的評分。注射了尿酸鹽晶體的動物在注射后的2小時內，在行走和站立時都顯示出明顯的跛足(參見圖4)。兩只狗在24內完全恢復了，而另外2只狗遭受了尿酸鹽晶體的影響，直至實驗結束。安樂死狗的膝關節的目測結果揭示了這2只狗具有膝蓋骨異位(解剖關節異常)。這種膝蓋骨異位結合尿酸鹽晶體的注射最可能導致上述延長時間段的不適。在注射了0.9%NaCl溶液的狗的組中，只有1只狗受到了注射很短時間的影響(在T=8小時時是明顯的)。在這只狗的膝關節目測時，清楚了該動物也具有膝蓋骨異位。臨床評估觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)。還監控了觸診時的疼痛和膝關節積液。如圖5中可看到的，SEM(均值標準誤差)大，表示在個體狗之間存在著一定的差異。在注射尿酸鹽晶體后2至8小時之間，觸診時的疼痛是可測量的，最大值在4至6小時之間。與觸診時的疼痛相比，膝關節積液有些延遲，開始于注射后4小時，最大在8小時時。臨床評估膝蓋病理學。在實驗結束時，將所有狗安樂死并肉眼觀察膝蓋。在所有狗中，沒有發現注射溶液的痕跡。只有1只狗中的注射部位仍然是明顯的。在3只狗的膝蓋中，可見到大量流體。這證明了這3只狗具有膝蓋骨異位。結論狗中所用的通過將含有尿酸鹽晶體的溶液通過關節內注入ι個膝關節中(后腿)的關節炎模型是快速的(2小時內，可看到效果)、短期的(幾小時至1-2天)和可逆的。監控進展的相關參數包括行走和站立時的跛足評分、觸診時的疼痛和關節積液。在該模型中，體溫和關節溫度不是相關的參數。C.設傳蘭群島M種馬Φ尿II^H秀發的OAIt型的建立。流體注入膝關節中。通常，將5.Oml0.9%NaCl或5.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸鹽晶體注入膝關節中，而沒有任何嚴重的副作用。臨床評估跛足的評分。注射了尿酸鹽晶體的動物在注射后的2小時內，在行走和站立時都顯示出明顯的跛足(參見圖6)。在注射后6至8小時之間評分為最大的不適。2匹對照的矮種馬未顯示出跛足的體征。臨床評估觸診時的疼痛和膝關節積液(腫脹)。還監控了觸診時的疼痛和膝關節積液。如圖7A中可看到的，在注射后2小時內對疼痛進行評分，而在之后的階段(>48小時)才檢測到膝關節積液(圖7B)。由于在72至96小時之間，膝關節積液沒有增加，這可能表示了在96小時時腫脹達到最大值。臨床評估膝蓋病理學。在實驗結束時，將所有矮種馬安樂死并肉眼觀察膝蓋。在所有矮種馬中，沒有發現注射溶液的痕跡。注射了尿酸鹽的矮種馬的膝關節的肉眼觀察顯示了增加量的黃色滑液，滑膜增厚，伴有水腫和出血。對照未顯示出病狀。Mrk和我們在狗中所示的一樣，在評價跛足和疼痛時，矮種馬中所用的通過將含有尿酸鹽晶體的溶液通過關節內注入1個膝關節中(右后腿)的關節炎模型是快速的(2小時內，可看到效果)、短期的(幾小時至1-2天)和可逆的。膝關節積液(腫脹)在注射后48小時開始是可觸知的，并且似乎在72和96小時之間達到了最大值。_3]P.予頁防t牛梓種對杭IL-I3^PTNF-α瘡苗的小獵犬中OA癥狀的防I卜_4]再次梓種后對杭IL-Iβ和TNF-α的杭體滴度。如圖8A-D(wt_唯一實驗)中所示，在接種后T=48周(即，最后一次加強接種后24周)的整體抗體滴度，維持在相當高的水平。狗的再次接種導致了在所有測試的抗原和所有組中抗體滴度的適度提高。臨床評估不適評分。在圖9(wt-唯一實驗)中，描繪了對“站立”(圖9B)、“行走”(圖9C)、“觸診時的疼痛”(圖9D)、“膝關節積液(腫脹)”(圖9E)的不適評分和“總臨床評分”，這是所測量的所有不適評分的平均值(圖9A)。從所有圖中清楚的是未接種疫苗的狗在注射后2小時內顯示出明顯的不適。接種疫苗的狗在幾個情況下明顯地顯示出降低的或中度至輕度的不適。如在圖中可看到的，接種疫苗的狗與未接種疫苗的狗相比時，不適評分明顯較低，并顯示出延遲。臨床評估膝蓋病理學。在實驗結束時，將所有狗安樂死并由病理學家肉眼檢查膝蓋。總的來說，除了NaCl對照狗，在所有狗中，滑膜顯示出增厚和微紅。然后，在所有膝蓋中，檢測到少量滑液。臨床評估不適評分。在圖10(混合的wt/mt實驗)中，描繪了在關節內尿酸鹽注射后6小時和8小時時間點的“站立”(圖10A)和“行走”(圖10B)的不適評分。從兩張圖清楚的是未接種疫苗的狗(尿酸鹽對照組)在注射后6小時和8小時時顯示出明顯的不適。接種疫苗的狗，在一些情況下，明顯地顯示出降低的或中度至輕度的不適。如在圖10中可看到的，接種疫苗的狗與未接種疫苗的狗(尿酸鹽對照組)相比，不適評分明顯較低。還清楚的是，特別是在注射后8小時時，只接種野生型CaIL-Iβ或只接種突變的CaIL-Iβ與未接種的尿酸鹽對照狗相比時減輕了不適。Mrk從該實驗獲得的結果，我們可以推斷出基于使用野生型或突變的細胞因子可以誘導對抗自體分子IL-Iβ和TNF-α的抗體，并且這些只針對IL-Iβ或者還針對TNF-α的抗體能夠抑制關節炎癥狀。還可以推斷出使用同時針對IL-Iβ和TNF-α的疫苗似乎獲得了最佳結果。Ε.各種形式注意到使用生物活性IL-Iβ和TNF-α，我們看到了急性副作用。可以通過使用這些細胞因子的生物無活性形式來防止這些副作用，例如從美國專利6，093，405所知的。可以選擇部分失活的細胞因子來獲得免疫原性和生物活性之間的平衡。我們使用了尿酸鹽晶體模型用于誘發OA。注意到其他用于OA的模型是現有技術中已知的，例如，AnteriorCruciateLigamentTransection模型(ACLT,描述于Fleming等；CurrOpinOrthop.2005年10月；16(5)354-362)或Groove模型(描述于Mastbergen等；Rheumathology，2006；45(4):405-413)。已知本申請中所述實驗的積極結果，認為使用這些模型或由于自然原因患有或產生了OA的患者時也能獲得相應的結果。我們已經顯示了接種IL-Iβ和TNF-α及其衍生物的組合時OA患者緩解的明顯效果。這已經在小獵犬中得到顯示。已知在該脊椎動物中的結果和關于脊椎動物組中關節的生理過程的相似性，特別是哺乳動物脊椎動物，如狗、馬和人，本發明可以用于任何脊椎動物中，特別是哺乳動物脊椎動物。F.附圖描述圖1顯示了在接種疫苗后不同的時間點測量的IL-Ιβ和TNF-α特異性抗體應答。狗是未免疫的(鹽水對照)，用在QuilA、MatrixC或Microsol中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]蛋白免疫的(縮寫為Ca)，或用在QuilA(只有首次)/鹽水(加強)中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α]蛋白免疫的(縮寫為Eq)。在首次接種后4、8、20和24周時，狗接受了加強接種。使用抗原特異性ELISA測量抗體，其中所用的蛋白沒有CDV-標記物。[Α],對抗CaIL-Iβ測量的抗體滴度；[B].對抗EqIL-Iβ測量的抗體滴度；[C].對抗CaTNF-α測量的抗體滴度；[D]對抗EqTNF-α測量的抗體滴度。T=首次接種后的周數。圖2顯示了CDV-標記的和未標記的CaIL-Iβ、CaTNF-α以及EqIL-1β禾口EqTNF-α蛋白的蛋白質印跡分析。在首次接種疫苗后9周時，使用每個接種組的1只狗的血清通過4-12%Nu-PAGE和蛋白質印跡分析蛋白質(lyg/泳道)。[A],考馬斯染色的凝膠；[B].用對照血清培養的蛋白質印跡；[C].用接種了在QuilA佐劑中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培養的蛋白質印跡；[D].用接種了在MatrixC佐劑中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培養的蛋白質印跡；[Ε].用接種了在Microsol佐劑中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培養的蛋白質印跡；[F].用接種了在QuilA(只有首次)/鹽水(加強)佐劑中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α]的狗的血清培養的蛋白質印跡。圖3顯示了通過來自接種了疫苗的狗的血清抑制了IL-Ιβ或TNF-α誘導的NFkB激活。將10ng/ml的[A]CaIL-Iβ，[B]EqIL-Iβ，[C]CaTNF-α或[DjEqTNF-α與抗體血清稀釋液混合并用ΝΙΗ-3Τ3受體細胞培養，該血清來自接種了[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗。以相對光單位(RLU)定量了抗體對IL-Iβ或TNF-α活性的抑制作用。T=6周這是在首次接種后6周取自組2+3+4的狗的合并血清(參見表1)。T=9+12周這是在首次接種后9和12周取自組2+3+4的狗的合并血清(參見表1)。T=24周這是在首次接種后24周取自組2+4的狗的合并血清(參見表1)。圖4顯示了對小獵犬站立[Α]和行走[B]時的平均評分和平均總跛足評分[C](站立+行走)。將數據表示為幾何平均數士SEM。圖5顯示了對小獵犬觸診時疼痛的平均評分[A]和膝關節積液的平均評分[B]。將數據表示為幾何平均數士SEM。圖6顯示了對設得蘭群島矮種馬站立[A]和行走[B]時的平均評分和平均總跛足評分[C](站立+行走)。將數據表示為幾何平均數士SEM。垂直軸左側的箭頭表示所示參數的最大評分。圖7顯示了觸診時疼痛的平均評分[A]和膝關節積液的平均評分[B]。圖7[C]顯示了對設得蘭群島矮種馬的總臨床評分(站立+行走+疼痛+腫脹)。將數據表示為幾何平均數士SEM。垂直軸左側的箭頭表示所示參數的最大評分。圖8顯示了在首次接種后的幾個時間點測量的IL-Iβ和TNF-α特異性抗體應答。狗時未接種疫苗的(鹽水對照)或在首次接種后T=48和T=54周時再次接種的，再次接種了在QuilA或Microsol中配制的[CDV-標記的CaIL-Iβ+CaTNF-α]蛋白(縮寫為Ca)，或再次接種了在QuilA(只有首次)或鹽水(加強)中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α](縮寫為Eq)。在首次接種后T=48,T=54和T=58時測量抗體，使用抗原特異性ELISA，其中所用的蛋白沒有⑶V-標記物。[Α]對抗CaIL-Ιβ測量的抗體滴度；[B]對抗EqIL-Iβ測量的抗體滴度；[C]對抗CaTNF-α測量的抗體滴度；[D]對抗EqTNF-α測量的抗體滴度。★=與鹽水組明顯差異(Ρ<0.05);O=所示組之間■明顯差異(尸<0.05)。τ=首次接種后的周數。圖9顯示了對于小獵犬的平均總臨床評分。圖9[Α]給出了總臨床評分(站立+行走+觸診時的疼痛+膝關節腫脹)。圖9[Β]給出了站立時的平均評分。行走顯示于[C]中，觸診時的疼痛顯示于[D]中，膝關節積液(腫脹)顯示于[Ε]中。將數據表示為幾何平均數士SEM。★=在所示時間點與尿酸鹽晶體對照組的明顯差異(P<0.05)。O=所示組之間明顯差異(戶<0.05)。圖10顯示了對于小獵犬的平均臨床評分。[Α].站立時的平均臨床評分；[B].行走時的平均臨床評分。將數據表示為幾何平均數士SEM。★=在所示時間點與尿酸鹽晶體對照組的明顯差異(P<0.05)。權利要求用于治療脊椎動物骨關節炎的疫苗，其含有IL-1β和任選的TNF-α細胞因子或其衍生物，并且所述IL-1β和任選的TNF-α或其衍生物與對于脊椎動物而言非自體的部分結合，使得該疫苗在脊椎動物體內引發對抗所述脊椎動物的IL-1β和任選的TNF-α自體分子的免疫應答。2.根據權利要求1的疫苗，其中IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物相對于治療的脊椎動物是同源的。3.根據權利要求1或2的疫苗，其中相對于脊椎動物而言非自體的部分含有源自微生物的抗原決定簇。4.根據在前任一項權利要求的疫苗，其中相對于脊椎動物而言非自體的部分包括佐劑。5.根據在前任一項權利要求的疫苗，其特征在于IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物當與脊椎動物的自體IL-Iβ和TNF-α細胞因子相比較時具有降低的生物活性。6.IL-Iβ和任選的TNF-α細胞因子生產用于治療脊椎動物骨關節炎的疫苗的用途。7.根據權利要求6的用途，其中IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物相對于治療的脊椎動物是同源的。8.根據權利要求6或7的用途，其中IL-Ιβ和TNF-α細胞因子或其衍生物與源自微生物的抗原決定簇結合，以產生疫苗。9.根據權利要求6-8任一項的用途，其中IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物與佐劑結合，以產生疫苗。10.根據權利要求6至8任一項的用途，其特征在于IL-Iβ和TNF-α細胞因子或其衍生物當與脊椎動物的自體IL-Iβ和TNF-α細胞因子相比較時具有降低的生物活性。11.通過給予根據權利要求1至5任一項的疫苗來治療脊椎動物的骨關節炎。全文摘要本發明涉及用于治療脊椎動物骨關節炎的疫苗，其含有IL-1β和任選的TNF-α細胞因子或其衍生物，并且所述IL-1β和任選的TNF-α或其衍生物與對于脊椎動物而言非自體的部分結合，使得該疫苗在脊椎動物體內引發對抗所述脊椎動物的IL-1β和TNF-α自體分子的免疫應答。文檔編號A61K39/00GK101808656SQ200880108631公開日2010年8月18日申請日期2008年9月24日優先權日2007年9月25日發明者V·E·J·C·希金斯,W·G·J·德根申請人:英特威國際有限公司