基于膠原的微球及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：基于膠原的微球及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請通常涉及由提供控釋和所需機械特性的細胞外基質(zhì)材料形成的微粒，及其 制備方法和用途。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2007年7月6日提交的U. S. S. N. 60/948，336的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，并且 是 2005 年 9 月 14 日提交的 U. S. S. N. 11/225，108 的接續(xù)專利，U. S. S. N. 11/225，108 要求 2004年9月14日提交的U. S. S. N. 60/609, 600的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)。以上所列的申請中的公開 在此引作參考。
背景技術(shù)：
基于微球的藥物遞送體系由于其注射能力以及在控制所裝載藥物釋放方式上的 多用性，所以是有利的(Sinha 和 Trehan，J. Control. Release, 90 (3) :261_80 (2003))。這 就減少了多次注射的侵害。生物相容性和生物降解性對于選擇藥物載體而言是必要標準。 如聚乳酸和聚乙醇酸的合成聚合物，以及如殼聚糖和藻酸鹽的天然聚合物均可用來制備用 于藥物遞送的微球(Sinha 和 Trehan，J. Control. Release, 90 (3) :261_80 (2003))。由于 已經(jīng)用作縫合材料多年，所以聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)微球在此領(lǐng)域占主導地位(Pean 等，J. Control. Release,56 (1-3) 175-87 (1998) ；Sinha 禾口 Trehan, J. Control. Release, 90(3) 261-80(2003) Jiang 等，Adv. Drug Deliv. Rev. ,57(3) :391_410 (2005))。但是， 作為聚酯，PLGA有不可避免的固有缺點(Sinha和Trehan, J. Control. Release, 90 (3) 261-80(2003))，例如由于蛋白在疏水PLGA基質(zhì)中有限的溶解性和穩(wěn)定性所導致的低蛋白 聚合物相容性，以及可破壞細胞并使蛋白變性的在局部受傷部位降解產(chǎn)物的極端酸性。通 常由雙乳化技術(shù)制備的PLGA微球往往顯示低包封效率，并且包封蛋白生物活性保留差。以 前的報告已證實，早在48小時時，就有神經(jīng)生長因子(“NGF”)釋放的高突釋效應(yīng)和生物活 性損失(Pean 等，J. Control. Release, 56 (1-3) 175-87 (1998) ；Hadlock 等，J. Reconstr. Microsurg. ,19(3) 179-84 ；discussion 185-6(2003))。除了蛋白藥物的不穩(wěn)定性外，高 初始突發(fā)的和不完全的釋放也影響基于微球的藥物遞送系統(tǒng)的效率(Yeo和Park，Arch. Pharm. Res. ,27(1) 1-12 (2004)) 已經(jīng)報道了旨在改進初始快速損失的策略，其使用提高蛋白在整個聚合物基質(zhì)分 布的方法(Fu等，J. Pharm. Sci. ,92(8) :1582_91 (2003))。聚合、乳化、噴霧干燥和溶劑提取 或這些工藝的組合是通常使用的制備聚合物微球的方法(Freiberg和Zhu，Int. J. Pharm.， 282(1-2) 1-18 (2004))。Seo等的美國專利號6，630，156公開了通過乳化并隨后溶劑提取 來制備摻入生理活性分子的聚合物微球的方法。這些方法涉及使用有機溶劑、乳化穩(wěn)定劑 和劇烈攪拌。這些產(chǎn)生能對許多藥物、特別是蛋白的構(gòu)象和生物的完整性施加破壞作用的 化學和機械應(yīng)力(Yeo和Park，Arch. Pharm. Res. ,27(1) :1_12 (2004))。此外，降解的聚合 物中的酸性和疏水微環(huán)境能夠進一步破壞裝載的藥物(Freiberg和Zhu，Int. J. Pharm.， 282(1-2) 1-18(2004))。天然細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白具有良好的生物相容性和可忽略的免疫原性(Sano
4等，Adv. Drug Deliv. Rev. ,31(3) =247-266(1998) ；Lee 等 2001)，以及極佳的蛋白相容 性。因此，它們是非常好的蛋白遞送裝置的候選物。這些材料提供了穩(wěn)定蛋白并增強 或提高蛋白藥物如生長因子活性的天然細胞外環(huán)境(Lee等，Int. J. Pharm. ,221(1-2) 1-22 (2001) ； Jones 等，J. Physiol.，533 (1) :83_9(2001) ；Milev 等，J. Biol. Chem.， 273(34) =21439-42(1998)) 此外，在不產(chǎn)生局部損傷或炎癥的中性pH下，這些材料的降 解產(chǎn)生天然存在的單體。此外，這些材料促進細胞黏著、附著和生長，其可有助于有效傳 遞調(diào)節(jié)細胞活性的信號。但是，因為這些天然細胞外基質(zhì)生物材料的空間和機械穩(wěn)定性 差，以及迅速溶脹的特性，所以它們作為藥物遞送裝置的發(fā)展不及聚合物的進展(Yarmas 等 IV. Natural materials. In :Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ, Lemons JE, editors. Biomaterials Sciences-Anintroduction to materials in medicine. California Academic Press, 1996 :84_93)。這是因為大多數(shù)微球制造方法需要可使這些材料破碎的劇 烈混合(Freiberg*Zhu，Int.J.Pharm. ,282(1-2) 1-18 (2004))。因此，使用這些材料制造 微球幾乎是不可能的，除非已經(jīng)使用化學交聯(lián)。然而，與殘留化學交聯(lián)劑有關(guān)的毒性阻礙了 其在藥物遞送方面的使用(Sinha 和 Trehan，J. Control. Release, 90 (3) :261_80 (2003))。 Yang和Mark提出的美國專利申請20060222680公開了制備化學交聯(lián)膠原微球的方法。使 用戊二醛的化學交聯(lián)在交聯(lián)具有增強的機械和形狀穩(wěn)定性的聚合物方面是有效的。然而， 它損害了交聯(lián)結(jié)構(gòu)的生物相容性，因為有毒的殘余化學品和降解產(chǎn)物誘導細胞毒性和鈣化 (Simmons 等，Biotechnol.Appl. Biochem.，17 (Pt 1) :23_9 (1993))。藥物從基質(zhì)載體釋放是由擴散或降解或在許多情況下這二者的組合控制的。包 括藥物、基質(zhì)和環(huán)境因素的許多制劑參數(shù)影響初始突釋和釋放速率(Yeo和Park，Arch. Pharm. Res.，27(1) :1_12 (2004))。諸如藥物連續(xù)相中的表面電荷、疏水性、裝載和溶解性的 藥物因素可能影響藥物和基質(zhì)間相互作用，并因此影響初始突釋和釋放速率。諸如基質(zhì)的 親水性、濃度、孔隙度、密度、篩目大小和溶脹性能的基質(zhì)因素也影響藥物和基質(zhì)間相互作 用，因此影響初始突釋和釋放速率。因此，本發(fā)明的目的是提供由ECM材料形成的微粒及其制造方法和用途，所述材 料提供生物活性材料的控釋并具有理想機械特性。本發(fā)明另一目標是提供與生物活性材料、尤其是肽、多肽和蛋白呈高相容性的ECM 材料所形成的微粒。本發(fā)明的又一目標是提供無需劇烈攪拌或有機溶劑的簡單、溫和且無毒的制備方 法。發(fā)明概述摻入用于藥物遞送和/或組織工程學的生物活性分子的ECM微球的制備方法已得 以發(fā)展，其采用改進的乳化方法或油包水相分離方法。將所述微球光化學交聯(lián)，以為了用于 更好的藥物遞送而控制生物活性分子的釋放，并不損害交聯(lián)結(jié)構(gòu)生物相容性地形成結(jié)構(gòu)。 該方法使用溫和制備條件和簡單工藝，沒有植入后可能導致細胞毒性和鈣化的有毒化學交 聯(lián)試劑，沒有可能降低藥物利用度和生物活性的有機溶劑，并且沒有劇烈攪拌作用，該作用 可能使材料碎裂致使形狀和機械穩(wěn)定性差，從而破壞乳化。由此得到的微?；蛭⑶蛴惺芸?的大小、受控的釋放、高生物相容性，并可用于藥物遞送和細胞培養(yǎng)。


圖1是顯示使用本文公開的方法制備微球的過程的流程圖。圖2是顯示微球的光化學交聯(lián)方法的流程圖。圖3是顯示具有1%TWEEN 20 (- -)或不具有TWEEN 20 (- ■-)的微 球大小分布的線圖。將大小分布以微球比例(百分比)作為大小(微米)的函數(shù)來作圖。圖4是顯示BSA的控釋以及降低的突釋效應(yīng)(包封的BSA的百分比)的線圖，其 得自具有(-■-)或不具有(- -)0. 01%光交聯(lián)劑(“PC”)玫瑰紅(“RB”)的微球。將 BSA從微球釋放的速率以釋放的包封BSA(百分比)作為時間(小時)的函數(shù)來作圖。圖5是BSA釋放方式的RB的劑量依賴性的線圖。RB的檢測濃度為0 %(- -)、 0. 01% (- ▲ -)、0. 001 % (-X-)、0. 0001% (-*_)、0. 00001% (- ■-)和 0. 000001% (-+-)。 將BSA從微球的釋放以BSA濃度/微克對時間(小時)作圖。圖6是顯示具有以及不具有PC的微球的控釋和降低的突釋效應(yīng)的線圖。RB的檢 測濃度為 0% (- -)、0. 01% (- ■ -)、0. 001% (- ▲-)和 0. 0001% (-X-)。將 BSA 從微 球的釋放以BSA的釋放量(微克)作為時間(小時)的函數(shù)來作圖。圖7是顯示神經(jīng)生長因子(NGF)生物活性作為NGF濃度(ng/ml)的函數(shù)的標準曲 線的線圖。使用1. 5626,3. 125,6. 25,12. 5和25ng/ml的NGF,以具有生長超過一個體長的 神經(jīng)突的PC12細胞的比例來測量NGF生物活性。每組中計算超過100個細胞。圖8是顯示將包封效率的控制(百分比)作為蛋白裝載量(1000、500、100和75 微克)的函數(shù)的柱狀圖。圖9是顯示具有或不具有光化學交聯(lián)的膠原微球中NGF的分布百分比的柱狀圖(n =5)。發(fā)明詳述I.定義本文使用的細胞外基質(zhì)(“ECM”)指細胞產(chǎn)生并分泌到周圍環(huán)境中的任何材料，但 通常適用于動物組織的非細胞部分。結(jié)締組織ECM尤其廣泛，ECM的性質(zhì)決定了組織的特 性。從廣義上講有三個主要組成部分纖維成分(尤其是膠原蛋白、彈性蛋白或網(wǎng)硬蛋白)、 連接蛋白(如纖維連接蛋白、層粘連蛋白)以及空間填充分子(通常是氨基多糖)。本文使用的“微粒”包括微球(通常為球形)和微囊(通常為球形空心)以及不 規(guī)則形狀的顆粒，典型的直徑范圍為0. 5至小于1000微米。II.制備方法如圖1所示，制備膠原以及膠原和其它細胞外基質(zhì)組分混合物的微球的方法，包 括以下步驟(1)提供膠原單體或膠原單體和其它天然細胞外基質(zhì)組分混合物的溶液；(2)引發(fā)膠原的溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換或膠原和其它基質(zhì)組分的沉淀；(3)使溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程減速適當?shù)囊欢螘r間；(4)在適當?shù)臅r間將一種或多種生物活性分子摻入水凝膠混合物中；(5)在有或沒有表面活性劑的存在下，將水相與粘度適當?shù)挠拖嘁赃m當?shù)臄噭铀?率混合適當?shù)臅r間；(6)在適當?shù)囊欢螘r間后加速溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程；
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(7)通過如在適當速率下離心混合物的方法，從由油相和水相組成的液相分離固 體微球。雖然參照微粒進行描述，但可形成其它結(jié)構(gòu)，和/或可以將微粒形成入諸如包衣 的其它結(jié)構(gòu)中，包封或摻入其它起粘合劑作用的材料中，例如用作組織工程基質(zhì)。A.材料 1.ECM 材料天然細胞外基質(zhì)組分包括但不限于諸如I、II和III型的不同表型的膠原、變性 膠原明膠、蛋白多糖、透明質(zhì)酸、彈性蛋白，其是從天然存在的來源如人或動物組織提取的 或是合成的。這些可使用公開的方法獲得，或從任何幾個供應(yīng)商處購買。在某些特定條件 下，一些諸如膠原、明膠和透明質(zhì)酸的細胞外基質(zhì)組分可被誘發(fā)進行溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換，而在 其它特定條件下，其他諸如膠原和GAGs (氨基多糖)的天然細胞外基質(zhì)組分彼此共同沉淀。在優(yōu)選實施方案中，細胞外基質(zhì)是膠原I型、II型、III型或其混合物。這可能是 人或動物或合成來源的。在一個實施方案中，膠原來自大鼠尾巴、牛跟腱、豬皮或人類胎盤， 以及來自提取膠原的不同級分，例如酸溶性級分、經(jīng)胃蛋白酶消化的級分和不溶性級分。在 另一實施方案中，蛋白多糖來自鯊魚軟骨。膠原單體可來自由動物來源提取的膠原級分，如 酸溶性級分、經(jīng)胃蛋白酶消化的級分或不溶性級分。2.生物活性材料任何治療、預(yù)防或診斷材料可摻入微球。這些可能是蛋白或肽，糖和多糖，脂或其 綴合物或復(fù)合物，如DNA、RNA或其復(fù)合物的核酸，或其他無機或有機分子，例如抗生素、化 療藥物等。微球使用尤其適合包封蛋白質(zhì)生物活性材料的溫和制備條件制備。在一個實施方 案中，包封的治療、預(yù)防或診斷材料是肽、多肽或蛋白。優(yōu)選的材料包括生長因子，例如但不 限于細胞因子和生長因子，例如神經(jīng)生長因子(NGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血 小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)換生長因子β (TGF-β)和胰島素樣生長因子I (IGF-I)。這 些因子因素通常是水溶性的并會與膠凝混合物徹底混合，這樣乳化過程中形成的任何微滴 會含有均勻分布的因子。穩(wěn)定這些生物活性因子的分子也可包括在內(nèi)，如穩(wěn)定NGF的牛血 清白蛋白(“BSA”)或人血清白蛋白(“HSA”)。3.油、表面活性劑和其它乳化劑油相通常包括如橄欖油或玉米油的植物油、如石蠟油的有機油、如硅油的合成油 或不同油的混合物，其取決于膠凝混合物的粘度，例如石蠟油體積比在1 1至1 100之 間，優(yōu)選1 6至1 10。溶液應(yīng)該優(yōu)選具有Ι-lOOOmPas (單位毫帕斯卡秒)的粘度，最優(yōu)選20-100mPaS。 本文提及的體積比是ECM組分(膠原)_生物活性蛋白混合物與油的體積比。表面活性劑可加到水溶液或油的二者之一或兩者中。優(yōu)選的表面活性劑是 TWEEN 20或180、SDS或TRITON x-ioo，最優(yōu)選ΤλΥΕΕΝ 20，加至液體混合物的 0. 1%、1%、10%、20%，優(yōu)選 10%。B.反應(yīng)條件1.提供膠原單體或膠原單體與其他天然細胞外基質(zhì)組分混合物的溶液。ECM材料以單體的水溶液提供，優(yōu)選0. 5-30mg/ml，更優(yōu)選7mg/ml。酸可溶性膠原的PH為約3。通常不需要分散劑或緩沖劑。膠原水溶液通常用諸如0. 02N乙酸的酸性溶液 調(diào)至酸性PH。2.引發(fā)膠原的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換或膠原和其它基質(zhì)組分的沉淀。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程通常由化學和/或物理反應(yīng)引發(fā)。在一個實施方案 中，通過提高pH(例如加入氫氧化鈉或碳酸氫鈉)、增加離子強度或溫度，引發(fā)膠原單體以 聚合或重構(gòu)形成原生纖維。在另一實施方案中，膠原單體與GAGs混合，沉淀通過機械作用 例如攪拌、渦旋、攪動、旋轉(zhuǎn)引發(fā)。在另一實施方案中，酸溶性膠原I型和II型混合物的溶 膠_凝膠轉(zhuǎn)換是通過使用堿提高混合物的PH弓I發(fā)，所述堿為例如氫氧化鈉或碳酸氫鈉或氫 氧化胺，優(yōu)選PH為4至14，最優(yōu)選8至14。在另一實施方案中，通過提高溶液溫度引發(fā)膠 原單體或與其它EMC組分混合的膠原單體來聚合或重構(gòu)為原生纖維。3.使溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程減速適當?shù)囊欢螘r間。這些天然的細胞外基質(zhì)組分在聚合、溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換和沉淀過程中固化，直到該過程完成或直到一段時間后達到平衡。這些組分完全固化前，通過控制相同的或另一參數(shù)， 使混合物經(jīng)歷聚合或沉淀過程減慢甚至暫時受抑制的狀態(tài)。該步驟是為了將生物活性分子 摻入混合物中以及形成乳液。使過程減速的方法包括使溫度保持盡可能低，例如在2_25°C之間、最優(yōu)選4°C以 下但高于0°c。其他方法包括調(diào)節(jié)PH至低于7，例如4，或降低溶液離子強度，例如通過使用 0.IX PBSo在一個實施方案中，膠原膠凝混合物經(jīng)歷更低溫度(例如4°C )的環(huán)境。在再一實 施方案中，膠原和GAGs混合物經(jīng)歷無機械干擾的環(huán)境。在另一實施方案中，在溶膠-凝膠 轉(zhuǎn)換重新開始前的整個其它步驟中，基質(zhì)組分的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換在O、1、10或60秒，3、5、10 或60分鐘，2、4、8或24小時，或2、4、7或14天時減慢。在優(yōu)選實施方案中，溶膠_凝膠轉(zhuǎn) 換在15分鐘時減慢。4.在適當?shù)臅r間將一種或多種生物活性分子摻入水膠凝混合物。單個或多個生物活性分子可以以液體或粉末摻入混合物。添加生物活性分子至治 療有效濃度。在許多情況下，如對于大多數(shù)蛋白生長因子，這些都是在皮克至納克水平有 效。生物活性材料也可能以毫克水平摻入。這些通常均勻地分散，尤其在分子是水溶性的 情況下。5.在有或沒有表面活性劑的存在下，將水相與粘度適合的油相在適當攪動速率下 混合合適的時間。通過如下方法在天然細胞外基質(zhì)組分和油相的混合物的膠凝或沉淀之間形成乳 液，所述方法包括但不限于振動、攪動、混合、攪拌和渦旋的不使膠凝混合物破碎并干擾 溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換工藝，優(yōu)選用加樣裝置，以適當體積比、適當粘度，在適當攪拌速率下進 行適當時間。粘度通常是Ι-lOOOmPas (單位毫帕斯卡秒)，優(yōu)選20-100mPaS，攪動速率 800-10, OOOrpm,優(yōu)選2000rpm，進行1秒至24小時的一段時間，優(yōu)選10秒，含水蛋白混合物 與油的體積比為1 1至1 100，優(yōu)選1 10。在一個實施方案中，根據(jù)ECM膠凝混合物的粘度，將所述膠凝混合物與油相如橄 欖油、硅油、玉米油或不同油的混合物混合。油相通常會包括如橄欖油或玉米油的植物油、 如石蠟油的有機油、如硅油的合成油或不同油的混合物，根據(jù)膠凝混合物的粘度，例如石蠟油體積比為1 1至1 100，優(yōu)選1 6至1 10。優(yōu)選的材料是體積比1 1至 1 100、優(yōu)選1 10的石蠟油，混合如1、10、20、30、40、50或60秒，1、2、5、10或60分鐘， 或2、4、8或24小時的一段時間。這段時間由溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換速率、膠原混合物和油的總體 積、膠原蛋白混合物的粘度和油相的粘度、機械混合設(shè)備的功率和頻率、裝載混合物的容器 的大小和質(zhì)量、溫度等決定。這些實例說明了基于如下參數(shù)的范圍訂制混合設(shè)備最大功 率，在IOml塑料容器中，具有25mg BSA的7mg/ml膠原，膠原混合物和油的體積比為1 6， 在25°C下。在優(yōu)選實施方案中，以此訂制混合設(shè)備的最大攪動速率的四分之一混合材料10 秒。如果速度太低，將無法提供足夠的能量來乳化混合物。如果速度太快，會發(fā)生相轉(zhuǎn)變， 使得油滴被捕集于膠原膠凝混合物微滴中并得到膠原碎片。如果乳化時間太短，材料將合 并，形成大直徑微球。如果乳化時間太長，會發(fā)生相轉(zhuǎn)換和破碎。為了進一步穩(wěn)定形成的乳液，在此過程中，可引入濃度1%、10%、20%、優(yōu)選 的表面活性劑，其包括但不限于TWEEN 20。6.在適當?shù)囊欢螘r間后加速溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程。乳液形成后立即使乳液經(jīng)受環(huán)境加速(environment accelerating)或以最大速 率重新開始溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換或沉淀過程一段時間。這是為了固化乳液中的微滴，從而包封 摻入微球的均相固體材料中的生物活性分子。這還防止合并，從而減小微球的大小?？刂?同樣的工藝參數(shù)。在一個實施方案中，使膠原乳液經(jīng)受具有12°C、25°C、37°C、優(yōu)選37°C的高溫的環(huán) 境一段時間，諸如10、30或60秒，2、5、10、30或60分鐘，2、4、8或24小時，或2、4或7天， 優(yōu)選45分鐘，直到完成溶膠_凝膠轉(zhuǎn)變或達到平衡，從而形成固化的微球，這取決于基質(zhì)組 分的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換特性。在另一實施方案中，膠原微球的膠凝速率通過改變磷酸鹽緩沖 液濃度(“PBS”，0. OlM 磷酸鹽緩沖液，NaCl 0. 138M ；KCl 0. 0027M ；pH 7. 4，25°C )進行控 制，所使用的緩沖液為1X、5X和10X，優(yōu)選5X。在另一實施方案中，通過將乳液在充滿用于 固化的氨的堿性室中溫育(incubating)，使乳液經(jīng)受pH增加到pH 14的環(huán)境。7.從由油相和水相組成的液相分離固體微球。將固化的微球使用如過濾、沉淀、離心等標準技術(shù)分離。這種方法提供了簡易工藝，其不涉及已知降低藥物、尤其是蛋白藥物的生物活性 的有機溶劑以及劇烈機械和化學應(yīng)力。固化的微球易于從由水相和油相組成的各液相分 離。在一個實施方案中，將混合物以不使微球破碎的速度離心一段時間，所述速度如1、10、 100、1000 或 lOOOOrpm，優(yōu)選 4000rpm，所述時間如 1、5、10、30 或 60 秒，2、5、10、30 或 60 分 鐘，或2、4、8或24小時，優(yōu)選10分鐘。III.進一步修飾微球的方法得到微球，其直徑大小分布為0. 05至1000微米，優(yōu)選50至100微米。脫水時，這
些微球有光滑或粗糙的表面。初始突釋效應(yīng)可以降低，并且可通過如下方法控制從微球釋放生物活性分子的方 式，所述方法包括但不限于光化學交聯(lián)，其包括步驟(1)以合適劑量的光敏劑平衡微球； (2)徹底沖洗微球以去除多余的光敏劑；以及(3)用合適能量水平的光源輻照微球一段時 間。A.試劑
光敏試劑包括能夠被特定波長的光子激活的發(fā)色團，包括但不限于熒光素、曙紅、 玫瑰紅(“RB”)和亞甲藍。光敏試劑包括吸收光譜高達約600nm的RB。除了 UV區(qū)，在大 約514nm和550nm有兩個吸收峰。RB有高吸收效率，因此是非常有效的光敏試劑。玫瑰紅是重要的已用于臨床 診斷眼科疾病幾十年的染料(Lansche R. K. ,"VitalStaining in Normal Eyes and in Keratoconjunctivitis Sicca”，Am. J. Ophthalmol. 60 (3) :520_5 (1965))。它是能使用的 安全試劑。玫瑰紅是水溶性的熒光光敏試劑。但是，聚集體可能在高濃度例如> (w/v) 下形成，因此玫瑰紅的優(yōu)選濃度為0. 00001 %至0. 01 %。玫瑰紅溶液在暗處使用溶液制備， 所述溶液如蒸餾水或PBS和乙醇、優(yōu)選水。B.交聯(lián)的方法
1.將微球浸泡在光敏劑中將微球浸沒在光敏劑溶液中1、10、30或60秒，2、5、10、30或60分鐘，或2、4、8或 24小時，優(yōu)選10分鐘。光敏劑濃度范圍為0.00001%至1%，優(yōu)選0.001%。代表性光敏劑 包括熒光素、玫瑰紅、亞甲藍、曙紅和卟啉。優(yōu)選地將微球接觸光敏劑5秒至100小時的一段時間，優(yōu)選10分鐘。最優(yōu)選將過
量試劑通過洗滌去除。光化學交聯(lián)是無熱、無毒和快速的技術(shù)，其交聯(lián)基于膠原的材料但不損害生物相 容性。這種方法已在美國公開專利申請?zhí)?0060099268中公開。光化學交聯(lián)的膠原已證 明具有顯著增強的理化性質(zhì)(Chan 和 So, J. Biomed. Mater. Res. A, 75 (3) :689_701 (2005)， Chan等，Tissue Eng. , (1) =73-85 (2007)) 0除了增加的機械性能、熱和化學穩(wěn)定性之外， 已顯示該技術(shù)大大降低膠原結(jié)構(gòu)的孔徑和溶脹率，其改變膠原網(wǎng)和裝載蛋白之間的相互作 用。這些特性是影響藥物的初始突釋和釋放速率的重要基質(zhì)參數(shù)。2.微球接觸光源把水或等滲溶液中的微球置于光源下，如UV源、激光、LED或其他可見光源。由于 其與光子數(shù)量成正比，所以光的量和功率強度影響交聯(lián)的程度。合適的光源包括波長514nm 的氬激光器，或多譜線綠激光器。也可使用玫瑰紅可吸收的其它激光。氬激光器可為連續(xù) 的或脈沖的。激光在輻照度0. 0001、0. 001、0. 01、0. 1、1或10W/cm2，優(yōu)選0. 2ff/cm2時發(fā)射。 輻照持續(xù)時間1、10、100、1000或10000秒，優(yōu)選100秒。傳遞給微球的總光能為0. 5、1、5、 10、100 或 1000J，優(yōu)選 20J。整個過程可在無菌條件下進行。交聯(lián)過程中，激光將通過透明容器傳遞到微球。C.光交聯(lián)的微球光化學交聯(lián)的微球直徑大小分布為0. 05至1000微米，優(yōu)選50至100微米。脫水
時，光化學交聯(lián)的微球有光滑或粗糙度的表面。光化學交聯(lián)通過擴散和降解，降低了摻入的生物活性分子的釋放速率。光化學交 聯(lián)強化了膠原纖維，導致具有微米大小孔徑的超精細微結(jié)構(gòu)與凍干結(jié)構(gòu)中納米大小的纖維 網(wǎng)絡(luò)相互連接。這可能會減低擴散速度，因而降低從被捕集于纖維網(wǎng)中的液相釋放摻入的 生物活性分子。光化學交聯(lián)也減少了生理相關(guān)條件下膠原結(jié)構(gòu)的分解速率。光化學交聯(lián)還 提高了生物活性分子在基質(zhì)網(wǎng)中的保留。這減少了脫水樣品再水化時摻入的生物活性分子 釋放的量和速率。經(jīng)交聯(lián)的微球以明顯減少的突釋效應(yīng)和一級釋放動力學釋放摻入的生物活性分子。光化學交聯(lián)沒有改變微球中水合膠原纖維網(wǎng)的篩目大小，但可能會改變交聯(lián)膠原結(jié)構(gòu)和裝載的蛋白之間的相互作用(如離子、靜電和疏水相互作用)，從而阻礙蛋白的釋 放。釋放可以長時間維持而不損害摻入的生物活性分子的生物活性。具有摻入的生物活性分子的未交聯(lián)的微球和光化學交聯(lián)的微球可通過直接注射 到受傷部位系統(tǒng)(injury site system)以遞送生物活性分子，所述受傷部位系統(tǒng)包括但不 限于神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉骨骼系統(tǒng)。D.微球的保存微球可進一步處理和保存，例如通過浸沒在無水乙醇或逐漸增加濃度的乙醇中， 凍干，臨界點干燥，烘箱干燥，空氣干燥，丙酮干燥，或分散在甘油中，或不使微球的基質(zhì)組 分和摻入的生物活性分子變性的其他條件迅速或逐漸使微球脫水。乙醇脫水法從微球中吸 取水，通過浸沒在無水乙醇中進行幾次沖洗，或浸沒在一系列增加濃度的從10%到100%， 優(yōu)選50%至100%的乙醇中，每次1分鐘到10天，優(yōu)選30分鐘的一段時間。微球可以以漿 狀物或使用梯度脫水法干燥保存。E.微球的應(yīng)用微球用于藥物遞送以及三維細胞培養(yǎng)和移植，因為這些微球與化學交聯(lián)的微球不 同，沒有毒性。通過參考以下非限制性實施例進一步理解本發(fā)明。 實施例實施例1.制備摻入BSA或肌紅蛋白的膠原微球?qū)舛葹?mg/ml鼠尾膠原I型的0. 02N乙酸溶液在IOX的磷酸鹽緩沖液存在下， 用IN氫氧化鈉中和，使終濃度為0. 5X。該膠凝混合物放置在4°C冰水浴中，以減慢聚合速率 1分鐘。能將樣品蛋白如BSA和肌紅蛋白摻入。將BSA(4mg)加到混合物中，并充分混合。將比例為1 1的橄欖油和硅油混合物以6 1的體積比加入含水膠凝混合物。 乳化前將非離子表面活性劑Tween吐溫20加到水相中。將混合物的容器放在混合裝置上。 將混合物以最大速度(3000rmp)攪動30秒。然后將所形成的乳液置于37°C水浴中以加速 聚合。將混合物溫育30分鐘，直到平衡。將混合物在4000rpm短暫離心10分鐘，從包含水 相和油相的液相分離固體微球。棄去油相和液相后，將微球沖洗兩次，準備注射或隨后的釋 放實驗。實施例2.膠原微球的光化學交聯(lián)從實施例1所述操作中獲得的微球浸泡在濃度0. 001 % (w/v)的玫瑰紅(光交聯(lián) 反應(yīng)劑，“PC”)溶液中10分鐘。棄去過量的玫瑰紅，沖洗微球。將微球再懸浮在水中，并置 于4孔板培養(yǎng)皿中。采用514nm氬激光以0.02W/cm2輻照微球100秒。輻照后緊接著在水 中沖洗微球。然后微球準備用于注射或隨后的實驗。實施例3.膠原微球的脫水將微球浸泡在100%乙醇中30分鐘，重復(fù)三次由微球中提取水。逐漸增加乙醇濃 度用于改善微球表面光滑度。將膠原微球浸泡在50% ν/ν乙醇中20分鐘，70%乙醇中30 分鐘兩次，80 %乙醇兩次，90 %乙醇兩次以及100 %乙醇兩次。實施例4.微球的形態(tài)學分析
室溫下將微球在0. 25%戊二醛中固定4小時，然后通過臨界點干燥進行干燥。接 著用大量水徹底沖洗微球。將微球通過臨界點干燥脫水，并置于具有碳糊(carbon cement) 的樣品臺上。向樣品濺射金并用掃描電子顯微鏡(SEM)分析。結(jié)果表明，該微球在交聯(lián)時 更牢固，并有更小的孔隙率。實施例5.光化學交聯(lián)的膠原的微觀結(jié)構(gòu)鑒定 將重構(gòu)的膠原凝膠通過改變光敏劑和光劑量進行光化學交聯(lián)。戊二醛用作化學交 聯(lián)的陽性對照。將經(jīng)處理的結(jié)構(gòu)冷凍干燥。將膠原支架的橫截面濺射金，以進行多孔結(jié)構(gòu) 的SEM分析。該分析表明，戊二醛交聯(lián)膠原支架和光化學交聯(lián)膠原支架均有精細的微觀結(jié) 構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有有著納米纖維和微米孔的互相連接的纖維。在對照組中，只發(fā)現(xiàn)有著膜樣結(jié) 構(gòu)的宏觀結(jié)構(gòu)。表1-3顯示了光化學交聯(lián)后膠原微觀結(jié)構(gòu)的變化、對光敏劑濃度以及光流量 (fluence)的劑量依賴性。表4顯示了光化學交聯(lián)和表面活性劑處理后纖維大小和篩目大 小的變化。表1-膠原支架的孔徑分布 表2-有不同激光能量劑量和輻照后溫育時間的膠原支架的孔徑分布 表3-不同光敏劑劑量的膠原支架的孔徑分布
網(wǎng)/μΜ孔徑大小(微米) 表4-不同處理組的膠原微球中纖維網(wǎng)的纖維大小、體積分數(shù)和篩目大小(η = 3)
I 實施例6. BSA釋放方式如實施例1所述，將25mg BSA摻入lmg/ml膠原微球中。將膠原微球在Eppendoff 管內(nèi)重新混懸于5ml IX PBS中，在37°C水浴、200rpm常規(guī)攪動下溫育。在0. 5、1、2、4、8、24 小時，2、4、7、14和35天時，拋棄并補充2ml上清。將上清稀釋到適當范圍，使用Bio-Rad蛋 白檢測試劑盒檢測BSA的濃度。圖4、5和6表明，光化學交聯(lián)的膠原微球初始突釋顯著降低，BSA幾乎為一級釋放 動力學。對于未交聯(lián)的微球，初始突釋效應(yīng)導致約40%總裝載量的損失，這大大降低了藥物 遞送裝置中特定貴重蛋白藥物的效力。光化學交聯(lián)的微球中，釋放曲線持續(xù)超過35天并且 釋放仍然呈線性。實施例7.光化學交聯(lián)和表面活性劑處理后NGF生物活性的保留如實施例1所述，將含有2. 5g NGF的5mg BSA摻入膠原微球。光化學交聯(lián)如實施 例2中所述進行。另一組使用Tween20作表面活性劑。微球混懸在Iml介質(zhì)中，37°C水 浴溫育1-4天。
溫育結(jié)束時，上清被取出，用于孵育PC12細胞。PC12細胞在24孔板上的添加了 15%馬血清、2. 5%胎牛血清和PBS的81. 5% F12K培養(yǎng)基中保持生長。細胞在37°C下， 水飽和的5% C02，95%空氣氣氛中培養(yǎng)，以大約每孔3，000個細胞(800 ill中)的密度鋪 板。1-3天后，將這些細胞固定，在相差顯微鏡下觀察。將神經(jīng)突生長超過細胞一個體長的 細胞計數(shù)，記錄有神經(jīng)突生長的PC12細胞的百分比。使用已知濃度的NGF以標準曲線校 準有神經(jīng)突生長的PC12細胞的量。標準曲線如圖7中所示。將部分從微球釋放的NGF與 PC12細胞一起孵育，而部分樣本用于使用ELISA測量NGF。這允許測定所釋放的保留生物 活性的NGF的量。通過與對照比較對PC12分化和神經(jīng)突生長的刺激，結(jié)果表明了 NGF保留其生物活 性。表5顯示，與對照中的類似，從光化學交聯(lián)或表面活性劑處理的微球釋放的NGF保留差 不多所有其期望的生物活性。表5-包封的NGF的生物活性的保留 實施例8.固定在膠原微球內(nèi)部的NGF的生物活性的保留在單獨的實驗中，摻入膠原微球的NGF在37°C下溫育1、2、3和4天。在每個時間 點結(jié)束時，棄去上清液，將微球用200U/ml的細菌膠原酶消化5小時。然后消化混合物稀釋 到適當?shù)姆秶?。部分樣品用于與PC12細胞一起孵育，而部分樣品使用ELISA試劑盒測量濃度。結(jié)果表明，保留在膠原微球中的NGF即使4天后仍有生物活性，因為它誘導PC12 細胞中神經(jīng)突生長。實施例9.包封效率測量如實施例1中所述形成膠原微球。微球分離的水相并且合并油相和微球洗滌液。 合并的溶液渦旋震蕩充分混合，對等份洗滌物測量摻入的BSA或肌紅蛋白。然后包封效率 如下計算[(總裝載量-洗滌物中的量)/總裝載量]xlOO%。改變裝載的蛋白總量和微球形成中使用的膠原濃度，以研究它們對包封效率的影 響。圖8顯示，由于待裝載的蛋白的量增加，所以包封效率下降。圖9顯示，光化學交聯(lián)微 球中保留的NGF的量比未交聯(lián)微球中的高。實施例10.表面活性劑的作用除了額外使用非離子表面活性劑TWEEN 20外，如實施例1所述地制備膠原微 球。摻入生物活性分子后，在加入油相之前將不同濃度的TWEEN 20(1、5和10% )與水相混合。如實施例1所述地形成乳液，并將微球通過離心從液相分離。分析表面活性劑 存在下形成的微球的形態(tài)學和釋放方式。結(jié)果表明，如更少的相轉(zhuǎn)換和更均勻的微球群所示，表面活性劑濃度增加產(chǎn)生更 穩(wěn)定的乳液。此外，由于表面活性劑濃度增加，微球的大小分布已被證明向更小的中間值轉(zhuǎn)變。除非另有規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與所公開的發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常所理解的意思相同。將本文引用的出版物和引用它們的資料特別地引作參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到或者使用不超過常規(guī)實驗而能夠確定本文所述發(fā)明具 體實施方案的許多等價方案。這種等價方案意欲包括在所提交的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
制備基于天然細胞外基質(zhì)的微球的方法，其包含提供一種或多種天然細胞外基質(zhì)組分的水溶液；引發(fā)所述基質(zhì)組分的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換，以形成水凝膠混合物；使所述溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換過程減速；將治療、預(yù)防或診斷分子摻入所述水凝膠混合物中；采用攪拌混合所述水凝膠混合物與油相，形成油包水乳液；加速所述溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換過程；以及從所述油相和水相分離所述固體微球。
2.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括光化學交聯(lián)所述微球，以降低所述分子從所述微 球的突釋效應(yīng)或控制所述分子從所述微球的釋放。
3.權(quán)利要求2的方法，其包括用光敏試劑平衡所述微球；和以有效地交聯(lián)一些或所有所述細胞外基質(zhì)組分的一段時間使用光源輻照所述微球。
4.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括使所述微球脫水。
5.權(quán)利要求4的方法，其中通過浸沒在乙醇或丙三醇中來將所述微球脫水。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述天然細胞外基質(zhì)選自膠原蛋白、明膠、蛋白多糖、透明 質(zhì)酸和彈性蛋白。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞外基質(zhì)溶液含有單體或溶解狀態(tài)的細胞外基質(zhì)組分。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述細胞外基質(zhì)組分是膠原蛋白I、II、III型或其混合物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換由聚合、沉淀或聚集引發(fā)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中根據(jù)所述基質(zhì)組分的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換特性，通過控制pH、 溫度或離子強度而引發(fā)所述溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換。
11.權(quán)利要求10的方法，其中通過增加pH或離子強度或溫度，例如37°C，來引發(fā)酸溶 膠原的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換。
12.權(quán)利要求1的方法，其中在引發(fā)所述溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換后使所述基質(zhì)組分的溶膠-凝 膠轉(zhuǎn)換減速。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過控制所述基質(zhì)組分混合物的pH、溫度、離子強度或動 力學運動而使所述基質(zhì)組分的溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換減速。
14.權(quán)利要求1的方法，其中將所述水凝膠混合物與所述油相混合形成乳液，而不使所 述凝膠混合物破裂且不干擾所述溶膠_凝膠轉(zhuǎn)換過程。
15.權(quán)利要求1的方法，其中乳液形成后，使所述溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換加速。
16.權(quán)利要求2的方法，其中所述光源是在0.000Iff/cm2至lOW/cm2、優(yōu)選0. 2ff/cm2的 輻照度變化下運行的UV或可見光源，并且其中所述輻照能量變化為o. 0001J至10000J，優(yōu)選25J，進行輻照的時間的變化為3秒 至100小時，優(yōu)選60秒。
17.通過權(quán)利要求1的方法形成的微球群。
18.權(quán)利要求17的群，其中所述微球大小分布變化為5至2000微米。
19.權(quán)利要求17的群，其中與非光化學交聯(lián)的微球相比，所述光化學交聯(lián)的微球以顯 著降低的初始突釋效應(yīng)釋放所摻入的分子。
20.權(quán)利要求17的群，其中與非光化學交聯(lián)的微球相比，所述光化學交聯(lián)的微球以顯 著降低的速率釋放所摻入的生物活性分子。
21.權(quán)利要求17的群，其中所述光化學交聯(lián)的微球以一級釋放動力學釋放所摻入的分子。
22.權(quán)利要求17的群，其中與非光化學交聯(lián)的微球相比，所述光化學交聯(lián)的微球在所 述基質(zhì)中保留更多的生物活性分子。
23.權(quán)利要求17的群，其中在光化學交聯(lián)的微球中，所摻入的生物活性分子保留其生 物活性。
24.形成用于組織工程學的結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求17的群。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)了用于藥物遞送的包含生物活性分子的ECM微粒的制備方法，其使用改進的乳化方法或油包水相分離方法。將微球光化學交聯(lián)來控制生物活性分子的釋放，以期更好的藥物遞送而不損害交聯(lián)結(jié)構(gòu)的生物相容性。該方法使用溫和的生產(chǎn)條件和簡單的工藝，沒有植入后可能導致細胞毒性和鈣化的有毒化學交聯(lián)試劑，沒有可能降低藥物利用度和生物活性的有機溶劑，并且沒有劇烈攪拌作用，該作用可使材料碎裂致使形狀和機械穩(wěn)定性差，從而使乳液不穩(wěn)定。由此產(chǎn)生的微?；蛭⑶蛴惺芸氐拇笮?、受控的釋放、高生物相容性，并可用于藥物遞送和細胞培養(yǎng)。
文檔編號A61K9/50GK101868298SQ200880106169
公開日2010年10月20日 申請日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者蘇國輝, 陳佩, 陳卓銘 申請人:香港大學