專利名稱：三環癸-9-基-黃原酸酯的立體異構體的制作方法
相關申請的交叉參考
本申請要求2007年7月3日遞交的美國臨時申請號60/958,370的優先權，將其全部內容作為參考并入本發明中。
發明領域 本發明提供了三環癸-9-基黃原酸酯的光學活性立體異構體、及其制備方法和藥物組合物。也提供了將其用于治療、預防或改善病毒感染和這樣的感染引起的疾病的方法。
背景技術：
三環癸-9-基黃原酸酯是包含五個手性中心的復雜分子，其在理論上可以產生32個立體異構體。然而，由于其環狀結構的限制，該分子存在的立體異構體比理論可能性少得多。一些立體異構體顯示在方案1中，包括四個對映體對O-外/C-外，(9R)-1A和(9S)-1A、O-外/C-內，(9R)-1B和(9S)-1B、O-內/C-外，(9R)-1C和(9S)-1C、和O-內/C-內，(9R)-1D和(9S)-1D。
英國專利GB 2,091,244以及美國專利號4,602,037和4,981,869描述了三環癸-9-基-黃原酸酯的立體異構體混合物，其被稱為D609。如在美國申請公開號2005/0085448中表征的，D609包含83％的外消旋的O-外/C-外立體異構體1A和17％的外消旋的O-外/C-內1B、O-內/C-外1C和O-內/C-內1D。
已經報道D609顯示出多種生物活性，包括抗腫瘤活性(美國專利號4,602,037；Amtmann和Sauer，Cancer Lett.1987，35，237-244；Furstenberger等人，Int.J.Cancer 1989，43，508-512；Schick et al.Cancer Lett.1989，46.143-147；Schick等人，Cancer Lett.1989，46，149-152；Sauer等人，Cancer Lett.1990，53，97-102；PorN-Ares等人，Exp.Cell.Res.1997，235，48-54)、抗病毒活性(Sauer等人，Pro.Natl.Acad.ScL USA 1984，81，3263-3267；Amtmann等人，Biochem.Pharmacol.1987，36，1545-1549；Villanueva等人，Virology1991，181，101-108；Walro和Rosenthal，Antiviral Res.1997，36，63-72)和抗炎活性(Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733；Tschaikowsky等人，J.Pharmacol.1998，285，800-804)。
方案1
還報道D609是一種磷脂酰膽堿-特異性磷脂酶C(PC-PLC)的特異性抑制劑(Amtmann，Drugs Exp.Clin.Res.1996，22，287-294；Muller-Decker，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，162，198-205)。PC-PLC水解磷脂酰膽堿產生第二信使二酰甘油，其激活蛋白激酶C(PKC)和/或酸性神經磷脂酶(aSMase)。已經提出通過D609抑制PC-PLC可用于抑制PKC和aSMase的活性(Schutze等人，Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015；Cifone等人，EMBO J.1995，14，5859-5868；Amtmann，DrugsExp.Clin.Res.1996，22，287-294；Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733；Yamamoto等人，Biochem.J.1997，325，223-228)。PKC的抑制可以部分地解釋D609的抗增殖和抗腫瘤活性(Muller-Decker等人，Exp.CellRes.1988，777，295-302；Muller-Decker等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，162，198-205；Amtmann，Drugs Exp.Clin.Res.1996，22，287-294)。D609抑制aSMase可以導致神經酰胺生成減少，從而抑制神經酰胺-介導的信號轉導(Schutze等人，Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015；Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733)，例如PKC-z(Simarro等人，J.Immunol.1999，162，5149-5155)、細胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶(Buscher等人，MoI Cell.Biol.1995，15，466-475；Monick等人，J.Immunol.1999，162，3005-3012)和核因子-kB(NF-kB)
(Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015)的活化。
另外，美國專利號4,851,435、WO 96/14841、和美國申請公開號2004/0122086和2005/0085448描述了應用助劑，例如離子型去垢劑、脂質和類固醇來增強D609作為抗病毒劑或抗腫瘤劑的治療效果。
Gonzalez-Roura等人(Lipid 2002，37，401-406)和美國專利申請公開號2005/0085448描述了外消旋的O-外/C-外1A、O-外/C-內1B、O-內/C-外1C和O-內/C-內1D立體異構體的合成。然而，Gonzalez-Roura等人報道這些非對映異構體在其抗PC-特異性磷脂酶C的抑制活性方面沒有顯著性差異。
上述生物學研究是使用D609進行的，D609是一種三環癸-9-基黃原酸酯的復合二立體異構混合物或外消旋混合物。特別地需要找到三環癸-9-基黃原酸酯的一種光學純立體異構體化合物，其具有D609的治療優點，但是避免或減少了D609或其它抗病毒劑的非故意的、不期望的、不需要的、不利的或副的作用。
在本發明中對各參考文獻的引證并不意味著這樣的參考文獻是本申請的現有技術。
發明簡述 本發明提供光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。在一實施方案中，本發明提供光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸的藥學上可接受的鹽，其包括但不限于鋰鹽、鎂鹽、鈣鹽、鈉鹽、鉀鹽和鋅鹽。
所述光學活性的單一立體異構體可用于治療病毒感染的藥物組合物和方法。據本發明人所知，還不存在合成三環癸-9-基黃原酸酯的單一對映異構體或從三環癸-9-基黃原酸酯或外消旋的O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其衍生物中分離單一對映異構體的報道。本發明提供三種用于制備這樣的光學活性的對映異構體的方法。
在一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥在與手性單齒膦復合的過渡金屬催化劑存在下，通過不對稱氫化硅烷化烯5合成的
在另一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥是通過酶拆分不飽和的酯11的外消旋混合物來制備的
在另一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥是通過酶拆分飽和的酯13的外消旋混合物制備的
本發明還提供藥物組合物，其包含光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；與一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體的組合。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸的藥學上可接受的鹽，例如鋰鹽、鎂鹽、鈣鹽、鈉鹽、鉀鹽或鋅鹽。在某些實施方案中，所述藥物組合物以表面給藥的劑型提供。
本發明進一步提供一種用于治療、預防或改善由病毒引起的疾病的一種或多種癥狀的方法，其包括向個體施用治療有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。在一實施方案中，所述疾病為性傳播疾病。在另一實施方案中，所述病毒為致癌病毒。在另一實施方案中，所述病毒為乳頭瘤(pallipoma)病毒。在另一實施方案中，所述病毒為單純皰疹病毒。
本發明提供一種用于抑制病毒復制的方法，其包括用有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥來接觸所述病毒。在一實施方案中，所述病毒為性傳播的。在另一實施方案中，所述疾病為致癌病毒。在另一實施方案中，所述病毒為乳頭瘤病毒。在另一實施方案中，所述病毒為單純皰疹病毒。
本發明提供一種用于抑制磷脂酰膽堿-特異性磷脂酶C活性的方法，其包括用有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥來接觸所述磷脂酶C。
圖1顯示與INF-γ的作用相比，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對一代的(single passage)HPV-31-感染的CIN612 9E角質形成細胞生長的影響。
圖2顯示光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對HPV-31-特異性RNA和DNA水平的影響，和對HPV-31-感染的CIN612 9E角質形成細胞中細胞增殖的影響。
圖3顯示與INF-γ相比，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對多代的HPV-31-感染的CIN6129E角質形成細胞生長的影響。
圖4顯示與INF-γ相比，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對多代的A431細胞生長的影響。
圖5顯示(A)用光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽(A)處理的HPV-31-感染的CIN6129E角質形成細胞和(B)未處理的CIN6129E細胞的細胞形態。
圖6顯示與INF-γ相比，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對多代的HPV-31-感染的CIN6129E角質形成細胞中的HPV-31-特異性DNA水平的影響。
圖7顯示與INF-γ相比，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽對多代的HPV-31-感染的CIN612 9E角質形成細胞中的HPV-31-特異性RNA水平的影響。
發明詳述 為了幫助理解本發明公開的內容，如下定義多個術語。
除非另外特別地說明，本發明使用的單數形式“一個(種)”和“所述”可以指復數冠詞。通常，本發明使用的命名法和本發明描述的有機化學、藥物化學和藥理學的實驗方法是眾所周知的和本領域通常應用的。除非另有定義，本發明所用的所有技術和科學術語通常具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。
術語“個體”指動物，包括但不限于靈長類動物(例如人類)、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠或小鼠。術語“個體”和“患者”在本發明中可互換地使用，例如，提及的哺乳動物個體，如人類個體。
術語“治療”意味著包括減緩或消除障礙、疾病或病癥；或一種或多種與所述障礙、疾病或病癥相關的癥狀；或減緩或根除所述障礙、疾病或病癥本身的病因。
術語“預防”指延遲或消除障礙、疾病或病癥；和/或一種或多種與所述障礙、疾病或病癥相關的癥狀；使個體免于獲得疾病或減少個體獲得障礙、疾病或病癥的風險的方法。
術語“治療有效量”指當施用時，在某種程度上足夠預防一種或多種待治療的障礙、疾病或病癥的癥狀的發展或減緩其的化合物的量。術語“治療有效量”也指研究人員、獸醫、醫生或臨床醫師尋求的足夠引發細胞、組織、系統、動物或人類生物學或醫學反應得化合物的量。
術語“藥學上可接受的載體”、“藥學上可接受的賦形劑”、“生理學可接受的載體”或“生理學可接受的賦形劑”指藥學上可接受的物質、組合物或賦形劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊物質。在一實施方案中，每種組分為在與藥物制劑的其它成分相容含義上的“藥學上可接受的”，并且適于與人類和動物的組織或器官接觸，而沒有過度的毒性、刺激、變態反應、免疫原性或其它問題或并發癥，與合理的益處/危險比例相稱。參見，RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第21版，Lippincott Williams&WilkinsPhiladelphia，PA，2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第5版，Rowe等人編輯，ThePharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版，Ash和Ash Eds.，GowerPublishing Company2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation，Gibson編輯，CRC Press LLCBoca Raton，FL，2004。
術語“活性成分”和“活性物質”指單獨或與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合施用于個體用于治療、預防或改善病癥或疾病的一種或多種癥狀的化合物。如本發明使用的“活性成分”和“活性物質”具體指本發明描述的化合物光學活性異構體。
術語“藥物”、“治療劑”和“化療劑”指施用于個體以治療、預防或改善病癥或疾病的一種或多種癥狀的化合物或其藥物組合物。
術語“釋放控制賦形劑”指與常規立即釋放劑型中的賦形劑相比，其主要功能是改變從劑型中釋放活性物質的持續時間或位置的賦形劑。
術語“非釋放控制賦形劑”指與常規立即釋放劑型中的賦形劑相比，其主要功能不包括改變從劑型中釋放活性物質的持續時間或位置的賦形劑。
術語“烷基”指直鏈飽和一價烴基或支鏈飽和一價烴基。除非另有說明，術語“烷基”也同時包括直鏈和支鏈烷基。在某些實施方案中，烷基為具有1至20(C1-20)、1至15(C1-15)、1至10(C1-10)或1至6(C1-6)個碳原子的直鏈飽和一價烴基，或3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)個碳原子的支鏈飽和一價烴基。如本發明使用的直鏈C1-6和支鏈C3-6烷基也稱為“低級烷基”。烷基的實例包括但不限于甲基、乙基、丙基(包括所有的異構形式)、正丙基、異丙基、丁基(包括所有異構形式)、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基(包括所有異構形式)和己基(包括所有異構形式)。例如，C1-6烷基指1至6個碳原子的直鏈飽和一價烴基或3至6個碳原子的支鏈飽和一價烴基。在某些實施方案中，烷基可以被一個或多個如本發明描述的取代基Q取代。
術語“環烷基”指環狀飽和的橋連或非橋連一價烴基，其可任選地被一個或多個如本發明描述的取代基Q取代。在某些實施方案中，所述環烷基具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至7(C3-7)個碳原子。環烷基基團的實例包括但不限于環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、十氫萘基和金剛烷基。
術語“芳基”指包含至少一個芳香烴環的單環芳香基和/或多環一價芳香基。在某些實施方案中，所述芳基具有6至20(C6-20)、6至15(C6-15)或6至10(C6-10)個環原子。芳基基團的實例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基(azulenyl)、蒽基、菲基、芘基、聯苯基和三聯苯基。芳基也指二環或三環碳環，其中一個環是芳香的，而其它環可以是飽和的、部分不飽和的或芳香的，例如二氫萘基、茚基、茚滿基或四羥基萘基(四氫萘基)。在某些實施方案中，芳基也可以任選地被一個或多個如本發明描述的取代基Q取代。
術語“雜芳基”指包含至少一個芳香環的單環芳香基和/或多環芳香基，其中至少一個芳香環含有一個或多個獨立地選自O、S和N的雜原子。雜芳基基團的每個環可以包含一個或兩個O原子、一個或兩個S原子和/或一個至四個N原子，條件是每個環中雜原子的總量為四個或更少，并且每個環包含至少一個碳原子。所述雜芳基可以在其引起形成穩定化合物的任何雜原子或碳原子位點連接到主結構。在某些實施方案中，所述雜芳基具有5至20、5至15或5至10個環原子。單環雜芳基基團的實例包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基和三嗪基。二環雜芳基基團的實例包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氫異吲哚基和四氫喹啉基。三環雜芳基基團的實例包括但不限于卡唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫噸基。在某些實施方案中，雜芳基也可以任選地被一個或多個如本發明描述的取代基Q取代。
術語“雜環基”或“雜環”指包含至少一個非芳香環的單環非芳香環系統和/或多環環系統，其中一個或多個非芳香環原子為獨立地選自O、S或N的雜原子；并且其余環原子為碳原子。在某些實施方案中，所述雜環基或雜環基團具有3至20、3至15、3至10、3至8、4至7或5至6個環原子。在某些實施方案中，所述雜環為單環、二環、三環或四環環系統，其可以包括稠合的或橋連的環系統，其中氮原子或硫原子可以任選地被氧化，氮原子可以任選地季銨化，一些環可以被部分地或完全地飽和或者芳香化。所述雜環可以在任何雜原子或碳原子處連接到主結構，形成穩定的化合物。這樣的雜環基的實例包括但不限于吖啶基、氮雜卓基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并異噁唑基、苯并異噁嗪基、苯并[4，6]咪唑并[1，2a]吡啶基、苯并二噁烷基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氫呋喃基、苯并四氫噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并噻喃基、苯丙噁嗪基、苯并噁唑基、β咔啉基、卡唑基、苯并二氫吡喃基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氫異喹啉基、二苯并呋喃基、二氫苯并異噻嗪基、二氫苯并異噁嗪基、二氫呋喃基、二氫吡喃基、二氧戊環基、二氫吡嗪基、二氫吡啶基、二氫吡唑基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氧戊環基、1，4-二噻吩基(dithianyl)、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、二氫吲哚基、吲嗪基、吲哚基、異苯并四氫呋喃基、異苯并四氫噻吩基、異苯并噻吩基、異色滿基、異香豆素基、異二氫氮茚基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噻唑基、異噁唑烷基、異噁唑基、嗎啉基、萘啶基、八氫吲哚基、噁二唑基、噁唑烷酮基、噁唑烷基、噁唑并吡啶基、噁唑基、環氧乙烷基、萘嵌間二氮雜苯基、菲啶基、phenathrolinyl、吩砒嗪基(phenarsazinyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎寧環基、四氫呋喃基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、噻二唑基、硫代嗎啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基和1，3，5-三噻烷基(trithianyl)。在某些實施方案中，雜環也可以任選地被一個或多個如本發明描述的取代基Q取代。
術語“酰基”指-C(O)R基團，其中R為烷基、環烷基、烯基、雜環、芳基或雜芳基，各自如本發明定義的。酰基基團的實例包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基、并丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻腦酰基、棕櫚油酰基、油酰基、亞油酰基、花生四烯酰基、苯甲酰基、吡啶并羰基和糠酰基。
術語“鹵素”、“鹵化物”或“鹵代”指氟、氯、溴或碘。
術語“任選取代的”是指基團例如烷基、亞烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜芳基或雜環基可以被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自例如鹵素、氰基、(-CN)、硝基(-NO2)、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra、-Ra、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NRbRc、-C(NRa)NRbRc、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)ORa、-OC(O)NRbRc、-OC(＝NRa)NRbRc、-OS(O)Ra、-OS(O)2R8、-OS(0)NRaRb、-OS(O)2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)ORb、-NRaC(O)NRbRc、-NRaC(NRb)NRcRd、-NRaS(O)Rb、-NRaS(O)2Rb、-NRaS(O)RbRc或-NRaS(O)2RbRc；其中Ra、Rb、Rc和Rd各自獨立地為例如烷基、烯基、環烷基、芳基、雜芳基或雜環基。
術語“任選取代的”是指基團例如烷基、環烷基、烯基、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基或酰基可以被一個或多個取代基Q取代，在一實施方案中，其被一個、兩個、三個或四個取代基Q取代，其中各個Q獨立地選自氰基、鹵素和硝基；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基和雜環基；和-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NRfRg、-C(NRe)NRfRg、-ORe、-OC(O)Re、-OC(O)ORe、-OC(O)NRfR8、-OC(＝NRe)NRfRg、-OS(O)Re、-OS(O)2Re、-OS(O)NRfRg、-OS(O)2NRfRg、-NRfRg、-NReC(O)Rf、-NReC(O)ORf、-NReC(O)NRfRg、-NReC(＝NRh)NRfRg、-NReS(O)Rf、-NReS(O)2Rf、-NReS(O)NRfRg、-NReS(O)2NRfRe、-SRe、-S(O)Re或-S(O)2Re；其中Re、Rf、Rg和Rh各自獨立地為氫；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基或雜環基；或Rf和Rg與它們連接的N原子一起形成雜環。
術語“光學活性的”和“對映異構活性的”在本發明中可互換地使用，指化合物包含至少足夠過量的一種對映異構體多于其它對映異構體，從而該化合物混合物旋轉平面偏振光。對映異構體的光學活性典型地表示為對映體過量(e.e.)。在某些實施方案中，“光學活性的”和“對映異構體活性的”指下述分子集合，所述分子具有的對映體過量為不少于約50％、不少于約70％、不少于約80％、不少于約90％、不少于約91％、不少于約92％、不少于約93％、不少于約94％、不少于約95％、不少于約96％、不少于約98％、不少于約99％或不少于約99.5％、不少于約99.8％。在某些實施方案中，所述化合物包含基于所述消旋體總重量的約95％或更多的(-)對映異構體和約5％或更少的(+)對映異構體。
在描述光學活性化合物中，前綴R和S用于表示所述分子圍繞手性中心的絕對構型。(+)和(-)用于表示化合物的旋光性，即，其中光學活性化合物旋轉平面偏振光的方向。(-)前綴指示化合物為左旋的，即，該化合物向左或逆時針方向旋轉平面偏振光。(+)前綴指示化合物為右旋的，即，該化合物向右或順時針方向旋轉平面偏振光。然而，旋光性的符號(+)和(-)不涉及分子的絕對構型R和S。
術語“溶劑化物”指本發明提供的化合物或其鹽，其進一步包含通過非共價分子間作用力結合的化學當量或非化學當量的溶劑。當溶劑為水時，所述溶劑化物為水合物。
術語“IC50”指在測量反應的實驗中最大反應抑制50％所需要的化合物的量、濃度或劑量。
術語“三環癸-9-基黃原酸酯”指式1的三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸，或藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸 三環5.2.1.02.6-癸-9-基-黃原酸是包含五個手性中心的復雜分子，理論上其可以產生32個立體異構體。然而，由于其環狀結構的限制，該分子存在比理論可能性少得多的立體異構體。一些立體異構體在方案1中顯示，包括四個對映體對，O-外/C-外、(9R)-1A和(9S)-1A；O-外/C-內，(9R)-1B和(9S)-1B；O-內/C-外，(9R)-1C和(9S)-1C；和O-內/C-內，(9R)-1D和(9S)-1D。
本發明預期采用光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A作為治療劑具有優于外消旋或非對映體的混合物的一些優點。首先，光學純的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A是顯著有效的，因而允許使用較低劑量或濃度以獲得與外消旋的或非對映體的混合物相同的益處。第二，本發明預期減少或避免與使用非對映體的或外消旋的混合物相關的不需要的、不期望的、不利的或副的作用。事實上，與外消旋的或非對映體的混合物相比，光學純的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A具有增強的治療指數(參見，如本發明公開的實施例)。使用本發明描述的光學純的異構體或其組合物的其它預期益處可以包括使藥代動力學特征簡單化、減少不期望的藥物-藥物相互作用和減少患者-患者間變化。
因此，本發明提供光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在某些實施方案中，所述光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥具有的對映體過量不少于約50％、不少于約60％、不少于約70％、不少于約80％、不少于約85％、不少于約90％、不少于約91％、不少于約92％、不少于約93％、不少于約94％、不少于約95％、不少于約96％、不少于約97％、不少于約98％、不少于約99％、不少于約99.5％、不少于約99.9％、不少于約99.95％、不少于約99.99％或約100％。
在某些實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的對映體過量不少于約50％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約60％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約70％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約80％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約85％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約90％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約91％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約92％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約93％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約94％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約95％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約96％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約97％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約98％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約99％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約99.5％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約99.9％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約99.95％。在某些實施方案中，所述對映體過量不少于約99.99％。在某些實施方案中，所述對映體過量為約100％。
在某些實施方案中，所述光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥包含不少于約60％、不少于約70％、不少于約80％、不少于約90％、不少于約95％、不少于約96％、不少于約97％、不少于約98％、不少于約99％、不少于約99.5％、不少于約99.8％、不少于約99.9％或約100％重量的(-)-對映異構體。
在某些實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥中(-)-對映異構體的含量不少于約60％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約70％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約80％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約90％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約95％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約96％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約97％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約98％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約99％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約99.5％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約99.8％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量不少于約99.9％重量。在某些實施方案中，(-)-對映異構體的含量為約100％重量。
在另一實施方案中，本發明提供光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的藥學上可接受的鹽。用于制備所述藥學上可接受的鹽的合適的堿包括但不限于無機堿，所述無機堿包括但不限于氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋅和氫氧化銨；和有機堿，例如伯胺、仲胺、叔胺或季胺、脂肪族胺和芳香族胺，包括但不限于L-精氨酸、苯乙芐胺、芐星青霉素(benzathine)、N，N′-二芐基乙二胺、N-芐基苯乙胺、膽堿、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二異丙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、異丙胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明青霉素(hydrabamine)、1H-咪唑、L-賴氨酸、嗎啉、4-(2-羥乙基)-嗎啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羥乙基)-吡咯烷、吡啶、喹核堿、喹啉、異喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、氯普魯卡因、普魯卡因、N-甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羥甲基)-1，3-丙二醇、1-對-氯芐基-2-吡咯烷-1-基甲基-苯并咪唑、三(羥甲基)氨基甲烷和氨基丁三醇。對于另外的藥學上可接受的堿的評論，參見Berge等人，J.Pharm.Sci.1977，66，1-19；和“Handbook of Pharmaceutical Salts，Properties，and Use，”Stah和Wermuth編輯；Wiley-VCH and VHCA，Zurich，2002。
在某些實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的藥學上可接受的鹽為無機鹽，包括但不限于堿金屬鹽，例如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽；鋅鹽；和銨鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為堿金屬鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為堿土金屬鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鋰鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鎂鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鈣鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鈉鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鉀鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為鋅鹽。在某些實施方案中，所述藥學上可接受的鹽為銨鹽。
在另一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的藥學上可接受的鹽為有機鹽。用于制備所述藥學上可接受的鹽的合適的有機堿為如本發明描述的那些。
在另一實施方案中，本發明提供光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的前藥，其包括但不限于在WO 2005/032492中公開的那些，將其全部內容作為參考并入本發明中。
化合物的前藥是在體內容易轉變為母體化合物的母體化合物的功能衍生物。前藥通常是有用的，因為在某些情況下，它們可能比母體化合物更容易施用。例如，它們可以通過口服施用來生物利用，而母體化合物不可以。所述前藥在藥物組合物也可以具有比母體化合物高的溶解度。前藥可以通過多種機制轉變成母體藥物，所述機制包括酶處理和代謝性水解。參見，Harper，Progress in Drug Research 1962，4，221-294；Morozowich等人的“Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs，”Roche編輯，APHA Acad.Pharm.Sci.1977；“Bioreversible Carriers in Drug inDrug Design，Theory and Application，”Roche編輯，APHA Acad.Pharm.Sci.1987；“Design of Prodrugs，”Bundgaard，Elsevier，1985；Wang等人，Curr.Pharm.Design 1999，5，265-287；Pauletti等人，Adv.Drug.Delivery Rev.1997，27，235-256；Mizen等人，Pharm.Biotech.1998，11，345-365；Gaignault等人，Pract.Med.Chem.1996，671-696；Asgharnejad in“Transport Processes inPharmaceutical Systems，”Amidon等人，Ed.，Marcell Dekker，185-218，2000；Balant等人，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.1990，15，143-53；Balimaneand Sinko.adv.Drug Delivery Rev.1999，39，183-209；Browne，Clin.Neuropharmacol.1997，20，1-12；Bundgaard，Arch.Pharm.Chem.1979，86，1-39；Bundgaard，Controlled Drug Delivery 1987，17，179-96；Bundgaard，Adv.Drug Delivery Rev.1992，5，1-38；Fleisher等人，Adv.Drug Delivery Rev.1996，19，115-130；Fleisher等人，Methods Enzymol 1985，112，360-381；Farquhar等人，J.Pharm.Sci.1983，72，324-325；Freeman等人，J.Chem.Soc，Chem.Commun.1991，875-877；Friis和Bundgaard，Eur.J.Pharm.Sci.1996，4，49-59；Gangwar等人，Des.Biopharm.Prop.Prodrugs Analogs，1977，409-421；Nathwani和Wood，Drugs 1993，45，866-94；Sinhababu和Thakker，Adv.DrugDelivery Rev.1996，19，241-273；Stella等人，Drugs 1985，29，455-73；Tan等人，Adv.Drug Delivery Rev.1999，39，117-151；Taylor，Adv.Drug DeliveryRev.1996，19，131-148；Valentino and Borchardt，Drug Discovery Today 1997，2，148-155；Wiebe and Knaus，Adv.Drug Delivery Rev.1999，39，63-80；Waller等人，Br.J.Clin.Pharmac.1989，28，497-507。
在一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的前藥是式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物
其中Ra為用一個或多個選自S、O、N和P的雜原子取代的烷基。
在另一實施方案中，所述前藥為式(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物
其中Rb、Rc和Rd各自獨立地為H或烷基。
式(II)的前藥的合成在方案2中舉例說明(Krise等人，J.Pharm.ScL1999，88，922-927；和Krise等人，J.Pharm.Sci.1999，88，928-932)。化合物2與光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽發生取代反應生成式(II)的相應光學活性前藥。在某些實施方案中，Rb為H。在某些實施方案中，Rc和Rd各自獨立地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。在某些實施方案中，Rc和Rd各自獨立地為甲基、正丙基或叔丁基。在某些實施方案中，Rc和Rd都是甲基。在某些實施方案中，Rc和Rd都是正丙基。在某些實施方案中，Rc和Rd都是叔丁基。在某些實施方案中，Rb為H，Rc和Rd各自獨立地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。
方案2
在另一實施方案中，所述前藥為式(III)的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物
其中Rb和Rc各自獨立地為H或烷基。在某些實施方案中，Rb為H。在某些實施方案中，Rc為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。Rc為甲基、正丙基或正丁基。在某些實施方案中，Rb為H，且Rc為甲基、正丙基或叔丁基。
式(III)的前藥的合成在方案3中舉例說明。使乙酸氯甲酯3(其根據Bodor等人(J.Org.Chem.1983，48，5280-5284)合成的)與光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽反應，得到式(III)的相應光學活性的前藥4，其中Rb為H. 方案3
光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸的制備 1.不對稱氫化硅烷化 本發明提供一種用于合成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的不對稱氫化硅烷化方法(方案4)。如本發明使用的結構中的星號“*”指示基團可能的連接位點，從而，當所述基團連接至期望的位點時，得到的光學活性化合物將如所期望的在相同方向上具有(+)或(-)的光學活性。
在本發明中通過合成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥來闡述該方法。如果需要，所述方法同樣適用于合成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
方案4
在一實施方案中，所述方法包括在與手性單齒膦復合的過渡金屬催化劑存在下，使非手性的C-外烯5與硅烷反應，得到光學活性的有機硅烷6。
在另一實施方案中，所述方法進一步包括用氧化劑氧化所述光學活性的有機硅烷6，得到保留立體化學的光學活性的烷醇7。
在另一實施方案，所述方法進一步包括將所述光學活性的烷醇7轉化成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在另一實施方案中，所述方法包括步驟a)在與手性單齒膦復合的過渡金屬催化劑存在下，使非手性的C-外烯5與硅烷反應，得到光學活性的有機硅烷6；b)用氧化劑氧化該光學活性的有機硅烷6，得到保留立體化學的光學活性的烷醇7；和c)將所述光學活性的烷醇7轉化成光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
用于不對稱氫化硅烷化反應的合適的硅烷包括但不限于式(IV)的化合物
其中 R1、R2和R3各自獨立地為H；鹵素；C1-6烷基，任選地被下述基團取代一個或多個取代基Q，在一實施方案中，一個、兩個或三個取代基Q；或-OR4，其中R4為C1-6烷基、C3-7環烷基或C6-10芳基，各自任選地被一個或多個取代基Q取代，在一實施方案中，各自任選地被一個、兩個或三個取代基Q取代。
合適的硅烷的實例包括但不限于三氯硅烷、甲基二氯硅烷、二甲基氯硅烷、甲氧基二氯硅烷、三乙基硅烷、五甲基二硅氧烷(HSiMe2OTMS)和1，1-二甲基-3，3-二苯基-3-叔-丁基二硅氧烷(HSiMe2OTBDPS)。在某些實施方案中，所述硅烷為三氯硅烷。在某些實施方案中，所述硅烷為甲基二氯硅烷。在某些實施方案中，所述硅烷為二甲基氯硅烷。在某些實施方案中，所述硅烷為甲氧基二氯硅烷。在某些實施方案中，所述硅烷為三乙基硅烷。在某些實施方案中，所述硅烷為五甲基二硅氧烷(HSiMe2OTMS)。在某些實施方案中，所述硅烷為1，1-二甲基3，3-二苯基-3-叔丁基二硅氧烷(HSiMe2OTBDPS)。
在不對稱氫化硅烷化反應中用作催化劑的合適的過渡金屬包括但不限于鉑、銦、鈀、銠和釕。所述過渡金屬催化劑可以是非均質的或均質的。在某些實施方案中，所述過渡金屬催化劑為鉑。在某些實施方案中，所述過渡金屬催化劑為銥。在某些實施方案中，所述過渡金屬催化劑為鈀。在某些實施方案中，所述過渡金屬催化劑銠。在某些實施方案中，所述過渡金屬催化劑為釕。
合適的手性單齒膦配體包括但不限于式(V)的化合物
其中 R5為H；C1-6烷基，任選地被下述基團取代一個或多個取代基Q，在一實施方案中，一個、兩個或三個取代基Q；或-OR8，其中R8為C1-6烷基、C3-7環烷基，或C6-10芳基，各自任選地被一個或多個取代基Q取代，在一實施方案中，各自任選地被一個、兩個或三個取代基Q取代；和 R6和R7各自獨立地為C6-10芳基，任選地被一個或多個取代基Q取代，在一實施方案中，任選地被一個、兩個、三個、四個或五個取代基Q取代。
在某些實施方案中，R5為烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。在某些實施方案中，R5為甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。在某些實施方案中，R5為OR8，其中R8為C1-6烷基、C3-7環烷基或C6-10芳基。在某些實施方案中，R8為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基或己基。在某些實施方案中，R5為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。在某些實施方案中，R6和R7各自獨立地為苯基；或單-、二-、三-、四-或五鹵代苯基。在某些實施方案中，R6和R7為苯基。在某些實施方案中，R5為-OR8，其中R8為甲基。在某些實施方案中，R5為-OR8，其中R8為甲基；和R6和R7為苯基。
O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的手性主要由使用的手性單齒膦的手性決定。例如，與式II的(R)-(+)-單齒膦配體復合的鈀，其中R5為甲氧基，R6和R7為苯基，導致形成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-醇(7)，其導致形成保留立體化學的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
用于氧化所述光學活性的有機硅烷6的合適的氧化劑包括但不限于過氧化氫；和過酸，例如過乙酸(AcOOH)和間-氯過苯甲酸。在某些實施方案中，所述氧化劑為過氧化氫。在某些實施方案中，所述氧化劑為過酸。在某些實施方案中，所述氧化劑為過乙酸或間-氯過苯甲酸。
使用本領域技術人員已知的方法，可以容易地將光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-醇轉變為光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，所述方法參見“Xanthates and Related Compounds，”Rao Ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1971，第7-31頁；美國專利號4,602,037；和Gonzalez-Roura等人，Lipids 2002，37，401-40。
起始原料非手性的C-外烯5是由雙環戊二烯8制備的，如方案5所示。首先，用氫溴酸處理雙環戊二烯8，經由華-米二氏重排得到C-外-溴代烯9(Brunson等人，J.Am.Chem.Soc.1945，67，1178-1180)。氫化C-外-溴代烯9，得到C-外溴代烷10，然后，將其脫溴化，形成非手性的C-外烯5(Youngblood等人，J.Org.Chem.1956，27，1436-1438；Osawa等人，J.Org.Chem.1982，47，1923-1932)。
方案5
2.酶拆分方法I 本發明還提供一種通過酶拆分不飽和的酯11來合成光學合成的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的方法
其中R9C(O)-為C1-24酰基。
式11的結構代表兩對對映異構體(R)-11A和(S)-11A，和(R)-11B和(S)-11B。在某些實施方案中，在酶拆分中使用的酯11為所有四種立體異構體(R)-11A、(S)-11A、(R)-11B和(S)-11B的混合物。在某些實施方案中，在酶拆分中使用的酯11為(R)-11A和(S)-11A的混合物，例如其外消旋混合物。在某些實施方案中，在酶拆分中使用的酯11為(R)-11B和(R)-11B的混合物，例如其外消旋混合物。
在某些實施方案中，酰基為乙酰基、丙酰基、丁酰基、異丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻腦酰基、棕櫚油酰基、油酰基、亞油酰基或花生四烯酰基。在某些實施方案中，所述酰基為乙酰基。在某些實施方案中，所述酰基為丙酰基。在某些實施方案中，所述酰基為丁酰基。在某些實施方案中，所述酰基為異丁酰基。在某些實施方案中，所述酰基為戊酰基。在某些實施方案中，所述酰基為己酰基。在某些實施方案中，所述酰基為庚酰基。在某些實施方案中，所述酰基為辛酰基。在某些實施方案中，所述酰基為壬酰基。在某些實施方案中，所述酰基為癸酰基。在某些實施方案中，所述酰基為十二烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為十四烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為十六烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為十八烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為二十烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為二十二烷酰基。在某些實施方案中，所述酰基為肉豆蔻腦酰基。在某些實施方案中，所述酰基為棕櫚油酰基。在某些實施方案中，所述酰基為油酰基。在某些實施方案中，所述酰基為亞油酰基。在某些實施方案中，所述酰基為花生四烯酰基。在某些實施方案中，所述酰基為天然脂肪酰基，包括但不限于丁酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻腦酰基、棕櫚油酰基、油酰基、亞油酰基和花生四烯酰基。
在一實施方案中，所述方法包括步驟用水解酶選擇性地水解不飽和的酯11，取決于酶的特異性，得到光學活性的(+)或(-)-烯醇12，并且保留另一種對映異構體作為光學活性的未反應的酯11，其具有相反光學活性(方案6)。如果期望的對映異構體是酯形式，所述方法也可包括在酶催化水解之后，使用常規方法例如層析法從光學活性的未反應的酯11中分離出光學活性的烯醇12的步驟。當期望的對映異構體是光學活性的未反應的酯11時，所述方法進一步包括將光學活性的酯11轉化成相應光學活性的醇12的步驟，其可以使用本領域技術人員已知的常規方法完成，例如，用堿例如氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀處理光學活性的酯11。
如本發明使用的術語“水解酶”指水解酶或包含水解酶的微生物。所述水解酶可以從任何來源獲得，包括但不限于動物、植物和微生物。所述酶可以以任何常規形式應用，例如以純化形式、粗制形式、微生物發酵液、發酵液或發酵液的濾液。另外，所述酶或微生物可以是固定化的。
在酶拆分中使用的合適的水解酶包括但不限于脂肪酶、酯酶、肽酶、酰胺酶和酰基轉移酶。
合適的脂肪酶包括但不限于Amano PS-30(洋蔥假單胞菌)、AmanoGC-20(念珠地絲菌)、Amano APF(Aspergillus niger)、Amano AK(Pseudomonas sp.)、熒光假單胞菌脂酶、Amano Lipase P30(Pseudomonassp.)、Amano P(Pseudomonas fluorescens)、Amano AY-30(Candidacylindracea)、Amano N(Rhizopus niveus)、Amano R(Penicillium sp.)、Amano FAP(Rhizopus oryzae)、Amano AP-12(Aspergillus nlger)、AmanoMAP(Mucor melhei)、Amano GC-4(念珠地絲菌)、Sigma L-0382和L-3126(porcine pancrease)、Lipase OF、Lipase R(Rhizopus sp.)、Sigma L-3001(Wheat germ)、Sigma L-1754(Candida cytindracea)、Sigma L-0763(Chromobacterlum vlscosum)、Amano K-30(Aspergillus nlger)和南極假絲酵母(Candida antactica)脂酶A或熒光假單胞菌脂肪酶。合適的肽酶包括但不限于稻根霉菌肽酶。
方案6
在某些實施方案中，所述酶拆分在緩沖溶液中進行，所述緩沖溶液包括無機酸鹽緩沖液，例如磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉；和有機酸鹽緩沖液，例如檸檬酸鈉。取決于使用的特異性酶或微生物，所述緩沖液的濃度可以在約0.005至約2M或約0.005至約0.5M的范圍內變化。
根據酯11的溶解度，可以向反應混合物中加入表面活性劑以使酶解物增溶。合適的表面活性劑包括但不限于非離子表面活性劑，例如烷基芳基聚醚醇、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇和Triton X-100。
也可以加入有機溶劑作為共溶劑以促進所述酶拆分。合適的溶劑包括但不限于乙腈、叔丁基甲醚、THF、DMSO、DMF和醇。
在另一實施方案中，所述方法用于制備(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，如方案6所示，其包括步驟a)用水解酶選擇性地水解酯11，得到光學活性的(-)-酯11和光學活性的(+)-烯醇12；b)水解該光學活性的(-)-酯11，得到光學活性的(-)-烯醇12；c)還原該光學活性的(-)-烯醇12，得到保留立體化學的光學活性的(-)烷醇7；和d)將該光學活性的(-)-烷醇7轉化成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在本發明提供的方法中，水解反應(步驟b)和還原反應(步驟c)不限于任何特定順序。如果需要，還原反應可以在水解反應之前進行。
如果需要，也可以類似地制備(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。用于合成(+)對映異構體的方法包括步驟a)用水解酶選擇性地水解酯11，得到光學活性的(-)-酯11和光學活性的(+)-烯醇12；b)還原該光學活性的(+)-烯醇12，得到保留立體化學的光學活性的(+)-烷醇7；和c)將光學活性的(+)-烷醇7轉化成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在某些實施方案中，所述水解酶為脂酶、酯酶、肽酶、酰胺酶或酰基轉移酶。在某些實施方案中，所述水解酶為脂酶。在某些實施方案中，所述水解酶為肽酶。在某些實施方案中，所述水解酶為酯酶。在某些實施方案中，所述水解酶為酰胺酶。在某些實施方案中，所述水解酶為酰基轉移酶。在某些實施方案中，所述水解酶為各自任選固定的稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或熒光假單胞菌脂酶。在某些實施方案中，所述水解酶為稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或固定的南極假絲酵母脂酶A。在某些實施方案中，所述水解酶為稻根霉菌肽酶。在某些實施方案中，所述水解酶為南極假絲酵母脂酶A。在某些實施方案中，所述水解酶為固定的南極假絲酵母脂酶A。
在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶為催化量的，即，在所述酶拆分反應中酶的含量不大于酯11的約50％、不大于約25％、不大于約20％、不大于約15％或不大于約10％重量。在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的約50％重量。在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的約25％重量。在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶為不大于酯11的約20％重量。在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的約15％重量。在某些實施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的約10％重量。
在某些實施方案中，所述酶拆分是在約5至約100℃、約10至約75℃、約15至60℃、約20至約50℃、約25至約40℃、約30至約40℃的溫度下進行的。在某些實施方案中，所述溫度為約5至約100℃。在某些實施方案中，所述溫度為約10至約75℃。在某些實施方案中，所述溫度為約15至約60℃。在某些實施方案中，所述溫度為約20至約50℃。在某些實施方案中，所述溫度為約25至約40℃。在某些實施方案中，所述溫度為約30至約40℃。
在某些實施方案中，所述拆分進行的持續時間不超過約48小時、不超過約36小時或不超過約24小時。
起始原料O-外/C-外-酯11是由雙環戊二烯8制備的，如方案7所示。首先，用硫酸處理雙環戊二烯8，形成O-外/C-外烯醇12(Brunson和Riener，J.Am.Chem.Soc.1945，67，723-728)，接著，進行酰化，得到起始原料O-外/C-外-酯11。
方案7
3.酶拆分方法II 在另一實施方案中，光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥是通過酶拆分酯13制備的
其中R9C(O)-如本發明描述的。式13的結構代表兩種對映異構體(R)-13和(S)-13。
在一實施方案中，所述方法包括步驟用水解酶選擇性地水解酯13，取決于酶的特異性，得到光學活性的(+)或(-)-烷醇7，并且保留另一種對映異構體作為光學活性的未反應的酯13，其具有相反光學活性。所述方法也可包括在酶催化水解之后，使用常規方法，例如層析法從光學活性的未反應的酯13中分離出光學活性的烷醇7的步驟。當期望的對映異構體是光學活性的未反應的酯13時，所述方法進一步包括將光學活性的酯13轉化成相應光學活性的醇7的步驟，其可以使用本領域技術人員已知的常規方法完成，例如，用堿例如氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀處理光學活性的酯13。合適的反應條件和參數，例如水解酶、溶劑和緩沖液都是如本發明描述的那些。
在另一實施方案中，用于制備(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的方法，包括步驟a)用水解酶選擇性地水解酯13，得到光學活性的(-)-酯13和光學活性的(+)-烷醇7；b)水解該光學活性的(-)-酯13，得到光學活性的(-)-烷醇7；和c)將光學活性的(-)-烷醇7轉化成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
如果需要，也可以類似地制備(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。用于合成(+)對映異構體的方法包括步驟a)用水解酶選擇性地水解酯13，得到光學活性的(-)-酯13和光學活性的(+)-烷醇7；b)將該光學活性的(+)-烷醇7轉化成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在某些實施方案中，所述水解酶為各自任選固定的稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或熒光假單胞菌脂酶。在某些實施方案中，所述水解酶為稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或熒光假單胞菌脂酶。在某些實施方案中，所述水解酶為稻根霉菌肽酶。在某些實施方案中，所述水解酶為南極假絲酵母脂酶A。在某些實施方案中，所述水解酶為熒光假單胞菌脂酶。
起始原料酯13是由O-外/C-外烯醇12制備的，如方案7所示。將O-外/C-外烯醇12氫化成O-外/C-外烯醇7，接著酰化，得到起始原料O-外/C-外酯13。
方案8
所述光學活性的O-外/C-外三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥也可以使用本領域技術人員已知的其它常規方法和技術制備。例如，外消旋的O-外/C-外三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A可以通過如下方法拆分與光學活性的堿反應，形成非對映異構體，接著層析或分級結晶，并用游離再生，或轉化成其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
或者，外消旋的O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥可以使用手性柱或TLC來色譜拆分。用于分離所述對映異構體的各種手性柱和洗脫液都是可獲得的，并且用于分離的適宜條件可以由本領域技術人員根據已知的方法憑經驗確定。可獲得用于分離本發明提供的對映異構體的示例性手性柱包括但不限于
OB、
OB-H、
OD、
OD-H、
OF、
OG、
OJ和
OK。
另外的方法和技術可以在例如Enantiomers，Racemates and Resolutions，Jacques等人，Wiley-Interscience，New York，1981；Wilen，Collet和Jacques，Tetrahedron 1977，2725-2736；Stereochemistry of Carbon Compounds，Eliel，McGraw-Hill，New York，1962；Wilen in Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions，Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，Indianapolis，1972，第268-298頁；Stereochemistry of Organic Compounds，Eliel，Wilen和Manda，John Wiley&Sons，Inc.，1994；和StereoselectiveSynthesis A Practical Approach，Nogradi，VCH Publishers，Inc.，New York，1995中找到。
O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的光學活性的立體異構體；和手性中間體，例如化合物6、7和11至13的同一性和光學純度可以通過旋光分析、NMR或本領域已知的其它分析方法確定。
藥物組合物 本發明提供藥物組合物，其包含作為活性成分的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，與一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體的組合。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含至少一種釋放控制賦形劑或載體。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含至少一種非釋放控制賦形劑或載體。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含至少一種釋放控制和至少一種非釋放控制賦形劑或載體。
本發明提供的藥物組合物可以以單位劑型或多劑型(multiple-dosageform)提供。如本發明使用的單位劑型指適于施用至人類或動物個體，且如本領域已知的分別進行包裝的物理分散單位。每個單位劑量包含足夠產生期望治療效果的預定量的活性成分與需要的藥物載體或賦形劑。單位劑型的實例包括安瓿、注射器和分別包裝的片劑和膠囊。單位劑型可以以其部分或多倍給藥。多劑型為多個相同的單位劑型，其被包裝在單一容器中，需要按分離的單位劑型施用。多劑型的實例包括小瓶、片劑或膠囊瓶、或品脫或加侖瓶。
所述光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A，和其藥學上可接受的鹽、溶劑化物及前藥可以單獨施用，或者與一種或多種其它活性成分組合施用。本發明提供的藥物組合物可以配制成用于口服、腸胃外和表面施用的多種劑型。所述藥物組合物也可以配制成改性釋放劑型，包括延遲-、延緩-、延長-、緩釋-、脈沖-、控制-、促進-和快速-、靶向-、程序化-釋放劑型和胃滯留劑型。這些劑型都可以根據本領域技術人員已知的常規方法和技術制備(參見RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，supra；Modified-Release Drug Deliver Technology，Rathbone等人編輯，Eds.，Drugs and the Pharmaceutical Science，Marcel Dekker，Inc.NewYork，NY，2002；Vol.126)。
在一實施方案中，所述藥物組合物以用于口服施用至個體的劑型提供，其包含光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體。所述藥物組合物也可以包括一種或多種進一步增強其藥理學性質的助劑。合適的助劑包括但不限于離子洗滌劑、脂質和類固醇。離子洗滌劑的實例包括C6-19脂肪酸及其鹽，例如癸酸、十一烷酸、月桂酸、癸酸鉀、十一烷酸鉀、月桂酸鉀、癸酸鈉、十一烷酸鈉和月桂酸鈉；和C8-18烷基硫酸鹽，包括十二烷基硫酸鈉和十二烷基硫酸鉀。脂質的實施例包括磷脂類，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇；糖脂例如神經節苷脂(ganglisoide)；和神經鞘脂類，例如鞘磷脂。類固醇類的實例包括硬脂酰胺、膽固醇；膽甾烷醇、膽烷酸、菠菜甾醇和α，β，γ-sisterol。
在另一實施方案中，所述藥物組合物以腸胃外施用至個體的劑型提供，其包含光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體。所述藥物組合物也可以包含一種或多種如本發明描述的進一步增強其藥理學特性的助劑。
在另一實施方案中，所述藥物組合物以表面施用至個體的劑型提供，其包含光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體。所述藥物組合物也可以包含一種或多種如本發明描述的進一步增強其藥理學特性的助劑。
本發明提供的藥物組合物可以一次性施用，或者按時間間隔多次給藥，應當理解，精確劑量和治療的持續時間可以隨待治療患者的年齡、體重和病癥而變化，并可以使用已知的試驗設計或根據體內或體外試驗或診斷數據外推確定。應進一步理解，對于任何具體的個體，特定劑量方案應當根據個體需要和施用或監督施用所述制劑的人員的專業判斷隨時調整。
A.口服施用 本發明提供的藥物組合物可以以口服施用的固體、半固體或液體劑型提供。如本發明使用的，口服施用還包括含服、舌面和舌下施用。合適的口服劑型包括但不限于片劑、膠囊、丸劑、糖錠劑、錠劑、軟錠劑、扁囊劑、小球、加藥口香糖、顆粒劑、散裝粉末劑、泡騰或非泡騰粉劑或顆粒劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、溶液劑、糯米紙囊劑、撒劑、酏劑和糖漿劑。除了活性成分之外，藥物組合物可以包含一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑，其包括但不限于粘合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、潤濕劑、潤滑劑、助流劑、著色劑、染料遷移抑制劑、甜味劑和調味劑。
粘合劑或造粒劑賦予片劑粘性，以保護片劑在壓制后保持完整。合適的粘合劑或造粒劑包括但不限于淀粉例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和預膠化淀粉(例如STARCH 1500)；明膠；糖類，例如蔗糖、葡萄糖、葡萄糖、糖蜜和乳糖；天然樹膠和合成樹膠，例如阿拉伯膠、海藻酸、海藻酸鹽、鹿角菜的提取物、Panwar gum、印度樹膠、mucilage of isabgol husks、羧甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硅酸鋁鎂鹽(Veegum)、落葉松阿拉伯半乳聚糖、粉狀西黃蓍膠和瓜爾膠；纖維素，例如乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)；微晶纖維素，例如AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(FMC Corp.，Marcus Hook，PA)；及其混合物。合適的填充劑包括但不限于滑石、碳酸鈣、微晶纖維素、粉末狀纖維素、葡聚糖結合劑、高嶺土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、預膠化淀粉及其混合物。所述粘合劑或填充劑在本發明提供的藥物組合物中的存在量可以為約50至約99％重量。
合適的稀釋劑包括但不限于磷酸二鈣、硫酸鈣、乳糖、山梨醇、蔗糖、肌醇、纖維素、高嶺土、甘露醇、氯化鈉、無水淀粉和粉末狀糖。某些稀釋劑例如甘露醇、乳糖、山梨醇、蔗糖和肌醇，當以足量存在時，可以賦予某些壓制片以通過咀嚼從而在口腔中發生崩解的性質。這樣的壓制片可以用作咀嚼片。
合適的崩解劑包括但不限于瓊脂；膨潤土；纖維素，例如甲基纖維素和羧甲基纖維素；木制品；天然海綿；陽離子交換樹脂；海藻酸；樹膠，例如瓜爾膠和Veegum HV；桔漿；交聯纖維素，例如交聯羧甲纖維素；交聯聚合物，例如交聚維酮；交聯淀粉；碳酸鈣；微晶纖維素，例如淀粉羥乙酸鈉；聚克立林鉀；淀粉，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉和預膠化淀粉；粘土；aligns；及其混合物。崩解劑在本發明提供的藥物組合物中的含量根據制劑的類型變化，并且其是本領域普通技術人員容易判斷的。本發明提供的藥物組合物可以包含約0.5至約15％，或約1至約5％重量的崩解劑。
合適的潤滑劑包括但不限于硬脂酸鈣；硬脂酸鎂；礦物油；輕質礦物油；甘油；山梨醇；甘露醇；二醇，例如山萮酸甘油酯和聚乙二醇(PEG)；硬脂酸；十二烷基硫酸鈉；滑石；氫化植物油，包括花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；硬脂酸鋅；油酸乙酯；月桂酸乙酯；瓊脂；淀粉；石松子；二氧化硅或二氧化硅凝膠劑，例如
200(W.R.Grace Co.，Baltimore，MD)和CAB-O-S
(Cabot Co.of Boston，MA)；及其混合物。本發明提供的藥物組合物可以包含約0.1至約5％重量的潤滑劑。
合適的助流劑包括膠態二氧化硅、CAB-O-
(Cabot Co.of Boston，MA)和不含石棉的滑石。著色劑包括任何批準的、證實的、混懸在氧化鋁水合物上的水溶性的FD&C染料，和水不溶性的FD&C染料，和色淀及其混合物。色淀為水溶性染料吸附至重金屬水合氧化物上，得到不溶性形式的染料的組合。調味劑包括從植物，例如果實提取的天然調味劑，和得到令人愉快的味覺的化合物例如薄荷和水楊酸甲酯的合成性混合物。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇、果汁、甘油和人工甜味料，糖精和阿司帕坦。合適的乳化劑包括明膠、阿拉伯膠、西黃蓍膠、膨潤土和表面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(
20)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯80(
80)和油酸三乙醇胺酯。懸浮劑和分散劑包括羧甲基纖維素鈉、果膠、西黃蓍膠、硅酸鋁鎂、阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。防腐劑包括甘油、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉和醇。潤濕劑包括單硬脂酸丙二醇酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、單月桂酸二甘醇酯和聚氧乙烯月桂醚。溶劑包括甘油、山梨醇、乙醇和果汁。在乳劑中使用的非水液體的實例包括礦物油和棉籽油。有機酸包括檸檬酸和酒石酸。二氧化碳的來源包括碳酸氫鈉和碳酸鈉。
應當理解許多載體和賦形劑可以起多種功能作用，甚至在相同的制劑中。
[本發明提供的藥物組合物可以以壓制片、研磨片、可咀嚼錠劑、速溶片、多層壓制片或腸包衣片、糖包衣或膜包衣片提供。腸包衣片為用物質包衣的壓制片，所述物質能抗胃酸作用但在腸中溶解或崩解，從而保護活性成分免于胃酸環境的破壞。腸包衣包括但不限于脂肪酸、脂質、水楊酸苯酯、蠟、紫膠、含氨紫膠和醋酸纖維素對苯二甲酸酯。糖衣片為被糖衣包裹的壓制片，所述糖衣在掩蔽令人不愉快的味道或氣味方面和在保護片劑免于氧化方面有利。膜包衣片為用水溶性物質的薄層層覆蓋的壓制片。膜包衣包括但不限于羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇4000和醋酞纖維素對苯二甲酸酯。膜包衣賦予與糖衣相同的一般特性。多層壓制片為通過超過一次壓制循環制備的壓制片，包括層壓片和壓制包衣或干包衣片。
所述片劑劑型可以由單獨的粉末、結晶或顆粒形式的活性成分或者與一種或多種本發明描述的載體或賦形劑的組合來制備，所述載體或賦形劑包括粘合劑、崩解劑、控制釋放聚合物、潤滑劑、稀釋劑和/或著色劑。調味劑和甜味劑特別地用于形成咀嚼片和錠劑。
本發明提供的藥物組合物可以以軟膠囊或硬膠囊提供，所述膠囊可以由明膠、甲基纖維素、淀粉或海藻酸鈣制備。硬明膠膠囊也稱為干填充的膠囊(DFC)，其由兩部分組成，一部分套在另一部分上，從而完全包圍了活性成分。軟彈性膠囊(SEC)是一種軟的、小球狀殼，例如明膠殼，其中通過加入甘油、山梨醇或類似多元醇來增塑。所述軟明膠殼可以包含防腐劑來防止微生物生長。合適的防腐劑為如本發明描述的那些，包括對羥基苯甲酸甲酯和丙酯，及山梨酸。本發明提供的液體、半固體和固體劑型可以包囊在膠囊中。合適的液體和半固體劑型包括在碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液劑和混懸劑。包含這樣的溶液的膠囊可以如在美國專利號4,328,245；4,409,239；和4,410,545中描述的制備。所述膠囊也可以如本領域技術人員已知的進行包衣，以改善或延緩活性成分的溶出。
本發明提供的藥物組合物可以以液體和半固體劑型提供，所述劑型包括乳劑、溶液劑、混懸劑、酏劑和糖漿劑。乳劑為其中一種液體以小球形式分散在另一種液體中的二相系統，其可以是水包油型或油包水型。乳劑可以包括藥學上可接受的非水液體或溶劑、乳化劑和防腐劑。混懸劑可以包括藥學上可接受的懸浮劑和防腐劑。含水醇溶液可以包括藥學上可接受的縮醛，例如低級烷基醛的二(低級烷基)縮醛(術語“低級”指具有1至6個碳原子的烷基)，例如乙醛二乙基縮醛；和具有一個或多個羥基的水可混溶溶劑，例如丙二醇和乙醇。酏劑是澄清的、甜味的含水醇溶液。糖漿劑為糖例如蔗糖的濃的水溶液，并且可以包含防腐劑。對于液體劑型，例如。在聚乙二醇中的溶液劑可以用足量的藥學上可接受的液體載體例如水稀釋，以方便地測量用于給藥。
其它有用的液體和半固體劑型包括但不限于包含本發明提供的活性成分和二烴基化單-或聚-烷撐二醇的那些劑型，所述單-或聚-烷撐二醇包括1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四乙醇二甘醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的近似平均分子量。這些制劑可以進一步包含一種或多種抗氧劑，例如丁基化羥基甲苯(BHT)、丁羥茴醚(BHA)、沒食子酸丙酯、維生素E、氫醌、羥基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、腦磷脂、抗壞血酸、蘋果酸、山梨醇、磷酸、亞硫酸氫鹽、焦亞硫酸鈉、硫代二丙酸及其酯、和二硫代氨基甲酸鹽。
本發明提供的用于口服施用的藥物組合物還可以以脂質體、膠束、微球或納米系統的形式提供。Miccellar劑型可以如在美國專利號6,350,458中描述的制備。
本發明提供的藥物組合物可以以非泡騰的或泡騰的顆粒劑和粉劑提供，其可重構形成液體劑型。在非泡騰顆粒劑或粉劑中使用的藥學上可接受的載體和賦形劑可以包括稀釋劑、甜味劑和潤濕劑。在泡騰顆粒劑或粉劑中使用的藥學上可接受的載體和賦形劑可以包括有機酸和二氧化碳源。
在所有上述劑型中可以使用著色劑和調味劑。
本發明提供的藥物組合物可以配制成立即釋放或改性釋放劑型，包括延遲-、緩釋-、脈沖-、控制-、靶向-和程序化-釋放形式。
本發明提供的藥物組合物可以與不會損害期望的治療作用的其它活性成分共同配制，或者與補充期望作用的物質，例如抗酸劑、質子泵抑制劑和H2-受體拮抗劑共同配制。
B.腸胃外給藥 本發明提供的藥物組合物可以通過注射、輸注或植入腸胃外施用，用于局部或全身施用。如本發明使用的腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌內、滑膜內和皮下施用。
本發明提供的藥物組合物可以配制成適于腸胃外施用的任何劑型，包括溶液劑、混懸劑、乳劑、膠束、脂質體、微球、納米系統和適于在注射劑前在液體中制成溶液或懸浮液的固體形式。這樣的劑型可以以藥物科學領域的技術人員已知的常規方法制備(參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，同上)。
預期用于腸胃外施用的藥物組合物可以包含一種或多種藥學上可接受的載體和賦形劑，包括但不限于水性賦形劑、水可溶混賦形劑、非水性賦形劑、抗微生物劑或抗微生物生長的防腐劑、穩定劑、溶解增強劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧劑、局部麻醉劑、助懸劑和分散劑、濕潤劑或乳化劑、絡合劑、多價螯合劑(sequestering agent)或螯合劑、防凍劑、冷凍保護劑、增稠劑、pH調節劑和惰性氣體。
合適的水性賦形劑包括但不限于水、鹽水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、氯化鈉注射液、Ringers注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、葡萄糖和乳酸化的Ringers注射液。非水性賦形劑包括但不限于植物來源的非揮發油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄欖油、花生油、薄荷油、紅花油、芝麻油、豆油、氫化植物油、氫化豆油和椰子油的中鏈甘油三酯、及棕櫚種子油。水可溶混賦形劑包括但不限于乙醇、1，3-丁二醇、液體聚乙二醇(例如聚乙二醇300和聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和二甲亞砜。
合適的抗微生物劑或防腐劑包括但不限于苯酚、甲酚、汞劑、苯甲醇、氯代丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯銨、芐索氯銨、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯及山梨酸。合適的等滲劑包括但不限于氯化鈉、甘油和葡萄糖。合適的緩沖劑包括但不限于磷酸鹽和檸檬酸鹽。合適的抗氧劑為如本發明描述的那些，包括亞硫酸氫鹽和焦亞硫酸鈉。合適的局部麻醉劑包括但不限于鹽酸普魯卡因。合適的助懸劑和分散劑為如本發明描述的那些，包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。合適的乳化劑包括本發明描述的那些，包括聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯80和油酸三乙醇胺酯。合適的多價螯合劑或螯合劑包括但不限于EDTA。合適的pH調節劑包括但不限于氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸和乳酸。合適的絡合劑包括但不限于環糊精，包括α-環糊精、β-環糊精、羥丙基-β-環糊精、磺基丁基醚-β-環糊精和磺基丁基醚7-β-環糊精(
CyDex，Lenexa，KS)。
本發明提供的藥物組合物可以配制用于單劑量或多劑量施用。所述單劑量制劑包裝在安瓿、小瓶或注射器中。所述多劑量腸胃外制劑必須包含抑菌或抑真菌濃度的抗微生物劑。如本領域已知和實踐的，所有的腸胃外制劑都必須是無菌的。
在一實施方案中，所述藥物組合物以即用無菌溶液提供。在另一實施方案中，所述藥物組合物以無菌無水可溶性產品提供，包括冷凍干燥粉末和皮下注射片劑，在使用前用賦形劑重構。在另一實施方案中，所述藥物組合物以即用無菌混懸劑提供。在另一實施方案中，所述藥物組合物以無菌無水不溶性產品提供，在使用前用賦形劑重構。在另一實施方案中，所述藥物組合物以即用無菌乳劑提供。
本發明提供的藥物組合物可以配制成立即釋放或改性釋放劑型，包括延遲-、緩釋-、脈沖-、控制-、靶向-和程序化-釋放形式。
所述藥物組合物可以配制成混懸劑、固體、半固體或觸變液體，用于作為植入的貯庫施用。在一實施方案中，本發明提供的藥物組合物分散在固體內部基質中，其被外部聚合膜所包圍，所述外部聚合膜不溶于體液中，但是允許藥物組合物中的活性成分擴散通過。
合適的內部基質包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚丁基丙烯酸甲酯、增塑的或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龍、增塑的聚對苯二甲酸乙酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、硅酮橡膠、聚二甲硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、親水性聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝膠、膠原、交聯聚乙烯醇及交聯的部分水解的聚乙酸乙烯酯。
合適的外部聚合膜包括聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙烯基乙酸酯共聚物、硅酮橡膠、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯化乙烯與乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、離子交聯聚合物聚對苯二甲酸乙二酯、丁基橡膠氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。
C.表面施用 本發明提供的藥物組合物可以表面施用于皮膚、腔或粘膜。如本發明使用的表面施用包括皮膚(皮內)、結膜、角膜內、眼內、眼眶、耳、透皮、鼻腔、陰道、尿道、呼吸道和直腸施用。
本發明提供的藥物組合物可以配制成適于表面施用以獲得作用或全身作用的任何劑型，包括乳劑、溶液劑、混懸劑、乳膏劑、凝膠劑、水凝膠、軟膏劑、撲粉、敷料、酏劑、洗劑、混懸劑、酊劑、糊劑、泡沫劑、膜劑、氣霧劑、沖洗劑、噴霧劑、栓劑、綁帶、皮膚貼劑。本發明提供的藥物組合物的表面制劑還可以包括脂質體、膠束、微球、納米系統及其混合物。
適用于本發明提供的表面制劑的藥學上可接受的載體和賦形劑包括但不限于水性賦形劑、水可溶混賦形劑、非水性賦形劑、抗微生物劑或抗微生物生長的防腐劑、穩定劑、溶解增強劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧劑、局部麻醉劑、助懸劑和分散劑、濕潤劑或乳化劑、絡合劑、多價螯合劑或螯合劑、滲透促進劑、低溫保護劑(cryopretectants)、冷凍保護劑、增稠劑和惰性氣體。
所述藥物組合物也可以通過電穿孔、離子電滲療法、超聲透入療法、超聲促滲和顯微針或無針注射表面施用，例如POWDERJECTTM(ChironCorp.，Emeryville，CA)，and BIOJECTTM(Bioject Medical Technologies Inc.，Tualatin，OR)。
本發明提供的藥物組合物可以以軟膏劑、乳膏劑和凝膠劑的形式提供。合適的軟膏劑賦形劑包括油脂性基質或烴基基質，包括豬脂、安息香豚脂、橄欖油、棉籽油、白凡士林及液體石臘和聚乙烯的復合軟膏基質(plastibase)；可乳化基質或可吸收基質，例如親水性凡士林、硫酸羥基硬脂精和無水羊毛脂；水可除去性基質，例如親水性軟膏；水溶性軟膏基質，包括不同分子量的聚乙二醇；乳劑基質，油包水(W/O)型乳劑或水包油型(O/W)乳劑，包括鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸(參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，同上)。這些賦形劑為軟化劑，但通常需要加入抗氧劑和防腐劑。
合適的乳膏劑基質可以為水包油型或油包水型。乳膏劑賦形劑可以是水可洗除型，并且包含油相、乳化劑和水相。油相也稱為“內”相，其通常由凡士林和脂肪醇例如鯨蠟醇或硬脂醇組成。盡管不一定，但水相的體積通常高于油相，并且通常包含濕潤劑。在乳膏劑中的乳化劑可以是非離子的、陰離子的、陽離子的或兩性的表面活性劑。
膠劑為半固體、懸浮類型的系統。單相凝膠劑包含基本上均勻分布在液體載體中的有機高分子。合適的膠凝劑包括交聯丙烯酸聚合物，例如卡波姆、羧基聚亞烷基、Carbopol(R)；親水性聚合物，例如聚氧化乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纖維素聚合物，例如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和甲基纖維素；樹膠，例如西黃蓍膠和黃原膠；海藻酸鈉；和明膠。為了制備均勻的凝膠劑，可以加入分散劑例如醇或甘油，或者可以通過研磨、機械攪拌和/或攪拌將膠凝劑分散在其中。
本發明提供的藥物組合物可以以栓劑、陰道栓、桿劑(bougies)、泥敷劑或泥罨劑、糊劑、粉劑、敷料、乳膏劑、硬膏劑、避孕劑、軟膏劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、衛生棉條、凝膠劑、泡沫劑、噴霧劑或灌腸劑提供，經直腸、尿道、陰道或陰道周圍給藥。這些劑型可以使用常規方法制備，所述方法如在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(同上)中描述的。
直腸、尿道和陰道栓劑為用于插入人體腔孔(body orifices)中的固體，其在常溫下是固體，但是在體溫下熔融或軟化將活性成分釋放到腔孔內。在直腸和陰道栓劑中使用的藥學上可接受的載體包括賦形劑，例如硬化劑，當與本發明提供的藥物組合物配制時，其產生接近體溫的熔點；和如本發明描述的抗氧劑，包括亞硫酸氫鹽和焦亞硫酸鈉。合適的賦形劑包括但不限于可可脂(可可油)、甘油-明膠、聚乙二醇(聚氧乙二醇)、鯨蠟、石蠟、白蠟和黃蠟，和合適的脂肪酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物、水凝膠例如聚乙烯醇、甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸；甘油膠。可以使用多種賦形劑的組合。直腸和陰道栓劑可以通過壓制方法或模壓法制備。直腸和陰道栓劑的典型的重量為約2至3g。
本發明提供的藥物組合物可以以溶液劑、混懸劑、軟膏劑、乳劑、形成凝膠的溶液劑、形成溶液的粉劑、凝膠劑、眼用嵌入劑和植入物的形式眼內給藥。
本發明提供的藥物組合物可以經鼻內或吸入至呼吸道給藥。所述藥物組合物可以以單獨的氣霧劑或溶液劑或者與合適的推進劑的組合的形式提供，其使用加壓容器、泵、噴霧器、霧化器例如使用電水動力產生微小煙霧的霧化器或噴灑器遞送，所述推進劑例如1，1，1，2-四氟代乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟代丙烷。所述藥物組合物還可以以用于吹入的單獨干粉劑或與惰性載體例如乳糖或磷脂的組合及滴鼻劑提供。對于鼻內使用，所述粉劑可以包含生物粘附劑，包括殼聚糖或環糊精。
在加壓容器、泵、噴霧劑、霧化器或噴酒器中使用的溶液劑或混懸劑可以配制為包含乙醇、含水乙醇或用于分散、增溶或延長本發明提供的活性成分釋放的合適的可代替試劑、推進劑如溶劑；和/或表面活性劑，例如脫水山梨糖醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸(oligolactic acid)。
本發明提供的藥物組合物可以微粉化至適于吸入遞送的粒徑，例如50微米或更小，或10微米或更小。這樣粒徑的顆粒可以使用本領域技術人員已知的粉末化方法制備，所述方法例如螺旋噴射研磨、流化床噴射研磨、形成納米顆粒的超臨界流體處理、高壓勻漿化或噴霧干燥。
用于吸入器或吹入器的膠囊、泡罩和藥筒可以配制成包含本發明提供的藥物組合物的粉末混合物；合適的粉末狀基質，例如乳糖或淀粉；和功能調節劑，例如1-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸鎂。乳糖可以是無水的或一水合物的形式。其它合適的賦形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。本發明提供的用于吸入/鼻內給藥的藥物組合物可以進一步包括合適的調味劑，例如薄荷醇和左薄荷腦，或甜味劑，例如糖精或糖精鈉。
本發明提供的用于表面施用的藥物組合物可以配制成立即釋放或改性釋放形式，包括延遲-、緩釋-、脈沖-、控制-、靶向-和程序化-釋放形式。
D.改性釋放 本發明提供的藥物組合物可以配制成改性釋放劑型。如本發明使用的術語“改性釋放”指當通過相同的途徑施用時，活性成分的釋放速率和位點與立即釋放劑型不同的劑型。改性釋放劑型包括延遲-、延緩-、延長-緩釋-、脈動-或脈沖-、控制-、促進-和快速-、靶向-、程序化-釋放和胃滯留劑型。改性釋放劑型中的藥物組合物可以使用本領域技術人員多種改性釋放裝置和方法制備，所述裝置和方法包括但不限于基質控釋裝置、滲透控釋裝置、多顆粒控釋裝置、離子交換樹脂、腸包衣、多層包衣、微球、脂質體及其組合。活性成分的釋放速率也可以通過改變顆粒粒徑和活性成分的多形性(polymorphorism)來調整。
改性釋放的實例包括但不限于，描述在美國專利號3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,639,480、5,733,566、5,739,108、5,891,474、5,922,356、5,972,891、5,980,945、5,993,855、6,045,830、6,087,324、6,113,943、6,197,350、6,248,363、6,264,970、6,267,981、6,376,461、6,419,961、6,589,548、6,613,358；和6,699,500中的那些。
1.基質控釋裝置 本發明提供的改性釋放劑型中的藥物組合物可以使用本領域技術人員已知的基質控釋裝置制備(參見，Takada等人的“Encyclopedia of ControlledDrug Delivery，”第2卷，Mathiowitz編輯，Wiley，1999)。
在一實施方案中，本發明提供的改性釋放劑型的藥物組合物是使用可侵蝕性基質裝置配制的，其為水可膨脹性、可侵蝕性或可溶性聚合物，包括天然存在的聚合物和衍生物，例如多糖和蛋白質。
用于形成可侵蝕性基質的物質包括但不限于殼多糖、殼聚糖、葡聚糖和支鏈淀粉；瓊脂膠(gum agar)、阿拉伯膠、梧桐膠、豆角膠、黃蓍樹膠、角叉菜膠、印度膠、瓜爾膠、黃原膠和硬葡聚糖；淀粉，例如糊精和麥芽糖糊精；親水膠體，例如果膠；磷脂，例如卵磷脂；海藻酸鹽；藻酸丙二醇酯；明膠；膠原；和纖維素，例如乙基纖維素(EC)、甲基乙基纖維素(MEC)、羧甲基纖維素(CMC)、CMEC、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、醋酸纖維素(CA)、丙酸纖維素(CP)、丁酸纖維素(CB)、乙酸丁酸纖維素(CAB)、CAP、CAT、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、HPMCP、HPMCAS、羥丙基甲基纖維素乙酸偏苯三酸酯(HPMCAT)和乙基羥基乙基纖維素(EHEC)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；聚乙酸乙烯酯；脂肪酸甘油酯；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸；乙基丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物(
Rohm America，Inc.，Piscataway，NJ)；聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)；聚交酯；L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物；聚-D-(-)-3-羥基丁酸；及其它丙烯酸衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯和(三甲基氨乙基)甲基丙烯酸酯氯化物的均聚物和共聚物。
在另一實施方案中，所述藥物組合物用非可侵蝕性基質裝置配制。活性成分溶解或分散在惰性的基質中，一旦施用，其主要通過擴散穿過惰性基質來釋放。適于作為非可侵蝕性基質裝置的物質包括但不限于不溶性塑料，例如聚乙烯、聚丙烯、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丁基丙烯酸甲酯、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、氯化乙烯與乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、離子交聯聚合物聚對苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡膠氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物、聚氯乙烯、增塑的尼龍、增塑的聚對苯二甲酸乙酯、天然橡膠、硅酮橡膠、聚二甲硅氧烷、硅氧烷碳酸酯共聚物，和；親水性聚合物，例如乙基纖維素、醋酸纖維素、交聚維酮和交聯的部分水解的聚乙酸乙烯酯；和脂肪族化合物，例如棕櫚蠟(camauba wax)、微晶蠟和甘油三酯。
在基質控釋系統中，例如，所期望的釋放動力學可以通過以下因素來控制所采用的聚合物類型、聚合物粘度、聚合物和/或活性成分的顆粒粒徑、活性成分與聚合物的比例以及組合物中的其它賦形劑。
本發明提供的改性釋放劑型的藥物組合物可以通過本領域技術人員已知的方法制備，所述方法包括直接壓片、干法制粒或濕法粒法之后壓制、熔融制粒之后壓制。
2.滲透控釋裝置 本發明提供的改性釋放劑型的藥物組合物可以使用滲透控釋裝置制備，所述滲透控釋裝置包括一室系統、兩室系統、非對稱膜技術(AMT)和擠壓核芯系統(extruding core system)(ECS)。通常，這樣的裝置具有至少兩個部分(a)核芯，其包含活性成分；和(b)具有至少一個遞送口(port)的半透薄膜，其包裹所述核芯。所述半透薄膜控制水從所用的水相環境中流入所述核芯，使得藥物經擠壓穿過遞送口釋放。
除了活性成分之外，所述滲透裝置的核芯任選地包含滲透劑，其產生用于將水從應用環境中轉運到裝置核芯的驅動力。一種類型的滲透劑為水可膨脹的親水性聚合物，其為稱為“滲透性聚合物”和“水凝膠”，包括但不限于親水性乙烯和丙烯聚合物、多糖例如海藻酸鈣、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(丙烯)酸、聚(甲基丙烯)酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聯PVP、聚乙烯醇(PVA)、PVA/PVP共聚物、PVA/PVP與疏水性單體例如甲基丙烯酸甲酯和乙酸乙烯酯的共聚物、包含大的PEO嵌段的親水性聚氨酯、交聯羧甲纖維素鈉、角叉菜膠、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧乙基纖維素(CEC)、海藻酸鈉、聚卡波非、明膠、黃原膠和淀粉羥乙酸鈉。
另一種類型的滲透劑為osmogen，其能夠吸收水而影響穿過周圍包衣屏障的滲透壓梯度。合適的osmogen包括但不限于無機鹽，例如硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋰、硫酸鉀、磷酸鉀、碳酸鈉、亞硫酸鈉、硫酸鋰、氯化鉀和硫酸鈉；糖類，例如葡萄糖、果糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇；有機酸，例如抗壞血酸、苯甲酸、富馬酸、檸檬酸、馬來酸、癸二酸、山梨酸、己二酸、乙二胺四乙酸、谷氨酸、對甲苯磺酸、琥珀酸和酒石酸；脲；及其混合物。
可以采用不同溶出速率的滲透劑以影響活性成分最初以什么速度從劑型中釋放。例如非晶形糖，例如Mannogeme EZ(SPI Pharma，Lewes，DE)可用于提供在第一個小時期間更快地遞送，以迅速地產生期望的治療效果，和經長期的時間，逐漸連續地釋放剩余量，以保持治療或預防作用的期望水平。在這種情況下，活性成分按代替代謝和排泄的活性成分的量的速率釋放。
所述核芯也可包括多種如本發明描述的其它賦形劑和載體，以增強所述劑型的性能或提高穩定性或易加工性。
用于形成半透膜的物質包括各種等級的丙烯、乙烯、醚、聚酰胺、聚酯和纖維素衍生物，所述纖維素衍生物在生理學相應pH下為水可滲透的和水不溶性的，或者可以通過化學改變例如交聯成為水不溶性。用于形成所述包衣的合適的聚合物的實例包括增塑的、未增塑的和強化的醋酸纖維素(CA)、纖維素二醋酸酯、三醋酸纖維素、CA丙酸酯、硝酸纖維素、醋酸纖維素丁酸酯(CAB)、CA氨基甲酸乙酯、CAP、CA氨基甲酸甲酯、CA琥珀酸酯、醋酸纖維素偏苯三酸酯(CAT)、CA二甲基氨基醋酸酯、CA碳酸乙酯、CA氯乙酸酯、CA草酸乙酯、CA磺酸甲酯、CA磺酸丁酯、CA對-甲苯磺酸酯、瓊脂乙酸酯、直鏈淀粉三醋酸酯、β葡聚糖乙酸酯、β葡聚糖三乙酸酯、乙醛二甲基乙酸酯、豆角膠的三乙酸酯、羥基化乙烯-乙烯基乙酸酯、EC、PEG、PPG、PEG/PPG共聚物、PVP、HEC、HPC、CMC、CMEC、HPMC、HPMCP、HPMCAS、HPMCAT、聚(丙烯)酸與聚(甲基丙烯)酸和酯的酯及其共聚物、淀粉、葡聚糖、糊精、殼聚糖、膠原、明膠、聚烯烴、聚醚、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯酯和醚、天然蠟和合成蠟。
半透膜也可以是疏水性微孔膜，其中孔基本上被氣體充滿，并且沒有被水介質潤濕，但是其是水蒸汽可滲透的，如在美國專利號5,798,119中公開的。這樣的疏水但水蒸汽可滲透的膜典型地由疏水性聚合物組合，所述疏水性聚合物例如聚烯烴、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯酸衍生物、聚醚、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚乙烯鹵化物、聚偏二氟乙烯、聚乙烯酯和醚、天然蠟和合成蠟。
半透膜上的遞送口可以在完成包衣后通過機械打孔或激光打孔形成。遞送口也可以通過水溶性物質填料的腐蝕，或者通過核芯凹陷較薄的膜部分裂開而原位形成。另外，遞送口可以是在進行包衣過程中形成，如在美國專利號5,612,059和5,698,220中公開類型的不對稱膜包衣的情況下形成。
釋放的活性成分的總量和釋放速率基本上可以經由半透膜的厚度和孔隙率、核芯的組分以及遞送口的數量、尺寸和位置調節。
在滲透控釋劑型中的藥物組合物可以進一步包含另外的如本發明描述的常規賦形劑，以提高制劑的性能或加工性。
所述滲透控釋劑型可以根據本領域技術人員已知的常規方法和技術制備(參見，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，同上；Santus和Baker，J.Controlled Release 1995，35，1-21；Verma等人，Drug Developmentand Industrial Pharmacy 2000，26，695-708；Verma等人，J.Controlled Release2002，79，7-27)。
在某些實施方案中，本發明提供的藥物組合物被配制成AMT控釋劑型，其包括包裹核芯的非對稱滲透膜，所述核芯包含活性成分及其它藥學上可接受的賦形劑。參見，美國專利號5,612,059和WO 2002/17918。所述AMT控釋劑型可以根據本領域技術人員已知的常規方法和技術制備，所述常規方法和技術包括直接壓片、干法制粒、濕法制粒和浸漬包衣方法。
在某些實施方案中，本發明提供的藥物組合物被配制成ESC控釋劑型，其包括包衣核芯的滲透膜，所述核芯包含活性成分、羥乙基纖維素及其它藥學上可接受的賦形劑。
3.多顆粒控釋裝置 本發明提供的改性釋放劑型中的藥物組合物可以被制備成多顆粒控釋裝置，其包括大量微粒、顆粒或丸劑，直徑為約10μm至約3mm、約50μm至約2.5mm或約100μm至1mm。這樣的多顆粒可以通過本領域技術人員已知的加工方法制備，所述加工方法包括濕法制粒和干法制粒、擠壓/滾圓成丸法、滾筒壓縮、熔融凝固和噴霧包衣種子核芯(seed cores)。參見，例如Multiparticulate Oral Drug Delivery；Marcel Dekker1994；和Pharmaceutical Pelletization Technology；Marcel Dekker1989。
可以將如本發明描述的其它賦形劑與所述藥物組合物混合，以幫助加工和形成所述多顆粒。得到的顆粒自身可以構成所述多顆粒狀指，或者可以用多種成膜物質包衣，所述成膜物質是例如腸道聚合物、水可膨脹的和水溶性聚合物。所述多顆粒可以被進一步加工成膠囊或片劑。
4.靶向遞送 本發明提供的藥物組合物也可以被配制成靶至待治療個體的特定組織、受體或身體其它區域的系統，包括脂質體-遞送系統、再密封的紅細胞-遞送系統和抗體-基遞送系統。實例包括但不限于美國專利號6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542、和5,709,874。
使用方法 本發明提供一種用于治療、預防或改善由病毒引起的疾病的方法，其包括向個體施用治療有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。由病毒引起的疾病的實例包括但不限于傳染性軟疣感染、HTLV感染、HTLV-1感染、HIV感染(AIDS)、人乳頭瘤病毒感染、皰疹病毒感染、生殖器皰疹感染、病毒性痢疾、流行性感冒、麻疹、風疹、水痘、流行性腮腺炎、骨髓灰質炎、狂犬病、單核細胞增多癥、埃博拉病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、登革熱、黃熱病、拉沙熱、沙粒體病毒感染、布尼亞病毒感染、纖絲病毒感染、黃病毒感染、漢坦病毒感染、輪狀病毒感染、病毒性腦膜炎、西尼羅河熱、蟲媒病毒感染、副流行性感冒、天花、EB病毒感染、登革出血熱、巨細胞病毒感染、嬰兒巨細胞病毒感染、進行性多灶性白質腦病、病毒性胃腸炎、肝炎、感冒瘡、眼部皰疹、腦膜炎、腦炎、帶狀皰疹、腦炎、加州血清群病毒感染、圣路易斯腦炎、裂谷熱、手足口病、亨德拉病毒感染、腸道病毒感染、星狀病毒、腺病毒感染、日本腦炎、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、幼兒急疹、白蛉熱、SARS、疣、貓抓病、傳染性紅斑綜合征、羊痘、玫瑰糠疹、狂犬病毒感染、H5N1病毒感染(禽類流感)和人乳頭瘤病毒感染。
本發明提供的治療方法能夠治療的病毒的實例包括但不限于腺病毒、蟲媒病毒、沙粒病毒、星狀病毒、布亞病毒、冠狀病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、腸道病毒、EB病毒、黃病毒、線狀病毒、H5N1病毒、亨德拉病毒、人T淋巴細胞病毒、人類免疫缺陷性病毒、人乳頭瘤病毒、漢坦病毒、肝炎病毒、肝DNA病毒、皰疹病毒、單純皰疹病毒-1、單純皰疹病毒-2、嬰兒巨細胞癥病毒、流感病毒、日本腦炎病毒、JC病毒、拉沙病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、狂犬病毒(lyssavirus)、接觸傳染性軟疣病毒、腮腺炎病毒、口瘡病毒、副流感病毒、副粘病毒、副痘病毒、細小病毒、微小RNA病毒、脊髓灰質炎病毒、多瘤病毒、狂犬病毒(rabies virus)、裂谷熱病毒、玫瑰疹病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花病毒、圣路易斯腦炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅病毒和黃熱病毒。
在一實施方案中，所述病毒為性傳播的。在另一實施方案中，所述病毒為致癌病毒。在某些實施方案中，所述病毒為乳多空瘤病毒或單純皰疹病毒。在某些實施方案中，所述乳多空瘤病毒為多形瘤病毒或乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述乳多空病毒為多形瘤病毒。在某些實施方案中，所述乳多空瘤病毒為乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述病毒為人乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述病毒為單純皰疹病毒。
本發明還提供一種用于治療、預防或改善由致癌病毒引起的疾病的一種或多種癥狀的方法，其包括向患有或懷疑患有這樣的疾病的個體施用治療有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在某些實施方案中，所述致癌病毒為性傳播的。在某些實施方案中，所述致癌病毒為乳多空病毒。在某些實施方案中，所述致癌病毒為多形瘤病毒或乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述致癌病毒為多形瘤病毒。在某些實施方案中，所述致癌病毒為乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述致癌病毒為人或牛乳頭瘤病毒。
在某些實施方案中，由致癌病毒引起的疾病為疣，包括但不限于足底疣和生殖器疣；子宮頸非典型增生；復發性呼吸性乳頭瘤病，包括但不限于喉部乳頭瘤；或與乳頭瘤病毒感染相關的癌癥，包括肛門生殖器癌，例如子宮頸癌、肛門癌和肛周癌、外陰癌、陰道癌和陰莖癌；頭頸部癌，例如口腔咽部區域癌癥和食道癌；和皮膚癌，例如基底細胞癌和鱗狀細胞癌。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法給藥后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，例如測定病毒滴度，相對于沒有施用所述化合物的個體，施用治療有效量光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物，使得病毒的復制減少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法給藥后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對于沒有施用所述化合物的個體，施用治療有效量光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物，使得病毒的復制減少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法給藥后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對于沒有施用所述化合物的個體，施用治療有效量光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法給藥后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對于沒有施用所述化合物的個體，施用治療有效量光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多倍。
本發明進一步提供一種用于抑制病毒復制的方法，其包括用有效量的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥接觸所述病毒。
在一實施方案中，所述病毒為性傳播的。在另一實施方案中，所述病毒為致癌病毒。在某些實施方案中，所述病毒為乳多空瘤病毒或單純皰疹病毒。在某些實施方案中，所述乳多空瘤病毒為多形瘤病毒或乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述乳多空瘤病毒為多形瘤病毒。在某些實施方案中，所述乳多空瘤病毒為乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述病毒為人乳頭瘤病毒。在某些實施方案中，所述病毒為單純皰疹病毒。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法初次接觸后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對與沒有這樣接觸的病毒，用治療有效量的光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物接觸病毒，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法初次接觸后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對與沒有這樣接觸的病毒，用治療有效量的光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物接觸病毒，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法初次接觸后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對與沒有這樣接觸的病毒，用治療有效量的光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物接觸病毒，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些實施方案中，在通過本領域已知的方法初次接觸后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天測定時，相對與沒有這樣接觸的病毒，用治療有效量光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥；或其藥物組合物接觸病毒，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
本發明還提供一種用于治療、預防或改善個體中疾病的一種或多種癥狀方法，其包括向患有或懷疑患有這樣疾病的個體施用治療有效量光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
在一實施方案中，所述疾病為癌癥，包括但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌、肝癌、子宮頸癌、結腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頸部癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宮癌、淋巴癌、白血病、胃癌、胰腺癌、睪丸淋巴瘤和多發性骨髓瘤。
本發明提供一種抑制磷脂酶C活性的方法，其包括用光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥接觸磷脂酶C。
根據待治療的疾病和個體的狀況，本發明提供的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥可以經由口服、腸胃外(例如肌內、腹膜內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、吸入、鼻腔、陰道、直腸、舌下或表面(例如透皮或局部)施用途徑給藥，并且可以單獨配制成合適的劑量單元，或者與適于每種施用途徑的藥學上可接受的載體、助劑和賦形劑一起配制。
所述劑量可以是一次、兩次、三次、四次、五次、六次或更多的亞劑量，每天按合適的間隔給藥。所述劑量或亞劑量可以以包含0.1至10毫克、0.1至5毫克或0.1至2毫克活性成分/劑量單元的劑量單元形式施用，或者，如果患者的病癥需要，可以連續輸注施用。
在某些實施方案中，合適的劑量水平為約0.001至約10mg/kg患者體重/天(mg/kg/天)、約0.01至約10mg/kg/天、約0.01至約1mg/kg/天或約0.05至約1mg/kg/天，其可以以單劑量或多劑量給藥。合適的劑量水平可以為約0.001至25mg/kg/天、約0.001至10mg/kg/天、或約0.001至5mg/kg/天。在該范圍內，所述劑量可以為0.001至0.005、0.005至0.05、0.05至0.5或0.5至5.0mg/kg/天。
在某些實施方案中，合適的劑量水平為約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10mg/kg/天。
試劑盒/制品 [所述光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥也可以使用本領域那些技術人員熟知的包裝材料提供。參見，例如美國專利號5,323,907、5,052,558、和5,033,252。藥用包裝材料的實例包括但不限于泡罩包裝、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和適于選擇制劑和預期給藥和治療方式的任何包裝材料。
本發明還提供試劑盒，當醫師使用時，其可以簡化向個體施用合適量的活性成分。在某些實施方案中，本發明提供的試劑盒包括容器和光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的劑型。
在某些實施方案中，所述光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥與如本發明描述的其它治療劑組合給藥。其它治療劑可以或者不可以同時或按相同的施用途徑給藥至患者。
在某些實施方案中，所述試劑盒包括一個容器，該容器包含光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的劑型，該容器中還包含一種或多種本發明描述的其它治療劑。
本發明提供的試劑盒可以進一步包括用于施用活性成分的裝置。這樣的裝置的實例包括但不限于注射器、無針注射器滴注袋、貼劑和吸入器。本發明提供的試劑盒也可以包括給藥所述活性成分的避孕套。
本發明提供的試劑盒可以進一步包括可用于施用一種或多種活性成分的藥學上可接受的賦形劑。例如，如果活性成分以必須重構用于腸胃外施用的固體形式提供，則所述試劑盒可以包括合適賦形劑的密封容器，其中活性成分可以溶解形成適于腸胃外施用的無顆粒無菌溶液。藥學上可接受的賦形劑的實例包括但不限于含水賦形劑，包括但不限于注射用水USP、氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、和乳酸化林格氏注射液；水可溶混賦形劑，包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非含水賦形劑，包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和苯甲酸芐酯。
實施例 如本發明使用的，無論特定的縮寫是否有特別的定義，在這些制備方法、方案和實施例中使用的符號和規則與在同期科學文獻例如，Journal ofthe American Chemical Society或Journal of Biological Chemistry中使用的那些一致。特別地，但不限于，在實施例和整個說明書中可以使用下述縮寫g(克)；mg(毫克)；L(升)；mL(毫升)；μL(微升)；psi(磅/平方英寸)；M(摩爾濃度)；mM(毫克分子)；μM(微摩爾)；Hz(赫茲)；MHz(兆赫)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；RT(室溫)；hr(小時)；min(分鐘)；TLC(薄層色譜法)；mp(熔點)；RP(逆相)；T1-(保留時間)；TFA(三氟乙酸)；TEA(三乙胺)；THF(四氫呋喃)；TFAA(三氟醋酐)；CD3OD(氘代甲醇)；CDCl3(氘代氯仿)；DMSO(二甲亞砜)；SiO2(二氧化硅)；atm(大氣壓)；EtOAc(乙酸乙酯)；CHCl3(氯仿)；HCl(鹽酸)；Ac(乙酰基)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；Me(甲基)；Cs2CO3(碳酸銫)；EtOH(乙醇)；Et(乙基)；tBu(叔丁基)；MeOH(甲醇)。
對于所有下述實施例，可以使用本領域技術人員已知的標準檢驗和純化方法。除非另有說明，所有的溫度都以℃(攝氏度)表示。除非另有說明，所有的反應都在在室溫下進行。在方案2至6中闡述的合成方法是通過具體實施例來舉例說明可適用的化學方法，而并不表示本發明的范圍。
實施例1 光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的合成 光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽的合成在方案4和5中闡述。
步驟1.在70℃下，攪拌雙環戊二烯8(132.2g，1mol)和48％的氫溴酸(227mL)的混合物3小時。過濾沉淀物，并用己烷洗滌。分離有機層與水層，并用己烷進一步萃取水層。用水洗滌混合的有機層，經無水MgSO4干燥，并濃縮。在真空(12mmHg)下，于105-113℃蒸餾殘余的油狀物，得到呈無色油狀的C-外溴代烯烴9(199.3g，93.5％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.30-1.65(2H，m)，1.75-2.15(5H，m)，2.25-2.35(1H，m)，2.40-2.70(2H，m)，3.95-4.05(1H，m)，5.60-5.75(1H，m)。
步驟2.向C-外-溴代烯烴9在乙酸乙酯(200mL)中的溶液中加入10％的Pd/C(2g)。在50psi氫化該混合物過夜。過濾除去催化劑，并濃縮反應溶液。在真空(12mmHg)下，于112-118℃蒸餾殘余油狀物，得到呈無色油狀的C-外溴代烷10(196.53g，98％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.85-0.21(14H，m)，3.85-3.95(1H，m)。
步驟3.在室溫下，向tBuOK(75.74g，0.675mol)在無水tBuOH(400mL)中的懸浮液中滴加C-外溴代烷10(96.81g，0.45mol)在無水THF(100mL)中的溶液，同時攪拌。在氬氣下回流該混合物過夜。在冷卻后，用水(800mL)稀釋該反應混合物，并用己烷萃取。經無水MgSO4干燥混合的有機層，過濾并濃縮。在真空(15mmHg)下，于58-63℃蒸餾殘余油狀物，得到呈無色油狀的C-外烯5(38.62，64％)。IR(純)cm-12949，1471，1456，1325，693；MS(APCI)m/z135(M+1)；1H NMR(CDCl3)δ0.90-1.05(2H，m)，1.30-2.00(8H，m)，2.40-2.50(2H，m)，6.05-6.15(2H，m)。
步驟4.超聲處理三-(雙苯亞甲基丙酮)-二鈀(0)(Pd2dba3)和CHCl3加合物(41mg，0.04mmol)、R-(+)-MOP(74mg，0.16mmol)和C-外烯5的混合物5分鐘，接著在0℃的水浴溫度，在氬氣下，滴加三氯硅烷(1mL，9.6mmol)，同時攪拌。在該反應中使用的特定手性單齒膦配體具有R構型，R5為-OCH3，R6和R7為苯基。然后，在相同的溫度下，攪拌該混合物過夜。通過滴加己烷稀釋該反應混合物，過濾，并用己烷洗滌。濃縮混合的有機物，得到呈無色油狀的粗光學活性的Si-外/C-外有機硅烷6，將其直接用于下一步中，無需進一步純化。
步驟5.向用冰浴冷卻的粗Si-外/C-外有機硅烷6、KHCO3(5.82g)和KF(2.25g)在THF(10mL)和MeOH(10mL)的混合物中滴加30％的含水H2O2(5.1mL)，同時攪拌。在攪拌過夜之后，用CHCl3萃取反應混合物。用水洗滌混合的有機層，經無水Mg2SO4干燥，過濾并濃縮。用二氧化硅層析純化粗產物，得到呈無色油狀的光學活性的(-)-O-外/C-外烷醇7(954mg，79％)。
IR(純)cm-13347，2941，2861；MS(APCI)m/z135(M+1-H2O)；HNMR(CDCl3)δ0.85-1.05(2H，m)，1.15-1.40(5H，m)，1.50-2.00(8H，m)，3.70-3.75(1H，m)。
如下所述，通過將所述分子轉化成氨基甲酸酯來測定光學活性的(-)-O-外/C-外烷醇7的對映體過量(e.e.)和外/內比例。向光學活性的(-)-O-外烷醇7(91mg，0.6mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入3，5-二硝基苯基異氰酸酯(150mg，0.72mmol)。在室溫下，攪拌該反應混合物3小時。在除去溶劑之后，用二氧化硅層析純化殘余物，得到呈淺黃色非晶形的相應氨基甲酸酯(84mg)。
HPLC(化學純度)99.2％；HPLC(化學純度)83％e.e.；MS(ESI)m/z360(M-1)；外/內比例大于99％。
也通過改變催化劑和其它反應條件來使非對稱的氫化硅烷化反應最佳化。結果概括在表1中。
表1.非對稱氫化硅烷化的最佳化 a.在加入三氯硅烷之前，超聲處理Pd2dba3·CHCl3加合物、(R)-MOP和化合物5的混合物5分鐘。
b.在加入化合物5之前，超聲處理Pd2dba3·CHCl3加合物、(R)-MOP和三氯硅烷的混合物5分鐘。
c.在加入化合物5和三氯硅烷之前，超聲處理Pd2dba3·CHCl3加合物和(R)-MOP的混合物5分鐘，并除去溶劑。
d.在加入三氯硅烷之后，內部溫度上升至超過三氯硅烷的沸點。
步驟6.向冰浴冷卻的光學活性的(-)-O-外/C-外烷醇7(79.5mg，0.52mmol，78％e.e.)在無水THF(2mL)中的溶液中加入tBuOK(53mg，0.47mmol)，同時攪拌，接著滴加CS2(40mg，0.53mmol)在無水THF(3mL)中的溶液。在室溫下，攪拌該混合物過夜。在除去溶劑之后，將殘余物與Et2O研磨，并干燥至得到呈淺黃色固體的光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽(99mg，71％)。
MS(ESI)m/s227(M-K)；1H NMR(CD3OD)δ0.80-1.10(2H，m)，1.10-2.10(HH，m)，2.15-2.20(IH，m)，5.05-5.10(1H，m)；[α]D20-12.5°(c1.04，H2O)。
實施例2 光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的合成 光學活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽的合成在方案6至8中闡述。
步驟1.在107℃，于氮氣下，機械攪拌H2SO4(25％重量，150ml)中的環戊二烯8(50g)5小時。在冷卻至室溫之后，將該反應混合物分離成水層和有機層。將有機層與水層分離，用水洗滌，用叔丁基甲醚(250mL)稀釋，真空濃縮，得到呈無色油狀的烯醇12(55g，100％)。
步驟2.將烯醇12(200g)和Pd/C(3.75％重量，7.5g)在乙醇(600mL)中的混合物加入高壓滅菌器中。在室溫下，在氫氣(5bar)下，攪拌該混合物過夜。用1H NMR監測該反應。在反應完成之后，過濾該反應混合物穿過Celite(400g)，并真空濃縮，得到呈無色油狀的烷醇7(200g，100％)。
步驟3.在氮氣下，向烷醇7(2g)在吡啶(8mL)中的溶液中加入乙酸酐(1.35mL)和二甲基氨基吡啶(290mg)。在50℃下，攪拌該混合物3.5小時。在用鹽酸(2M，30mL)中和之后，用CH2Cl2萃取該反應混合物。經無水Na2SO4干燥混合的有機層，并真空濃縮，得到呈淺黃色油狀的酯13(2g)。
步驟4.在表2中所列的三種酶之一(2mg)存在下，在攪拌器上攪拌在叔丁基甲醚(0.2mL)和pH 7的0.1M KH2PO4緩沖溶液(1mL)混合物中的酯13(20mg)過夜。所有三種酶都得自Mann Associates(London，UK)。這些酶選擇性地水解(+)酯13，從而得到光學活性的(+)烷醇7和(-)酯13。如Holscher等人描述的(HeIv.Chim.Acta 2004，87，1666-1680)，通過手性GC分析它們的光學純度，并將結果概括在表2中。
表2.酯13的酶拆分 步驟5.將(-)-酯13(25g)溶于甲醇(150mL)中。加入NaOH水溶液(4M，65mL)，并在22℃攪拌該混合物60分鐘。在減壓下，濃縮該反應混合物，并將殘余物分配在水(100mL)和甲基叔丁基醚(100mL)中。用甲基叔丁基醚(100mL)萃取水層，并經Na2SO4干燥混合的有機萃取物。在減壓下除去溶劑，得到(-)烷醇7(19.9g)。
步驟6.向叔丁醇鈉(1.6g)在THF(10mL)的溶液中加入光學活性的(-)-烷醇7，接著滴加二硫化碳(1.5g)。然后，在室溫下，靜置該反應混合物過夜。過濾該反應混合物，并用乙醚洗滌，得到光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽。
使用相同的方法，將光學活性的(+)-烷醇7轉變成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽。
實施例3 光學活性的O-外/C-外三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的合成 光學活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽的合成闡述在方案6和7中。
步驟1.在氮氣下，向烯醇12(2g)在吡啶(8mL)的溶液中加入乙酸酐(1.35mL)和二甲基氨基吡啶(290mg)。在50℃下，攪拌該混合物3.5小時。在用鹽酸(2M，30mL)中和之后，用CH2Cl2萃取該反應混合物。經無水Na2SO4干燥混合的有機層，并真空濃縮，得到呈淺黃色油狀的不飽和的酯11(2g)。
步驟2.在表2中列出的水解酶之一(2mg)的存在下，在攪拌器上攪拌叔丁基甲醚(0.2mL)和pH 7的0.1M KH2PO4緩沖溶液(1mL)的混合物中的酯11(20mg)過夜。所有的三種酶都得自Mann Associates(London，UK)。這些酶選擇性地水解(+)-酯11，從而得到光學活性的(+)烯醇12和光學活性的(-)酯11。通過如Holscher等人描述的手性GC(HeIv.Chim.Acta2004，87，1666-1680)分析它們的光學純度，并將結果概括在表3中。
步驟3.在氮氣下，將碳酸鉀(21.6g)加入(-)酯11(10g))的甲醇(50mL)溶液中。室溫下，攪拌該混合物過夜，并通過TLC(CH2Cl2，PMA染色劑)監測，直到乙酸酯消失。加入水(30mL)和甲基叔丁基醚(30mL)。用甲基叔丁基醚(3×20mL)萃取水層，并經Na2SO4干燥混合有機層，蒸干，得到(-)烯醇12(7.6g，98％)。
步驟4.將(-)12(7.6g)在乙醇(40mL)中的溶液裝入到高壓滅菌器中。加入Pd/C(3.75％w/w，285mg)，并在H2(5bars)下，在室溫下攪拌該混合物過夜。通過1H NMR監測反應直到完成，然后過濾通過Celite(5g)，并濃縮，得到呈深色油狀的(-)7(7.8g)。
步驟5.使用本發明描述的方法，將光學活性的(+)-烷醇7和(-)-烷醇7轉變成光學活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽。
表3.不飽和的酯11的酶拆分 實施例4 光學活性的O-外/C-外三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的合成 步驟1.醇+/-12的合成。在氮氣下，在107℃加熱25％w/w H2SO4(150mL)中的環戊二烯8(50g)5小時。冷卻該反應，并分離各層。用水洗滌有機層，用叔丁基甲醚(250mL)稀釋。然后，在真空中除去所述叔丁基甲醚，得到醇+/-12(55g，100％)。
步驟2.乙酸酯+/-11(R9＝Me)的合成。向烯醇+/-12(537g)中加入乙酸酐(340mL)、三乙胺(490mL)和N-甲基咪唑(2.5mL)。在50℃下，攪拌該混合物2.5小時，然后，加入叔丁基甲醚(540mL)和2M HCl(490mL)。分離各層，并進一步用叔丁基甲醚(540mL)萃取水層兩次。用5％的NaHCO3(270mL)、鹽水(540mL)洗滌混合的有機相，并濃縮，得到乙酸酯+/-11(R9＝Me)(590g，96％)。
步驟3.乙酸酯+/-13(R9＝Me)的合成。在25℃下，在3bar下，使用Pd/C(20g)氫化乙醇(1500mL)中的乙酸酯+/-11(R9＝Me)(600g)2小時。當完成(如通過GC判斷)時，將反應介質過濾通過Celite，并濃縮，得到乙酸酯+/-13(R9＝Me)(606g)。
步驟4.乙酸酯+/-13(R9＝Me)的生物拆分(Bioresolution)。將磷酸氫二鉀(82.5g)加入到水(6L)中，攪拌30分鐘，然后用2M NaOH調節pH至pH 7。將該溶液加熱至35℃，并一次性加入+/-13(R9＝Me)(500g)，接著加入酶AE015(300g)和0.1M的磷酸氫二鉀緩沖液(1L)。當根據GC判斷反應完成時，加入氯化鈉(50g)和甲苯(2.5L)。攪拌該混合物5分鐘，使其分離，將含水物萃取到甲苯(2×2.5L)中。用鹽水(2.5L)洗滌混合的有機層，然后過濾通過Celite(400g)。濃縮有機層，得到包含乙酸酯-13(R9＝Me)(96g)和烷醇+7(197g)的粗物質(480g)。
步驟5.鄰苯二甲酸酯+14的形成和乙酸酯-13(R9＝Me)的分離。向吡啶(107mL)中加入不需要的醇+7和來自生物拆分步驟的期望的乙酸酯-13(R9＝Me)的混合物(107)。然后，加入鄰苯二甲酸酐(65g)和N，N-二甲基氨基吡啶(4.3g)，并在60℃加熱該反應5小時。當冷卻至10℃時，滴加2M HCl(214mL)以保持內部溫度低于20℃。加入叔丁基甲醚(214mL)，并攪拌5分鐘。分離有機層，并用2M HCl(214mL)洗滌。將混合的含水成分萃取到叔丁基甲醚(214mL)中。用1M NaOH(2×214mL)、鹽水(214mL)洗滌有機部分，并濃縮至干，得到乙酸酯-13(R9＝Me)(49.1g)。
步驟6.包含同分異構雜質的烷醇-7的合成。在氮氣氛下，將氫氧化鈉(11.8g)加入甲醇(260mL)中的乙酸酯-13(R9＝Me)(52g)中。在25℃下，攪拌該反應2小時，從該反應中蒸餾出甲醇，然后加入叔丁基甲醚(75mL)和水(75mL)。攪拌該混合物5分鐘。分離各層，并進一步加入水(2×75mL)。加入鹽水(75mL)，并攪拌該混合物5分鐘，然后加入氯化銨(75mL)，攪拌5分鐘。分離各層，并濃縮有機層，得到烷醇-7(37.1g)。
步驟7.對硝基苯甲酸酯-15的合成。將烷醇-7(39.8g，被副產物和異構體污染)溶于130mL的吡啶(130mL)中。滴加二氯甲烷中的對硝基苯甲酰氯(231g)25％w/w溶液，同時在冰浴中冷卻該混合物。在22℃下，繼續攪拌18小時。在加入水(130mL)之后，攪拌該混合物60分鐘。加入甲基叔丁基醚(1L)，并用2M HCl水溶液(1L)洗滌該混合物。用NaHCO3(aq.)和鹽水洗滌有機相，并干燥(Na2SO4)。減壓蒸發溶劑，得到呈褐色固體的粗對-硝基苯甲酸酯-15(84.4g)。在異丙醇(400mL)中加熱回流粗的對硝基苯甲酸酯-15(84.4g)。在5小時內，將該混合物冷卻到22℃，并在45℃接種(seeded)。置于22℃下另外2小時之后，過濾該混合物。先用異丙醇(50mL)洗滌濕濾餅，接著用己烷(50mL)洗滌。在風干之后，獲得化學非對映體-和對映體-純的-15(43.4g)。按照相同的方法，從異丙醇(190mL)中再次再結晶母液殘余物，得到第二次收獲的純-15(13.1g)。
步驟8.純-7的合成。將純化的對-硝基苯甲酸酯-15(142g)在甲醇(1.4L)中加熱至60℃。加入4M NaOH水溶液(360mL)，并在22℃攪拌該混合物60分鐘。然后，減壓蒸餾出大部分甲醇。將殘余物在水(250mL)和甲基叔丁基醚(250mL)中分配。再次用甲基叔丁基醚(150mL)萃取水層。經Na2SO4干燥混合的有機萃取物。在減壓下除去溶劑，得到呈無色油狀的烷醇-7(57.4g)。
步驟9.使用本發明描述的方法，將光學活性的(+)-和(-)-烷醇7轉變成光學活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A的鉀鹽。
實施例5 磷脂酰膽堿-特異性磷脂酶C的抑制 使用Amplex Red磷脂酰膽堿-特異性磷脂酶C(PC-PLC)檢測試劑盒，其從Invitrogen(Calsbad，CA)獲得，評價光學活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A((+)-和(-)-對映異構體1A)的鉀鹽、以及D609和外消旋的O-外/C-外黃原酸1A(外消旋的1A)抗磷脂酰膽堿-特異性磷脂酶C的抑制活性。D609是從Sigma Aldrich獲得。
根據檢測試劑盒的說明，制備Amplex Red儲備溶液(-20mM)、工作反應緩沖液和辣根過氧化酶儲備溶液(200U/mL)、H2O2工作溶液(20mM)、膽堿氧化儲備溶液(20U/mL)、堿性磷酸酶儲備溶液(400U/mL)和B.cereusPC-PLC儲備溶液(10U/mL)。在試驗開始之前2小時，將每種試驗化合物溶于水中制備其儲備溶液(100mg/mL)。
Amplex Red/HRP/卵磷脂工作溶液通過將200μL的Amplex Red試劑儲備溶液、100μl的HRP儲備溶液、200μl的堿性磷酸酶儲備溶液、100μl的膽堿氧化酶儲備溶液和78μl的卵磷脂溶液加入到9.32μL的工作反應緩沖液中制備的。PC-PLC溶液(0.2LVmL)通過用工作反應緩沖液稀釋PC-PLC儲備溶液至期望的濃度制備的。
將系列濃度的試驗化合物(25μL)移液到96孔板中。對于未抑制的PC-PLC對照和非PC-PLC對照，加入25μl的水。加入50μL的AmplexRed/HRP/卵磷脂工作溶液之后，向各個孔中加入25μL的PC-PLC溶液引發反應。向非-PC-PLC對照中，加入25μL的水代替PC-PLC溶液。進行試驗，一式三份。保護該反應使其避光。在37℃下培養30分鐘之后，用熒光全自動定量繪圖酶標儀，使用550nm的檢測激發波長和590nm的檢測發射波長來測定反應。通過從本底熒光減去從非-PC-PLC對照獲得的值來校正獲得的熒光數據。然后，計算各個試驗化合物的IC50值，并將結果概括在表4中。
表4PC-磷脂酶C的抑制 實施例6 牛乳頭瘤病毒(BPV)的抑制 使用如描述的(Amtmann等人，Exp.Cell.Res.1985，161，541-550)體外BPV-感染的倉鼠胚胎成纖維細胞(HEF)細胞增殖測定，來評價光學活性的(+)-和(-)-對映異構體1A以及D609和外消旋的1A的鉀鹽抗牛類乳頭瘤病毒的抑制活性。將結果概括在表5中。
簡而言之，在伊格爾基礎培養基中生長倉鼠胚胎成纖維細胞和1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)-轉變的HEF(HEF-BPV)。將BPB-HEP和HEF細胞以pH 6.8的包含10％胎牛血清的DMEM細胞培養中0.5×106細胞/板接種在96-孔板中。然后，在37℃和100％濕度下，在5％的CO2存在下，培養所述板。在6小時之后，用包含一系列濃度試驗化合物的新制DMEM細胞培養基交換在所述板中的細胞培養基。在37℃下，再培養所述板72小時。然后，用PBS洗滌所述板中的細胞，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分鐘，用水洗滌10秒，并干燥過夜。對于測定，在室溫下，用結晶紫溶液染色所述板5分鐘，用水洗滌5次，并在室溫下干燥過夜。在向各孔加入乙醇/乙酸(99∶1，v/v，100mL)之后，使用ELISA讀數器在595nm測量所述板。
表5.牛乳頭瘤病毒的抑制 實施例7 人乳頭瘤病毒(BPV)的抑制 使用HPV-31感染的CIN6129E角質形成細胞評價光學活性的(-)-對映異構體1A抗人乳頭瘤病毒的抑制活性(Meyers等人，Science 1992，257，971-973)。
a.短期研究 對細胞增殖的作用。將感染了HPV-31的細胞在E培養基中以0.5×106細胞/板(0.5×104細胞/孔)的密度接種在含1×106絲裂霉素C處理的3T3細胞(1×104細胞/孔)的96孔板中。在CO2恒溫箱中，在100％濕度中，5％的CO2和37℃下，培養所述板6小時之后，去除細胞培養基，加入含0.85g/LNaHCO3和一系列濃度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128μg/mL)的試驗化合物的新制E培養基或陽性對照(200IU/mL的干擾素γ)。在測定之前不早于1小時，制備100mg/mL的光學活性的(-)-對映異構體1A在重蒸餾H2O中的儲備溶液，并在使用之前保存在冰上。試驗每種濃度的所有樣品，一式四份。在與試驗化合物或對照處理細胞的同時時間點，固定含有未處理細胞的一個96孔板。在CO2恒溫箱中，在37℃下，再培養所述板72小時。通過傾倒除去細胞培養基之后，用PBS中的0.5mM EDTA溶液(100μL/孔)和PBS(100μL/孔)洗滌兩次。向所述板中加入甲醛(3％，100μL/孔)。在5分鐘之后，傾倒出甲醛，在室溫下，將所述板倒置在吸水紙上干燥。通過向每孔中加入0.1mL的結晶紫溶液染色所述細胞。在室溫下培養5分鐘之后，傾倒出結晶紫溶液，并通過將所述板浸在3L新鮮水中洗滌5次。所使用的結晶紫溶液是通過如下步驟制備的首先，將結晶紫溶解在乙醇中至10％的濃度，然后用重蒸餾的H2O稀釋該乙醇溶液(1∶20)。在將所述板倒置在吸水紙上過夜干燥之后，向各孔中加入0.1mL的乙醇/乙酸(99∶1)，并在ELISA讀數器中測定在595nm的光密度。
通過繪制生長對試驗化合物的濃度圖或對照曲線圖建立劑量響應曲線。結果顯示在圖1和2中。根據該劑量響應曲線，從該劑量響應曲線與平行于X軸且對應于50％未抑制生長的線的交叉點處確定IC50值。光學活性的(-)-對映異構體1A顯示出的EC50為16μg/mL，而陽性對照(INF-γ)顯示出在200UI/mL抑制約50％的HPV-31感染的CIN6129E角質形成細胞的生長。
對HPV-31特異性DNA和RNA的作用。將感染了HPV-31的細胞(3×106)分配到14.5cm的平皿中，所述平皿包含新制E培養介質和1×106絲裂霉素C-處理的J23T3成纖維喂養細胞。在6小時之后，加入包含0.85g/l NaHCO3和一系列濃度(0、0.5、1、2、4、8、16和32μg/mL)的試驗化合物的新制培養基。試驗每種濃度的所有樣品，一式兩份。在37℃培養72小時之后，用4mM EDTA除去喂養細胞，然后分離DNA和RNA。在Southern和Northern Blot凝膠中分析分離的DNA和RNA的HPV-31特異性序列。使用人A431上皮癌細胞作為HPV-未感染的陰性對照。掃描X射線底片，并對HPV-31特異性DNA和主要mRNA種類的光密度進行累積。
通過繪制累積值對試驗化合物的濃度的曲線圖建立劑量響應曲線。將結果顯示在圖2中。根據該劑量響應曲線，從該劑量響應曲線與平行于X軸的對應于50％未抑制的累積的線的交叉點來確定IC50值。光學活性的(-)-對映異構體1A顯示出抑制HPV-31特異性RNA表達的IC50為10.7μg/mL。對照RNA(肌動蛋白特異性RNA)的表達僅僅在光學活性的(-)-對映異構體1A的最高濃度32μg/mL時受影響。在抑制HPV-31特異性DNA方面，光學活性的(-)-對映異構體1A在32μg/mL顯示出37.5％抑制。
b.長期研究 將感染了HPV-31的細胞(3×106)鋪在14.5cm平皿中，該平皿包含新鮮的E培養基和1×106細胞的絲裂霉素C-處理的3T3成纖維喂養細胞。在CO2恒溫箱中，37℃和5％CO2中，在100％的濕度中培養所述平皿。使用人A431上皮癌細胞作為HPV-未感染的陰性對照。在培養6小時之后，除去細胞培養基，并加入包含0.85g/L NaHCO3和濃度為10μg/mL和3.3μg/mL的化合物、或對照(200ILVmL的干擾素γ)的新鮮E培養基。對于每個濃度，制備4個平皿。在CO2恒溫箱中，在37℃培養所述平皿。每72小時，將所述培養介質替換為包含各種濃度的試驗化合物或對照的新鮮E培養基。在七天之后，或者當未處理的細胞開始融合時，收獲每組的一個平皿用于DNA/RNA萃取，接著進行Southern/Northern Blot分析；用胰蛋白酶處理一個平皿，測定細胞數量，將細胞接種在三個新的平皿中，如上所述處理和培養。重復該方法傳代9次。在這些傳代期間，監測細胞形態學和細胞密度。
對細胞增殖的作用。在Neubauer血細胞計數器中測定收獲的平皿中的細胞數量。測定每個傳代步驟的倍增因數。用傳代結束時每個培養物的細胞數量除以在每次傳代開始時接種細胞的數量。當用試驗化合物處理的角質形成細胞停止生長時，達到終點。將細胞生長停止定義為倍增因數不大于1。
在整個9次傳代期間，未處理的CIN612 9E細胞生長保持恒定。倍增因子的變化為2.7至3.9。在觀察期間，生存力沒有明顯損失。相反，用所有試驗化合物處理都影響細胞生長(圖3)。
在第一次細胞傳代期間，用INF-γ處理導致細胞快速死亡，導致倍增因數低于1(0.8)。然而，在第二次傳代中，倍增因數激增(2.4)，之后的3次傳代保持該水平，在最后的四次傳代期間，倍增因數有些降低至1.9至1.5之間。然而，減少不是累積的。
用3.3μg/mL濃度的光學活性的(-)-對映異構體1A處理CIN612 9E細胞導致生長率降低。倍增因數從2.9(1代)降至1.1(9代)，即，在9次傳代后，所述細胞幾乎停止生長。
用10μg/mL濃度的光學活性的(-)-對映異構體1A處理CIN612 9E細胞導致細胞增殖明顯減少。倍增因數從未處理細胞的3降低至第一個5次傳代期間的值2-2.5。在5次傳代之后，觀察到倍增因數的急劇和累積降低(5代2.4，6代1.3，9代0.1)。從7代開始，倍增因數＜1，表明細胞正在死亡。
與整個9次傳代過程中CIN 9E細胞的相比，對照A431細胞(上皮癌細胞)的生長恒定或小幅度減少(圖4)。既沒有用光學活性的(-)-對映異構體1A處理，也沒有用IFN-γ處理的對照A431的倍增因數為3.5至4.7。用200IU/mL的INF-γ處理A431細胞對細胞生長沒有顯著影響。在整個9次傳代過程中，倍增因數為3.7至4.6。用光學活性的(-)-對映異構體1A處理細胞對細胞生長僅僅有很小的影響。用3.3μg/mL濃度的光學活性的(-)-對映異構體1A處理引起細胞生長的輕微抑制。倍增因數的變化為3.1至4.2。不存在累積效應。用10μg/mL濃度的光學活性的(-)-對映異構體1A處理也引起細胞生長的輕微抑制。倍增因數的變化為2.8至3.5。不存在累積效應。
在5次傳代之后，觀察到用10μg/mL的光學活性的(-)-對映異構體1A處理的CIN 612 9E細胞的形態有顯著變化(圖5A和5B)。細胞生長的更有像未轉變的角質形成細胞，而不是未處理的CIN 612 9E細胞的十字形模式。當培養物生長融合時，用光學活性的(-)-對映異構體1A處理的CIN 6129E細胞開始被抑制，而未處理的CIN 612 9E細胞堆積(piling up)并且在達到融合之后不會停止其生長。另外，用光學活性的(-)-對映異構體1A處理的CIN 612 9E細胞獲得扁球形，而未處理的CIN 612 9E細胞保持紡錘形。
對HPV-31特異性DNA和RNA的作用在SouthernBlot和Northern Blot凝膠中分析DNA和RNA的HPV-31特異性序列。掃描X射線底片，并累積HPV-31特異性DNA和主要mRNA種類的光密度。通過繪制累積值對每次處理劑量的傳代次數的曲線圖建立時間曲線。根據該時間曲線，從該時間曲線與平行于X軸且對應于未處理的對照樣品的50％累積的線的交叉點確定T50(減低至對照水平的50所需的時間)。
將結果顯示在圖6和7中，并概括在表6中。所有用3.3μg/mL或10μg/mL的光學活性的(-)-對映異構體1A或200IU/mL的INF-γ處理的細胞都顯示出HPV-31特異性DNA和RNA含量的連續降低(表6)。最有效的處理是用10μg/mL的光學活性的(-)-對映異構體1A。在單次傳代之后，病毒基因組/細胞的數量降低超過50％(T50DNA＜1和T50RNA＜1)，在6次傳代之后為＜5％。在9次傳代之后，幾乎檢測不到病毒DNA和RNA(低于1％)。
表6.HPV-31特異性DNA和RNA表達的抑制 1HPV-31特異性RNA的含量減少50％所需要的傳代次數 2HPV-31特異性DNA的含量減少50％所需要的傳代次數 實施例8 2型單純皰疹病毒(HS V-2)的抑制 用D609、外消旋的1A的鉀鹽和阿昔洛韋一起評價光學活性的(+)-和(-)-對映異構體1A的鉀鹽對2型單純皰疹病毒的抑制活性和細胞毒性。將結果概括在表6中。
在100％濕度的CO2恒溫箱中，在5％CO2和37℃下，在DMEM細胞培養基中培養Calu-6細胞和RITA細胞。
對于細胞毒性測定，將Calu-6細胞在DMEM細胞培養基中以3×106細胞/板的密度接種在96孔板中。在37℃下，在5％的CO2存在下，培養所述板24小時。用包含一系列濃度試驗化合物的新鮮DMEM細胞培養基交換所述板中的DMEM細胞培養基。在37℃下，在5％的CO2存在下，培養所述板48小時。然后，用PBS洗滌所述板，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分鐘，用水洗滌10秒并干燥過夜。對于測定，在室溫下，用結晶紫溶液染色所述板5分鐘，用水洗滌5次，并在室溫下干燥過夜。在向各孔加入乙醇/乙酸(99∶1，v/v，100mL)之后，使用ELISA讀數器在595nm測量所述板。通過繪制光密度平均值對化合物濃度的曲線圖獲得每種化合物的劑量響應曲線。將根據劑量響應曲線獲得的LD50值概括在表5中。
對于HSV-2抑制，將Calu-6細胞以在DMEM細胞培養基中3×106細胞/板的密度接種在96孔板中。在5％的CO2存在下，在37℃下，培養該板24小時。除去所述板中的DMEM細胞培養基，并用2型單純皰疹病毒以50個噬斑形成單位/孔感染細胞。在37℃培養60分鐘之后，加入DMEM細胞培養基中的一系列濃度的試驗化合物。在5％的CO2存在下，在37℃培養該板48小時。將該板冷凍在-20℃，之后進一步分析。在室溫下解凍之后，在4℃以18,000g從各孔中離心上清液5分鐘以制備包含有傳染性的病毒顆粒的上清液。在試驗期前，進一步稀釋所述上清液。
將RITA細胞在2mL的DMEM細胞培養基中以4×106細胞/板的密度接種在24孔Linbra板中。在5％的CO2存在下，在37℃培養所述板24小時。在除去細胞培養基之后，加入0.1mL的稀釋的上清液，并在37℃培養所述板1小時。加入包含10％胎牛血清和0.5％甲基纖維素的DMEM細胞培養基，并在37℃培養所述板48小時。然后，用PBS洗滌所述板，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分鐘，用水洗滌10秒，并干燥過夜。為了檢測，接著在室溫下，用結晶紫溶液染色所述板5分鐘，用水洗滌5次，并在室溫下干燥過夜。目測確定噬斑數量。然后，用每孔噬斑的數量乘以稀釋系數。通過繪制噬斑數目/0.1mL對化合物濃度的曲線圖獲得劑量響應曲線。通過LD50除以IC50計算每種化合物的治療指數。
表7.HSV-2的抑制 實施例9 表面制劑 軟膏劑
將活性成分(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物和凡士林混合，直到混合均勻。
實施例10 表面制劑 軟膏劑
將活性成分(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物和凡士林以及膽固醇混合，直到混合均勻。
實施例11 表面制劑 軟膏劑
將活性成分(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A和阿昔洛韋、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物和凡士林混合，直到混合均勻。
***** 提供的上述實施例是為了給予本領域普通技術人員如何制造和使用所述實施方案的完整公開和說明，并不意味著限制本發明的范圍。對本領域技術人員而言顯而易見的實施本發明公開內容的上述方式的改變包含在下述權利要求書的范圍之內。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請都被引入本發明作為參考，如同將這樣的出版物、專利或專利申請特別地和分別地指出引入本發明作為參考一樣。
權利要求
1.光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
2.權利要求1的化合物，其中所述化合物為鹽。
3.權利要求1的化合物，其中所述化合物為鉀鹽、鈉鹽或鋰鹽。
4.權利要求1的化合物，其中所述化合物為鉀鹽。
5.權利要求1至4中任一項的化合物，其中所述化合物具有不低于約80％的對映體過量。
6.藥物組合物，其包含權利要求1至5中任一項的化合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所述組合物被配制用于口服、表面或腸胃外施用。
8.權利要求6或7的藥物組合物，其中所述組合物配制成膠囊或片劑。
9.權利要求6至8中任一項的藥物組合物，其中所述組合物以單元劑量提供。
10.一種用于治療個體中病毒引起的疾病的方法，其包括向所述個體施用治療有效量的權利要求1至5中任一項的化合物。
11.權利要求10的方法，其中所述疾病選自傳染性軟疣感染、HTLV感染、HTLV-1感染、AIDS、人乳頭瘤病毒感染、皰疹病毒感染、生殖器皰疹感染、病毒性痢疾、流行性感冒、麻疹、風疹、水痘、流行性腮腺炎、骨髓灰質炎、狂犬病、單核細胞增多癥、埃博拉、呼吸道合胞病毒感染、登革熱、黃熱病、拉沙熱、沙粒病毒感染、布尼亞病毒感染、纖絲病毒感染、黃病毒感染、漢坦病毒感染、輪狀病毒感染、病毒性腦膜炎、西尼羅河熱、蟲媒病毒感染、副流行性感冒、天花、EB病毒感染、登革出血熱、巨細胞病毒感染、嬰兒巨細胞病毒感染、進行性多灶性白質腦病、病毒性胃腸炎、肝炎、感冒瘡、眼部皰疹、腦膜炎、腦炎、帶狀皰疹、腦炎、加州血清群病毒感染、圣路易斯腦炎、裂谷熱、手足口腔疾病、亨德拉病毒感染、腸道病毒感染、星狀病毒、腺病毒感染、日本腦炎、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、幼兒急疹、白蛉熱、SARS、疣、貓抓病、傳染性紅斑綜合征、羊痘、玫瑰糠疹、狂犬病毒感染、H5N1病毒感染和人乳頭瘤病毒感染。
12.權利要求10的方法，其中所述疾病為疣、子宮頸非典型增生；復發性呼吸性乳頭瘤病或與乳頭瘤病毒感染相關的癌癥。
13.權利要求10的方法，其中所述疾病為子宮頸癌、肛門癌和肛周癌、外陰癌、陰道癌或陰莖癌。
14.權利要求10的方法，其中所述疾病為肛門生殖器癌、頭頸部癌或皮膚癌。
15.權利要求14的方法，其中所述頭頸部癌是口腔咽部區域癌癥或食道癌。
16.一種用于抑制個體中病毒感染的方法，其包括向所述個體施用治療有效量的權利要求1至5中任一項的化合物。
17.一種用于抑制病毒復制的方法，其包括用有效量的權利要求1至5中任一項的化合物來接觸所述病毒。
18.權利要求10至17的方法，其中所述病毒選自腺病毒、蟲媒病毒、沙粒病毒、星狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、腸道病毒、EB病毒、黃病毒、纖絲病毒、H5N1病毒、亨德拉病毒、人T淋巴細胞病毒、人類免疫缺陷性病毒、人乳頭瘤病毒、漢坦病毒、肝炎病毒、肝DNA病毒、皰疹病毒、單純皰疹病毒-1、單純皰疹病毒-2、嬰兒巨細胞病毒、流感病毒、日本腦炎病毒、JC病毒、拉沙病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、狂犬病毒、接觸傳染性軟疣病毒、腮腺炎病毒、羊痘病毒、副流感病毒、副粘病毒、副痘病毒、細小病毒、微小RNA病毒、脊髓灰質炎病毒、多瘤病毒、狂犬病病毒、裂谷熱病毒、玫瑰疹病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花病毒、圣路易腦炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、西尼羅病毒和黃熱病毒。
19.權利要求10和16至18中任一項的方法，其中所述病毒為性傳播病毒。
20.權利要求10和16至19中任一項的方法，其中所述病毒為致癌病毒。
21.權利要求10和16至20中任一項的方法，其中所述病毒為乳多空病毒。
22.權利要求10和16至20中任一項的方法，其中所述病毒為多瘤病毒或乳頭瘤病毒。
23.權利要求22的方法，其中所述病毒為乳頭瘤病毒。
24.權利要求23的方法，其中所述乳頭瘤病毒為人乳頭瘤病毒。
25.權利要求10和16至20中任一項的方法，其中所述病毒為單純皰疹病毒。
26.一種用于抑制磷脂酶C活性的方法，其包括用權利要求1至5中任一項的化合物來接觸磷脂酶C。
27.一種用于制備權利要求1至5中任一項的化合物的方法，其包括步驟
a)在與手性單齒膦復合的過渡金屬催化劑存在下，使非手性的C-外烯5與硅烷反應，得到光學活性的有機硅烷6；
b)用氧化劑氧化所述光學活性的有機硅烷6，得到保留立體化學的光學活性的烷醇7；和
c)將該光學活性的烷醇7轉化成光學活性的(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
28.一種用于制備光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的方法，其包括步驟
a)在與手性單齒膦復合的過渡金屬催化劑存在下，使非手性的C-外烯5與硅烷反應，得到光學活性的有機硅烷6；
b)用氧化劑氧化所述光學活性的有機硅烷6，得到光學活性的烷醇7；和
c)將所述光學活性的烷醇7轉化成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
29.權利要求27或28的方法，其中所述手性單齒膦為式(V)的化合物
其中
R5為H；C1-6烷基；或-OR8，其中R8為C1-6烷基，C3-7環烷基或C6-10芳基；和
R6和R7各自獨立地為C6-10芳基；
其中烷基、環烷基和芳基各自獨立地、任選地被一個或多個取代基Q取代，取代基Q各自獨立地選自氰基、鹵素或硝基；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基或雜環；或-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NRfRg、-C(NRe)NRfRg、-ORe、-OC(O)Re、-OC(O)ORe、-OC(O)NRfR8、-OC(＝NRe)NRfRg、-OS(O)Re、-OS(O)2Re、-OS(O)NRfRg、-OS(O)2NRfRg、-NRfRg、-NReC(O)Rf、-NReC(O)ORf、-NReC(O)NRfRg、-NReC(＝NRh)NRfRg、-NReS(O)Rf、-NReS(O)2Rf、-NReS(O)NRfRg、-NReS(O)2NRfRe、-SRe、-S(O)Re或-S(O)2Re；其中Re、Rf、Rg和Rh各自獨立地為氫；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基或雜環；或者Rf和Rg與它們連接的N原子一起形成雜環。
30.權利要求27至29中任一項的方法，其中手性單齒膦為R-構型。
31.權利要求27至29中任一項的方法，其中手性單齒膦為S-構型。
32.權利要求29至31中任一項的方法，其中R5為-OR8，R8為C1-6烷基。
33.權利要求29至32中任一項的方法，其中R8為甲基。
34.權利要求29至33中任一項的方法，其中R6和R7各自獨立地為任選被一個或多個鹵素基團取代的苯基。
35.權利要求27至34中任一項的方法，其中所述硅烷為式(IV)的化合物
其中R1、R2和R3各自獨立地為H；鹵素；C1-6烷基；或-OR4，其中R4為C1-6烷基、C3-7環烷基或C6-14芳基；
其中烷基、環烷基和芳基各自獨立地、任選地被一個或多個取代基Q取代，取代基Q各自獨立地選自氰基、鹵素或硝基；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基或雜環；或-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NRfRg、-C(NRe)NRfRg、-ORe、-OC(O)Re、-OC(O)ORe、-OC(O)NRfR8、-OC(＝NRe)NRfRg、-OS(O)Re、-OS(O)2Re、-OS(O)NRfRg、-OS(O)2NRfRg、-NRfRg、-NReC(O)Rf、-NReC(O)ORf、-NReC(O)NRfRg、-NReC(＝NRh)NRfRg、-NReS(O)Rf、-NReS(O)2Rf、-NReS(O)NRfRg、-NReS(O)2NRfRe、-SRe、-S(O)Re或-S(O)2Re；其中Re、Rf、Rg和Rh各自獨立地為氫；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7環烷基、C6-14芳基、雜芳基或雜環；或者Rf和Rg與它們連結的N原子一起形成雜環。
36.權利要求27至35中任一項的方法，其中所述硅烷為三氯硅烷、甲基二氯硅烷、二甲基氯硅烷、甲氧基二氯硅烷、三乙基硅烷、五甲基二硅氧烷(HSiMe2OTMS)或1，1-二甲基-3，3-二苯基-3-叔-丁基二硅氧烷(HSiMe2OTBDPS)。
37.權利要求27至36中任一項的方法，其中所述硅烷為三氯硅烷。
38.權利要求27至37中任一項的方法，其中所述過渡金屬為鉑、銥、鈀、銠或釕。
39.一種用于制備權利要求1至5中任一項的化合物的方法，其包括步驟
a)用水解酶選擇性水解酯11，得到光學活性的(-)-酯11和光學活性的(+)-烯醇9；
b)水解所述光學活性的(-)-酯11，得到光學活性的(-)-烯醇9；
c)還原所述光學活性的(-)-烯醇12，得到光學活性的(-)-烷醇7；和
d)將所述光學活性(-)-烷醇7轉化成光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
40.一種用于制備光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的方法，其包括步驟
a)用水解酶選擇性水解酯11，得到光學活性的(-)-酯11和光學活性的(+)-烯醇9；
b)還原所述光學活性的(+)-烯醇12，得到光學活性的(+)-烷醇7；和
c)將所述光學活性(+)-烷醇7轉化成光學活性(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
41.權利要求39或40的方法，其中所述水解酶為稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或熒光假單胞菌脂酶。
42.權利要求41的方法，其中所述水解酶為稻根霉菌肽酶。
43.權利要求41的方法，其中所述水解酶為南極假絲酵母脂酶A。
44.權利要求41的方法，其中所述水解酶為熒光假單胞菌脂酶。
45.一種用于制備權利要求1至5中任一項的化合物的方法，其包括步驟
a)用水解酶選擇性水解酯13，得到光學活性的(-)-酯13和光學活性的(+)-烷醇7；
b)水解光學活性的(-)-酯13，得到光學活性的(-)-烷醇7；和
c)將所述光學活性(-)-烷醇7轉化成光學活性(-)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
46.一種用于制備光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥的方法，其包括步驟
a)用水解酶選擇性水解酯13，得到光學活性的(-)-酯13和光學活性的(+)-烷醇7；和
b)將所述光學活性的烷醇7轉化成光學活性的(+)-O-外/C-外-三環[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黃原酸1A、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。
47.權利要求45或46的方法，其中所述水解酶為稻根霉菌肽酶、南極假絲酵母脂酶A或熒光假單胞菌脂酶。
48.權利要求47的方法，其中所述水解酶為稻根霉菌肽酶。
49.權利要求39至48中任一項的方法，其中所述水解酶為催化量。
50.一種用于治療、預防或改善選自下述疾病的方法癌癥、自身免疫性疾病、炎癥疾病、神經變性疾病和與局部缺血、再灌注損傷、創傷、動脈粥樣硬化和/或衰老相關的疾病；其包括向個體施用治療有效量的權利要求1至5中任一項的化合物。
51.權利要求50的方法，其中所述癌癥為乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌、肝癌、子宮頸癌、結腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頸部癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宮癌、淋巴癌、白血病、胃癌、胰腺癌、睪丸淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
全文摘要
本發明提供了三環癸-9-基-黃原酸酯的光學活性立體異構體、及其制備方法和藥物組合物。還提供了將其用于治療、預防或改善病毒引起的疾病的一種或多種癥狀的方法。
文檔編號A61K31/265GK101796024SQ200880105498
公開日2010年8月4日 申請日期2008年7月3日 優先權日2007年7月3日
發明者富岡美雪, 長谷川柯 申請人:露馬維塔股份公司