生產病毒疫苗的方法

專利名稱：：生產病毒疫苗的方法
技術領域：
：本發明涉及生產病毒疫苗的方法。
背景技術：
：疫苗是抗原物質的免疫原成分，例如(非傳染性的)病原體如病毒、它的包膜、顆粒以及它的蛋白抗原。給藥或免疫會導致受試者例如哺乳動物如人或鳥的免疫。免疫可能引起對疫苗的特定的反應和一些輕微的炎癥，但是比完全活性病毒的感染的危害性要小得多，免疫正是被設計成防止此病毒的。受試者的免疫系統將調整自身以便特異性地識別疫苗的抗原，并在受試者進一步與病原體接觸后很快滅活該病原體。這樣通過免疫取得對抗病原體的提高的抵抗力。為了疫苗的目的，病毒通常在合適的細胞培養基上或一般的細胞培養基上培養。在流感的情況中，通常使用含胚的雞蛋。傳染性病毒收獲物被收集并被純化，以便去除不想要的非病毒細胞成分。尤其是，在來源于雞培養基的疫苗的情況中，對雞/蛋的蛋白質的過敏反應在某些易感染的個體上是可能的。病毒疫苗生產的一個基本步驟是傳染性病毒的滅活。福爾馬林(甲醛水溶液)在疫苗的生產中是最常使用的滅活劑。它通常作為濃度大約是37%甲醛的飽和水溶液使用。福爾馬林通過將表面蛋白的伯氨基團與蛋白質或DNA上鄰近的氮原子通過_CH2-鍵不可逆交聯來滅活病毒。尤其是這些交聯能引起與非病毒物質的連接，因此在活的傳染性病毒上進行一些預先純化是必需的，因為純化前的滅活會引起病毒蛋白與雜質之間大量的不可逆的化學聯接，這對于純化操作的有效性和產品的質量是有害的。基于這個原因，在現有技術中，活的傳染性病毒最初至少被部分純化，例如通過區帶超速離心，然后滅活(美國專利6，048，537)。福爾馬林的滅活步驟用已建立的分析程序驗證。與福爾馬林處理相補充，紫外線滅活已經被考慮并入生產過程。紫外線照射滅活用于人類疫苗以前已被證實用于非包膜和包膜的病毒(美國專利2006/0270017)。因為病毒的基因組比病毒的表面抗原更易受到紫外線的傷害，所以顯示紫外線滅活對產品的生化特性或免疫性幾乎沒有負面影響。紫外線滅活的目標主要是核酸，相反福爾馬林的目標是蛋白。當滅活特別是反彈性的病毒家族時，科學家通過將福爾馬林與紫外線滅活相結合，設法克服單獨紫外線滅活或福爾馬林滅活各自的局限性。可選地，許多生產商使用以去污劑為基礎的處理步驟來同時滅活活的病毒并修飾病毒。這些基于去污劑的處理破壞了流感病毒的脂質包膜，產生了裂解(部分破壞)或亞單位(完全破壞)的疫苗抗原。去污劑處理大多能減少病毒抗原的反應性，因此減少疫苗過程中不想要的副作用。去污劑處理的病毒可以進一步被滅活，例如福爾馬林處理。可以在美國專利6，048，573、美國專利4，522，809和W002/09702中發現這些方法的例子。此方法中的缺點是病毒要在破壞步驟之前經過不同的純化步驟，因此生產者要在幾個步驟上處理活的傳染性的病毒。這尤其是需要注意的，當生產對抗尤其是致命型的流感如H5N1的疫苗時。
發明內容本發明的目的在于提供一種生產病毒疫苗的方法，其具有減少的需要處理傳染性物質的步驟數，同時生產出反應性減小的病毒抗原。因此本發明提供一種制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)在液體中用傳染性的病毒接種細胞，b)所述病毒在所述細胞中增殖，c)在細胞培養物的上清液中收集所述增殖的病毒，d)滅活所述收集的病毒，以及e)用去污劑處理所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。第二個方面，提供了一種制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)收獲包含傳染性病毒的液體，b)完全地滅活所述收集的病毒，c)用去污劑處理所述滅活的病毒，以及d)純化所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。本發明的其他方面提供了由根據本發明的方法制造出來的病毒抗原制備而來的疫苗制品。本發明的另一方面提供了提高受試者對抗病毒感染耐受性的方法，包括制造含有病毒抗原的制品和將所述制品給藥于受試者。圖la顯示在增殖后從病毒收集到滅活收獲物的發明步驟的流程圖。圖lb顯示從滅活收獲物到單價批量制品的發明步驟的后續流程圖。具體實施例方式提供了一種制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)在液體中用傳染性的病毒接種細胞，b)所述病毒在所述細胞中增殖，c)在細胞培養物的上清液中收集所述增殖的病毒，d)完全地滅活所述收集的病毒，以及e)用去污劑處理所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。這個步驟的重點是有可能減少在活性病毒上操作的步驟數，因此病毒在最初收獲的收集后、在去污劑處理和/或任選的純化步驟前是滅活的。根據本發明的"病毒抗原"是病毒或病毒的一部分，可以引起受試者抗所述抗原的免疫應答。不需要在完全免疫受試者方面取得絕對的成功，但是在一定意義上應理解，增加對抗所述病毒的免疫防御或免疫應答可以減少在進一步的接觸后與所述病毒相關的發病幾率。這種病毒抗原可以是，例如完整的滅活病毒、裂解的病毒、修飾過的病毒、病毒蛋白尤其是表面蛋白比如血球凝集素或神經氨酸酶。"疫苗"是一種給藥形式的所述疫苗抗原制品，例如用于注射、鼻腔黏膜、經皮給藥。根據本發明，"純化"涉及去除收獲液體中非病毒成分的步驟。收集步驟后得到的收獲液體優選澄清的上清液，其中固體的或大的雜質例如殘留的完整細胞或在病毒增殖過程中裂解的受感染細胞的細胞碎片通過沉淀法例如離心法去除。因此"收集"指的是在液體中尤其是在清澈的液體中產生完整的傳染性病毒的任何步驟。除了去除細胞碎片外，收集步驟還包括去除細胞生長培養基的其他固體組分的步驟，例如培養細胞的任何種類的培養基。增殖的完整病毒被釋放到所述的細胞培養上清液中，從上清液中可以收集病毒。因此，在本發明的一個特定的實施方式中，收集增殖病毒的步驟包括在感染后將病毒從細胞和/或所述細胞的細胞碎片中分離出來。這種分離例如可以通過以大約2000g到3000g、直到5000g、10000g、15000g或20000g低速離心來促進分離，從液體中將可以看得見的顆粒分離出來。可選地，分離可以通過過濾來進行。在特定的優選實施方式中，比如通過選擇用于病毒增殖的細胞如哺乳動物、鳥類或昆蟲細胞培養，而不是胚胎卵細胞，所述的液體基本上沒有尿囊素、膠原蛋白和/或白蛋白例如卵清蛋白。在本發明的特定的實施方式中，非洲綠猴腎細胞株系(VERO)細胞被用于病毒的增殖。在收集步驟后，通過任何已知的用于病毒滅活的方法、比如在美國專利公布號2006/0270017Al所公開的方法來滅活病毒，在此將其引入本文以供參考。尤其是，通過甲醛處理和/或紫外線照射，單獨地或者組合地進行滅活。如同本申請中使用的術語"完全滅活"或"完全被滅活"，當它們涉及到病毒制品時，意味著當通過在雞胚纖維原細胞(CEF)或非洲綠猴腎細胞株系細胞上培養來測定病毒制品時，病毒制品并不含有空斑形成單位(pfu)。本發明方法的優勢之一是減少了在傳染性的病毒培養基上進行的需要特定的安全預防措施的步驟。現有技術認為，在最初收獲時進行純化步驟是必要的，以便去除或大量減少在福爾馬林處理過程中可與病毒交聯的非病毒蛋白或核酸。本發明克服了這個偏見，本發明顯示，在病毒收集之后、在純化之前，直接滅活實際上是可行的或甚至更有利。為了避免滅活過程中的這些副作用，含有病毒的液體或其非病毒組分優選在收集步驟過程中或之后不進一步濃縮或以低于10、9、S、7、6、5、4、3或2的倍數濃縮。優選地，在滅活步驟前維持來自于細胞培養物本身的上清液中的非病毒蛋白和/或DNA的濃度。在特定的實施方式中，在滅活過程中或在收集病毒之后的液體中，完整蛋白或非病毒蛋白的濃度在Pg/ml的范圍內，例如在950iig/ml、900iig/ml、850iig/ml、800iig/ml、700iig/ml、650iig/ml、600iig/ml、550iig/ml、500iig/ml、450iig/ml、400iig/ml、350iig/ml、300iig/ml、250iig.ml、200iig/ml、150iig/ml、100ug/ml、80ug/ml、60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug.ml、10iig/ml、8iig/ml、6iig/ml、4iig/ml、3iig/ml、2iig/ml以下或在1lig/ml以下。可以選擇對滅活病毒有效的任何劑量的甲醛或紫外線照射劑量，單獨的或者組合的，用于滅活。在本申請的優選的實施方式中，病毒滴度的減少歸因于樣品中病毒的滅活，減少量至少是大約lx105;在較優選的實施方式中，至少是大約lx107;在更優選的實施方式中，至少是大約lxl(T;在最優選的實施方式中，至少是大約lx1014。在本發明的一個優選的實施方式中，用有效濃度的福爾馬林處理樣品大約12至大約96個小時。在較優選的實施方式中，用有效濃度的福爾馬林處理樣品大約24至大約48個小時，更優選的是處理大約24至30個小時。在本發明的一個尤其優選的實施方式中，用有效濃度的福爾馬林處理樣品大約24至大約24.5個小時。疫苗領域的技術人員將會認識到，對于被處理的特定的疫苗菌株，需要優化福爾馬林的濃度和處理時間來達到完全的滅活，無論是單獨的福爾馬林或是與紫外線的組合。在更進一步的實施方式中，用有效濃度的福爾馬林處理樣品的步驟是在大約10至大約4(TC下進行的。在本申請的一個尤其優選的實施方式中，用有效濃度的福爾馬林處理樣品的步驟是在大約32t:下進行的。本發明的一個優選的實施方式包括用有效濃度的福爾馬林處理樣品，其中福爾馬林的有效濃度的范圍優選從大約0.01%至大約1%(w/V)，較優選從大約0.01X至大約0.1%，更優選在大約0.025%和大約0.1%之間，其中當使用37%的福爾馬林溶液來調節有效濃度時，大約0.025%和大約0.1%各自對應于大約92mg/l和大約368mg/l的福爾馬林。在本申請中，術語"紫外線"指的是具有100至400nm波長的紫外線輻照。紫外線可以選自由UVC(100至280nm)、UVB(280至320nm)、以及UVA(320至400nm)所組成的組。像那些插入進DNA并且被紫外線激活的光敏劑，例如補骨脂素，可以被用來增加紫外線輻射的滅活效果。在本發明的一個優選的實施方式中，紫外線是具有大約100至大約280nm波長的UVC。在本發明的一個更優選的實施方式中，紫外線的波長大約從240至290nm。在本發明的一個尤其優選的實施方式中，大約85%或更多的紫外線的波長大約是254nm。紫外線的發射可能是連續形式的紫外線發射，例如水銀燈技術；或脈沖紫外線，例如單頻激光技術。理想的紫外線強度可能通過組合兩個或更多的燈而產生。本發明的主題包括紫外線的任何有效劑量，即，優選當和福爾馬林處理組合起來時安全地滅活給定的病毒的紫外線的任何劑量。免疫領域的技術人員會認識到，紫外線的波長和照射需要針對特定的被處理病毒株進行優化，以便能達到完全滅活，無論是單獨的紫外線或與福爾馬林處理組合。有效的劑量取決于為這個領域所熟知的多種因素，例如紫外線滅活室的物理參數比如燈和室的大小和直徑、含病毒的培養基與紫外線源之間的距離、室內材料的光吸收和反射性質。出于同樣的原因，UVC光的波長和強度以及病毒暴露于紫外線下的接觸時間對于有效劑量也是很關鍵的。此外，有效劑量也受病毒本身、含病毒的培養基以及它們的光吸收性質的影響。優選地，有效劑量足以殺死至少99.99%的樣品所含病毒，更優選滅活病毒至在哺乳動物或鳥類細胞培養檢驗上沒有檢測出活性病毒的水平，或完全滅活。在一個優選的使用UVC光的實施方式中，含病毒的樣品暴露于范圍在約5至約200mJ/cm2之間的有效劑量。在一個優選的實施方式中，有效劑量范圍在約20至約100mJ/cm2之間，在其它優選的實施方式中，有效劑量范圍在約40至約90mJ/ci^之間。在一個優選的實施方式中，有效劑量減少了初始病毒滴定度的lx105。在批量疫苗滅活中，有效劑量應是足以消除初始化學(福爾馬林)滅活步驟之后可能存在的任何殘留的活病毒。如實施例所述，這可以通過非常靈敏的哺乳動物細胞培養感染檢驗例如在實施例1.3中所述的Vero細胞培養檢驗法來測定。在滅活后，純化病毒抗原。純化優選通過超速離心進行，例如在約100000g的范圍內，比如50000g、60000g、70000g、80000g、或90000g，或直到200000g、180000g、160000g、140000g、120000g、或110000g。超速離心方法在本領域中是為人們所熟知的，并被用在病毒疫苗的常規生產中，例如在美國專利6，048，537中的描述，將此引入本文以作參考。優選地，超速離心是在離心過程中自身建立起的蔗糖密度梯度中進行的。在特定的優選實施方式中，蔗糖梯度是通過使用約42%至55%)蔗糖(或本領域中任何適合的碳水化合物或糖)溶液形成的。對于超速離心，可能使用連續流動離心。在超速離心后各組分的參數取決于使用的病毒株的特性。峰值蓄積液(peakpool)組分的收集參數針對每個病毒株單獨地被評估和確定，并在約46-50%至34-38%的蔗糖范圍之內。優選非病毒物質通過密度分離被去除(例如這步中完整的滅活病毒)。細胞膜碎片，包括脂質體和蛋白質，每個都有特征性的特定密度。作為蛋白質、核酸以及包膜病毒中的膜特征性組分的病毒可以通過它們特定的密度而被從非病毒物質中純化出來。尤其是，完整病毒抗原可以從不完整的病毒部分中被純化出來，或反之亦然。純化滅活病毒的這個步驟包括從病毒中至少部分地去除溶解性的非病毒物質。尤其是溶解性的非病毒物質包括來自于原細胞培養基或培養物中細胞的細胞蛋白或細胞核酸。非病毒物質，包括不完整的病毒部分，優選減少至少20%的量，優選在純化過程中至少減少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或至少90%。在特定的優選實施方式中，收集的液體用核酸酶處理來降解寄主細胞中的核酸。這樣的核酸酶例如可以是benzonase。在本發明的進一步的實施方式中，用于細胞培養和病毒增殖的細胞可以是原始細胞或任何適合生產病毒的培養細胞系。可用細胞的例子包括哺乳動物細胞(例如CH0(中國倉鼠卵巢細胞)、BHK(幼倉鼠腎細胞)、VERO(非洲綠猴腎細胞株系)、HELA(宮頸癌細胞)、或perC6細胞)，鳥類細胞(例如雞胚纖維原細胞，或來自鳥類的連續細胞系)以及昆蟲細胞(例如sf9細胞)。在特定的優選實施方式中，細胞呈細胞培養物形式。發明方法允許進行有效的純化，包括裂解物質，無論潛在的以前滅活試劑的交聯特性如何。與蛋培養的病毒相反，來源于細胞培養的病毒有更高的初始純度，并且不含白蛋白和膠原蛋白，這代表了福爾馬林處理的收獲物純化的一個重要優勢。最終的產品的改進劑型沒有絮凝作用，不需要任何穩定劑例如生育酚或聚乙二醇單十二醚。在本發明中，待被滅活的病毒選自包膜DNA或RNA病毒，是具有單鏈或雙鏈(DNA)基因組、致敏或抗致敏、連續的或片斷的病毒。在本發明的優選實施方式中，病毒選自由包膜病毒組成的組，包括黃病毒、外衣病毒、逆轉錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、棒狀病毒、布尼亞病毒、正粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、肝DNA病毒、皰疹病毒以及痘病毒。在其它優選實施方式中，病毒是黃病毒、冠狀病毒、正粘病毒或外衣病毒。特別優選的是包膜病毒，例如流感，包括流感A、B或C株、西尼羅以及羅斯河病毒(RRV)。在本發明的其它優選實施方式中，病毒選自由包膜RNA病毒組成的組，包括黃病毒、外衣病毒、逆轉錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、棒狀病毒、布尼亞病毒、正粘病毒、副粘病毒以及沙粒病毒。在特定的優選實施方式中，病毒選自正粘病毒，例如流感病毒株流感病毒株可能有血凝素(hemaglutianin)和神經氨酸酶表面蛋白的不同組合。在另一個特定的優選實施例中，病毒選自外衣病毒，例如甲病毒屬如羅斯河病毒(RRV)。另一組用作批量病毒溶液的優選病毒組是冠狀病毒，包括與嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)相關的病毒。另一組優選的病毒組是黃病毒，包括日本腦炎、虱傳腦炎(TBE)、登革熱病毒、黃熱病病毒、西尼羅河病毒以及出血熱病毒。另一優選的病毒組是痘病毒，包括正痘病毒(如牛痘或變更牛痘安卡拉病毒)和禽痘病毒。在進一步的實施方式中，被純化的病毒被進一步地加工。在純化后，進一步的步驟包括稀釋被純化的病毒，尤其是在蔗糖超速離心后，以便稀釋預期是含有約40%蔗糖的粘稠的峰值蓄積液組分。將被純化的病毒勻漿化，另外用核酸酶處理、壓濾和/或超/滲濾。7在本發明的實施方式中，病毒用去污劑處理進行修飾來產生修飾的完整病毒或裂解病毒疫苗。病毒脂質包膜的修飾是通過用去污劑例如TritonX100以使病毒尤其是病毒脂質包膜不穩定或分解的適合濃度增溶來進行的。去污劑處理至少部分地去除所述病毒的膜。優選去污劑的濃度通過例如滲濾或色譜方法來去除。在去污劑處理步驟中使用的去污劑包括離子型(陽離子、陰離子、兩性離子)去污劑或非離子型去污劑。合適的去污劑包括吐溫組去污劑(例如吐溫80)，以及Triton組去污劑(例如Triton100)。可選地，病毒抗原制品可以通過額外的甲醛處理或添加穩定劑來進一步穩定化，例如使用如WO02/097072A2所公開的去污劑，將其引入本文以作參考。這些去污劑舉例來說是適合穩定HA蛋白的去污劑，例如吐溫80、TritonX100、脫氧膽酸鹽、聚乙二醇單十二醚和生育酚。人們認為表面蛋白是通過細胞膜成分與去污劑的復合微膠束而溶解的。在特定的優選的實施方式中，病毒被進一步加工成裂解病毒，所述加工包括以下的任何一個步驟稀釋、勻槳化、核酸酶處理、壓濾、超/滲濾、增溶、滲濾、用甲醛處理來穩定、稀釋、超/滲濾、(去污劑)穩定劑添加、第二次勻漿化和滅菌過濾。在其他特定的優選實施方式中，病毒被進一步加工成修飾過的病毒制品，所述加工包括以下任何一個步驟稀釋、勻漿化、核酸酶處理、壓濾、去污劑處理、超/滲濾、穩定劑添加、第二次勻漿化和滅菌過濾。尤其是進行去污劑穩定化，將去污劑引入至包膜病毒的病毒膜中來增加完整病毒的穩定性，這樣就修飾了病毒。在另外的實施方式中，病毒被處理成亞單位疫苗，包括單個病毒亞單位或病毒蛋白尤其是諸如血凝素或神經氨酸酶的表面蛋白的分離。分離可以是例如通過親和純化和/或色譜方法比如離子交換色譜法來進行的。令人驚訝的是，本發明的方法適合工業規模生產病毒抗原疫苗。因此優選滅活或任何其它步驟例如接種、增殖、收集或純化進行的量或產物的量是包含病毒或病毒抗原的液體的量至少是0.5L、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、12L、14L、16L、18L、20L、25L、30L、35L、40L、60L、80L、100L、120L、140L、160L、180L、200L。在進一步方面，本發明也提供了用于生產包含病毒抗原的制品的方法，其包括a)獲取含有傳染性病毒的液體，b)完全滅活所述收集的病毒，c)用去污劑處理所述滅活的病毒，d)純化所述滅活的病毒，得到包含病毒抗原的制品。當然使用含有傳染性病毒的液體本身也是可能的，病毒來自于上述任何細胞的上清液，用于滅活、去污劑處理、以及純化。優選所述包含傳染性病毒的液體是從細胞培養物中獲得的。在特定的優選實施方式中，病毒抗原，尤其是裂解病毒或經過修飾的病毒抗原，通過添加有效劑量的吐溫80來被穩定，尤其優選吐溫80的濃度為約0.125%，比如高于0.01%、0.05%或0.4%，以及低于0.6%、0.5%、0.4%、0.3%或0.2%。因此，本發明在進一步的方面也提供了通過添加吐溫80來穩定病毒抗原的方法。根據本發明，發現去污劑吐溫80溶解病毒膜沒有TritonX100有效，但是吐溫80是目前最具生物相容性的、并且能存在于疫苗制品中。穩定病毒抗原的有效劑量優選低于在使用高濃度的TritonX100如0.5%的裂解病毒增溶步驟中用于增溶病毒膜的劑量。在其它實施方式中，病毒抗原不含穩定劑。在特定的實施方式中，通過在裂解和純化步驟前將病毒收獲物完全滅活的步驟，提供了生產的裂解疫苗。令人驚訝的是，用福爾馬林處理和紫外線處理的滅活步驟并不影響隨后的去污劑處理和純化步驟。在進一步的實施方式中，提供了包含一種或多種疫苗抗原的疫苗或藥物組合物。該藥物組合物可進一步包括藥物載體和/或佐劑。這些藥物載體舉例來說是穩定性鹽、乳化劑、增溶劑或滲透壓調節劑、懸浮劑、增稠劑、維持生理氧化還原電勢的氧化還原劑成分。優選佐劑包括鋁鹽、微乳液、脂質顆粒、和/或被用來增加免疫應答的寡核苷酸。本發明的進一步的方面是提供藥物組合物或包含抗原的作為疫苗的制品。疫苗可以用來例如注射作為預防與病毒相關的疾病的方法。在特定的優選實施方式中，組合物或疫苗包含不止一個抗原，如2、3、4、5、6、7或8個抗原，尤其是不同病毒株、亞型或類型例如流感A和流感B的抗原，尤其選自以下抗原中的一種或多種人的H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7亞型的抗原，豬流感H1N1、H1N2、H3N1和H3N2亞型的抗原，狗或馬流感H7N7、H3N8亞型的抗原或鳥H5N1、H7N2、H1N7、H7N3、HI3N6、H5N9、HI1N6、H3N8、H9N2、H5N2、H4N8、H10N7、H2N2、H8N4、H14N5、H6N5、H12N5亞型的抗原。合適的佐劑可以選自礦物膠、氫氧化鋁、表面活性劑、溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇類、聚陽離子或油乳劑例如油包水或水包油或其組合。當然，佐劑的選擇取決于有目的的使用。例如，毒性可能取決于受試的生物體，可以從無毒至高毒性間變化。本發明的組合物或疫苗的另一個優選實施方式進一步包括緩沖物質。本領域的技術人員可以選擇緩沖物質來建立根據本發明的組合物溶液中的生理條件。像PH和離子強度以及離子含量的性質可以按需要來選擇。根據本發明進一步的優選組合物或疫苗，包含藥物可接受的載體。術語"載體"指的是稀釋劑，例如水、鹽、賦形劑或可以給藥組合物的介質。作為固體成分，藥物組合物中的載體可以包括粘合劑，例如微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮或聚乙烯吡咯酮)、黃蓍膠、白明膠、淀粉、乳糖或單水乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、玉米淀粉以及類似物；潤滑劑或表面活性劑，例如硬脂酸鎂或月桂基磺酸鈉；助流劑，例如硅膠；甜味劑，例如蔗糖或糖精。還提供了提高受試者對病毒感染的耐受性的方法，包括生產包含一種或多種不同病毒抗原的制品，并且將如上所述包含一種或多種病毒抗原的制品給藥于受試者。制品優選是疫苗。也預期提供按本發明制備的病毒抗原作為疫苗，或者通過將所述病毒抗原給藥于受試者以提高受試者對病毒感染的耐受性。實施例實施例1:傳染性病毒的滅活在Vero細胞培養物中生產三種不同的流感株兩種A型病毒株一廣島病毒株(HR，H3N2)和新喀里多尼亞病毒株(NC，H1N1)，以及B型病毒株一馬來西亞病毒株(MA)。在病毒增殖后，傳染性的病毒收獲物在純化之前按照圖la所示流程被滅活。1.1.福爾馬林滅活用福爾馬林處理的第一個滅活步驟是在不含細胞的、傳染性單價病毒收獲物、即通過離心澄清后的生物反應器中的收獲物上進行的。在30至34t:下收集后，在30至34°C下用約0.9至約1.1U/mlBenzonase處理單價病毒收獲物4至8個小時。然后在32+/_2°C下用《92mg/l的福爾馬林處理24至24.5個小時。1.2.紫外線滅活用福爾馬林滅活病毒的許多滅活試驗是使用具有65W紫外燈的滅活室和薄層室進行的。雖然當用每小時ioo升的流速三次循環時，能夠證明完全滅活單價病毒收獲物，但是這個裝置不能在線測定紫外線信號。用于生產流感病毒的Vero細胞培養基含有不同的有機化合物是造成紫外線信號吸收的原因。因此，這個系統裝配了110W燈，允許在處理單價病毒收獲物的過程中能連續監控紫外線信號。福爾馬林處理的單價流感巴拿馬病毒株收獲物被用作滅活的模型底物。對于采用薄層紫外線技術的連續滅活，使用了裝配有VISA燈(110W)的WEDECOVISA系統(德國)。紫外線薄層室是不銹鋼1.4435裝置，帶有30mm直徑的石英管。校準過的紫外線傳感器能在線監控紫外線信號。紫外線薄層室在室溫下以每小時240+/-10升的流速運轉。流速條件通過校準過的流量計來控制。單價收獲物暴露于10次紫外線循環。每次循環后，紫外線處理的20升的單價收獲物被移出，并且被進一步使用連續超速離心通過蔗糖梯度純化來純化。1.3安全性檢驗標準Vero安全性檢驗室用于滅活流感株殘留感染性的非常嚴格的質量檢驗。此檢驗也可應用于其他病毒。單價批量產品，即蔗糖梯度離心和超濾_滲濾后的純化病毒抗原，被加到5個Roux扁瓶中(4ml/個扁瓶)。在Vero培養基中32"C下孵育7天后，獲得細胞培養物、集中并加到5個Roux扁瓶中(10ml/個扁瓶)。在另一個32t:下孵育7天的步驟后，獲得細胞培養物、集中、并被用于紅血球凝集素(HA)檢驗。HA-檢驗基于如下事實流感病毒能用它們的表面蛋白紅血球凝集素來結合紅血球。此檢驗在無菌環境中進行。用具有確定的HA滴度的流感病毒懸浮液作為陽性對照，0.9X的氯化鈉溶液作為陰性對照。將50ia以l:2稀釋在0.9%氯化鈉溶液中的待檢驗的樣品放入96孔板的一個孔中。將50iU的含有雞紅細胞的溶液加入每個孔中。隨后，孔板在室溫下孵育30至45分鐘。然后目測紅血球凝聚，其中如果5個含有相同樣品的孔不顯示任何紅血球凝聚，則樣品通過HA檢驗。實施例2:超速離心純化在流感病毒抗原的純化過程中，單價收獲物(MVH)通過離心來濃縮。在用蔗糖水溶液形成的蔗糖梯度的基礎上，連續流動離心步驟被應用于Vero細胞培養物培養的病毒疫苗的生產。使用的離心機型號配有預澄清器。使用20mMTris-緩沖液中約42X和55X(w/V)的蔗糖溶液形成的密度梯度的小規模實驗在不同的離心條件下進行。此外，沒有預澄清器、但是增加g-離心力的超速離心也是提高產量的有用的手段。單價流感病毒收獲物(MVH)被用于比較研究。單價流感病毒收獲物用實驗室離心機型號RK-6在35，OOOrpm下通過連續超速離心被純化。實施例3:純化/處理對于流感候選疫苗，三種不同的流感株按照實施例2所述的方法通過超速離心被純化和收集。抗原產量在各峰值蓄積液中是不同的。新喀里多尼亞流感株含有最低的抗原產量，接著是廣島流感株，最后是馬來西亞流感株。蛋白含量在馬來西亞流感株中最高，在廣島流感株中最低。來自于馬來西亞流感株和新喀里多尼亞流感株的峰值蓄積液中的SRD(單輻射免疫擴散試驗(HA-定量))對總蛋白量的比值是相當的，但是在廣島流感株中較高(表l)。表1:峰值收集液的分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>進一步的處理如下總述3.1.峰值蓄積液的稀釋用TBS緩沖液稀釋峰值蓄積液3倍，來減少蔗糖濃度用于減少粘性。3.2.第一次勻漿化峰值蓄積液用高壓勻漿器"NS1001LPanda"(NiroSoaviS.p.A.)處理稀釋的峰值蓄積液。病毒懸浮液在800巴的壓力下通過勻漿器3次。這個壓力通過破壞病毒聚集體足以改善隨后的處理步驟。3.3.添力口BenzonaseBenzonase，大腸桿菌中產生的重組核酸酶，以3U/ml的最終濃度被加到病毒懸浮液中來降解來源于細胞的DNA。3.4.壓濾添加Benzonase后，進行0.22iim的壓濾，使得在隨后的孵育過程中病毒懸浮液不含有外來的生物體例如細菌。孵育在32t:下過夜進行。3.5.超濾/滲濾在Benzonase孵育完成后，超濾/滲濾通過30kD懸浮通道超濾膜(Pall)在過濾面積0.lm2的小規模和0.5m2的中試規模下進行。超濾滯留液(ultraretentate)使用10個滯留液體積的TBS(Tris緩沖鹽溶液)+0.008%TritonX100(w/w)來滲濾。113.6.添加TritonX100用于增溶和孵育。對于病毒裂解，TritonX100被加至最終濃度是0.5%(w/w)，并在室溫下孵育過夜。3.7.滲濾II為了去除高濃度的TritonX100，滲濾通過30kD懸浮通道超濾膜(Pall)來進行。超濾滯留液用15個滯留液體積的TBS(Tris緩沖鹽溶液)來滲濾。3.8.添加甲醛和孵育甲醛被加到超濾滯留液/滲濾滯留液(Diaretentate)中至最終濃度是0.025%，用于抗原的穩定化。在室溫下進行18-24個小時的孵育。福爾馬林是約36-37%甲醛氣體的飽和水溶液。3.9.通過HPLC來確定TritonX100的濃度隨后的處理步驟由稀釋步驟和進一步的超濾/滲濾組成。為了針對TritonX100(TX100，約0.015X，250iiM，在水溶液中)稀釋UDR(超濾滯留液/滲濾滯留液)至低于臨界膠束濃度，引入分析TX100的測定步驟被來確定TX100的濃度。稀釋倍數取決于TX100濃度。3.10.對于TX100稀釋UDR至低于臨界膠束濃度含有殘留TX100約0.1-0.2%(通過HPLC確定)的超濾滯留液/滲濾滯留液用TBS稀釋至最終TX100濃度為0.008%，明顯低于CMC(臨界膠束濃度)。3.11.超濾/滲濾III超濾/滲濾通過相同的30kD懸浮通道超濾膜來進行。超濾滯留液用5個滯留液體積的TBS(Tris緩沖鹽溶液)+5VCTBS+0.008%TritonX100(w/w)來滲濾。3.12.去污劑穩定化在TXIOO濃度減少至目標水平時，吐溫80被加到懸浮液中，至最終濃度是0.125%士0.025X，用于進一步的病毒抗原穩定化。這可避免由于TXIOO濃度過低引起的抗原再聚集。3.13.第二次勻漿化進行第二次高壓勻漿化步驟是為了在O.22iim過濾步驟中使得抗原損失減少。使用如3.2部分所述的相同裝置中的相同勻漿器。3.14.無菌過濾在第二次勻漿化步驟之后，用0.22iim過濾器(Millipore)進行無菌過濾。無菌過濾的批量物質被稱為單價批量(MVB)。實施例4:結果表2:以裂解病毒(廣島)為例的超速離心后的純化結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>DIL(l:3):峰值蓄積液的稀釋；UDR:超濾/滲濾后的超濾滯留液/滲濾滯留液；H0M-1，H0M-2:勻槳化1和2;PFIL:0.22iim壓濾；MVB:單價批量MVB中總的SRD是73mg。總Vero蛋白水平從5.2mg減少至lmg，減少了80.8%。MVB中總Vero的DNA減少至0.28yg。總蛋白從487mg減少至212mg，減少了56.5%。在馬來西亞病毒株上也能得到相似的結果總Vero蛋白從8.3mg減少至2.4mg，從峰值蓄積液到MVB減少了大約67.5%。MVB中Vero的DNA含量是1.8yg。在純化過程中總蛋白從748mg減少至310mg，減少了58.6%。對于新喀里多尼亞病毒株，在純化的最后，總Vero蛋白從峰值蓄積液的8mg減少至MVB中的2mg，減少了大約75%。MVB中總Vero的DNA含量是0.27yg。總蛋白從峰值蓄積液的382mg減少至MVB中的162mg，減少了大約57.6%。純化步驟是非常一致和有效的。寄主細胞的蛋白和DNA、以及處理化學物如Benzonase、蔗糖、甲醛和TritonX100的成功減少得到高度純化的病毒制品，并且沒有內毒素。所有的制品在生產后都是無菌的。三種MVB中SRD與蛋白的比值符合規定。1權利要求一種用于制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)在液體中用傳染性病毒接種細胞，b)使所述病毒在所述細胞中增殖，c)收集所述增殖的病毒，d)完全地滅活所述收集的病毒，以及e)用去污劑處理所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，收集所述增殖的病毒的步驟包括在感染后將病毒從所述細胞和/或所述細胞的細胞碎片中分離出來。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述滅活是通過加入甲醛進行的。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述滅活是通過紫外線照射進行的。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖的病毒被釋放在所述液體中。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，收集后用核酸酶處理被收集的液體。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸酶是benzonase。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述病毒增殖過程中所述細胞呈細胞培養物形式。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是哺乳動物或鳥類細胞。10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是上皮細胞。11.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述細胞是Vero細胞。12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒是包膜病毒。13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒。14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述滅活期間非病毒蛋白的濃度低于350iig/ml。16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述制造是以工業規模的量進行。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述滅活是在至少IL含有病毒的液體上進行的。18.—種制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)獲取包含傳染性病毒的液體，b)滅活所述收集的病毒，c)用去污劑處理所述滅活的病毒，以及d)純化所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述液體從細胞培養物中獲得。20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，進一步包括穩定所述病毒抗原的步驟。21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，通過加入有效劑量的吐溫80來穩定所述病毒抗原。22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，吐溫80的含量大約是0.125%。23.—種提高受試者對病毒感染的耐受性的方法，包括制造含有病毒抗原的制品，將通過權利要求1-22所述方法中的任何一種所獲得的制品給藥于受試者。全文摘要本發明提供一種制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)在液體中用傳染性的病毒接種細胞，b)所述病毒在所述細胞中增殖，c)收集所述增殖的病毒，d)滅活所述收集的病毒，以及e)用去污劑處理所述滅活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。文檔編號A61K39/12GK101790381SQ200880105185公開日2010年7月28日申請日期2008年8月28日優先權日2007年8月28日發明者C·陶爾,N·巴里特,O·基斯特納,W·芒德特申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司