專利名稱：：用于治療呼吸疾病的nrg1調節物的制作方法用于治療呼吸疾病的NRG1調節物1.發明領域本發明涉及在治療疾病和病癥中用于中和神經調節蛋白(NRG)家族成員的生物學活性的化合物、組合物和方法。本發明尤其涉及在治療人疾病和病癥中，與神經調節蛋白-1(NRG1)和其同工型結合并中和神經調節蛋白-1(NRG1)和其同工型生物學活性的拮抗物。本發明的其它方面、目的和優點從以下描述將是顯而易見的。2.
背景技術：
：已將氣道黏液分泌過多與幾種呼吸疾病的病理學特征聯系了起來，其中所述幾種呼吸疾病如哮喘[Aikawa等人，1992]、慢性阻塞性肺病(C0PD)[Vestbo，2002]和囊性纖維化(CF)[Boucher,2002]。事實上，已將黏液分泌過多與呼吸疾病中感染的頻率和持續時間的增加、肺功能的下降以及發病率和死亡率的增加聯系了起來[Vestbo，2002;Prescott等人，1995;Vestbo等人，1996]。雖然在大的氣道中，黏液由杯形細胞和黏膜下腺體產生，但是在小的氣道中，黏液的唯一來源是杯形細胞[Rogers,2003]。黏蛋白MUC5AC和MUC5B是呼吸疾病如哮喘、C0PD和CF中氣道黏液分泌物的主要組分[Williams等人，2006;Rose和Voynow，2006;Rogers，2003]。黏液分泌過多是哮喘的特征，其中對死于嚴重急性哮喘發作患者的肺的形態測量分析顯示了增加的杯形細胞數量和氣道腔中黏液[Aikawa等人，1992]。已經報道了氣道腔的黏液堵塞是引起大多數患者致死性哮喘的主要原因[Kuyper等人，2003;Hays和Fahay，2003]。與正常個體比較，MUC5AC表達在哮喘持續狀態中是增加的，且MUC5AC表達定位于表面上皮、管腔和杯形細胞[Gronenberg等人，2002a]。也已經報道了與健康個體比較，患輕度到中度哮喘的受試者具有增加的杯形細胞數量，且報道了分泌的黏蛋白水平在患有中度哮喘患者的氣道中的水平更高[Ordonez等人，2001]。此外，已經報道了與健康個體比較，患哮喘的受試者的杯形細胞增加的MUC5AC黏蛋白染色[Ordonez等人，2001]。在哮喘中，黏蛋白MUC5B也由一些氣道表面杯形細胞產生[Gronenberg等人，2002a]。已報道了C0PD的發展與小氣道腔中黏液的積聚強烈相關[Hogg等人，2004]。已經描述了患C0PD的個體在支氣管上皮細胞中MUC5AC的增加表達和在支氣管腔中MUC5B的增加水平[Caramori等人，2004]。在另一研究中也已經報道了MUC5B是患C0PD患者的痰中主要的黏蛋白[Kirkham等人，2002]。已經建議了在COPD患者的細支氣管腔中觀察到的增加的黏液在COPD中對阻礙外周氣道有作用[Caramori等人，2004]。也已經描述了在患COPD和慢性支氣管炎的患者的細支氣管上皮中杯形細胞的增加數量[Saetta等人，2000]。在CF中，黏液分泌過多與氣流阻塞和致死病例中小氣道的閉塞有關[Williams等人，2006]。過多的黏液也似乎可以通過增加肺部感染的頻率和嚴重程度來促成CF的發病[Williams等人，2006]。盡管已經報道了與正常人相比，在CF受試者中分泌的黏蛋白MUC5AC和MUC5B的濃度是下降的[Henke等人，2004]，但是MUC5AC和MUC5B在惡化期間的CF患者的痰中是增加的[Henke等人，2007]。已經報道了由MUC5AC陽性細胞數量的增加導致的杯形細胞增生在囊性纖維化肺中是增加的[Gronenberg等人，2002b]。盡管IL-13已經顯示出影響MUC5AC基因和蛋白質在體外和體內的表達[Wills-Karp等人，1998;Zhu等人，1999;Kuperman等人，2002;Atherton，Jones和Danahay，2003]，但是它對黏蛋白MUC5B沒有影響。MUC5B產生的介質沒有很好地表征。神經調節蛋白是信號蛋白質，所述信號蛋白質通過ERB家族的受體酪氨酸激酶來介導多種細胞-細胞之間的相互作用。作為選擇性剪接的結果，存在至少15種不同的神經調節蛋白-l(NRGl)的同工型[Falls,2003]。這些同工型中的兩種，NRG1a禾PNRGIPI，在EGF樣結構域的C末端部分不同[Holmes等，1992]。認為NRG1與ErbB3或ERRB4結合，所述ErbB3或ERRB4與ErbB2形成異二聚體[Falls,2003]。NRG1P1以比NRG1a高100倍的親和力與ErbB3結合。NRG1P1也對ErbB2/ErbB3異二聚體具有比與ErbB3同型二聚體大100倍的親和力[Jones等人，1999]。ErbB3缺少酪氨酸激酶活性，但是與ErbB2的二聚化作用導致能介導下游信號的活性異二聚體的形成[Citri，Skaria和Yarden，2003]。通過對胎兒肺組織的免疫組織化學和功能研究，以前已經建議了NRG1和ErbB2受體以及ErbB3受體在人肺發育中的作用[Patel等人，2000]。NRG1P1分泌自胎兒肺成纖維細胞并剌激II型細胞表面活性物質合成，并因此提出NRG1131通過間質的-上皮的相互作用來控制胎兒肺成熟[Damma皿等人，2003]。最近，已經提出了NRG1a同工型在上皮的創傷修復和氣道重塑中起作用[Vermeer等人，2003]。該研究中顯示ErbB2受體表達于已分化的上皮細胞的基底外側的表面，且NRGla配體表達于頂端表面。因而，認為直到上皮損傷發生時配體受體相互作用才會發生。NRG(有時稱為Heuregulin，"HRG")的表達已經在來自COPD患者的支氣管組織中檢測到，且與那些未患COPD的受試者相比，在患COPD的受試者的完整上皮中觀察到了NRG的更高表達[deBoer等人，2006]。然而，在deBoer等人的研究中，沒有說明研究的NRG1的特定同工型。在本說明書中引用的所有出版物(包括專利申請)和本申請要求優先權的任一說明書在此處明確地以其整體引入作為參考。3.發明概述本發明基于(至少部分基于)NGR-1，以及特別是同工型NRG1131促進MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質表達的研究，并因此提出了在杯形細胞形成中的作用。因此，本發明的第一個方面提供了抑制杯形細胞形成的方法，所述方法包括提供中和NRG-1，如NRG1P同工型，特別是NRG113l(和特別是人NRGie1)的生物學活性的結合化合物。本發明的第二個方面提供了篩選能中和NRG-1如NRG1P1的生物學活性的結合化合物的方法。本發明的第三個方面提供了包含結合化合物(或基本上由結合化合物組成)的藥物組合物，其中所述結合化合物中和NRG-1如NRG1131(特別是人NRG1P1)的生物學活性。本發明的第四個方面提供了在哺乳動物患者中抑制杯形細胞形成的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治療有效量的中和NRG-1如NRG1131的生物學活性的結合化合物。本發明的第五個方面提供了在臨床需要其的哺乳動物患者中抑制有害的黏液產生的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治療有效量的中和NRG-1如NRG1131的生物學活性的結合化合物。第六個方面提供了治療人患者中選自COPD、CF、慢性支氣管炎和哮喘(特別是中5疾病或病癥的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治療有效量的人或人源化的中和NRG1P1的生物學活性(如通過與NRG1P1結合并抑制NRG1P1和ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用)的抗體(如IgG同種型，例如IgGl或IgG4)。本發明的這些和其它方面將在下文進行更詳細的描述。4.發明詳述在本說明書隨后的第4部分中，提及的多種蛋白質、其同工型和疾病/病癥的治療與人蛋白質、其同工型以及人疾病和病癥有關。因此，"NRG-l"、"NRGla"和"NRG1Pl"理解為指人NRG-1等。在以下所述的實施方案中，提及的"NRG1"和"NRG113l"可用于指各種蛋白質的所有形式，以及另外地和分別地指可溶性和膜結合形式，且本說明書的讀者可認為每一實施方案應如此理解。因此，除非特別說明，以下所述的每一實施方案指三個實施方案，第一指各種蛋白質的所有形式，第二指任何膜結合形式和第三指各種蛋白質的可溶性形式。4.1結合化合物在本發明的一個方面中，提供了中和NRG1蛋白質的生物學活性的結合化合物。在一些實施方案中，結合化合物與NRGIP1結合并中和NRG1P1促進MUC5AC和MUC5B在上皮細胞(如杯形細胞)上表達的能力。這類結合化合物可與NRG1P1結合并抑制NRG1P1與其相關受體如ErbB2和/或ErbB3，優選地ErbB2/ErbB3異二聚體結合。在此類實施方案中，結合化合物可以是能與NRG-1蛋白質如NRG-1131結合并因此中和其生物學活性，如通過抑制蛋白質和其相關受體例如ErbB2和/或ErbB3之間的相互作用的低分子量化學實體。在其它此類實施方案中，結合化合物可以是能與NRG-1蛋白質(如NRG-1P1)結合并抑制NRG-1蛋白質(如NRG-1131)與其相關受體(如ErbB2和/或ErbB3)之間相互作用的治療性蛋白質如抗體。這些實施方案將在下文進行更詳細的描述。在另一實施方案中，結合化合物可與ADAM-17結合并抑制其活性，轉而抑制可溶性NRG1P1從其膜結合前體形式的形成。在另一實施方案中，結合化合物可抑制NRG-1如NRG-1P1的表達并因此中和NRG1促進MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質在上皮細胞上表達的能力。在這些實施方案中，結合化合物可在轉錄和/或翻譯水平上抑制NRG-1(如NRG-1131)的表達。例如，結合化合物可以是能與NRG-1基因的互補區域結合并因此抑制其轉錄的反義寡核苷酸。在其它這類實施方案中，結合化合物可以是能抑制能夠編碼NRG-1(如NRG-1131)蛋白質的RNA化合物翻譯的短干擾RNA(siRNA)。這些實施方案將在下文進行更詳細的描述。4.1-治療件蛋白質本發明的治療性蛋白質可是抗體、Adnectin、Ankyrin、Maxybody/Avimer、Affibody、anticalin或Affilin。4.1.1-抗體本發明的抗體可以是技術人員熟知的許多形式中的一種形式。這些形式包括如下所述的完整抗體、多種抗體片段和其它工程化形式。在優選的形式中，本發明的抗體提供為單克隆群體。4.1.1.1-完整抗體完整抗體包括含至少兩條重鏈和兩條輕鏈的異源多聚體糖蛋白。除IgM外，完整6抗體通常是大約150Kda、由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的異源四聚體糖蛋白。一般來說，每一輕鏈與重鏈通過一個共價二硫鍵連接，但是不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數目不同。每一重鏈和輕鏈也具有鏈內二硫橋接。每一重鏈在一個末端具有接著許多恒定區的可變結構域(VH)。每一輕鏈具有在其另一末端的可變結構域(VL)和恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一恒定區整列，且輕鏈的可變結構域與重鏈的可變結構域整列。來自大多數脊椎動物物種的抗體的輕鏈可指定為兩類基于恒定區的氨基酸序列命名的k或A中的一類。根據人抗體重鏈恒定區的氨基酸序列，人抗體可指定為5種不同的類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可進一步細分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類；以及IgAl和IgA2亞類。存在于小鼠和大鼠中的物種變體至少具有IgG2a、IgG2b。抗體的可變結構域以展示特定可變性的、稱為互補決定區(CDR)的某些區域來賦予抗體結合特異性。可變區的較保守部分稱為構架區(FR)。每一完整重鏈和完整輕鏈的可變結構域都包含由3個CDR連接的4個FR。每一鏈中的CDR通過FR區密切接近地保持在一起，并且與來自其它鏈的CDR—起對抗體的抗原結合位點的形成起作用。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能如參與抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、通過與Fcyr受體結合的吞噬作用、通過新生Fc受體(FcRn)的半壽期/清除率和通過補體級聯的Clq組分的補體依賴的細胞毒性。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了能結合NRG1(如NRG1131)并中和其生物學活性的完整治療性抗體。具體而言，所述完整治療性抗體與NRG1(如NRG1131)結合并抑制NRG1(或NRG1P1)與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在一般的實施方案中，抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區，且所述抗體是如下所述的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在另一實施方案中，提供了能優先地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整治療性抗體。具體而言，所述完整治療性抗體優先地與NRG1131結合并抑制NRG1P1與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在優選的形式中，所述完整治療性抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區，且所述抗體是如下所述的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。使用于整個說明書的術語"優先地結合"和其語法變化指治療性蛋白質(如抗體)以比其結合NRGla更高的親和力(至少2倍)結合NRG1P1的能力。然而，優先地結合的蛋白質能中和NRG1131和NRG1a二者的同樣共有的生物學活性到顯著的程度。在另一實施方案中，提供了能特異地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整治療性抗體。具體而言，所述完整治療性抗體特異地與NRG1131結合并抑制NRG1P1與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在優選的形式中，所述完整治療性抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區，且所述抗體是如下所述的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。使用于整個本說明書的術語"特異地結合"和其語法變化指治療性蛋白質(如抗體)以比其與NRGla結合更高的結合親和力(至少5倍)與NRG1P1結合的能力。特異結合的治療性蛋白質能中和NRG1131的生物學活性，但是不能中和NRG1a的同樣共有的生物學活性到任何顯著的程度。在本發明的一個實施方案中，提供了能結合膜結合NRG1(如NRG1131)并中和其生物學活性的完整治療性抗體。具體而言，所述完整治療性抗體與膜NRGl(如NRGlPI)結合并抑制NRGl(或NRGlP1)與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。完整治療性抗體可例如與膜結合NRGl(如NRGl131)結合并通過如抑制膜結合NRGl(如NRGl131)的切割或通過促進膜NRGl(如NRGlP1)的再循環來抑制由其形成可溶性NRGl(如NRGl131)。在一般的實施方案中，抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區，且所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在本發明的另一實施方案中，提供了能結合可溶性NRG1(如NRG1131)并中和其生物學活性的完整治療性抗體。具體而言，所述完整治療性抗體與可溶性NRGl(如NRGl131)結合并抑制NRGl(或NRGlP1)與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在一般的實施方案中，抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區，且所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。4.1.1.1.1人抗體人抗體可通過本領域技術人員已知的許多方法來產生。人抗體可通過使用人骨髓瘤細胞系或小鼠-人異骨髓瘤細胞系來制備，參見KozborJ.Immunol133，3001，(1984)和Brodeur，單克隆抗體產生技術和應用，51-63頁(MarcelDekker公司，1987)。備選的方法包括使用噬菌體文庫或轉基因小鼠，所述二者都利用了人V區所有組成成分(參見WinterG，(1994)，A匪.Rev.Immunol.12,433-455，GreenLL(1999)，J.Immunol.Methods231，11-23)。轉基因小鼠的幾個株系目前是可得到的，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座已由人免疫球蛋白基因區段替代(參見TomizukaK，(2000)PNAS97，722-727;FishwildDM(1996)NatureBiotechnol.14，845-851.MendezMJ，1997，NatureGenetics,15，146-156)。用抗原攻擊后，這類小鼠能產生人抗體的所有組成成分，目標抗體可從這些人抗體的所有組成成分中選擇。值得特別注意的是TrimeraTM系統(參見ErenR等人，(1988)Immunology93:154-161)，其中將人淋巴細胞移植到經輻射的小鼠中；選擇的淋巴細胞抗體系統(SelectedLymphocyteAntibodySystem)(SLAM，參見Babcook等人，PNAS(1996)93:7843-7848)，其中將人(或其它物種)淋巴細胞有效地完成大規模集中的體外抗體產生過程，然后進行去巻曲(deconvulated)、有限稀釋和選擇過程；以及XenomouseTM(Abgenix公司)。備選的方法是從Morphotek公司可獲得的使用Morphodoma技術。噬菌體展示技術可用于產生人抗體(和其片段)，參見McCafferty;Nature，348，552-553(1990)和GriffithsAD等人(1994)EMB013:3245-3260。根據該技術，將抗體V結構域基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的主要或次要外殼蛋白質基因中，并作為功能抗體片段(通常借助于輔助噬菌體)展示于噬菌體顆粒的表面。基于抗體的功能特性的選擇導致編碼展示這些特性的抗體基因的選擇。噬菌體展示技術能夠用于從由人B細胞制備的文庫選擇抗原特異性抗體，所述人B細胞取自患上述疾病和病癥的個體或備選地取自未經免疫的人供體(參見Marks;JMolBio222，581-591，1991)。當期望完整人抗體包含Fc結構域時，必須將噬菌體展示的衍生片段再克隆到包含想要的恒定區的哺乳動物表達載體中，并建立穩定表達細胞系。親和力成熟技術(Marks;Bio/teehnol10，779-783(1992))可用于提供結合親和力，其中初級人抗體的親和力通過用天然存在的變體來順序替代H鏈和L鏈的V區以及基于改善的結合親和力的選擇來改善。目前，這種技術的變型如'表位印記'是可獲得的，參見WO93/06213。也參見Waterhouse;NuclAcidsRes21,2265-2266(1993)。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了能結合NRGl(如NRGl131)并中和其生物學活性的完整的治療性人抗體。具體而言，所述完整的治療性人抗體與NRGl131結合并抑制NRGlP1與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在一般的實施方案中，完整的治療性人抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的恒定區。在另一實施方案中，提供了能優先地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整的治療性人抗體。具體而言，所述完整的治療性人抗體與NRG1131優先地結合并抑制NRG1與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間，尤其是與ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用。在優選的形式中，完整的治療性人抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的恒定區。在另一實施方案中，提供了能特異地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整的治療性人抗體。具體而言，所述完整的治療性人抗體與NRG1131特異地結合并抑制NRG1P1和其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間的相互作用。在優選的形式中，完整的治療性人抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的恒定區。4.1.1.1.2嵌合抗體和人源化抗體在治療人疾病或病癥中使用完整的非人抗體可能具有目前已非常明確的免疫原性問題，也就是患者的免疫系統可能將非人完整抗體作為異己來識別并發動中和反應。這在對人患者進行非人抗體的多次施用后尤為明顯。多年來已經研發了多種技術來克服這些困難，且通常涉及在完整抗體中降低非人氨基酸序列組成的同時保留從免疫動物如小鼠、大鼠或兔中獲取非人抗體的相對容易。從廣義上講，已有兩種方法用于達到這一目標。第一種是嵌合抗體，所述嵌合抗體通常包含非人(例如嚙齒類動物如小鼠)可變結構域與人恒定區的融合。因為抗體的抗原結合位點定位于可變區中，所以嵌合抗體保留了其對抗原的結合親和力，但是由于所述嵌合抗體獲得了人恒定區的效應子功能，因此所述嵌合抗體能執行如前所述的效應子功能。嵌合抗體一般使用重組DNA方法來制備。編碼抗體的DNA(如cDNA)使用常規方法(如通過使用能與編碼本發明抗體的H鏈和L鏈的基因，例如編碼如上所述的SEQIDNO1、2、3、4、5、和6的DNA特異結合的寡核苷酸探針)來進行分離并測序。雜交瘤細胞作為此種DNA的一般來源。一旦將DNA分離，將所述DNA置入表達載體中，然后將所述表達載體轉染入不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞如大腸桿菌(E.Coli)、COS細胞、CH0細胞或骨髓瘤細胞中以得到抗體的合成。DNA可通過用人L鏈和H鏈的編碼序列替換相應的非人(如鼠)H和L恒定區來修飾，參見如Morrison;PNAS81,6851(1984)。第二種方法涉及人源化抗體的產生，其中抗體的非人含量通過人源化可變區來減少。兩種人源化的技術已經得到了通用。第一種是通過CDR移植來人源化。CDR建立靠近抗體N端的環，在所述環處它們形成位于由構架區提供的支架的表面。抗體的抗原結合特異性主要由其CDR表面的拓撲圖和化學特征來定義。這些特征本身又由單個CDR的構象、CDR的相對排列以及包含CDR的殘基的側鏈的性質和排列來決定。可通過僅移植非人(如鼠)抗體('供體'抗體)的CDR到人構架區('受體構架區')和恒定區上來實現免疫原性的大幅度減低(參見Jones等人(1986)Nature321，522-525和VerhoeyenM等人(1988)Science239,1534-1536)。然而，CDR移植本身可不導致抗原結合特性的完整保留，且通常發現，如果欲恢復顯著的抗原結合親和力，那么需要將供體抗體的一些構架區殘基(有時稱為'回復突變')保留于人源化的化合物中(參見QueenC等人(1989)PNAS86，10，029-10,033，Co，M等人(1991)Nature351,501-502)。在這種情況下，為了提供人構架區(FR)，將表現出與非人供體抗體顯示最大序列同源性的人V區從數據庫中挑選出來。可從人共有序列或單個的人抗體來選擇人FR。根據需要，將來自供體抗體的關鍵殘基替代入人受體構架區中以保留CDR構象。抗體的計算機建模可用于幫助鑒定這些結構重要的殘基，參見W099/48523。備選地，人源化可通過'鑲嵌術(veneering)'的方法來實現。獨特的人和鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的統計學分析揭示了被暴露殘基的精確模式在人抗體和鼠抗體中不同，并且大多數單個的表面位置具有強的對少數不同殘基的偏好性(參見PadlanEA等人；(1991)Mo1Immunol28，489-498和PedersenJT等人(1994)JMolBiol235;959-973)。因此，通過替代抗體構架區中的不同于通常在人抗體中發現的那些被暴露殘基來降低非人Fv的免疫原性是可能的。由于蛋白質抗原性可能與表面可接近性相關，所以表面殘基的替代可能對于使得人免疫系統對小鼠可變區'不可見的'是足夠的(也參見MarkGE等人(1994)在HandbookofExperimentalPharmacologyvol113:單克隆抗體的藥理學，Springer-Verlag，105-134頁)。這種人源化的方法稱為'鑲嵌術'，因為僅僅改變了抗體的表面，而支持殘基維持原狀。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了能結合NRG1(如NRG1131)并中和其生物學活性的完整的治療性人源化抗體。具體而言，所述完整的治療性人源化抗體與NRG1131結合并抑制NRG1131與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間的相互作用。在一般的實施方案中，完整的治療性人源化抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的恒定區。在另一實施方案中，提供了能優先地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整的治療性人源化抗體。具體而言，所述完整的治療性人源化抗體與NRG1131優先地結合并抑制NRG1131與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間的相互作用。在優選的形式中，完整的治療性人抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的恒定區。在另一實施方案中，提供了能特異地結合NRG113l(與NRGla比較)并中和其生物學活性的完整的治療性人源化抗體。具體而言，所述完整的治療性人源化抗體與NRG1131特異地結合并抑制NRG1與其相關受體ErbB2和/或ErbB3之間的相互作用。在優選的形式中，完整的治療性人源化抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類、并尤其是人的恒定區。4.1.1.1.3雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。制備此類抗體的方法是本領域已知的。通常地，基于兩對免疫球蛋白H鏈-L鏈對的共表達來重組產生雙特異性抗體，其中兩個H鏈具有不同的結合特異性(參見Millstein等人，Nature305，537-539(1983)，W093/08829和Traunecker等人，EMB0，10，1991，3655-3659)。由于H鏈和L鏈的隨機組合，產生了10種不同抗體結構的潛在混合物，在所述混合物中只有一種具有想要的結合特異性。備選的方法涉及將具有想要的結合特異性的可變結構域與包含至少部10分鉸鏈區、CH2區和CH3區的重鏈恒定區融合。優選地將含有對輕鏈結合必需位點的CH1區存在于至少一種融合中。可將編碼這些融合的和根據需要地將編碼L鏈的DNA插入到單獨的表達載體中，并共轉染到合適的宿主生物體中。但可以將兩條鏈或所有三條鏈的編碼序列都插入到一個表達載體中。在一個優選的方法中，雙特異性抗體由在一個臂中具有第一結合特異性的H鏈和在另一臂中提供第二結合特異性的H-L鏈對組成，參見W094/04690。也參見Suresh等人，MethodsinEnzymology121,210,1986。在本發明的一個實施方案中，提供了雙特異的治療性抗體，其中所述抗體的至少一個結合特異性是針對NRG1，特別是針對NRG1131，其中所述抗體與NRG1(如NRG1P1)結合并中和NRG1(如NRG1131)的生物學活性。在優選的形式中，雙特異性抗體包含IgG同種型如IgGl或IgG4的靈長類抗體如人抗體。4.1.1.1.4抗體片段在本發明的某些實施方案中，提供了調節(如抑制)NRG1與其相關受體如ErbB2和/或ErbB3例如ErbB2/ErbB3異二聚體之間相互作用的治療性抗體片段。此類片段可是完整抗體和/或人源化的嵌合抗體的功能性抗原結合片段例如如前所述的抗體的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段。通常來說，此類片段通過完整抗體的蛋白水解消化如木瓜蛋白酶消化(參見如W094/29348)來產生，但是可直接產生自重組轉化的宿主細胞。對于ScFv的產生，參見Bird等人；(1988)Science,242，423-426。此外，抗體片段可使用以下描述的多種工程技術來產生。FV片段的兩條鏈比Fab片段似乎具有更低的相互作用能量。為了穩定VH結構域和VL結構域的結合，已將它們用肽(Bird等人，(1988)Science,242，423-426，Huston等人，PNAS，85，5879-5883)、二硫橋(Glockshuber等人，(1990)Biochemistry,29，1362-1367)和'knobinhole，突變(Zhu等人(1997)，ProteinSci.，6,781-788)連接。ScFv片段可通過本領域技術人員熟知的方法產生(參見Whitlow等人(1991)，MethodscompanionMethodsEnzymol，2，97-105和Huston等人(1993)IntRevl匪nol10,195-217)。ScFv可在細菌細胞如大腸桿菌中產生，但更優選地是在真核細胞中產生。ScFv的一個缺點是產物的單價，所述產物的單價排除了由于多價結合而增加的親合力，以及ScFv的短半壽期。克服這些困難的嘗試包括通過化學偶聯含額外的C端半胱氨酸的ScFv(Adams等人(1993)CanRes53，4026-4034和McCartney等人(1995)ProteinEng，8，301-314)或通過含未配對的C端半胱氨酸殘基的ScFv的自發的位點特異性二聚化(參見Kipriyanov等人(1995)Cell.Biophys26,187-204)來產生二價(ScFv')2。備選地，ScFv可通過將肽接頭縮短至3個殘基和12個殘基以形成'二體(diabodies)'來強制形成多聚體(參見Holliger等人PNAS(1993)，90,6444-6448)。此外，減少接頭還可導致ScFV三聚體('三體(triabodies)'，參見Kortt等人(1997)ProteinEng，10，423-433)和ScFV四聚體('四體(tetrabodies)'，參見LeGall等人(1999)FEBSLett,453，164-168)。二價ScFV化合物的構建也可通過與蛋白質二聚化基序的基因融合以形成'微型抗體(miniantibodies)'(參見Pack等人(1992)Biochemistry31,1579-1584)和'微型體(minibodies)，(參見Hu等人(1996)，CancerRes.56,3055-3061)來達到。ScFv-Sc-Fv串聯體((ScFV)2)也可通過利用第三肽接頭連接兩個ScFV單元來產生(參見Kurucz等人(1995)JImmunol,154，4576-4582)。雙特異的二體可通過非共價結合的兩條單鏈融合產物來產生，其中所述兩條單鏈融合產物由一種抗體的VH結構域與另一種抗體的VL結構域通過短接頭連接組成(參見Kipriyanov等人(1998)，IntJCan77，763-772)。此類雙特異性二體的穩定性可通過引入如前所述的二硫橋或'knobinhole'突變或者通過單鏈二體(ScDb)的形成來增強，其中二個雜化ScFv片段通過肽接頭來連接(參見Kontermann等人(1999)JImmunolMethods226，179-188)。四價的雙特異性化合物通過如ScFv片段與IgG化合物的CH3結構域或者經鉸鏈區與Fab片段的融合來得到(參見Coloma等人(1997)NatureBiotechnol，15，159-163)。備選地，四價雙特異性化合物已經通過雙特異性單鏈二體的融合產生(參見Alt等人(1999)FEBSLett454,90-94)。更小的四價雙特異性化合物也可通過二聚化具有含螺旋-環_螺旋基序的接頭的ScFv-ScFv串聯體(DiBi微型抗體，參見Mulle等人(1998)FEBSLett432,45-49)或者二聚化以阻止分子內配對的方向包含四個抗體可變結構域(VH和VL)的單鏈化合物(串聯二體，參見Kipriyanov等人，(1999)JMo1Biol293,41-56)來形成。雙特異性F(ab'^片段可通過Fab'片段的化學偶聯或通過經亮氨酸拉鏈的異源二聚化來產生(參見Shalaby等人(1992)JExpMed175，217-225和Kostelny等人(1992)，JImmunol1481547-1553)。也可得到的是分離的VH結構域和分離的VL結構域(Domantispic)，參見US6，248，516;US6，291，158;US6，172，197，以及分離的VHH結構域抗體(納米抗體(Nanobodies))。這些結構域和納米抗體可以是雙重特異性，其中具有一種針對半壽期延長的蛋白質如人血清白蛋白(HSA)的特異性。該類結構域和納米抗體對本發明的NRGl蛋白質都是單特異性的，因此，本發明也特別考慮了針對半壽期延長的蛋白質如HSA的雙重特異性。在一個實施方案中，提供了如前所述的治療性抗體片段(如ScFv、Fab、Fab'、F(ab')2)或工程抗體片段，所述治療性抗體片段或工程抗體片段與NRGl如NRGlP1結合(如優先地或特異地結合)并通過如抑制NRGl與其相關受體如ErbB2和/或ErbB3例如ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用來中和其生物學活性。4.1.1.1.5異源綴合抗體(Heteroconiugateantibodies)異源綴合抗體也構成本發明的一個實施方案。異源綴合抗體包含使用任意合適的交聯方法形成的二價共價連接的抗體。參見如US4，676，980。4.1.1.1.6其它修飾認為抗體的Fc區與多種Fc受體(FcyR)之間的相互作用介導了抗體的效應子功能，所述抗體的效應子功能包括抗體依賴的細胞毒性(ADCC)、補體固定、吞噬作用和抗體的半壽期/清除率。對本發明抗體的Fc區的多種修飾可依據想要的特性進行實施。例如，EP0629240Bl和Ep0307434B2中詳述了Fc區中的特定突變產生了另外的溶解性抗體、另外的非溶解性抗體，或者可摻入補救受體結合表位到抗體中以增加血清半壽期，參見US5，739，277。目前存在5種公認的人Fcy、FcyR(I)、FCyRIIb、FcyRIIIa和新生FcRn。Shields等人，(2001)JBiolChem276，6591-6604證明了IgGl殘基的共有集合參與結合所有的FcyR，但是FCyRII和FcyRIII使用在該共有集合外的獨特位點。當將一組IgGl殘基Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239改變為丙氨酸時，所述一組IgGl殘基降低了與所有FcyR的結合。所有這一組IgGl殘基都在IgGCH2結構域中并成簇分布在連接CHI和CH2的鉸鏈附近。雖然FcyRI僅使用IgGl殘基的共有集合來結合，但FcyRII和FcyRIII(如G1u-293)不是如此。一些變體顯示出改善的與FcyRII或FcyRIII的結合，但不影響與其它受體的結合(如Ser-267Ala改善了與FcYRI1的結合但不影響與FcyRIII的結合)。其它變體顯示出改善的與DcYRII或FcyRIII的結合，同時降低與其它受體的結合(例如，Ser298Ala提高了與FcYRI11的結合，而降低了與FcyRII結合)。對于FcyRIIIa來說，最佳的結合IgGl變體具有在Ser-298、Glu_333和Lys_334位點處組合的丙氨酸替代。認為新生FcRn受體參與抗體清除和跨組織的胞吞轉運作用二者(參見J皿ghansRP(1997)I匪nolRes16，2957禾口Ghetie等人(2000)A匪RevImmunol18，739-766)。確定了與人FcRn直接相互作用的人IgGl殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。描述于本部分的在任意這些位點處的轉換可使血清半壽期增加和/或使本發明抗體的效應子特性改變，并因此構成本發明的實施方案。其它修飾包括本發明抗體的糖基化變體。已知在抗體的恒定區中保守位點的糖基化對抗體功能，尤其是如上述的那些效應子功能具有意義深遠的影響，參見如Boyd等人(1996)，Mo1Immunol32,1311-1318。考慮了下述的本發明的治療性抗體或其抗原結合片段的糖基化變體，其中添加、替換、缺失或修飾了一個或多個糖類部分。引入天冬酰胺-x-絲氨酸基序或天冬酰胺-x-蘇氨酸基序產生用于糖類部分酶促附著的潛在側面，并因此可用于操縱抗體的糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry40，8868-8876中，TNFR-IgG免疫黏附素的末端唾液酸化通過使用13-1，4-半乳糖基轉移酶和/或a，2，3唾液酸轉移酶的再半乳糖基化過程和/或再唾液酸化過程來增加。認為增加末端唾液酸化增加了免疫球蛋白的半壽期。同大多數糖蛋白一樣，抗體一般產生為糖形的混合物。當抗體在真核細胞中產生時，特別是在哺乳動物細胞中產生時，這種混合物尤其明顯。已經研發了多種方法來生產所定義的糖形，參見Zhang等人，Science(2004)，303，371;Sears等人，Science(2001)，291，2344;Wacker等人(2002)，Science298，1790;Davis等人(2002)，ChemRev102，579;Hang等人(2001)，AccChemRes34,727。因此，本發明考慮了如本文所述的多種治療性(單克隆)抗體(其可是IgG同種型如IgGl)，其包含所述抗體或者所述抗體的抗原結合片段的所定義數量(如7個或更少，例如5個或更少如2個或單個)的糖形。本發明進一步的實施方案包括與非蛋白質聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯偶聯的本發明的治療性抗體或其抗原結合片段。蛋白質與聚乙二醇的綴合是已建立的用于增加蛋白質的半壽期、以及降低蛋白質的抗原性和免疫原性的技術。已經使用完整抗體以及Fab'片段研究了具有不同分子量和種類(直線的或分枝的)的聚乙二醇化的用途(參見KoumenisIL等人(2000)IntJPharmaceut198;83-95)。4.2Adnectin-化合物治療劑adnectin支架基于纖連蛋白III型結構域(如纖連蛋白III型的第十組件(10Fn3結構域))。纖連蛋白III型結構域具有分布于兩個13片層之間的7個或8個13鏈，所述7個或8個13鏈相互自身包裝以形成蛋白質的核心，并還含有將13鏈相互連接的環(類似于CDR)，且是溶劑暴露的。在13片層多層結構的每一邊緣存在至少3個此類環，其中所述邊緣是蛋白質垂直于P鏈的方向的界限。(US6，818，418)。這些基于纖連蛋白的支架不是免疫球蛋白，但是總體的折疊與最小的功能抗體片段(重鏈的可變區)的折疊密切相關，所述最小的功能抗體片段包含駱駝(camel)IgG和美洲駝(llama)IgG中的整個抗原識別單位。因為這種結構，非免疫球蛋白抗體模仿類似于天然的抗原結合特性和對抗體的親和性。這些支架可用于與體內的抗體親和力成熟過程相似的體外環隨機化和改組策略。這些基于纖連蛋白的化合物可用作支架，其中化合物的環區可使用標準的克隆技術用本發明的CDR替代。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRG1P1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1P1的生物學活性的adnectin化合物。4.3Ankyrin-分子配偶體這種技術是基于使用具有ankyrin衍生的重復組件的蛋白質作為用于支撐可變區的支架，所述可變區可用于結合不同目標。Ankyrin重復組件是33個氨基酸多肽，由兩個反平行a-螺旋和一個P-轉角組成。可變區的結合主要通過使用核糖體展示來最優化。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRGIP1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1131的生物學活性的Ankyrin化合物。Avimers衍生自天然的含有A-結構域的蛋白質如LRP-l。這些結構域本質上用于蛋白質_蛋白質相互作用，并且在人中，超過250個蛋白質是結構地基于A-結構域的。Avimers由許多通過氨基酸接頭連接的不同"A-結構域"單體(2_10)組成。使用描述于如US20040175756;US20050053973;US20050048512;和US20060008844中的方法，可產生能與目標抗原結合的Avimers。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRG1P1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1P1的生物學活性的Maxybody化合物。4.5A蛋白-AffibodyAffibody⑧親和配體是包含基于A蛋白的igG結合結構域之一的支架的三螺旋束的小的簡單蛋白質。A蛋白是來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的表面蛋白質。這種支架結構域由58個氨基酸組成，其中將13個氨基酸隨機地產生具大量配體變體的Affibody文庫(參見如us5，831，012)。Affibody⑧'化合物模仿抗體，與150kDa分子量的抗體比較，它們具有6kDa的分子量。盡管其小型，但是Affibody⑧化合物的結合位點與抗體的結合位點相似。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRG1P1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1P1的生物學活性的A蛋白-affibody化合物。4.6Anticalins-PierisAnticalinS敷是由PierisProteoLabAG公司研發的產品。它們衍生自脂籠蛋白，一類廣泛分布的小且堅固的蛋白質，所述脂籠蛋白通常參與生理轉運或化學敏感的或者不溶的化合物的存儲。幾種天然的脂籠蛋白存在于人組織或體液中。蛋白質結構暗示為免疫球蛋白，在剛性構架頂部具有高變環。然而，與抗體或其重組片段相反，脂籠蛋白包含具有160個至180個氨基酸殘基的單一多肽鏈，這僅比單一的免疫球蛋白結構域略大。構成結合袋的4個環的集合顯示出意義深遠的結構可塑性并耐受多種側鏈。因此，為了高親和力和高特異性地識別不同形狀的指定目標化合物，結合部位可用專利方法進行重塑。通過誘變處理4個環的集合，已將脂籠蛋白家族的一種蛋白質，即PierisBrassicae的后膽色素結合蛋白(BBP)用于研發anticalins。描述"anticalins"的專利申請的一個例子是PCTWO199916873。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRG1P1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1P1的生物學活性的anticalin化合物。4.7Affilin-Scil蛋白質AffilinTM化合物是經設計的對蛋白質和小化合物具有特異親和力的小非免疫球蛋白蛋白質。新AffilinTM化合物可非常快地選自兩個文庫，其中每一個文庫基于不同的人來源的支架蛋白質。AffilinTM化合物與免疫球蛋白蛋白質不顯示出任何結構同源性。Scil蛋白質使用兩種AffilinTM支架，其中一種AffilinTM支架是y晶體蛋白(人結構性眼晶狀體蛋白質)和另一種是"遍在蛋白質"超家族蛋白質。兩種人支架都非常小，顯示出高溫穩定性且幾乎耐pH變化和變性劑。這種高穩定性主要由于蛋白質的展開的13片層結構。y晶體蛋白衍生的蛋白質的例子描述于W0200104144中，且"遍在蛋白樣"蛋白質描述于W02004106368中。因此，在一些實施方案中，提供了與NRG1且尤其是與NRG1P1結合并中和NRG1且尤其是中和NRG1P1的生物學活性的Affilin化合物。4.7.l-其它治療形式如前所指，本發明的其它治療形式包括NRG1且尤其是NRG1P1的調節物(尤其是抑制物)，所述調節物對它們的靶在蛋白質表達前發揮它們的作用。例子包括這樣的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸包含(或基本上由以下組成)在生理條件下(a)能與NRGl(尤其是NRG1131)基因的部分形成穩定三鏈體的序列，或者(b)能與NRG1(尤其是NRG1P1)基因的mRNA轉錄物的部分形成穩定雙鏈體的序列。其它例子包括能參與"RNA干擾"現象的分子。RNA干擾(RNAi)特別用于特異地抑制特定蛋白質的產生。雖然不期望被理論所束縛，Waterhouse等人(1998)已經提供了機制的模型，通過所述機制，dsRNA(雙鏈體RNA)可用于降低蛋白質產生。這種技術依賴于包含與目標基因的mRNA或其部分基本相同的序列的dsRNA分子的存在。方便地，dsRNA可產生自重組載體或宿主細胞中的單一啟動子，其中有義序列和反義序列通過無關序列形成側翼，所述無關序列使有義序列和反義序列雜交以形成具有無關序列形成的環狀結構的dsRNA分子。本發明的合適dsRNA分子的設計和產生是本領域技術人員的能力所及的，尤其借鑒Waterhouse等人(1998)、Smith等人(2000)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815。在一個例子中，導入DNA來指導至少部分與待失活的目標基因同源的雙鏈RNA產物的合成。因此，DNA包含有義序列和反義序列二者，當轉錄成RNA時，它們能雜交以形成雙鏈RNA區。在一個優選的實施方案中，有義序列和反義序列由間隔區分開，所述間隔區包含在轉錄成RNA時剪除的內含子。這種排列已經顯示出導致基因沉默的更高效率。雙鏈區可包含轉錄自一個DNA區或兩個DNA區的一個或兩個RNA分子。認為雙鏈分子的存在啟動了來自內源哺乳動物系統的應答，所述來自內源哺乳動物系統的應答破壞了雙鏈RNA和來自目標哺乳動物基因的同源RNA轉錄物二者，從而有效地降低或消除了目標基因的活性。雜交的有義序列和反義序列的長度應是每一個至少19個連續的核苷酸、優選地至少30個或50個核苷酸、和更優選地至少100個、200個、500個或1000個核苷酸。可使用對應于整個基因轉錄物的全長序列。長度最優選地是100個-2000個核苷酸。有義序列和反義序列與靶向的轉錄物的同一性程度應是至少85%，優選地至少90%和更優選地1595%-100%。當然，RNA分子可包含可能對穩定分子起作用的無關序列。RNA分子可在RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶HI啟動子的控制下表達。后者的例子包括tRNA啟動子或snRNA啟動子。優選的小干擾("siRNA")分子包含與目標mRNA的大約19個-21個連續核苷酸同一的核苷酸序列。優選地，siRNA序列以二核苷酸AA開始，包含大約30%-70%的GC含量(優選地，30%-60%的GC含量，更優選地40%-60%的GC含量和更優選地大約45%-55%的GC含量)，且在它所導入的哺乳動物基因組中與不是目標的任意核苷酸序列不具有高的同一性百分數，例如這一點通過標準的BLAST搜索來確定。微RNA調節與常規RNAi/PTGS不同，所述微RNA調節是朝基因調節進化的RNA沉默途徑的明確特定分支。微RNA是編碼于以特征性的反向重復序列組織的基因樣元件中的小RNA的特定類型。當轉錄后，微RNA基因產生莖環前體RNA，隨后由所述莖環前體RNA加工產生微RNA。微RNA—般大約21個核苷酸長度。釋放的微RNA摻入含有發揮序列特異性基因抑制的Argonaute蛋白質的特定子集的RISC樣復合物中(參見如Millar和Waterhouse，2005;Pasquinelli等人2005;Almeida和Allshire，2005)。4.8產牛方法本發明的治療性蛋白質，且尤其是抗體可產生為多克隆群體，但更優選地產生為單克隆群體(為針對特定抗原結合位點的相同抗體的基本同源群體)。當然，群體隱含多于一種抗體實體是本領域技術人員顯而易見的。本發明抗體可在轉基因生物如山羊(參見Pollock等人(1999)，J.Immunol.Methods231:147-157)、小雞(參見MorrowKJJ(2000)Genet.Eng.News20:1-55)、小鼠(參見Pollock等人)或植物(參見DoranPM，(2000)Curr.OpinionBiotechnol.11,199-204，MaJK_C(1998)，Nat.Med.4;601-606，BaezJ等人，BioPharm(2000)13:50-54，StogerE等人;(2000)PlantMol.Biol.42:583-590)中產生。抗體也可通過化學合成來產生。然而，本發明的抗體和其它治療性蛋白質一般使用本領域技術人員熟知的重組細胞培養技術來產生。將編碼抗體的多核苷酸分離并插入到可復制載體如質粒中用于進一步的克隆(擴增)或表達。一種有用的表達系統是谷氨酸合成酶系統(如由LonzaBiologies出售)，尤其是其中宿主細胞是CHO或NSO(見下文)。將編碼抗體的多核苷酸使用常規方法(如寡核苷酸探針)來容易地分離并測序。可用的載體包括質粒、病毒、噬菌體、轉座子、微型染色體，其中質粒是一般的實施方案。一般來說，該類載體還包括與輕鏈多核苷酸和/或重鏈多核苷酸有效連接的信號序列、復制起點、一個或多個標志基因、增強子原件、啟動子和轉錄終止序列以促進表達。編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸可插入到單獨的載體中并轉染到同一宿主細胞中，或者根據需要，可將重鏈和輕鏈二者插入到用于轉染到宿主細胞中的同一載體中。因此，根據本發明的一個方面，提供了構建編碼本發明治療性抗體或者其抗原結合片段的輕鏈和/或重鏈的載體的方法，所述方法包括將編碼本發明治療性抗體的輕鏈和/或重鏈的多核苷酸插入到載體中。4.8.1信號序列本發明抗體可產生為具有異源信號序列的融合蛋白質，其中在成熟蛋白質的N末端具有特定剪切位點。信號序列應被宿主細胞識別并加工。對于原核宿主細胞來說，信號序列可以是堿性磷酸酶的前導區、青霉素酶的前導區或熱穩定腸毒素n的前導區。對于酵母分泌，信號序列可以是酵母轉化酶的前導區、[a]因子的前導區或酸性磷酸化酶的前導區，參見如W090/13646。在哺乳動物細胞系統中，可使用病毒分泌前導區如單純皰疹病毒(herpessimplex)gD信號序列和天然免疫球蛋白信號序列。一般來說，信號序列是以閱讀框的形式與編碼本發明抗體的DNA連接的。4.8.2復制起點pBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性菌、2ii質粒的復制起點適合于大多數酵母和多種病毒的復制起點如SV40的復制起點、多瘤病毒的復制起點、腺病毒的復制起點、VSV的復制起點或BPV的復制起點適合于大多數哺乳動物細胞是本領域熟知的。一般來說，哺乳動物表達載體不需要復制起點元件，但是可使用SV40，因為它含早期啟動子。4.8.3詵擇標記—般的選擇基因編碼下述蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環素的抗性或者(b)互補營養缺陷型缺失或提供在復雜培養基中不具備的營養物。選擇方案可涉及停滯宿主細胞的生長。已成功轉染了編碼本發明治療性抗體基因的細胞由于如借助選擇標記賦予的藥物抗性而存活。另一個例子是所謂的DHFR選擇標記，其中將轉化體在氨甲喋呤存在下培養。在一般的實施方案中，將細胞在增加量的氨甲喋呤存在下培養，以擴增外源目標基因的拷貝數。CHO細胞是尤其有用的用于DHFR選擇的細胞系。另外的例子是谷氨酸合成酶表達系統(LonzaBiologies)。使用于酵母中的合適的選擇基因是trpl基因，參見Stinchcomb等人Nature282,38，1979。4.8.4啟動子用于表達本發明抗體的合適的啟動子與編碼抗體的DNA/多核苷酸有效地連接。原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、13-內酰胺酶啟動子系統和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸啟動子和雜合啟動子如Tac。適合于在酵母細胞中表達的啟動子包括3_磷酸甘油酸激酶的啟動子或其它糖酵解酶的啟動子如烯醇化酶的啟動子、甘油醛3磷酸脫氫酶的啟動子、己糖激酶的啟動子、丙酮酸脫羧酶的啟動子、果糖磷酸激酶的啟動子、葡萄糖6磷酸異構酶的啟動子、3磷酸甘油酸變位酶的啟動子和葡糖激酶的啟動子。誘導型酵母啟動子包括醇脫氫酶2的啟動子、同類細胞色素C(isocytochromeC)的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子、金屬硫蛋白的啟動子和負責氮代謝的酶的啟動子或負責麥芽糖/半乳糖利用的酶的啟動子。用于在哺乳動物細胞系統中表達的啟動子包括病毒的啟動子如多瘤病毒(polyoma)的啟動子、禽痘病毒(fowlpox)的啟動子和腺病毒(adenovirus)的啟動子(如腺病毒2(adenovirus2)的啟動子)、牛乳頭瘤病毒(bovinepapillomavirus)的啟動子、禽肉瘤病毒(aviansarcomavirus)的啟云力子、巨細胞病毒(cytomegalovirus)的啟動子(尤其是立即早期基因啟動子)、逆轉錄病毒(retrovirus)的啟動子、乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus)的啟動子、肌動蛋白(actin)的啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)的啟動子和早期猿猴病毒40(earlySimianvirus40)的啟動子或晚期猿猴病毒40(lateSimianvirus40)的啟動子。當然，啟動子的選擇是基于與用于表達的宿主細胞之間的合適的兼容性。4.8.5增強子元件根據需要，如用于在高等真核生物中表達，可使用在一個載體中將增強子元件與啟動子元件有效地連接。合適的哺乳動物增強子序列包括來自珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋17白、胎蛋白和胰島素的增強子元件。備選地，可使用來自真核細胞病毒的增強子元件如SV40的增強子(在100-270bp處)、巨細胞病毒早期啟動子的增強子、多瘤病毒的增強子、桿狀病毒(baculoviral)的增強子或鼠lgG2a基因座(參見W004/009823)。增強子優選地定位于載體啟動子的上游位點。4.8.6宿豐細胞用于克隆或表達編碼本發明抗體的載體的合適宿主細胞是原核細胞、酵母或高等真核細胞。合適的原核細胞包括真細菌如腸桿菌科(enterobacteriaceae)例如埃希桿菌屬(Escherichia)如大腸桿菌(E.Coli)(例如ATCC31，446;31，537;27，325)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文菌屬(Erwinia)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門菌屬(Salmonella)如傷寒沙門菌(Salmonellatyphimuri咖)、沙雷菌屬(Serratia)如粘質沙雷菌(Serratiamarcescans)禾口志賀桿菌屬(Shigella)以及芽胞桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)(參見DD266710)、假單胞菌屬(Pseudomonas)如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。在酵母宿主細胞中也考慮了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(如ATCC16,045;12,424;24178;56，500)、耶羅威亞酵母(yarrowia)(EP402,226)、巴斯德畢赤酵母(PichiaPastoris)(EP183,070，也參見Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185-192)、假絲酵母屬(Candida)、Thchodermareesia(EP244,234J)、青霉屬(Penicillin)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、以及曲霉屬(Aspergillus)宿主如構巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。盡管本發明特別考慮了原核宿主細胞和酵母宿主細胞，然而優選地，本發明的宿主細胞是高等真核細胞。合適的高等真核宿主細胞包括哺乳動物細胞如C0S-1(ATCC號CRL1650)、C0S-7(ATCCCRL1651)、人胚腎細胞系293、幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCCCRL.1632)、BHK570(ATCC號CRL10314)、293(ATCC號CRL1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(如CH0-K1、ATCC號CCL61、DHFR-CH0細胞系例如DG44(參見Urlaub等人，(1986)SomaticCellMol.Genet.12，555-556))，特別地是適合于懸浮培養的那些CH0細胞系、小鼠支持細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞(ATCCCRL-1587)、HELA細胞、犬腎細胞(ATCCCCL34)、人肺細胞(ATCCCCL75)、H印G2和骨髓瘤細胞或淋巴瘤細胞如NS0(參見US5，807，715)、Sp2/0、Y0。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了穩定轉化了包含編碼本文所述的治療性抗體或者其抗原結合片段的重鏈和/或輕鏈的載體的宿主細胞。優選地，該類宿主細胞包含編碼輕鏈的第一載體和編碼所述重鏈的第二載體。4.6.1細菌發酵細菌系統可用于上述非免疫球蛋白治療性蛋白質的表達。細菌系統也尤其適合于抗體片段的表達。該類片段定位于細胞內或周質中。根據本領域技術人員已知的方法，可將不溶性周質蛋白質提取并重折疊以形成活性蛋白質，參見Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72，13-20和CupitPM等人(1999)LettA卯lMicrobiol,29，273-277。4.8.7細胞培養方法用編碼本發明的治療性抗體或其抗原結合片段的載體轉化的宿主細胞可通過本領域技術人員已知的任意方法來培養。宿主細胞可培養于轉瓶、滾瓶或中空纖維系統中，但是對于大規模生產，優選的是將攪拌釜反應器特別地用于懸浮培養。優選地，攪拌釜反應器適合使用如噴頭、活門或低剪切葉輪來通氣。對于泡罩塔和空氣提升反應器，可使用空氣泡或氧氣泡直接通氣。當宿主細胞培養于無血清培養基中時，優選的是將培養基補充有細胞保護試劑如PluronicF-68以幫助防止由于通氣過程導致的細胞損傷。依據宿主細胞特性，可將微載體用作貼壁依賴細胞系的生長基質或者所述細胞可以適應于懸浮培養(這是一般情況)。宿主細胞的培養，尤其是無脊椎動物宿主細胞的培養可使用多種操作方式如補料分批培養、重復批處理培養(參見Dr即eau等人(1994)cytotechnology15:103-109)、擴展批處理培養或灌注培養。雖然經重組轉化的哺乳動物宿主細胞可培養于含血清的培養基如含胎牛血清(FCS)的培養基中，優選的是將這類宿主細胞培養于合成的無血清培養基如公開于Keen等人(1995)Cytotechnology17:153-163中的合成的無血清培養基或商業可得的培養基例如ProCH0-CDM或UltraCHO(TM)(CambrexNJ，美國)中，其中根據需要補充了能源如葡萄糖和合成生長因子如重組胰島素。宿主細胞的無血清培養可能要求這些細胞適應于在無血清條件中生長。一種適應方法是在含血清的培養基中培養這類宿主細胞，并反復地交換80%的培養基為無血清培養基以使宿主細胞學會適應于無血清條件(參見如ScharfenbergK等人(1995)，AnimalCelltechnology-Developmentstowardsthe21stcentury(BeuveryE.G.等人編車茸)，619頁-623頁，KluwerAcademic出片反公司)。分泌到培養基中的本發明抗體或其它治療性蛋白質可使用多種技術來回收并純化以提供適合于預期用途的純化程度。例如用于治療人患者的本發明治療性抗體的使用一般要求至少95%的純度、更一般地98%的純度或99%的純度或者更高純度(與粗培養基比較)。在第一個例子中，來自培養基的細胞碎片一般使用離心然后通過如微量過濾、超濾和/或深度過濾的上清澄清步驟來去除。多種其它技術如透析和凝膠電泳以及色譜技術例如羥磷灰石層析(HA)、親和層析(任選地涉及親和標簽系統如多聚組氨酸)和/或疏水作用層析(HIC，參見US5，429，746)是可用的。在一個實施方案中，本發明抗體在經過多個澄清步驟后，使用A蛋白或G蛋白親和層析然后通過進一步的層析步驟如離子交換層析和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、大小排阻層析和硫酸銨沉淀來捕獲。一般地，也使用多個病毒去除步驟(如使用例如DV-20濾器的納米過濾)。在經過這些多個步驟后，將提供包含至少75mg/ml或更多如100mg/ml或者更多的本發明抗體或其抗原結合片段的純化(優選地單克隆的)制備物，并因此構成本發明的一個實施方案。合適的此類制備物是基本上無聚合形式的本發明抗體。4.9-篩選方法在其它實施方案中，提供了鑒定能調節NRG1(如NRG1131)與其相關受體(如ErbB2/ErbB3異二聚體)之間相互作用的調節物(如拮抗物)的方法。在一些實施方案中，調節物中和NRG1的生物學活性。因此，根據本發明，提供了通過如抑制NRG1(如NRG1131)與相關受體如ErbB2/ErbB3異二聚體之間的相互作用來篩選具有中和NRGl(尤其是NRG1131)的生物學活性的能力的候選化合物的方法，所述方法包括將所述NRG1(如NRG1131)與所述候選化合物(如候選抗體)接觸并檢測在所述NRG1與其一個或所有兩個相關受體之間相互作用中的調節。因此，根據本發明，提供了篩選具有調節(如抑制)NRG1(如NRG1P1)與相關受體(如ErbB2/ErbB3異二聚體)之間相互作用的能力的候選化合物的方法，所述方法包括將所述NRG1(如NRG1131)與所述候選化合物(如候選抗體)接觸并檢測NRG1P1的生物學活性的中和。在一個實施方案中，所述方法包括檢測MUC5AC和/或MUC5B在能表達MUC5AC和/或MUC5B的細胞上的表達的改變。這種細胞的例子是上皮細胞如杯形細胞。用于檢測這種表達改變的方法對技術人員是顯而易見的。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了篩選NRG1(如NRG1P1)與相關受體(如ErbB2和/或ErbB3)之間相互作用的候選抑制物的方法，所述方法包括在存在表達MUC5AC和/或MUC5B的細胞下將所述NRG1與所述候選化合物接觸，并與存在所述NRG1、不存在所述候選化合物的所述細胞上所述MUC5AC和/或MUC5B的表達相比較來檢測MUC5AC和/或MUC5B表達的改變(如降低)。在另一實施方案中，所述方法包括在所述候選化合物存在下檢測杯形細胞增生的改變。因此，本發明的一個方面提供了用于篩選NRGl(如NRGiei)與相關受體(如ErbB2和/或ErbB3，例如ErbB2/ErbB3異二聚體)之間相互作用的候選抑制物的方法，所述方法包括在杯形細胞存在下將所述NRG1與所述候選化合物接觸，并與所述候選化合物不存在下的杯形細胞分裂相比較來檢測杯形細胞分裂的改變(如降低)。4.10藥物組合物本發明提供了包含與可藥用載體制劑的治療性蛋白質或低分子量化學實體的藥物組合物。所述組合物可額外地含有適用于治療或預防下文所指的人疾病或病癥的其它治療劑。藥物載體增強或穩定組合物，或者用于方便組合物的制備。可藥用載體包括生理學相容的溶齊U、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌齊U、等滲劑和吸收延遲劑等。本發明的藥物組合物可通過本領域已知的多種方法來施用。施用的途徑和/或方式依據預期的結果來變化。優選的施用是靜脈內的、肌內的、腹膜內的或皮下的或者近端地施用到目標部位。可藥用載體應適合于靜脈內的、肌內的、皮下的、胃腸外的、脊髓的或表皮的施用(如通過注射或輸注)。依據施用的途徑，活性化合物(尤其是低分子量化學實體)可包被入材料中以保護化合物免受酸和其它可失活化合物的自然條件的作用。組合物應是無菌的且是流體。適當的流動性可例如通過使用包衣如磷脂酰膽堿、在分散情況下通過維持所需要的顆粒大小、和通過使用表面活性劑來維持。在許多情況下，組合物中優選地包括等滲劑如糖類、多元醇例如甘露醇或山梨糖醇、和氯化鈉。可注射組合物的長期吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁或明膠來達到。本發明的藥物組合物可根據本領域熟知的和常規使用的方法來制備。參見如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Mack出片反公司，第20片反，2000;禾口SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson,編車茸，MarcelDekker，公司，紐約，1978。藥物組合物優選地在GMP條件下生產。一般地，將治療有效劑量或有效劑量的NRG1(如NRG1131)的調節物例如本文所述的NRG1P1抗體應用于本發明的藥物組合物中。它們一般通過本領域技術人員已知的常規方法配制成可藥用劑型。調整給藥方案以提供最佳預期的應答(如治療性應答)。例如，可施用單一的大丸劑、一段時間施用幾次分開的劑量或者如由治療情況的要求所指示可按比例地降低或增加劑量。以劑量單位形式配制腸胃外應用的組合物對施用的便利性以及劑量的均一性都是特別有利的。此處所用的劑量單位形式指適合作為用于待治療受試者的單元劑量的物理上分離的單位；每一單位含有經計算與所需藥物載體一起產生預期治療效果的預定量的活性化合物。本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以是不同的，以便在對患者無毒的情況下，獲得有效達到對特定患者預期的治療性反應的活性成分的量、組合物的量和施用方式。選擇的劑量水平取決于多種藥物動力學因素，所述藥物動力學因素包括本發明使用的特定組合物的活性或其酯的活性、其鹽的活性或者其酰胺化物的活性、施用途徑、施用時間、使用的特定化合物的排泄率、治療持續時間、與使用的特定組合物聯合使用的其它藥物、化合物和/或材料、受治療患者的年齡、性別、體重、疾病、一般健康和以前的病史等因素。醫師可以以低于達到預期治療效果所需的劑量水平來起始藥物組合物中使用的本發明抗體的劑量，并逐漸增加劑量直到達到預期效果。一般來說，用于治療本文所述的過敏性炎性病癥的本發明組合物的有效劑量依據許多不同因素變化，所述許多不同因素包括施用的手段、目標部位、患者的生理狀態、患者是人還是動物、施用的其它藥物、和治療是預防性的還是治療性的。治療劑量需要進行滴定法測量以優化安全性和有效性。對于使用抗體的施用，劑量范圍為大約0.0001mg/kg至100mg/kg，和更通常地0.01mg/kg至5mg/kg宿主體重。例如劑量可是每千克體重1毫克或每千克體重10毫克或在每千克體重1毫克至10毫克之間。示例性的治療方案需要每兩周施用一次或每一月施用一次或者每3個月至6個月施用一次。抗體治療和其它蛋白質治療通常在多種場合中施用。單一劑量之間的間隔可是每周、每月或每年。如通過測量患者中治療性蛋白質的血液水平所指示，間隔也可是不定期的。在一些方法中，調整劑量以達到1yg/ml-1000iig/ml的血槳抗體濃度和在一些方法中的25iig/ml-300iig/ml的血漿抗體濃度。備選地，抗體治療或其它蛋白質治療可施用為持續釋放制劑，在這種情況下，需要較低頻率的施用。劑量和頻率依據患者中抗體或其它蛋白質治療的半壽期來變化。一般來說，人源化抗體比嵌合抗體和非人抗體顯示出更長的半壽期。施用的劑量和頻率可依據治療是預防性的還是治療性的來變化。在預防性應用中，在長時間內以相對不頻繁的間隔施用相對低的劑量。一些患者在其余生繼續接受治療。在治療性應用中，在相對短的間隔有時需要相對高的劑量直到疾病的發展降低或終止，和優選地直到患者表現出疾病癥狀得到部分或完全的改善。此后，患者可施用預防性方案。4.11臨床用途本發明至少部分基于神經調節蛋白家族成員(尤其是NRG1家族如NRG1P并特別是NRG1P1)促進杯形細胞形成的發現。因此，本發明的調節物(尤其是拮抗物)可用于治療人疾病和病癥，在所述人疾病和病癥中異常杯形細胞形成起著病理學作用。因此，根據本發明，提供了治療杯形細胞循環調節的疾病和病癥的方法，所述方法包括向臨床需要其的人患者施用治療有效量的NRG1生物學活性的調節物。在一些實施方案中，調節物是與NRG1(如NRG1P1)禾P/或其相關受體(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是ErbB2/ErbB3異二聚體)結合并抑制它們之間相互作用的拮抗物(如抗體，尤其是IgG同種型的人抗體或人源化抗體或其抗體片段)。在其它實施方案中，提供了治療杯形細胞循環調節的疾病和病癥(如杯形細胞增生)的方法，所述方法包括向臨床需要其的人患者施用治療有效量的結合NRG1131的治療性蛋白質(如本文所述的優先地或特異地結合NRG1131的人抗體或人源化抗體的IgGl同種型或IgG4同種型)。杯形細胞增生對疾病有貢獻的臨床疾病或病癥的例子包括呼吸疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纖維化(CF)、慢性支氣管炎、哮喘(尤其21是其中度和重度形式)。因此，在一些實施方案中，提供了治療患呼吸疾病如C0PD、CF、慢性支氣管炎或哮喘(尤其是其中度和重度形式)的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用NRG1(如NRG1P1)生物學活性的治療有效量的調節物。在這些實施方案的優選形式中，調節物是與NRG1(尤其是NRG1131)結合(如優先地或特異地結合)并中和NRG1(尤其是NRG1P1)的生物學活性的抗體(尤其是人抗體或人源化抗體的IgGl同種型或IgG4同種型)或抗體片段。在此方面，使用于整個說明書的關于NRG1的"生物學活性"并尤其是關于NRG1131的"生物學活性"指這些蛋白質在促進MUC5AC和/或MUC5B表達中的活性。因此，使用于整個說明書的"中和生物學活性"等指通過本發明的調節物抑制MUC5B和/或MUC5AC表達。在一些實施方案中，提供了治療患包含異常黏液產生的疾病或病癥如C0PD、CF、慢性支氣管炎或哮喘(尤其是其中度或中度形式)或者患下呼吸道疾病和病癥(如下呼吸道感染)的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的、NRG1(尤其是NRG1131)與其一個或多個相關受體(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是ErbB2/ErbB3異二聚體)之間相互作用的抑制物(如人抗體或人源化抗體的IgGl同種型或IgG4同種型)。在這些實施方案的優選形式中，調節物是本文所述的與NRG1131優先地結合或更優選地特異地結合并抑制所述異常黏液分泌的人抗體或人源化抗體或者抗體片段。在一些實施方案中，提供了治療患呼吸疾病或病癥如COPD、CF、支氣管炎(尤其是慢性支氣管炎)或哮喘(尤其是其重度或中度形式)或者下呼吸道疾病和病癥(如下呼吸道感染)、肺炎、肺氣腫的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的、NRG1(尤其是NRG1P1)與其一個或多個相關受體(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是"ErbB"/ErbB3異二聚體)之間相互作用的抑制物(如人抗體或人源化抗體的IgGl同種型或IgG4同種型)。在一些實施方案中，提供了治療異常黏液產生方面的呼吸疾病如COPD、CF、慢性支氣管炎或哮喘(尤其是其重度或中度形式)的方法，所述方法包括向所述人患者施用治療有效量的中和NRG1的生物學活性，且尤其是中和NRG113的生物學活性的調節物(如人抗體或人源化抗體)。在其它實施方案中，提供了預防性治療有患以異常黏液產生(如COPD、慢性支氣管炎、囊性纖維化、哮喘)為特征的呼吸疾病和病癥危險的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的調節NRG1(尤其是NRG113且更尤其是NRG1P1)與其一個或多個相關受體(如ErbB2和/或ErbB3)之間相互作用的調節物(例如治療性蛋白質，如人抗體或人源化抗體的IgG同種型例如本文所述的IgGl或IgG4)。在一些實施方案中，調節物中和NRG1的生物學活性。在本發明的其它實施方案中，提供了治療患呼吸疾病或病癥如COPD、CF、慢性支氣管炎的人患者的方法，所述方法包括共施用NRG1(尤其是NRG113和更尤其是NRG1P1)生物學活性的抑制物(例如治療性蛋白質如本文所述的人抗體或人源化抗體)和抗人IL-13劑(如IL-13抗體，尤其是人IL-13抗體或人源化IL-13抗體)和/或抗人IL-4劑(如IL-4抗體，尤其是人IL-4抗體或人源化IL-4抗體)和/或抗人IL-5劑(如IL-5抗體，尤其是人IL-5抗體或人源化IL-5抗體)和/或抗IgE劑(如人抗IgE抗體或人源化抗IgE抗體)和/或抗IL-17(尤其是IL-17A)抗體(例如人抗IL-17如IL-17A抗體或人源化抗IL-17如IL-17A抗體)。特別地并分別地考慮了這些組合中的每一種組合。盡管已描述了本發明主要涉及人疾病或病癥的治療，技術人員可容易地理解，本文的教導可應用于非人哺乳動物中相似的疾病或病癥的治療。5.實施例本發明現僅以實施例的方式進行描述。5.1附圖簡述圖1.NRGlP1和NRGla對MUC5AC表達的影響用濃度增加的NRGl131(上左)或NRGla(上右)處理人支氣管上皮細胞(HBEC)7天并用抗MUC5AC(45M1)單克隆抗體染色。MUC5AC陽性細胞的比例通過圖象分析來評估。(下)MUC5AC/愛茜藍染色的運載體和NRGlP1(50nM)處理的HBEC的代表性組織學成像。箭頭所指為用抗MUC5AC抗體未染色的愛茜藍染色細胞。顯示的結果是來自對3個獨立供體實驗的代表性結果。顯示的結果是平均值士SEM(n=3)。指出了與未處理對照相比的顯著差異(*P<0.05)。圖2:NRGla和NRGlP1對MUC5B蛋白質的影響如通過免疫組織化學評估，濃度增加的NRGl|31(A)和NRGla(B)對MUC5B蛋白質的影響。將細胞用NRGl處理7天。(C)MUC5B/愛茜藍染色的運載體和NRGlP1(50nM)處理的HBEC的代表性組織學成像。顯示的結果是平均值士SEM(n二3)。指出了與未處理對照相比的顯著差異(*P<0.05)。圖3:—段時間內NRGlP1對MUC5AC和MUC5B表達的影響如通過組織學評估，NRGlP1(50nM)處理1至14天對MUC5AC蛋白質(A)和MUC5B蛋白質(B)的影響。經NRGIPI處理的樣品顯示為黑色和未處理樣品顯示為白色。顯示的結果是平均值士SEM(n=3)。指出了與未處理對照相比的顯著差異(*P<0.05)。圖4:NRG1P1在原代細胞中的表達通過RT-PCR分析了一組包括T細胞、嗜中性粒細胞、人支氣管上皮細胞(HBEC)、支氣管平滑肌細胞(BSMC)和肺成纖維細胞的原代細胞中NRGl131的表達。也分析了管家基因運鐵蛋白的表達。數據是用來自至少2個獨立供體的細胞獲得的數據的代表。圖5:MUC5AC和MUC5B在卵清蛋白攻擊的小鼠肺中的表達通過定量RT-PCR分析了在來自OVA攻擊的Balb/c小鼠肺組織中MUC5AC(A)和MUC5B(B)的表達。結果顯示為平均值士SEM(n二每組8只)，且顯示的是歸一化為管家基因P肌動蛋白的數據。與鹽水攻擊的小鼠比較*。<0.05。圖6:在來自OVA攻擊的小鼠BAL液中NRGlP1蛋白質的蛋白質印跡分析通過蛋白質印跡，對來自OVA攻擊的小鼠BAL液分析NRGlP1蛋白質。用優先識別NRGIP1同工型的抗體(sc-347)來探測印跡。每一處理分析來自4只動物的BAL液。顯示的數據是用2個獨立樣品的集合獲得的數據的代表。圖7:NRG1P1ELISA在來自0VA攻擊的小鼠BAL液中定量NRG1Pl蛋白質。數據顯示為平均值士SEM(n=每組4只小鼠)。顯示的數據是2個獨立樣品集合的代表。與鹽水攻擊的小鼠比較**。<0.001。圖8:pan-ErbB受體抑制物對杯形細胞形成的影響顯示了pan-ErbB受體抑制物對NRGlP1誘導的杯形細胞形成的影響。通過組織學確定抑制物(1-10yM)對NRGl|31誘導的MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質的影響。如所標示，細胞未經NRGlP1(50nM)處理或者經NRGlP1(50nM)處理。*與未處理對照相比存在顯著差異(P<0.05);#與僅經NRGl131處理組相比存在顯著差異(P<0.05);##與僅經NRG1P1處理組相比顯著差異(P<0.001)。結果顯示為平均值士SEM(n=3)，且結果是2次獨立實驗的代表。圖9:ErB受體在人支氣管上皮細胞中的表達分析通過RT-PCR(左)和蛋白質印跡(右)分析了ErbB受體在原代人支氣管上皮細胞中的表達。分別分析了3個或2個供體中ErbB受體的mRNA和蛋白質的表達。也顯示了管家基因GAPDH的表達。圖10:ErbB受體中和抗體對NRG1P1誘導的杯形細胞形成的影響通過組織學來定量抗ErbB受體抗體在HBEC中對NRG1P1誘導的MUC5AC蛋白質(A、C、E)和MUC5B蛋白質(B、D、F)的影響。顯示了抗ErbB2受體抗體的數據(A、B)、抗ErbB3受體抗體的數據(C、D)和抗ErbB4受體抗體的數據(E、F)，且所用抗體的濃度標示于圖上。*與未處理對照相比顯著差異(P<0.05);#與僅經NRG1131處理組相比顯著差異(P<0.05)。結果顯示為平均值士SEM(n=3)，且結果是2次獨立實驗的代表。5.2縮寫列表縮寫描述ALI氣液界面BAL支氣管肺泡灌洗BSA牛血清清蛋白BSMC支氣管平滑肌細胞CF囊性纖維化COPD慢性阻塞性肺病ELISA酶聯免疫吸附測定HBEC人支氣管上皮細胞HRGHeregulinIL-13白細胞介素1324<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>5.3方法5.3.1HBEC的培養將人支氣管上皮細胞(HBEC;Cambrex)培養于補充有提供了基本上如[Atherton等人，2003]中所述的單一配方的支氣管上皮細胞生長培養基(BEGM;Cambrex)中。對于分化，將細胞在分化培養基中以8.25Xl(^個細胞/Insert的細胞密度生長于0.4iim孔大小、12mm的Transwellinserts(Costar)上。分化培養基含50%BEGM和50%Dulbeccos改良的Eagle培養基(DMEM)并補充有52yg/ml牛垂體提取物、5yg/ml胰島素、0.5yg/ml皮質醇、10iig/ml運鐵蛋白、0.5iig/ml腎上腺素、0.5ng/ml人EGF、50yg/ml慶大霉素和50nM視黃酸。將細胞維持浸沒7天，然后在氣液界面(ALI)生長7-14天并每2-3天重新補充培養基。在ALI培養期間，將細胞用NRG1a或NRG1P1(R&D系統)處理，并加到Transwellinserts的基底外側小室中。所有階段都將細胞維持在37。C、存在5%C02的空氣溫箱中。5.3.2.MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質的免疫組織化學柃測在ALI分化7天后(除非另外說明)，將HBEC的頂端表面用PBS溫和地洗滌并用中性緩沖福爾馬林固定并包埋。將Insert切片為3ym厚并按照DABMAP步驟使用抗MUC5AC抗體(45M1;Labvision)或者抗MUC5B單克隆抗體在VentanaXT免疫染色儀上染色，并用在3%乙酸中的1X愛茜藍，pH2.5復染。使用具有ImagingAssociatedKS400圖象分析儀(ImagingAssociates)的ZeissAxioplan2顯微鏡(X10放大)來評估染色區域。每一樣品評分14個視野。數據表示為杯形細胞密度，其定義為染色區域(ym2)與評分的上皮的長度(ym)的比率。常規制備的抗MUC5B單克隆抗體獲自佛羅里達大學HybridomaCoreLaboratory,并且所述抗體是針對肽SWYNGHRPEPGLG(SEQ.I.D.NO:11)產生的。5.3.3RNA的制備和第一鏈cDNA合成分離試劑盒(Qiagen)從細胞中分離總RNA。RNA也分離自過敏原誘導的杯形細胞形成的小鼠卵清蛋白(OVA)模型的肺組織。已經將Balb/c小鼠用0VA致敏2周，并給予連續2天、每天一次的卵清蛋白(50mg/ml)攻擊，如在[Trifilieff等人，2000]中所述。使用在QiagenRNeasy小型制備試劑盒中提供的試劑和方法從小鼠肺組織中制備RNA。將冰凍的肺組織(20mg)在600iU的RLT緩沖液中使用polytron均化器(KinematicaAG)進行均化。裂解物根據生產商說明書使用Qiashredder柱(Qiagen)進行進一步的處理。使用1iig的總RNA和提供于第一鏈cDNA合成試劑盒(RocheDiagnostics公司)中的試劑和方法來進行第一鏈cDNA合成。5.3.4定量RT-PCR通過定量RT-PCR，分析在來自小鼠OVA模型(第2_3部分)的肺組織中MUC5AC基因和MUC5B基因的表達。將PCR反應混合物制備成20y1的終體積并含10y12XSYBRGreenPCRMasterMix(Sigma)、0.8ii1的10iiM各正向引物和反向引物(終濃度400nM)和4.4illdH20。在96孔OpticalReactionPlate中放入16ii1的這種主混合物并每孔加入4ill的cDNA模板(第2-3部分)。樣品一式兩份使用ABI7900SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems)進行分析。MUC5AC、MUC5B和P-肌動蛋白管家基因對照的引物序列顯示于表1中。使用具有cDNA濃度范圍為66，666pg至274pg的混合的肺cDNA庫，在每一板上包括標準曲線。包括含用無核酸酶水替代稀釋的cDNA的無模板對照(NTC)。定量PCR程序如下階段1，50°C2分鐘；階段2，95°C10分鐘；階段3，40個循環的95°C15秒、60。C15秒和72。C30秒。數據通過相對方法解釋(ABIPRISM7700SequenceDetectionSystem。UserBulletin#2，PEAppliedBiosystems,1997)。顯示了歸一化為管家基因P肌動蛋白的表達值。表lRT-PCR引物基因引物序列(5'到3')引物名稱PCR產物的長度(bp)運鐵蛋白TTACAGTGGCTGTATTCTGCTGG(SEQ.I.D.NO:1)TGCTGTTCTCATGGAAGCTATTransForTransRev401基因引物序列(5'到3')引物名稱PCR產物的長度(bp)26<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>.I.D.NO:3)TGTTTCGTTCTGACCGAAGG(SEQ.I.D.NO:4)NRGlPlForNRGlRev188MucOacCAGCCGAGAGGAGGGTTTGATCT(SEQ.I.D.NO:5)AGTCTCTCTCCGCTCCTCTCAAT(SEQ.I.D.NO:6)Muc5acForMuc5acRev399Muc5bAGGAAGACCAGTGTGTTTGTC(SEQ.I.D.NO:7)GTCCTCATTGAAGAAGGGCTG(SEQ.I.D.NO:8)Muc5bForMuc5bRev615P-肌動蛋白TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG(SEQ.I.D.NO:9)TTTGATGTCACGCACGATTTCC(SEQ.I.D.NO:10)MmPactinForMmPactinRev5145.3.5RT-PCR27用于在制備自人原代細胞的cDNA中分析NRG1P1基因表達。將含10iU的2XHotStarTaqMasterMix(Qiagen)、20pmol的每一NRG1P1正向引物和NRG1反向引物(Sigma-Genosys;表1)、1yl的cDNA模板(50ng)的PCR反應物在0.2ml薄壁PCR管中補足20iU的終體積。對照PCR反應使用管家基因運鐵蛋白特異的引物(使用引物TransFor和TransRev(表1))來進行。PCR循環條件如下95。C變性15分鐘，30個循環的94。C變性15秒、55t:退火15秒和72t:延伸45秒，然后72。C最終延伸5分鐘。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上分析并用溴化乙錠染色。5.3.6蛋白質印跡對來自小鼠OVA模型的支氣管肺泡灌洗(BAL)樣品進行蛋白質印跡分析。在使用NuPAGEMOPS運行緩沖液的4%-12%NuPAGEBis-Tris丙烯酰胺凝膠上、200V分析前，將含25iilBAL液的樣品在1XNuPAGELDS樣品緩沖液、50mMDTT中70°C、變性10分鐘。凝膠和緩沖液購自Invitrogen。使用NuPAGE轉移緩沖液(Invitrogen)，將樣品10V過夜轉移到Immobilon-PPVDF膜(Millipore)上。將膜在PBS、0.1%(v/v)吐溫_20、5%(w/v)Blotto奶粉(SantaCruz)中室溫封閉1小時。移去封閉緩沖液并將膜用1:600稀釋于封閉緩沖液中的抗NRG1131(sc-347;SantzCruz)第一抗體室溫孵育3小時。將膜在洗滌緩沖液(PBS、0.1%(v/v)吐溫_20)中室溫振蕩洗滌4次10分鐘。將印跡用1:2000稀釋于0.5XPBS、0.05%(v/v)吐溫-20、0.5X0dyssey封閉緩沖液、0.01%(w/v)SDS中的山羊抗兔IRDye800第二抗體(Tebu-bio)在暗處振蕩孵育1小時。將膜如前所述進行洗滌并使用169iim分辨率、3.Omm的焦距設置和5.0的強度設置的LI-COROdyssey紅外成像系統(LI-CORBiosciences)進行分析。包括NRGla對照蛋白質或NRG1P1對照蛋白質(Labvision)作為陽性對照。5.3.7腦lg1ELISA使用NRG1P1DuoSetELISA試劑盒(R&Dsystems)和使用提供于試劑盒中的試劑來分析OVA攻擊的小鼠BAL液中(第2-3部分)NRGiei蛋白質水平。將免疫板(96孔；Nunc)用4iig/ml的小鼠抗人NRG1P1100y1/孔室溫包被過夜。將平板用400y1/孔的洗滌緩沖液(PBS，O.05%(v/v)吐溫-20)洗滌4次。將平板用300y1/孔的緩沖液A(PBS，1%(w/v)BSA)室溫封閉1小時，然后如前所述進行洗滌。向孔加入BAL液樣品(100ii1/孔)或稀釋于緩沖液A中的NRG1131蛋白質標準(0.0625ng/ml-4ng/ml)并室溫孵育2小時。含緩沖液A的空白也包括在平板上。在添加100ii1/孔的200ng/ml的檢測抗體(生物素化的山羊抗人NRGiei)室溫2小時前，將平板如前所述進行洗滌。再次洗滌平板并加入100iU/孔的l:200稀釋于緩沖液A中的綴合辣根過氧化物酶的鏈親和素(100iU/孔)室溫30分鐘。向平板加入3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)底物(Sigma;100y1/孔)并室溫孵育30分鐘。通過添加50ii1/孔的1M硫酸來終止反應。使用Spectramax340平板讀取器(MolecularDevices)來測量在450nm的吸光度(用在540nm測量的背景校正吸光度)。將樣品一式兩份進行分析。5.3.8數據分析和統計學數據顯示為平均值±SEM，并代表來自2次獨立實驗的重復樣品。使用兩樣本t-檢驗來測定對照組和處理組之間是否存在顯著差異(*P<0.05，**P<0.001)。5.4結果5.4.1NRG1a和NRG131對黏蛋白表汰和杯形細胞形成的影響如通過組織學評估，在生長于ALI的原代人支氣管上皮細胞(HBEC)培養物中，NRG1131處理引起了MUC5AC蛋白質(氣道杯形細胞的標志)劑量依賴的增加(圖1A)。在50nMNRG1P1時，獲得了高于運載體水平3倍增加的MUC5AC蛋白質。密切相關的NRG1同工型NRGla，在多達250nM的濃度時，對MUC5AC蛋白質不具有顯著影響(圖IB)。將用MUC5AC抗體染色的HBECinsert也用愛茜藍復染。令人感興趣地，在NRG1P1處理的樣品中注意到了用MUC5AC(45M1)抗體未染色的幾個愛茜藍染色細胞(圖1C)，這可能反映其它黏蛋白如MUC5B的存在。為了證實NRG1P1和NRG1a對MUC5B蛋白質的任何影響，細胞也用針對MUC5B的單克隆抗體進行染色。兩種NRG1同工型直到50nM的濃度都引起MUC5B蛋白質的劑量依賴性增加(圖2)。在50nM時，NRG1P1和NRG1a分別引起MUC5B蛋白質的9.8倍增加和6.4倍增加。由于NRG1131同工型對MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質具有最顯著的影響，因此進一步的研究致力于NRG1131。在一段時間內，NRGIP1對MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質表達的影響顯示于圖3中。NRG1P1處理7、10或14天后，與運載體處理對照比較，MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質的表達是顯著的。(圖3)。在幾種原代細胞中分析了NRG1131的基因表達譜。發現NRG1P1表達于分化的原代人支氣管上皮細胞(HBEC)、支氣管平滑肌細胞(BSMC)和肺成纖維細胞中(圖4)。在T細胞或嗜中性粒細胞中未檢測到表達。通過定量RT-PCR，對來自用OVA攻擊或鹽水攻擊的小鼠肺組織進行MUC5AC基因和MUC5B基因表達的分析。與鹽水對照比較，OVA攻擊后觀察到57倍增加的MUC5AC基因表達(圖5)。OVA攻擊后MUC5B基因表達也增加3倍(圖5)。通過蛋白質印跡，分析了來自0VA攻擊的小鼠BAL液中的NRG1Pl蛋白質表達。與鹽水攻擊的對照小鼠比較，在來自0VA攻擊的小鼠BAL液中檢測到NRG1P1蛋白質的增加(圖6)。通過ELISA，對0VA攻擊的小鼠BAL液中的NRG1P1蛋白質進行定量。與鹽水攻擊的對照小鼠比較，在OVA攻擊的小鼠BAL液中檢測到NRG1P1的9倍增加(圖7)，這與蛋白質印跡數據一致。NRG1131的濃度是大約0.9ng/ml。5.4.2討論黏蛋白MUC5AC和MUC5B是患哮喘和COPD的患者氣道分泌物的主要成分[Rose和Voynow，2006;Rogers，2003]。已經報道了在哮喘、COPD和CF患者的氣道中增加的杯形細胞數量[Aikawa等人，1992;0rdonez等人，2001;Saetta等人，2000;Gronenberg等人，2002b]。在氣道中增加的杯形細胞數量可在抗原誘導炎癥的小鼠OVA模型中模擬。OVA的單一或重復攻擊導致氣道中愛茜藍/PAS染色的杯形細胞的增加[Trifilieff，El-Hasim和Bertrand，2000]。在這個報道中我們已經顯示，在OVA攻擊后的小鼠肺中，黏蛋白基因MUC5AC和MUC5B表達的顯著增加。這些數據與已公開的數據一致，其中通過RNA印跡分析，檢測到OVA模型中MUC5AC基因表達的增加[ZhudiAlimam等人，2000]。我們已經顯示，NRGIP1在分化的HBEC培養物中誘導MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質(二者都是氣道杯形細胞的標志物)表達。NRG1131而不是緊密相關的同工型NRG1a，在杯形細胞形成的體外模型中具有對MUC5AC和MUC5B最明顯的影響。為了進一步了解NRGIP1在杯形細胞體內形成中的作用，在來自0VA攻擊的小鼠BAL液中分析了NRG113l蛋白質。通過蛋白質印跡檢測到NRG1P1蛋白質的增加并通過ELISA進行定量，所述NRG1P1蛋白質的增加伴隨著在OVA攻擊的小鼠的肺中MUC5AC基因表達和MUC5B基因表達的增加。以前已經顯示，NRG1剌激人氣道上皮的分化，并在人氣道上皮培養物中引起杯形細胞數量的增加[Vermeer等人，2006]。然而，在Vermeer等人的研究中沒有研究NRG1P1同工型且沒有報道對黏蛋白MUC5AC和MUC5B的影響。本研究中發現NRG1P1表達于包括支氣管上皮細胞、支氣管平滑肌細胞和肺成纖維細胞的肺衍生細胞中。因此，我們已經顯示黏蛋白基因MUC5AC和MUC5B在OVA攻擊的小鼠的肺中是增加的，且這伴隨著氣道中NRG1131蛋白質的增加。我們也已經顯示NRG1131是體外MUC5AC陽性杯形細胞和MUC5B陽性杯形細胞有效的介質，并因此NRG1P1可代表針對黏液分泌過多在其中起作用的呼吸疾病如哮喘、COPD和CF的潛在治療目標。5.5NRG1|31與ErbB之間的相互作用5.5.1方法5.5.1.1細胞的化合物和抗體處理在添加NRG1131前2小時，將化合物或抗體稀釋于HBEC分化培養基中，并加到在Transwellinserts上生長有HBEC的基底外側小室。將HBEC用與NRG1P1組合的化合物或抗體在ALI處理7天，每次重新補充培養基時(每2-3天)替換NRG1P1連同新鮮抗體或新鮮化合物。對于每一處理，至少準備3個相同的孔。ErbB2受體抗體(AF1129)和ErbB3受體抗體(MAB3841)來自R&D系統和ErbB4受體抗體(MS-304-PlABX)來自LabVisionCorporation。5.5.1.2ErbB受體表達的RT-PCR分析對于在制備自分化的HBEC的cDNA中分析ErbB受體表達，PCR反應物制備如下含12.5iUHotStarTaqMastermix(Qiagen)、50pmol的每一正向引物和反向引物(表2)、50ngcDNA和水至25y1終體積的PCR反應混合物于0.2ml薄壁PCR管中。對照PCR反應用對管家基因GAPDH特異的引物(使用引物GAPDHF和GAPDHR(表2))來進行。PCR循環條件如下95。C變性15分鐘，35個循環的94。C變性15秒、55。C退火15秒、和72。C延伸45秒，然后72t:最后延伸5分鐘。將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上分析并用溴化乙錠染色。表2用于ErbB受體表達分析的RT-PCR引物基因引物序列(5'to3')引物名稱PCR產物的長度(bp)ErbBlgtcctcattgccctcaacacag(SEQ.I.D.NO:12)ccattgggacagcttggatcac(SEQ.I.D.NO:13)ErbBlFErbBlR326ErbB2cagttaccagtgccaatatcc(SEQ.I.D.NO:14)ttgtgcagaattcgtcccc(SEQ.I.D.NO:15)ErbB2FErbB2R250ErbB3actctgaatggcctgagtg(SEQ.I.D.NO:16)caaacttcccatcgtagacc(SEQ.I.D.NO:17)ErbB3FErbB3R253ErbB4ACCAGCATTGAGCACAACC(SEQ.I.D.NO:18)CGTCCACATCCTGAACTACC(SEQ.I.D.NO:19)ErbB4FErbB4R368GAPDHCCACCCATGGCAAATTCCATGGCA(SEQ.I.D.NO:20)TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC(SEQ.I.D.NO:21)GAPDHFGAPDHR5985.5.1.3ErbB受體表汰的蛋白質印跡分析將細胞在補充有Completeproteaseinhibitorcocktail(Roche)的含50mMTrispH7.5、150mMNaCl、0.65%v/vNP-40的冰冷裂解液中裂解，并通過4°C、16000Xg離心5分鐘來澄清裂解物。根據制造商說明書使用MicroBCA蛋白質測定試劑盒(Perbio)31來確定蛋白質濃度。澄清的裂解物在1XNuPAGE樣品緩沖液(Invitrogen)中7(TC變性10分鐘，并用MOPS運行緩沖液使用Bis-TrisNuPAGE聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)解析來自樣品的等量蛋白質。將蛋白質在NuPAGE轉移緩沖液(Invitrogen)中轉移至Immobilon-PPVDF膜(Millipore)。第一抗體以1/1000稀釋使用，且合適的第二抗體以1/2000或1/5000稀釋。除以下指出的抗體外EGFR(1005);ErbB2(C-18)、ErbB3(C-17)、ErbB4(C-18)和GAPDH、小鼠單克隆第一抗體(6C5)，所有第一抗體都來自SantaCruzBiotechnology且是兔多克隆抗體。第二抗體是綴合了AlexaFluor680的抗兔第二抗體(Invitrogen)或綴合了IRDye800的抗小鼠第二抗體(Tebu-bio)。將膜在封閉緩沖液(含0.1%v/v吐溫-20和5%w/vBlotto(SantaCruz)的PBS)中室溫孵育4小時，然后用稀釋于封閉緩沖液中的第一抗體4t:孵育過夜。在膜與各自稀釋于補充有O.1%v/v吐溫-20和0.01Xw/vSDS的Odyssey封閉緩沖液(50%v/vPBS:50%v/v0dyssey緩沖液(LI-CORBiosciencesUKLtd))中的經紅外染料綴合的第二抗體在室溫暗處孵育1小時前，將膜用洗滌緩沖液(PBS，0.1%v/v吐溫-20)洗滌。用第二抗體孵育后，在使用169m分辨率、3.0mm的焦距設置和5.0的強度設置的LI-C0ROdyssey紅外成像系統進行成像前，將膜暗處再次洗滌。5.6結果5.6.1mn-ErbB受體抑制物對杯形細胞形成的影響分析了pan-ErbB受體抑制物對NRGlP1誘導的杯形細胞形成的影響。在添加NRGl131前，將HBEC用抑制物預處理，并且然后將細胞在ALI生長7天。對杯形細胞標志物MUC5AC和MUC5B的影響通過組織學來分析。10yM的pan-ErbB受體抑制物顯著地抑制了NRGlP1i秀導的MUC5AC蛋白質和MUC5B蛋白質的增加(圖8)。5.6.2抗ErbB受體抗體對NRGl31誘導的杯形細胞形成的影響在來自多個人供體的HBEC中分析了ErbB受體表達譜。所有4個ErbB受體家族成員EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4的蛋白質和mRNA可在來自多個原代人支氣管上皮細胞供體的樣品中檢測到(圖9)。在杯形細胞形成的原代人支氣管上皮細胞模型中，使用針對ErbB2受體、ErbB3受體或ErbB4受體的中和抗體來評估ErbB受體參與的NRGlP1誘導的杯形細胞形成。在ALI處理NRGlP17天前，將HBEC用抗體預處理。針對ErbB2受體和ErbB3受體的抗體抑制NRGlP1誘導的MUC5AC和MUC5B產生，然而針對ErbB4的抗體沒有影響(圖10)。5.6.3討論已經報道NRGlP1通過ErbB2/ErbB3異二聚體或ErbB2/ErbB4異二聚體來傳導信號[Falls,2003;Citri等人，2003]。表達分析表明，所有的ErbB受體家族成員EGFR、ErbB2-ErbB4都表達于原代人支氣管上皮細胞上。為了進一步闡述哪一個受體參與NRGl|31誘導的杯形細胞形成，將pan-ErbB受體酪氨酸激酶抑制物[Traxler等人，2004]進行了體外杯形細胞形成測定分析。pan-ErbB受體酪氨酸抑制物顯著地降低了杯形細胞黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表達，表明ErbB受體參與這個過程。為了進一步研究哪一個ErbB受體負責NRGl|31誘導的杯形細胞形成，將針對ErbB2受體、ErbB3受體和ErbB4受體的中和抗體進行了測試。針對ErbB2和ErbB3的中和抗體顯著地降低了NRG1P1誘導的杯形細胞形成，如由杯形細胞標志物MUC5AC和MUC5B所顯示。相反，抗ErbB4受體中和抗體對NRG1131誘導的杯形細胞形成沒有影響。這些數據表明在人氣道上皮細胞中ErbB2受體和32ErbB3受體參與NRG1P1誘導的杯形細胞形成。6.參考文獻[AikawaT，ShimuraS，SasakiH，等人(1992)]在死于嚴重的急性哮喘發作的患者氣道中標記的杯形細胞增生伴有粘液累積(MarkedGobletCellHyperplasiawithmucusaccumulationintheairwaysofpatientswhodiedofsevereacuteasthmaattack)，Chest;101:916-922.[AthertonC，JonesG和DanahayH(2003)]IL-13誘導的人支氣管上皮細胞培養物的杯形細胞密度的改變MAP激酶和磷脂酰肌醇3激酶調節(IL-13-inducedchangesinthegobletcelldensityofhumanbronchial印ithelialcellcultures:MAPkinaseandphosphatidtylinositol3-kinaseregulation)，AmJPhysiolUmgCellMolPhysiol;285:L730_L739.[BoucherRC(2002)]囊性纖維化肺病的發病機理概述(Anoverviewofthepathogenesisofcysticfibrosislungdisease)，AdvDrugDelRev;54:1359-1371.[CaramoriG，DiGregorioC，CarlstedtI等人(2004)]在患慢性阻塞性肺病患者的夕卜周氣道中的黏蛋白表達(Mucinexpressioninperipheralairwaysofpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease)，Histopathology;45:477-484.[CitriA，SkariaKB和YardenY(2003)]聾和啞ErbB-2和ErbB-3的生物學(Thedeafanddumb:thebiologyofErbB-2andErbB-3)，ExpCellRes;284:54_65.[deBoerWI，HauCM，vanSchadewijkA等人(2006)]表皮生長因子和其受體在患慢性阻塞性肺病受試者的支氣管上皮中的表達(ExpressionoftheEpidermalGrowthFactorsandTheirReceptorsinBronchialEpitheliumofsubjectswithChronicObstructivePulmonaryDisease)，AmJClinPath;125:184-192.[FallsDL(2003)]神經調節蛋白功能、組成和信號策略(Neuregulins:functions,formsandsignallingstrategies)，ExpCellRes;284:14-30.[DammannCEL，NielsenHC禾口CarrawayIIIKL(2003)]神經調節蛋白1a在肺發育中的作用(RoleofNeuregulin-laintheDevelopingLung)，AmJRespCritCareMed;167:1711-1716.[GronenbergDA，EynottPR，LimS等人(2002a)]呼吸黏蛋白在致命性哮喘持續狀態禾口輕度哮喘中的表達(Expressionofrespiratorymucinsinfatalstatusasthmaticusandmildasthma)，Histopathology;40:367-373.[GronenbergDA，EynottPR，0atesT等人(2002b)]MUC5AC黏蛋白和MUC5B黏蛋白在正常和囊性纖維化肺中的表達(ExpressionMUC5ACandMUC5Bmucinsinnormalandcysticfibrosislung)，RespMed;96:81-86.[HaysSR和FahyJV(2003)]黏液在致命性哮喘中的作用(Theroleofm腦sinfatalasthma)，AmJMed;115:68-69.[HenkeM0，RennerA，HuberRM等人(2004)]MUC5AC黏蛋白和MUC5B黏蛋白在囊性纖維化氣道分泌物中是減少的(MUC5ACandMUC5Bmucinsaredecreasedincysticfibrosisairwaysecretions)，AmJRespCellMolBiol;31:86-91.[HenkeM0，JohnG，GermannM等人(2007)]在肺部惡化期間MUC5AC黏蛋白33和MUC5B黏蛋白在囊性纖維氣道分泌物中增加(MUC5ACandMUC5Bmucinsincreaseincysticfibrosisairwaysecretionsduringpulmonaryexacerbation)，AmJRespCritCareMed;175:816-821.[HoggJC，ChuF，Utok即archS等人(2004)]慢性阻塞性肺病中局部氣道阻塞的特性(Thenatureofsmallairwayobstructioninchronicobstructivepulmonarydisease)，NEnglJMed;350:2645-2653.[HolmesWE，SliwkowskiMX，AkitaRW等人(1992)]heregulin的鑒定，特異的激活物pfpl85erbB2(Identificationofheregulin，aspecificactivatorpfpl85erbB2)，Science;256:1205—1209.[JonesCE，HoidenS，TenaillonL，等人(2003)]在人嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞上高表達的5-氧代-6E，8Z，11Z，14Z-EicoastetraenoicAcid受體的表達和特征(ExpressionandCharacterisationofa5_oxo_6E，8Z，11Z，14Z_EicoastetraenoicAcidReceptorHighlyExpressedonHumanEosinophilsandNeutrophils)，MolPhamacol;63:471-477.[JonesJT，AkitaRW禾口SliwkowskiMX(1999)]egf結構域與ErbB受體的結合牛寺異性禾口親禾口力(BindingspecificitiesandaffinitiesofegfdomainsforErbBrec印tors)，FESLetts;447:227-231.[KirkhamS，SheehanJK，KnightD等人(2002)]氣道粘液的異質性主要寡聚黏蛋白MUC5AC禾口MUC5B的量禾口糖形的變4t(Heterogeneityofairwaysmucus-variationsintheamountsandglycoformsofthemajoroligomericmucinsMUC5ACadMUC5B)，BiochemJ;361:537-546.[KupermanDA，HuangX，KothLL等人(2002)]白細胞介素13對哮喘中上皮細胞引起的高反應性和黏蛋白超量產生的直接影響(Directeffectsofinterleukin-13onepithelialcellscauseairwayhyperreactivityandmucinoverproductioninasthma)，NatureMed;8:885-889.[KuyperLM，ParePD，HoggJC等人(2003)]致命性哮喘中氣道堵塞的特征(Characterizationofairwayplugginginfatalasthma)，AmJMed;115:6-11.[OrdonezCL，KhashayarR，WongHH等人(2001)]輕度和重度哮喘與氣道杯形細胞增生和黏蛋白基因表達異常有關(MildandModerateasthmaisassociatedwithairwaygobletcellhyperplasiaandabnormalitiesinmucingeneexpression)，AmJRespCritCareMed;163:517-523.[PatelNV，AcarreguiMJ，SnyderJM等人(2000)]神經調節蛋白_1和人表皮生長因子受體2禾P3在人肺體外發育中有作用(Neuregulin-1andhuman印idermalgrowthfactorreceptors2and3playaroleinhumanlungdevelopmentinvitro)，AmJRespCellMolBiol;22:432-440.[PrescottE，LangeP和VestboJ(1995)]在C0PD和由于肺部感染死亡中慢性黏液分泌過多(ChronicmucushypersecretioninC0PDanddeathfrompulmonaryinfection)，EurRespJ;8:1333-1338.[RogersDF(2003)]氣道杯形細胞(Theairwaygobletcell)，IntJBiochem34CellBiol;35:1-6.[RoseMC和VoynowJA(2006)]在健康和疾病中的呼吸道黏蛋白基因和黏蛋白糖蛋白(Respiratorytractmucingenesandmucinglycoproteinsinhealthanddisease)，PhysiolRev;86:245-278.[SaettaM，TuratoG，BaraldoS，等人(2000)]在患慢性支氣管炎和慢性氣流通氣受限兩癥狀吸煙者的外周氣道中的杯形細胞增生和上皮炎癥(Gobletcellhyperplasiaandepithelialinflammationinperipheralairwaysofsmokerswithbothsymptomsofchronicbronchitisandchronicairflowlimitation),AmJRespCritCareMed;161:1016-1021.[TraxlerP，AllegriniPR，BrandtR等人(2004)]AEE788:具有抗腫瘤和抗血管生成活性的雙家族表皮生長因子受體/ErbB2和血管內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制物(AEE788:Adualfamilyepidermalgrowthfactorrec印tor/ErbB2andvascularendothelialgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitorwithantitumorandantiangiogenicactivity)，CancerRes;64:4931-4941.[TrifilieffA，El-HashimA和BertrandC(2000)]在鼠哮喘模型中炎癥和重塑事件的時間過程類固醇治療的影響(Timecourseofinflammatoryandremodelingeventsinamurinemodelofasthma:effectofsteroidtreatment)，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol;279:L1120—L1128.[VermeerPD，EinwalterLA，MoningerTO等人(2003)]受體和配體的分離調節上皮生長因子受體的激活(Segregationofreceptorandligandregulatesactivationofepithelialgrowthfactorreceptor)，Nature;422:322-326.[VermeerPD，PankoL，KarpP等人(2006)]人氣道上皮的分化依賴于erbB2(Differentiationofhumanairway印itheliaisdependentonerbB2)，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol;291:L175-L180.[VestboJ(2002)]黏液分泌過多的流行病學研究(Epidemiologicalstudiesinmucushypersecretion)，NovartisFoundationSymposium;248:3-19.[VestboJ，PrescottE禾PLangeP(1996)]慢性黏液分泌過多與FEV1下降和慢性阻塞性月市病發病之間的聯系(AssociationofchronicmucushypersecretionwithFEV1declineandchronicobstructivepulmonarydiseasemorbidity)，AmJRespCritCareMed;153:1530-1535.[Williams0W，SharafkhanaehA，KimV等人(2006)]氣道粘液，從產生到分泌(Airwaymucus.Fromproductiontosecretion)，AmJRespCellMolBiol;34:527-536.[Wills-KarpM，LuyimbaziJ，XuX等人(1998)]白細胞介素13:過敏性哮喘的中心介質(Interleukin-13:CentralMediatorofAllergicAsthma)，Science;282:2258-2261.[ZhuZ，HomerRJ，WangZ等人(1999)]白細胞介素13的肺部表達引起炎癥、黏液分泌過多、上皮下纖維化、生理性異常和嗜酸細胞活化趨化因子產生(Pu1monaryexpressionofinterleukin—13causesinflammation,mucushypersecretion,subepithelialfibrosis,physiologicabnormalities,andeotaxinproduction),JClinInvest;103:779-788.[ZhuhdiAlimamM，PiazzaFM，SeibyDM等人(2000)]Muc_5/5ac黏蛋白信使RNA和蛋白質表達是鼠氣道中杯形細胞組織轉化的標志(Muc-5/5acMucinmessengerRNAandProteinExpressionisaMarkerofGobletCellMetaplasiaInMurineAirways),AmJRespCellMolBiol;22:253-260。Almeida和Allshire(2005)，TRENDSCellBiol.，15:251-258。Waterhouse等人(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:13959-13964。Smith等人(2000)，Nature,407:319-320。Pasquinelli等人(2005)，Curr.Opin.Genet.Develop.，15:200-205。Millar禾口Waterhouse(2005)，F皿ct.Integr.Genomics,5:129—135。權利要求調節NRG1與相關受體(如ERB2/ERB3異二聚體)之間的相互作用以抑制杯形細胞增生的NRG1調節物。2.權利要求1所述的調節物，其中所述NRG1是NRG1a或者是NRG1P家族的成員。3.權利要求2所述的調節物，其中所述NRG113是NRG1P1。4.權利要求1至3所述的調節物，其中所述NRG1是NRG1的膜結合形式和/或可溶性形式。5.任一前述權利要求所述的調節物，其中所述調節物是低分子量化學實體。6.權利要求1至4中任意一項所述的調節物，其中所述調節物是抗體。7.權利要求6所述的調節物，其中所述抗體是單克隆抗體。8.權利要求7所述的調節物，其中所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。9.權利要求5至8中任意一項所述的抗體，其中所述抗體與權利要求1至4中任意一項所述的NRG1結合并調節(如抑制)NRG1與其一個或多個相關受體(如ERB2和/或ERb3)，尤其是ERB2/ERB3異二聚體之間的相互作用。10.權利要求9所述的抗體，其中(與NRG1a比較)所述抗體優先地與NRG1P1結合。11.權利要求9或10所述的抗體，其中(與NRG1a比較)所述抗體特異地與NRG1P1妙A￡口口。12.權利要求5至11中任意一項所述的抗體，其中所述抗體包含IgGl或IgG4的人恒定區。13.任一前述權利要求所述的調節物用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療特征為異常黏液產生的(尤其是人)疾病或病癥。14.權利要求13所述的用途，其中所述疾病或病癥是呼吸疾病或病癥。15.權利要求14所述的用途，其中所述疾病或病癥是C0PD、囊性纖維化(CF)、慢性支氣管炎、哮喘。16.權利要求13至15中任意一項所述的用途，其中所述疾病或病癥是人的疾病或病癥。17.權利要求1至12中任意一項所述的調節物用于生產藥物的用途，所述藥物用于預防(或放緩發病和/或改善癥狀)特征為異常黏液產生的疾病如COPD、CF、慢性支氣管炎、哮喘。18.治療患有特征為異常黏液產生的疾病或病癥如COPD、CF、慢性支氣管炎、哮喘的人患者的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治療有效量的權利要求1至12中任意一項所述的調節物。19.用于鑒定權利要求1至4中任意一項所述的調節物的方法，其中所述方法包括(a)提供候選調節物；(b)將所述調節物與權利要求1至3中任意一項所述的NRG1接觸；(c)確定所述候選調節物是否調節(如抑制)權利要求1至3中任意一項所述的NRG1與其相關受體(如ERB2和/或ERB3)之間的相互作用，例如與不存在所述候選調節物時的杯形細胞增生比較，確定所述候選調節物是否抑制杯形細胞增生。20.藥物組合物，其包含權利要求1至12中任意一項所述的調節物和可藥用載體。21.治療患有特征為異常黏液產生的呼吸疾病或病癥(如COPD、CF、慢性支氣管炎)的人患者的方法，其中所述方法包括共施用與人NRG1結合、尤其是與人NRG113l結合，并抑制NRG1(如NRG1131)與ERB2/ERB3異二聚體之間的相互作用的抑制物(例如治療性蛋白質，如人抗體或人源化抗體)和抑制人IL-13與其相關人受體之間相互作用的抗人IL-13劑(例如IL-13抗體，尤其是人IL-13抗體或人源化IL-13抗體)和/或抑制人IL-45與其人IL-4受體之間相互作用的抗人IL-4劑(例如IL-4抗體，尤其是人IL-4抗體或人源化IL-4抗體)和/或抑制人IL-5與其相關受體之間相互作用的抗人IL-5劑(例如IL-5抗體，尤其是人IL-5抗體或人源化IL-5抗體)和/或抑制人IgE與其相關受體之間相互作用的抗IgE劑(例如人抗IgE抗體或人源化抗IgE抗體)。22.權利要求21所述的方法，其中所述抗人NRG1131抗體與抗人IL-13抗體共施用。23.權利要求21或22所述的方法，其中所述抗人NRG1P1抗體與抗人IL_4抗體共施用。24.權利要求21或22或23所述的方法，其中所述抗人NRG1P1抗體與抗人IL_5抗體共施用。25.權利要求21或22或23或24所述的方法，其中所述抗人NRG1P1抗體與抗人IgE抗體共施用。26.藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1至12中任意一項所述的調節物和可藥用載體，用于治療C0PD、CF、哮喘(尤其是其中度形式和重度形式)、慢性支氣管炎、下呼吸道疾病如呼吸性感染、肺氣腫、肺炎。全文摘要本發明涉及神經調節蛋白(NRG)家族的調節物，特別地涉及NRG1的調節物和更特別地涉及NRG1β的調節物，以及最特別地涉及NRG1β1的調節物。本發明也涉及此類調節物抑制杯形細胞增生的用途，并因此也涉及此類調節物在治療或預防特征為病理學黏液產生的人疾病和病癥如COPD、CF、慢性支氣管炎和哮喘中的用途。文檔編號A61K38/18GK101784302SQ200880104292公開日2010年7月21日申請日期2008年8月22日優先權日2007年8月24日發明者A·杰克遜,C·E·瓊斯申請人:諾瓦提斯公司