專利名稱：：包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及改良的肺炎鏈球菌疫苗。
背景技術：
：2歲以下的兒童不能形成對大多數多糖疫苗的免疫應答，因此需要通過與蛋白載體化學綴合使多糖具有免疫原性。將多糖(T非依賴性抗原)與蛋白(T依賴性抗原)偶聯，使該多糖具有包括同種型轉換、親和成熟和記憶誘導的T依賴性特性。然而，在重復施用多糖_蛋白綴合物或多糖_蛋白綴合物的組合以形成多價疫苗時可能存在問題。例如，已報道了使用破傷風類毒素(TT)作為蛋白載體的流感嗜血桿菌b型多糖(PRP)疫苗在劑量范圍內進行測試，其根據標準嬰兒方案同時以(游離)TT和肺炎球菌多糖-TT綴合物疫苗進行免疫。隨著肺炎球菌疫苗的劑量上升，對Hib綴合物疫苗的PRP多糖部分的免疫應答下降，提示多糖的免疫干擾，這可能是由于相同載體蛋白的使用(Dagan等人，Infectl匪n.(1998);巡2093-2098)。載體蛋白劑量對于針對蛋白本身的體液應答的效應也被證明具有多面性。據報道，在人類嬰兒體內四價破傷風類毒素綴合物劑量的上升導致對破傷風載體的應答的下降(Dagan等人，見上文)。對組合疫苗這些效應的經典分析已被描述為載體誘導的表位抑制，這尚未被完全理解，但被認為是載體蛋白的過量所導致(Fattom，VaccineU:126(1999))。這表現為導致針對載體蛋白的B-細胞和針對多糖的B-細胞對Th-細胞的競爭。如果針對載體蛋白的B-細胞占優，則沒有足夠的Th-細胞可對特異性針對多糖的B-細胞提供必要的幫助。然而，觀察到的免疫效應并不一致，在某些情況下載體蛋白的總量提高了免疫應答，在其它情況下則減少了免疫應答。因此，將多個多糖綴合物組合為單個、有效的疫苗制劑存在著技術難題。肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性細菌，其造成了相當大的致病率和死亡率(特別是在青年和老年人中)，引起了侵襲性疾病如肺炎、菌血癥和腦膜炎，以及與移生有關的疾病，如急性中耳炎。據估計在美國60歲以上人群中肺炎球菌肺炎的發病率為每100，000人中3至8人。在20%的情況下其導致了菌血癥，以及其它表現如腦膜炎，即使接受抗菌治療，其死亡率仍然接近30%。肺炎球菌被化學連接的多糖包封，該多糖帶來了血清型特異性。肺炎球菌具有90種已知的血清型，而莢膜是肺炎球菌主要的毒性決定因子，因為莢膜不僅針對補體保護該細菌的內部表面，其本身免疫原性也較差。多糖是T-非依賴性抗原，且不能在MHC分子上加工或呈現以與T-細胞相互作用。然而，它們可以通過替代性的機制剌激免疫系統，該機制包括B細胞上表面受體的交聯。在多個實驗中顯示，針對侵襲性肺炎雙球菌疾病的保護很大程度上與特異性針對該莢膜的抗體相關，所述保護具有血清型特異性。肺炎鏈球菌是嬰兒和幼兒的侵襲性細菌性疾病和中耳炎最常見的誘因。同樣地，老年人對肺炎球菌疫苗具有較差的應答[Roghmann等人，(1987)，J.Gerontol.42:9265-270]，因此增加了在該人群中細菌性肺炎的發病率[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。因此，本發明的一個目標在于開發一種改良的多重血清型肺炎鏈球菌多糖綴合物疫苗的制劑。附圖簡述圖1在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后的抗-PSIgG水平)柱形圖顯示了在老年恒河猴中11價綴合物的免疫原性。淺色條棒表示用在磷酸鋁佐劑中的11價綴合物兩次接種后的GMC。深色條棒表示用在佐劑C中的11價綴合物兩次接種后的GMC。圖2在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后抗-PS3記憶B細胞頻率)柱形圖顯示了在用佐劑C或磷酸鋁佐劑中的11價綴合物接種后針對PS3的記憶B細胞。圖3在Balb/c小鼠中PS19F的免疫原性(III期后IgG水平)柱形圖顯示了4價純多糖和4價dPly綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖19F免疫原性。圖4在Balb/c小鼠中PS22F的免疫原性(III期后IgG水平)柱形圖顯示了4價純多糖和4價PhtD綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖22F免疫原性。圖5血清抗-PSIgG抗體水平柱形圖顯示了在Balb/c小鼠中的抗-22FIgG應答。圖6在Balb/c小鼠中的抗_22F調理-吞噬效價柱形圖顯示了在Balb/c小鼠中的抗_22F調理-吞噬效價。圖7在幼年C57BI小鼠III期后以新型佐劑或A1P04免疫誘導的IgG應答的比較柱形圖比較了在幼年C57B1小鼠中以與不同佐劑制成的13價綴合物疫苗免疫后的IgG應答。所述柱與右側欄所示的順序相同。圖8PhtD和dPly蛋白組合在恒河猴中針對19F型肺部移生的保護效力柱形圖顯示不同疫苗組合在猴肺炎模型中的保護效力。"死亡"組包括將死亡但施用了抗生素處理的猴。圖9血清抗-PhtDIgG應答柱形圖顯示在Balb/c小鼠中以22F_PhtD或22F_AH_PhtD綴合物免疫后的抗PhtDIgG應答。圖10在小鼠中針對4型肺炎球菌攻擊的保護在小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后針對4型肺炎球菌攻擊的保護。圖11在以PhtD免疫和以針對血清型3多糖的抗體被動免疫后針對肺炎鏈球菌菌株3/43的致命攻擊的保護。圖12在以PhtD免疫和以針對血清型1多糖的抗體被動免疫后針對肺炎鏈球菌菌株l/57的致命攻擊的保護。圖13在以多價綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。圖14在以多價綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。圖15在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。柱2_llV+19A_dPlygmbs+22F_PhtD0.1iig/50ii1;柱4_llV+19A_dPlygmbs+22F-PhtD-E0.1iig/50ii1;柱62-11V+19A-DT+22F-PD0.1iig/50ii1圖16在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。圖17在以多價綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。圖18在以多價綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。圖19在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。圖20在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。圖21在以多價綴合物疫苗免疫的0F1小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。圖22在以多價綴合物疫苗免疫的0F1小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。發明詳述本發明提供了包含來自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，其中19A與作為第一細菌類毒素的載體蛋白綴合，19F與作為第二細菌類毒素的載體蛋白綴合，且該肺炎鏈球菌莢膜糖中的2-8種與蛋白D綴合。術語莢膜糖包括莢膜多糖和由莢膜多糖衍生的寡糖。寡糖包含至少4個糖殘基。術語綴合物和綴合的涉及與載體蛋白共價結合的莢膜糖。針對本發明的目的，"免疫人類宿主抗C0PD的惡化"或"治療或預防COPD的惡化"或"減少COPD的惡化的嚴重性"指降低COPD的惡化的發生率或比例(例如減少0.1、0.5、1、2、5、10、20%或更多的比例)，例如在以本發明的組合物或疫苗免疫的患者組中。術語細菌類毒素包括通過遺傳突變、通過化學處理或通過綴合失活的細菌毒素。合適的細菌類毒素包括破傷風類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、細菌溶細胞素或肺炎球菌溶血素。肺炎球菌溶血素(Ply)的突變已被描述減弱了肺炎球菌溶血素的毒性(W090/06951，WO99/03884)。類似地，已知降低毒性的白喉毒素遺傳突變(參見下文)。白喉毒素的遺傳解毒類似物包括CRM197和在US4，709，017、US5，843，711、US5,601,827和US5，917，017中描述的其它突變體。CRM197是白喉毒素的非毒性形式，但與白喉毒素在免疫學上無法區分。CRM197可由通過產毒素的棒狀桿菌噬菌體b的亞硝基胍突變生成的無產毒相P197tox感染的白喉桿菌生成(Uchida等人.NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量，但因在結構基因中具有單個堿基變化而與之不同。這導致在52號位上由甘氨酸轉變為谷氨酰胺的變化，使得片段A不能結合膽，從而不具毒性(Pappenheimer1977，AnnRev，Biochem.46;69_94，RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560_564)。第一和第二細菌類毒素可相同或不同。當第一和第二細菌類毒素不同時，意味著它們具有不同的氨基酸序列。11例如，19A和19F可被分別綴合至破傷風類毒素和破傷風類毒素；白喉類毒素和白喉類毒素；Crml97和CRM197、肺炎球菌溶血素和肺炎球菌溶血素、破傷風類毒素和白喉類毒素；破傷風類毒素和CRM197;破傷風類毒素和肺炎球菌溶血素；白喉類毒素和破傷風類毒素；白喉類毒素和CRM197、白喉類毒素和肺炎球菌溶血素；CRM197和破傷風類毒素、CRM197和白喉類毒素；CRM197和肺炎球菌溶血素；肺炎球菌溶血素和破傷風類毒素；肺炎球菌溶血素和白喉類毒素；或肺炎球菌溶血素和CRM197。本發明的免疫原性組合物包含2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8種莢膜糖綴合物，其中蛋白D為載體蛋白。例如，來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F或23F的糖被綴合至蛋白D。例如，選自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8種糖被綴合至蛋白D。在一個實施方式中，來自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、1禾口9V、1禾口14、1禾口22F、1禾口23F、3禾口4、3禾口5、3禾口6A、3禾口6B、3禾口7F、3禾口9V、3禾口14、3和22F、3和23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和22F、4和23F、5和6A、5禾口6B、5禾口7F、5禾口9V、5禾口14、5禾口22F、5禾口23F、6A禾口6B、6A禾口7F、6A禾口9V、6A禾口14、6A禾口22F、6A禾口23F、6B禾口7F、6B禾口9V、6B禾口14、6B禾口22F、6B禾口23F、7F禾口9V、7F禾口14、7F禾口22F、7F和23F、9V和14、9V和22F、9V和23F、14和22F、14和23F或者22F和23F的糖被綴合至蛋白D。在一個實施方式中，來自至少血清型1、3和4;1、3和5;1、3和6A;1、3和6B;1、3禾口7F;1、3禾口9V;1、3禾口14;3、4禾口7F;3、4禾口5;3、4禾口7F;3、4禾口9V;3、4禾口14;4、5禾口7F;4、5禾P9V;4、5禾P14;5、7F禾P9V;5、7F禾P14;7F、9V禾P14;1、3、4禾P5;3、4、5禾P7F;4、5、7F和9V;4、5、7F和14;4、5、9V和14;4、7F、9V和14;5、7F、9V和14;或者4、5、7F、9V和14的糖被綴合至蛋白D。在一個實施方式中，在本發明的免疫原性組合物中存在的莢膜糖綴合物中的一半或少于一半或少數包含作為載體蛋白的蛋白D。例如，在10價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如，在ll價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如，在12價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如，在13價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如，在14價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例如，在15價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例如，在16價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8種與蛋白D綴合。例如，在17價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8種與蛋白D綴合。例如，在18價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9種與蛋白D綴合。例如，在19價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7、8或9種與蛋白D綴合。可選地，與蛋白D綴合的血清型選自上述的組。在一個實施方式中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物進一步包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。在一個實施方式中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物12進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F的綴合物。在一個實施方式中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。在一個實施方式中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。在一個實施方式中，除了19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。本發明的肺炎鏈球菌疫苗通常將包含莢膜糖抗原(可選地綴合)，其中所述糖來自至少十種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數量范圍可從10種不同血清型(或"v"，價)至23種不同血清型(23v)。在一個實施方式中，具有10、11U2、13、14或15種不同血清型。在本發明另一實施方式中，該疫苗可包含綴合的肺炎鏈球菌糖和未綴合的肺炎鏈球菌糖。任選地，糖血清型的總數少于或等于23。例如，本發明可包含IO種綴合血清型和13種未綴合糖。該疫苗可以類似的方式包含11、12、13、14或16種綴合糖和分別12、11、10、9或7種未綴合糖。在一個實施方式中，本發明的多價肺炎球菌疫苗將選自如下血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，盡管可以理解，根據接受該疫苗的接受者的年齡以及該疫苗將施用的地理位置，一種或兩種其它血清型可被取代。例如，10價疫苗可包含來自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11價疫苗還可包含來自血清型3或19A的糖。12或13價兒童(嬰兒)疫苗還可包括添加了血清型6A和19A，或者6A禾口22F，或者19A和22F，或者6A和15，或者19A和15，或者22F和15的11價制劑(包含來自血清型3的糖)，而13價老年疫苗可包括添加了血清型19A和22F、8和12F，或者8和15，或者8和19A，或者8和22F，或者12F和15，或者12F和19A，或者12F和22F，或者15和19A，或者15和22F的10或11價制劑。14價兒童疫苗可包括添加了血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15、19A和22F;血清型3、8、19A和22F;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或者血清型3、6A、15和22F的上述IO價制劑。在一個實施方式中該組合物包含來自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(任選地綴合)的莢膜糖。在本發明進一步的實施方式中包括至少ll種糖抗原(任選地綴合)，例如，來自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發明進一步的實施方式中包括至少12或13種糖抗原，例如，疫苗可包含來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜糖或者來自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖，盡管本發明還可預期其它的糖抗原，例如23價(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。本發明的免疫原性組合物包含來自流感嗜血桿菌的蛋白D(PD)(參見EP0594610圖9)。流感嗜血桿菌是中耳炎的關鍵引發微生物，本發明人已顯示在肺炎鏈球菌疫苗中包含該蛋白將提供針對與中耳炎相關的流感嗜血桿菌的保護水平(Pyrmula等人Lancet367;740-748(2006))。一方面，PD作為一種或多種糖的載體蛋白存在。在另一方面，蛋白D可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。在進一步方面，蛋白D同時作為載體蛋白和作為游13離蛋白存在。蛋白D可以全長蛋白或片段使用(W00056360)。在其它方面，蛋白D作為多數糖的載體蛋白存在，例如糖中的6、7、8、9或更多種可與蛋白D綴合。在該方面，蛋白D還可作為游離蛋白存在。本發明的疫苗將包含兩種或兩種以上不同類型的載體蛋白。每種類型的載體蛋白可作為一種以上糖的載體，該糖可以相同或不同。例如，血清型3和4可被綴合至相同的載體蛋白，綴合至載體蛋白的相同分子或相同載體蛋白的不同分子。在一個實施方式中，兩種或兩種以上不同的糖可被綴合至相同的載體蛋白，綴合至載體蛋白的相同分子或相同載體蛋白的不同分子。在本發明的免疫原性組合物中存在的除了19A和19F以外的任意肺炎鏈球菌莢膜糖可被綴合至載體蛋白，所述載體蛋白獨立選自TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtBE或PhtDE融合體(特別是W001/98334和W003/54007中描述的那些)、解毒肺炎鏈球菌溶血素和蛋白D。下文顯示了可用于本發明綴合物的蛋白載體的更完整清單。綴合至本發明的免疫原性組合物中存在的綴合物中的一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖的載體蛋白任選地是聚組氨酸三聯體家族(Pht)蛋白成員，其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可與W000/37105或W000/39299中披露的序列(例如，與W000/37105中PhtD的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)具有80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%—致性。例如，融合蛋白由全長PhtA、PhtB、PhtD、PhtE或其2、3或4個片段組成。融合蛋白的范例為PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中該蛋白與首先提及的蛋白在N末端連接(例如參見W001/98334)。在使用Pht蛋白片段時(單獨或作為融合蛋白的部分)，每個片段可選地包含該種多肽的一個或多個組氨酸三聯體基序和/或巻曲螺旋區。組氨酸三聯體基序是多肽的部分，其具有序列HxxHxH，其中H為組氨酸，x為非組氨酸的氨基酸。巻曲螺旋區是通過"巻曲"算法預測的區域Lupus，A等人(1991)Science252;1162-1164。在一個實施方式中，該片段或每個片段包含一個或多個組氨酸三聯體基序和至少一個巻曲螺旋區。在一個實施方式中，該片段或每個片段包含恰好或至少2、3、4或5個組氨酸三聯體基序(任選地，具有介于2或2個以上三聯體的天然Pht序列，或者與天然肺炎球菌內三聯體Pht序列具有超過50、60、70、80、90或100%—致性的內三聯體序列-例如，W000/37105中PhtD的SEQIDNO:4中所示的內三聯體序列)。在一個實施方式中，該片段或每個片段包含恰好或至少2、3或4個巻曲螺旋區。在一個實施方式中，此處披露的Pht蛋白包含連接信號序列的全長蛋白，去除信號肽(例如在N末端的20個氨基酸)的成熟全長蛋白，Pht蛋白的天然存在變體以及Pht蛋白的免疫原性片段(例如，如上所述的片段或者包含來自W000/37105(SEQIDNOs4，6，8或10)或WOOO/39299(SEQIDNOs2，4，6，8，10或14)的氨基酸序列的至少15或20個連續氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠引發特異性針對W000/37105或WOOO/39299所述氨基酸序列的免疫應答)。具體而言，此處所用的"PhtD"包含連接信號序列的全長蛋白，去除信號肽(例如在N末端的20個氨基酸)的成熟全長蛋白，PhtD的天然存在變體以及PhtD的免疫原性片段(例如，如上所述的片段或者包含來自W000/37105或WOOO/39299的PhtD氨基酸序列的至少15或20個連續氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠引發特異性針對W000/37105或WOOO/39299所述PhtD氨基酸序列(例如，針對PhtD的WO00/37105的SEQIDNO:4或WO00/39299的SEQIDNO:14)的免疫應答)。上述PhtD的所有形式均可用于本發明。如果該組合物中蛋白載體有2種或2種以上的糖相同，該糖可被綴合至該蛋白載體的相同分子(載體分子具有另外2種與之綴合的不同的糖)[例如參見W004/083251]。替代性地，該糖可各自獨立地綴合至該蛋白載體的不同分子(每個蛋白載體分子僅具有一種類型的糖與之綴合)。可用于本發明的載體蛋白的范例為DT(白喉類毒素)，TT(破傷風類毒素)或TT的片段C，DTCRM197(—種DT突變體)，其它DT點突變體如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等人J.Biol.Chem.218;3838-3844，1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及Nicholls禾口Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel，MaecelDekkerInc，1992中所述的其它突變體；Glu-148缺失或突變為Asp、Gin或Ser和/或Ala158刪除或突變為Gly以及US4709017或US4950740中披露的其它突變；在至少一個或多個殘基Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534的突變以及US5917017或US6455673中披露的其它突變；或者US5843711中披露的片段，肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995)InfectImmun63;2706-13)，其包括以某些方式解毒的ply例如dPLY-GMBS(WO04081515，PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol，PhtX，其包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白融合體如PhtDE融合體、PhtBE融合體(WO01/98334和WO03/54007)，(PhtA_E在下文更加具體描述)，OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白_通常由腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501)，PorB(來自腦膜炎奈瑟氏球菌)、PD(流感嗜血桿菌蛋白D_參見，例如EP0594610B)，或其免疫學功能等同物，合成肽(EP0378881，EP0427347)，熱休克蛋白(WO93/17712，WO94/03208)，百日咳蛋白(WO98/58668，EP0471177)，細胞因子，淋巴因子，生長因子或激素(WO91/01146)，包含多個來自不同病原體衍生抗原的人CD4+T細胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)InfectImmun72;4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)，鐵攝取蛋白(WO01/72337)，艱難梭菌的毒素A或B(WO00/61761)。Nurkka等人PediatricInfectiousDiseaseJournal.23(11):1008—14，2004Nov描述了所有血清型綴合至PD的11價肺炎球菌疫苗。然而本發明人顯示與綴合至PD的19F相比，具有與DT綴合的19F綴合物誘導的抗體的調理吞噬活性更高。此外，本發明人顯示與DT綴合的19F具有對19A更大的交叉反應。因此，本發明的組合物的一個特征是血清型19F被綴合至細菌類毒素，例如，TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。一方面，血清型19F被綴合至DT。本發明的另一特征是血清型19A被綴合至細菌類毒素，例如，TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197。該免疫原性組合物剩余的糖血清型可全部綴合至一種或多種非DT載體蛋白(即，僅19F綴合至DT)，或者可部分綴合至非DT載體蛋白，部分DT綴合至DT。在一個實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，剩余的血清型分別綴合至PD，以及TT或DT或CRM197。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，且不超過一種糖綴合至TT。在該實施方式的一個方面，所述的一種糖為18C或12F。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，且不超過兩種糖綴合至TT。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，剩余的血清型分別綴合至PD，TT和DT或CRM197。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，剩余的血清型分別綴合至PD，TT和肺炎球菌溶血素。在進一步的實施方式中，19F15綴合至DT或CRM197，剩余的血清型分別綴合至PD，TT和CRM197。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，剩余的血清型分別綴合至PD，TT，肺炎球菌溶血素和任選地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197,19A綴合至肺炎球菌溶血素或TT，剩余的血清型分別綴合至PD，TT，肺炎球菌溶血素和任選地PhtD或PhtD/E融合蛋白。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197，19A綴合至肺炎球菌溶血素或TT，一種其它的糖綴合至TT，一種其它的糖綴合至PhtD或PhtD/E，且所有其它的糖綴合至PD。在進一步的實施方式中，19F綴合至DT或CRM197,19A綴合至肺炎球菌溶血素，一種其它的糖綴合至TT，一種其它的糖綴合至肺炎球菌溶血素，2種其它的糖綴合至PhtD或PhtD/E，且所有其它的糖綴合至PD。在整個說明書中術語"糖"可指多糖或寡糖，并同時包括兩者。多糖可從細菌分離并可通過已知的方法(例如參見EP497524和EP497525)和可選地通過微射流(microfluidisation)進行一定程度的大小處理。可對多糖進行大小處理(sized)以減少多糖樣本的粘度和/或提高綴合產物的可濾過性。寡糖具有少量的重復單元(通常5-30重復單元)，并通常為水解的多糖。肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含重復的寡糖單元，該寡糖單元可包含多達8個糖殘基。關鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元可參見綜述JONES，Christopher.Vaccinesbasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria.An.Acad.Bras.Ci紐c.，2005年6月，第77巻，第2期，第293-324頁.表IIISSN0001-3765。在一個實施方式中，莢膜糖抗原可以是全長多糖，然而在其它實施方式中，它可以是一個寡糖單元或短于天然長度的重復寡糖單元的糖鏈。在一個實施方式中，在疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長多糖可被"大小處理(sized)"，即，它們的大小可通過各種方法減小，所述方法例如酸水解處理、過氧化氫處理、通過emulsiflex⑧大小處理后以過氧化氫處理以生成寡糖片段或者微射流。本發明人還注意到本領域曾關注采用寡糖以便于綴合物生成。本發明人已發現通過采用天然或略微進行大小處理的多糖綴合物，可實現以下一種或多種優點1)具有高免疫原性的可濾過綴合物，2)可改變多糖與蛋白在綴合物中的比例，使得在綴合物中多糖與蛋白的比例(w/V)增加(這可對載體抑制作用具有影響)，3)可通過使用更大的糖進行綴合來穩定易于水解的免疫原性綴合物。更大的多糖的使用可導致與綴合物載體的更多交聯，并可減少游離糖從綴合物的釋放。在現有技術中描述的綴合物疫苗傾向于在綴合前將多糖解聚以改善綴合。本發明人已發現保留更大大小的糖的糖綴合物疫苗可提供針對肺炎球菌疾病的良好免疫應答。本發明的免疫原性組合物因而可包含一種或多種糖綴合物，其中在綴合前每種糖的平均大小(重均分子量;Mw)在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一個實施方式中，該綴合后的綴合物應當易于通過0.2微米過濾器，從而與過濾前樣本相比，在過濾后可得到50、60、70、80、90或95%以上的產率。為了本發明的目的，"天然多糖"指未經過加工的糖，該加工過程在于減小該糖的大小。在常規純化步驟中多糖可能會被略微減小。這種糖仍然是天然的。僅當多糖采用了大小處理技術后，該多糖會被認為不是天然的。天然多糖的大小例如介于250kDa-2，000kDa、400-1，500kDa、750kDa-l，250kDa、300kDa-600kDa、500-1，000kDa或1，000-1，500kDa，如本領域技術人員將理解，不同的血清型具有不同大小的天然多糖。針對本發明的目的，"以最大x2的因子進行大小處理"表示該糖通過加工意圖減小糖的大小，但保留天然多糖一半以上的大小。x3、x4等可以相同方式解釋，S卩，該糖通過加工減小多糖的大小，但保留天然多糖三分之一、四分之一等以上的大小。在本發明的一個方面，該免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的來自至少10種血清型的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一種肺炎鏈球菌糖是天然多糖。在本發明的一個方面，該免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的來自至少10種血清型的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或每一種肺炎鏈球菌糖以最多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子進行大小處理。在該方面的一個實施方式中，大部分糖(例如，6、7、8或更多種糖)以多達x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因子進行大小處理。本文的糖的分子量或平均分子量指在綴合前通過MALLS測量的糖的重均分子量(Mw)。MALLS技術已為本領域公知，并通常可按實施例2所述進行。為對肺炎球菌糖進行MALLS分析，可聯合使用兩根柱(TSKG6000和5000PWxl)并在水中洗脫糖。糖可采用光散射檢測器(例如配置10mW氬激光器的WyattDawnDSP以488nm)和干涉折射儀(例如裝備P100池和紅色濾光器的Wyatt0tilabDSP以498nm)進行檢測。在一個實施方式中，該肺炎鏈球菌糖為天然的多糖或在常規提取過程中大小減小的天然多糖。在一個實施方式中，該肺炎鏈球菌糖通過機械切割進行大小處理，例如可通過微射流或超聲。微射流和超聲具有能夠減小更大的天然多糖的大小，從而足以提供可濾過綴合物的優勢。大小處理的因子不超過x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2。在一個實施方式中，該免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物，其由通過以不超過x20的因子進行大小處理的天然多糖和糖的混合物制成。在該實施方式的一個方面，大部分糖(例如，6、7、8或更多種糖)以多達x2、x3、x4、x5或x6的因子進行大小處理。在一個實施方式中，該肺炎鏈球菌糖通過接頭(例如，雙功能接頭)綴合至載體蛋白。該接頭可選地為異雙功能或同雙功能的，其具有例如一個反應性氨基基團和一個反應性羧酸基團，2個反應性氨基基團或兩個反應性羧酸基團。該接頭具有例如介于4和20、4和12、5和10個碳原子。一種可能的接頭是ADH。其它的接頭包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣烷基卣化物(US4057685)、糖苷鍵(US4673574，US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一個實施方式中，ADH被用作綴合來自血清型18C的糖的接頭。本發明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可通過任意已知的偶聯技術制備。該綴合方法可依賴于以l-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶(CDAP)活化糖形成氰酸酯。該活化的糖可由此直接地或通過間隔(接頭)基團偶聯至載體蛋白上的氨基基團。例如，該間隔基可以是胱胺或半胱胺以得到硫醇多糖，后者可通過與馬來酰亞胺活化的載體蛋白(例如采用GMBS)或者鹵代乙酰化載體蛋白(例如采用碘乙酰亞胺[例如，乙基碘乙酰亞胺HC1]或N-溴乙酸琥伯酰亞胺酯或SIAB，或SIA，或SBAP)反應后獲得的硫醚鍵偶聯至載體。任選地，該氰酸酯(任選地通過CDAP化學制備)與己二胺或ADH偶聯，且該氨基衍生的糖采用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學通過蛋白載體上的羧基基團被綴合至載體蛋白。該種綴合物描述于PCT公布申請UniformedServicesUniversity的WO93/15760以及WO95/08348和WO96/29094。其它合適的技術采用碳二亞胺、碳亞胺、肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多描述于W098/42721。綴合可涉及羰基接頭，其可通過糖的游離羥基基團與CDI反應(Bethell等人J.Biol.Chem.1979,254;2572-4，Hearn等人J.Chromatogr.1981.218;509-18)，然后與蛋白反應形成氨基甲酸酯鍵而形成。這可包括將還原為伯羥基基團的末端異構反應，任選地在伯羥基基團與CDI的反應中保護/脫保護該伯羥基基團以形成CDI氨基甲酸酯中間體，并將該CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白上的氨基基團綴合。該綴合物可通過US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)所述的直接還原胺化法制備得到。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0_477508。其它方法包括將溴化氰(或CDAP)活化的糖的己二酸雙肼(ADH)衍生物通過碳二亞胺縮合(例如采用EDAC)綴合至蛋白載體(ChuC.等人Infect.Immunity,1983245256)。在一個實施方式中，糖上的羥基基團(任選地活化羥基基團，例如[如采用CDAP]活化制備氰酸酯的羥基基團)被直接或間接(通過接頭)連接至蛋白上的氨基或羧基基團。當接頭存在時，糖上的羥基基團任選地連接至接頭上的氨基基團，例如，通過CDAP綴合連接。在接頭如ADH中的其它氨基基團可被綴合至蛋白上的羧酸基團，例如，可采用碳二亞胺化學，例如采用EDAC進行綴合。在一個實施方式中，該肺炎球菌莢膜糖在綴合至載體蛋白前先背綴合至接頭。替代性地，該接頭可在綴合至糖之前被綴合至載體。也可采用組合技術，其中部分糖_蛋白綴合物通過CDAP制備，部分通過還原胺化制備。總體而言，在蛋白載體上的以下類型的化學基團可用于綴合/結合A)羧基(例如通過天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實施方式中該基團被直接連接至糖上的氨基基團或通過碳二亞胺化學(例如通過EDAC)連接至接頭上的氨基基團。B)氨基基團(例如通過賴氨酸)。在一個實施方式中該基團被直接連接至糖上的羧基基團或通過碳二亞胺化學(例如通過EDAC)連接至接頭上的羧基基團。在另一實施方式中該基團直接連接至糖上以CDAP或CNBr活化的羥基基團或者連接至接頭上的該種基團；連接至具有醛基團的糖或接頭；連接至具有丁二酰亞胺酯基團的糖或接頭。C)硫氫基(例如通過半胱氨酸)。在一個實施方式中，該基團被連接至溴或氯乙酰化的糖或具有馬來酰亞胺化學的接頭。在一個實施方式中，該基團通過雙重氮聯苯胺活化/修飾。D)羥基基團(例如通過酪氨酸)。在一個實施方式中，該基團通過雙重氮聯苯胺活化/修飾。E)咪唑基基團(例如通過組氨酸)。在一個實施方式中，該基團通過雙重氮聯苯胺活化/修飾。F)胍基基團(例如通過精氨酸)。[OWO]G)吲哚基基團(例如通過色氨酸)。18在一個實施方式中，肺炎鏈球菌莢膜糖中至少一種與載體蛋白直接綴合。任選地，肺炎鏈球菌莢膜糖中至少一種通過CDAP直接綴合。在一個實施方式中，莢膜糖中的大部分例如5、6、7、8、9或更多種通過CDAP直接連接至該載體蛋白(參見W095/08348和W096/29094)。該免疫原性組合物可包含肺炎鏈球菌蛋白，此處稱為本發明的肺炎鏈球菌蛋白。該種蛋白可用作載體蛋白，或者可作為游離蛋白存在，或者可同時作為載體蛋白和游離蛋白存在。本發明的肺炎鏈球菌蛋白可至少在肺炎球菌生命周期的一部分中暴露在表面，或者可作為由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。任選地，本發明的蛋白選自如下類別，例如具有LXXCII型信號序列基序的蛋白(其中X為任意氨基酸，例如，聚組氨酸三聯體家族(PhtX))，膽堿結合蛋白，具有I型信號序列基序的蛋白(如，Spl01)，具有LPXTG基序的蛋白(其中X為任意氨基酸，例如，Spl28，Spl30)，以及毒素(例如，Ply)。這些類別(或基序)中的范例為如下蛋白，或者其免疫學功能等同物。在一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含至少l種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。在進一步的實施方式中，該免疫原性組合物包含2種或多種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Spl28。在進一步的實施方式中，該免疫原性組合物包含2種或多種選自如下組合的蛋白聚組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Spl28。該Pht(聚組氨酸三聯體)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族的特征在于脂酶序列、被富脯氨酸區分離的兩個結構域和多個組氨酸三聯體，可能涉及金屬或核苷結合或酶催化活性、(3-5)巻曲螺旋區、保守N末端和異種C末端。它存在于所有測試的肺炎雙球菌菌株中。在鏈球菌和奈瑟菌中也曾發現了同源蛋白。在本發明的一個實施方式中，本發明的Pht蛋白為PhtD。然而，可以理解，術語PhtA、B、D和E指具有下文引用文獻中披露的序列的蛋白以及與該參考蛋白具有至少90%—致性的序列同源性的天然存在(和人工)變體。任選地，具有至少95%—致性或至少97%—致性。對于PhtX蛋白，PhtA披露于WO98/18930，也被稱為Sp36。如上文指出，它是一種來自聚組氨酸三聯體家族的蛋白，并具有LXXC的II型信號基序。PhtD披露于WO00/37105，也被稱為Sp036D。如上文指出，它也是一種來自聚組氨酸三聯體家族的蛋白，并具有II型LXXC信號基序。PhtB披露于WO00/37105，也被稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員為C3-降解多肽，披露于W000/17370。該蛋白也來自于聚組氨酸三聯體家族，并具有II型LXXC信號基序。例如，一種免疫原性功能等同物是披露于WO98/18930的蛋白Sp42。一種截短PhtB(約79kD)披露于W099/15675,也被認為是PhtX家族的一元。PhtE披露于WOOO/30299并被稱為BVH-3。此處提及Pht蛋白時表示可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如，提及PhtX時包括任意Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。提及PhtD時也表示提及在例如W00198334中發現的PhtDE或PhtBE融合體。肺炎球菌溶血素是一種多功能毒素，其具有明顯的細胞溶解性(溶血性)和補體激活活性(Rubins等人，Am.Respi.CitCareMed，153:1339-1346(1996))。該毒素不由肺炎雙球菌分泌，但在自溶素影響下在肺炎雙球菌溶解時釋放。它的影響包括，例如，剌激人單核細胞生成炎癥性細胞因子，抑制纖毛對人呼吸道上皮的拍打，以及減少細菌活性和嗜中性白血球遷移。肺炎球菌溶血素最明顯的影響是在紅血細胞的溶解，其涉及與膽固醇結合。由于它是一種毒素，它需要在體內施用前被解毒(在適于保護的劑量下提供時對人體無毒)。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表達和克隆已為本領域所知。例如，參見Walker等人(InfectI匪n，55:1184-1189(1987))、Mitchel1等人(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等人(NAR，18:4010(1990))。ply的解毒可通過化學手段實現，例如，進行甲醛或戊二醛處理或兩者的組合(W004081515，PCT/EP2005/010258)。該種方法在本領域中公知由于各種毒素。替代性地，ply可遺傳解毒。因此，本發明包括可以是例如突變蛋白的肺炎球菌蛋白衍生物。此處所用的術語"突變的"表示采用公知的定點突變技術或其它常規方法進行了一個或多個氨基酸的刪除、添加或替換的分子。例如，如上所述，突變體ply蛋白可被改變為生物失活，同時保持其免疫原性表位，例如參見W090/06951,Berry等人(InfectI匪n，67:981-985(1999))和W099/03884。此處所用的術語"Ply"應理解為適于醫學用途的突變或解毒肺炎球菌溶血素(即，無毒的)。對于膽堿結合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被鑒定為可通過膽堿親合層析純化的肺炎球菌蛋白。所有的膽堿結合蛋白為非共價結合至細胞壁磷壁酸和膜關聯脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。這整個家族在結構上具有多個共同區域，盡管這些蛋白的確切性質(氨基酸序列、長度等)可能不同。總體而言，膽堿結合蛋白包含N末端區(N)、保守重復區(Rl和/或R2)、脯氨酸富集區(P)和保守膽堿結合區(C)，由多個重復單元組成，構成了該蛋白的約一半。本申請中所用的術語"膽堿結合蛋白家族(CbpX)"選自在W097/41151中鑒定的膽堿結合蛋白PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA披露于W097/41151。CbpD和CbpG披露于W000/29434。PspC披露于W097/09994。PbcA披露于W098/21337。SpsA是一種披露于W098/39450的膽堿結合蛋白。任選地膽堿結合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。本發明的一個實施方式包括截短CbpX，其中"CbpX"如上定義，而"截短"指CbpX蛋白缺失了50%或更多的膽堿結合區(C)。任選地，該種蛋白缺失了整個膽堿結合區。任選地，該種截短蛋白缺失了(i)膽堿結合區和(ii)N末端一部分以及該蛋白的一半，并保留了至少一個重復區(Rl或R2)。任選地，該截短物具有2個重復區(Rl或R2)。該種實施方式的范例為W099/51266或W099/51188中所示的NRlxR2和RlxR2，然而，缺失了類似膽堿結合區的其它膽堿結合蛋白通常在本發明的范圍之內。LytX家族是與細胞溶解相關的膜相關蛋白。N末端結構與包含膽堿結合結構域，然而，LytX家族并不具有上述指出的CbpA家族中發現的所有特征，因此對于本發明，LytX家族被認為不同于CbpX家族。與CbpX家族相反，C末端結構域包含LytX蛋白家族的催化結構域。該家族包括了LytA、B和C。對于LytX家族，LytA披露于Ronda等人，EurJBiochem，164:621-624(1987)。LytB披露于WO98/18930，也被稱為Sp46。LytC也披露于W098/18930，也被稱為Sp9。本發明的一個實施方式包括LytC。另一實施方式包括截短LytX，其中"LytX"如上定義，而"截短"指缺失了膽堿結合區50X或更多的LytX蛋白。任選地，該種蛋白缺失了整個膽堿結合區。本發明的另一實施方式包括了截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白(或融合體)。任選地，其包含了CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm，S卩，缺失了膽堿結合結構域)(例如，LytCCterm或Sp91Cterm)。任選地，CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任選地，它是CbpA。任選地，LytX是LytC(也稱為Sp91)。本發明的另一實施方式是缺失了膽堿結合結構域(C)并作為具有LytX的融合蛋白表達截短的PspA或PsaA。任選地，LytX為LytC。PsaA和PspA均為本領域所知。例如，PsaA及其跨膜刪除變體已被Berry&Paton，InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62描述。PspA及其跨膜刪除變體已被例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940所披露。Spl28和Spl30披露于W000/76540。Spl25是具有LPXTG細胞壁錨定基序的肺炎球菌表面蛋白的范例(其中X為任意氨基酸)。在具有該基序的該類肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白已被發現可用于本發明的背景中，因此被認為本發明的其它蛋白。Spl25本身披露于WO98/18930，并被稱為ZmpB-—種鋅金屬蛋白酶。SplOl披露于WO98/06734(其中它具有參考編號y85993)。它以I型信號序列為特征。Spl33披露于W098/06734(其中它具有參考編號y85992)。它同樣以I型信號序列為特征。可包括在組合疫苗(特別是用于預防中耳炎)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的范例為:0MP106[W097/41731(Antex)&WO96/34960(PMC)];OMP21或其片段(WO0018910);LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785&WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME，等人(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);0MP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipolO(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipol8(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257);以及OmpE。可包括在組合疫苗(特別是用于預防中耳炎)中的不可分型的流感嗜血桿菌抗原或其片段的范例Fimbrin蛋白[(US5766608-OhioStateResearchFoundation)]其包含其肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067];0MP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;H鄰；D15(W094/12641);P2;以及P5(W094/26304)。本發明的蛋白還可被有利地合并。合并表示該免疫原性組合物包含來自以下組合的所有蛋白，該蛋白可作為載體蛋白或作為游離蛋白或者作為這兩者的混合物。例如，在下文所示的兩種蛋白的組合中，兩種蛋白均被用作載體蛋白，或者均作為游離蛋白存在，或者可同時作為載體蛋白和游離蛋白，或者一種可作為載體蛋白和游離蛋白而另一種僅作為載體蛋白或僅作為游離蛋白，或者一種可作為載體蛋白而另一種作為游離蛋白。當給出三種蛋白的組合時，存在類似的可能性。組合包括，但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2+PsaA、NRlxR2+Sp128、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Sp128、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。任選地，NRlxR2(或RlxR2)來自于CbpA或PspC。任選地，它來自于CbpA。其它組合包括3蛋白組合，例如PhtD+NRlxR2+Ply和PhtA+NRlxR2+PhtD。在一個實施方式中，該疫苗組合物包含作為載體蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。在進一步的實施方式中，該疫苗組合物包含作為游離蛋白的解毒肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE。在一個獨立的方面，本發明提供了免疫原性組合物，其包含至少四種含有來自不同肺炎鏈球菌血清型的糖的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，其中至少一種糖綴合PhtD或其融合蛋白，且該免疫原性組合物能夠引發針對PhtD的有效免疫應答。對PhtD或其融合蛋白的有效免疫應答可通過例如實施例15所述的保護測定進行測量。有效免疫應答可在異種菌株攻擊后7天提供至少40%、50%、60%、70%、80%或90%的存活。假定該攻擊菌株是異種的，所提供的保護是由于對PhtD或其融合蛋白的免疫應答。替代性地，對PhtD的有效免疫應答可通過例如實施例14所述的ELISA進行測量。有效免疫應答給出了至少250、300、350、400、500、550或600iig/mlGMC的抗-PhtDIgG應答。例如，該免疫原性組合物包含綴合至PhtD或其融合蛋白的來自不同血清型的至少2、3、4、5、6、7、8、9或IO種肺炎鏈球菌莢膜糖。例如進一步選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的血清型22F和1、2、3、4、5、6或7被綴合至PhtD。在一個實施方式中，血清型3、6A和22F中的兩種或三種被綴合至PhtD或其融合蛋白。在一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含至少一種通過接頭(例如ADH)綴合至PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個實施方式中，采用了如下列舉的其中一種綴合化學。在一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含了至少一種綴合至PhtD或其融合蛋白的肺炎鏈球菌莢膜糖，其中PhtD與糖在綴合物中的比例介于6:i和i:5、6:i和2:1、6:i和2.5:1、6:i和3:1、6:l和3.5:i(w/w)或大于(S卩，包含更大比例的PhtD)2.0:1、2.5:1、3.0:1、3.5:1或4.0:l(w/w)。在一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含肺炎球菌溶血素。本發明進一步提供了包含本發明的免疫原性組合物和藥學可接受的賦形劑的疫苗。本發明的疫苗可補充佐劑，特別是當該疫苗意圖用于老年人群，同時用于嬰兒時。合適的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明砜，但也可以是其它的金屬鹽，例如鈣、鎂、鐵或鋅的鹽，或者可以是酰化酪氨酸或者酰化糖、陽離子或陰離子衍生的糖或者聚磷腈的不溶性懸浮液。該佐劑任選地選擇為TH1型應答的優選誘導劑。該種高水平的Thl型細胞因子傾向于促進針對給定抗原的細胞介導免疫應答的誘導，而高水平的Th2型細胞因子傾向于促進針對該抗原的體液免疫應答的誘導。Th2和Th2型免疫應答的區別并不絕對。實際上一個個體將支持被描述為主要是Thl或主要是Th2的免疫應答。然而，通常可方便的以Mosmann和Coffman對鼠CD4+veT細胞克隆的描述來考慮細胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1andTH2cells-differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.(AnnualReviewofl匪nology，7，pl45_173)。習慣上，Thl型應答與T淋巴細胞生成INF-y和IL-2細胞因子相關聯。其它通常與Thl型免疫應答的誘導關聯的細胞因子并非由T細胞生成，例如IL-2。相反地，Th2型應答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌關聯。促進主要是Thl應答的合適佐劑系統包括單磷酰脂質A或其衍生物(或者一般而言的解毒lipidA-例如參見W02005107798)，特別是3-脫-0-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)(其制備可參見GB2220211A);以及單磷酰脂質A，任選地3-脫-0-酰化單磷酰脂質A，和鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳液的組合。在該種組合中，抗原和3D-MPL包含在相同的顆粒結構中，從而允許抗原性和免疫剌激信號被更有效傳遞。研究顯示3D-MPL能夠進一步增強alum吸附抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-B1]。增強系統包括單磷酰脂質A和皂甙衍生物的組合，特別是WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合，或者WO96/33739中披露的反應原性較低的組合物，其中以膽固醇淬滅QS21。特別有效的佐劑配方包括在W095/17210中描述的在水包油乳液中的QS21、3D-MPLS和生育酚。在一個實施方式中，該免疫原性組合物額外包含皂甙，其可以是QS21。該配方還可包含水包油乳液和生育酚(W095/17210)。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸(W096/02555)和其它免疫調節寡核苷酸(W00226757和W003507822)也是TH1應答的潛在誘導劑，并適于在本發明使用。具體的佐劑選自金屬鹽、水包油乳液、Toll樣受體激動劑(特別是Toll樣受體2激動劑、Toll樣受體3激動劑、Toll樣受體4激動劑、Toll樣受體7激動劑、Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體9激動劑)、皂甙及其組合。—種可用于本發明的疫苗組合物的佐劑為來自革蘭氏陰性細菌菌株的皰(bleb)或外膜囊泡，例如W002/09746所啟示-特別是腦膜炎奈瑟氏球菌皰。皰的佐劑特性可通過在其表面保留L0S(脂低聚糖)得到增強(通過以低濃度清潔劑[例如0-0.1%脫氧膽酸鹽]萃取)。L0S可通過W002/09746中討論的msbB(-)或htrB(-)突變進行解毒。佐劑特性還可通過從腦膜炎球菌皰保留PorB(并任選地去除PorA)得到增強。佐劑特性還可通過截短腦膜炎球菌皰上的L0S的外核糖結構得到增強_例如通過￥02004/014417中討論的lgtB(-)突變。替代性地，前述L0S(例如，從msbB(-)和/或lgtB(-)菌株分離)可被純化并被用作本發明組合物的佐劑。可用于本發明的組合物的另一佐劑選自如下組合皂甙、脂質A或其衍生物、免疫剌激寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳液或其組合。可用于本發明的組合物的其它佐劑為與另一佐劑組合的金屬鹽。在一個實施方式中，該佐劑為Toll樣受體激動劑，特別是Toll氧受體2、3、4、7、8或9的激動劑，或者皂甙，特別是Qs21。在一個實施方式中，佐劑系統包含來自上文列表的兩種或多種佐劑。具體而言，該組合任選地包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動劑，例如含CpG的免疫剌激寡核苷酸。其它的組合包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和Toll樣受體4激動劑或其3脫酰化衍生物3D-MPL，或者包含皂甙(特別是Qs21)佐劑和Toll樣受體4配體如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。在一個實施方式中，佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP0671948Bl)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO95/17210，WO98/56414)，或者與其它載體配制的3D-MPL(EP0689454Bl)。在一個實施方式中，佐劑系統包含中所述的3DMPL、QS21和CpG寡核苷酸的組合。在一個實施方式中，該佐劑為Toll樣受體(TLR)4配體，任選地如脂質A衍生物激動劑，具體而言單磷酰脂質A，更具體而言3脫酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)。3D-MPL可由GlaxoSmithKlineBiologicalsNorthAmerica獲得，主要促進具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T細胞應答。它可根據GB2220211A中披露的方法生成。從化學上看它是具有2、3、4或6條酰化鏈的3-脫酰單磷酰脂質A。在一個實施方式中，本發明的該組合物采用了微粒3D-MPL。微粒3D-MPL具有可通過0.22ym過濾器進行無菌過濾的粒徑。該種制備物描述于國際專利申請WO94/21292。脂質A的人工衍生物已知，并被認為是TLR4激動劑，包括但不限于0M174(2-脫氧_6-0-[2_脫氧_2_[(R)_3_十二烷酰氧基四_癸酰基氨基]_4-0-膦酰基_13-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]_a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸)，(W095/14026)0M294DP(3S，9R)-3—[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜_9(R)-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸)(W099/64301和W000/0462)0M197MP-AcDP(3S_，9R)_3_[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]_4_氧代-5_氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氫磷酸10-(6-氨基己酸)(W001/46127)其它可用的TLR4配體為例如W09850399或US6303347所披露的烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(同樣披露了AGP的制備方法)或者US6764840中披露的AGP藥學可接受的鹽。部分AGP為TLR4激動劑，部分為TLR4拮抗劑。兩者均為認為可用作佐劑。可用于本發明的另一免疫剌激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是一種從南美樹種QuilajaS即onariaMolina中分離的皂甙制備物，并由Dalsgaard等人在1974年首次描述為具有佐劑活性("saponinadjuvants，，，Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung，Vol.44，SpringerVerlag，Berlin,p243_254)。以通過HPLC分離了QuilA的純化片段，其保留了佐劑活性，而不具有QuilA的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也被稱為QA7和QA21)。QS-21是一種來自的Quillajas即onariaMolina樹皮的天然皂武，其誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTLs)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答，并且是本發明背景中的皂甙。QS21的具體配方已被表述，并且是本發明的實施方式，這些配方進一步包含固醇(W096/33739)。本發明的皂甙形成部分可以微團、混合微團(可選地具有膽鹽)或者可以ISC0M基質(EP0109942Bl)、脂質體或相關膠體結構例如蠕蟲狀或環狀多聚體復合物或油脂/分層結構以及與膽固醇和脂質配制形成的薄片、或以水包油乳液(例如在W095/17210)的形式分離。該皂甙可與金屬鹽(例如氫氧化鋁或磷酸鋁)(W098/15287)相關聯。任選地，該皂甙以脂質體、ISC0M或水包油乳液形式存在。增強系統包括單磷酰脂質A(或解毒脂質A)和皂甙衍生物的組合，特別是WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合，或者W096/33739中披露的反應原性較低的組合物，其中以膽固醇淬滅QS21。一種特別有效的佐劑配方包括在WO95/17210中描述的在水包油乳液中的具有或不具有QS21和/或3D-MPL的生育酚。在一個實施方式中，該免疫原性組合物額外包含皂甙，其可以是QS21。也可使用免疫剌激寡核苷酸或任意其它Toll樣受體(TLR)9激動劑。在本發明的佐劑或疫苗中使用的寡核苷酸為可選地含CpG的寡核苷酸，任選地包含被至少三個、任選地至少六個或更多個核苷酸分離的兩個或多個雙核苷酸CpG基序。CpG基序是一種后接鳥嘌呤核苷酸的胞嘧啶核苷酸。本發明的CpG寡核苷酸通常為脫氧核苷酸。在一個實施方式中，該寡核苷酸中的核苷酸間鍵合為二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯和其它核苷酸間鍵合鍵也在本發明的范圍內。同樣包含在本發明范圍內的是與核苷酸間鍵合混合的寡核苷酸。生產硫代磷酸酯寡核苷酸或而硫代磷酸酯的方法描述于US5，666，153、US5，278，302和W095/26204。寡核苷酸的范例具有如下序列。這些序列任選地包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合。0LIG0l(SEQIDN0:1):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)0LIG02(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)替代性的CpG寡核苷酸可包含上述序列，其中具有序列內刪除或添加。本發明中采用的CpG寡核苷酸可通過本領域已知的方法合成(例如參見EP468520)。這些寡核苷酸可方便地采用自動合成儀合成得到。該佐劑可以是水包油乳液或者可包含于其它佐劑組合的水包油乳液。該乳液系統的油相可選地包含可代謝的油。術語可代謝的油的含義已為本領域公知。可代謝的可被定義為'，夠通過代話撫化的，，(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary，W.B.SandersCompany,25thedition(1974))。該油可以是任意植物油、魚油、動物或人造油，其對受體沒有毒性并能夠通過代謝轉化。堅果、種子和谷物是植物油的常見來源。人造有也是本發明的一部分，并可包括已有市售的油，例如NEOBEE⑧等。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯)是一種不飽和油，其大量發現于鯊魚肝油中，少量發現于橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中，并且是一種可用于本發明的油。角鯊烯是一種可代謝的油，事實上它是膽固醇生物合成中的一種中間體(Merckindex,10thEdition,entryno.8619)。母育酚(例如，維生素E)也常被用在油乳液佐劑中(EP0382271Bl;US5667784;WO95/17210)。在本發明的油乳液(任選地水包油乳液)中所用的母育酚可參照EP0382271Bl所述進行配制，其中母育酚可作為母育酚液體的分散體，任選地包含乳化劑，任選地其直徑小于1微米。替代性惡，該母育酚可與另一種油聯用，以形成油乳液的油相。可與母育酚聯用的油乳液的范例已在此處描述，例如上述可代謝的油。水包油乳液本身已被建議用作佐劑組合物(EP0399843B)，此外水包油乳化和其它活性劑的組合也被描述為疫苗的佐劑(WO95/17210;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)。其它的油乳液佐劑已被描述，例如油包水乳液(US5，422，109;EP0480982B2)和水包油乳液(US5，424，067;EP0480981B)。所有這些形成油乳液系統(特別當結合了母育酚時)，以形成本發明的佐劑和組合物。在一個實施方式中，該油乳液(例如水包油乳液)進一步包含乳化劑，例如TWEEN80和/或固醇(如膽固醇)。在一個實施方式中，該油乳液(任選地水包油乳液)包含可代謝的無毒性油，例如角鯊烷、角鯊烯或生育酚如a生育酚(以及可選地角鯊烯和a生育酚兩者)以及任選地包含乳化劑(或表面活性劑)如Tween80。還可包含固醇(如膽固醇)。生產水包油乳液的方法已為本領域技術人員公知。該方法通常包括將含母育酚的油相與表面活性劑(如PBS/TWEEN80tm溶液)混合，然后采用勻漿機勻漿化，本領域技術人員顯然了解將混合物兩次通過注射器針頭的方法可用于將小量液體勻漿化。同樣地，本領域技術人員可采用微射流儀(M110S微射流機器，最大50次，周期2分鐘，最大輸入壓力6bar(輸出壓約850bar))中的乳化過程來生成更小或更大體積的乳液。這種方法可通過包括測量所得乳液直至制備物達到所需直徑的油滴的常規實驗實現。在水包油乳液中，該油和乳化劑應當在水性載體中。該水性載體可以是，例如，磷酸鹽緩沖鹽水。在穩定的水包油乳液中發現的油滴的大小任選地小于1微米，可以在大約30-600nm范圍內，任選地直徑大約為30-500nm，且任選地直徑大約為150-500nm，特別是直徑大約150nm，該直徑可通過光子相關光譜學測定。就此而言，數量上80%的油滴應在該范圍內，任選地數量上超過90%和任選地超過95%的油滴在指定的大小范圍內。在本發明的油乳液中存在的成分如角鯊烯的量通常約油(總劑量體積)的O.5-20%或2-10%范圍內；當a生育酚存在時為2-10%;表面活性劑(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)為0.3-3%。任選地油(例如角鯊烯)母育酚(例如a-母育酚)的比例等于或小于l，因為這提供了更穩定的乳液。乳化劑如Tween80或Span85也可以約1%的水平存在。在部分情況下，本發明的疫苗可有利地進一步包含穩定劑。乳液系統的范例描述于WO95/17210、WO99/11241禾口WO99/12565，其中披露了基于角鯊烯、生育酚和TWEEN80，任選地與免疫剌激劑QS21和/或3D-MPL配制的乳液佐劑。因此在本發明的一個實施方式中，本發明的佐劑可額外地進一步包含免疫剌激劑，例如LPS或其衍生物和/或皂甙。其它免疫剌激劑的范例在此處描述，并描述于"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach"1995，PharmaceuticalBiotechnology,Volume6，Eds.Powell,M.F.，andNewman,M.J.，PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在一個實施方式中，根據本發明的佐劑和免疫原性組合物在上述油乳液中包含皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)，任選地具有固醇(例如，膽固醇)。此外，該油乳液(任選地水包油乳液)可包含span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳液、固醇和皂甙的佐劑描述于WO99/12565。典型地，用于向人施用時，皂甙(例如QS21)和/或LPS衍生物(例如3D-MPL)在人用劑量的免疫原性組合物中的范圍為每劑量1Pg-200iig，例如10-100iig，或10iig-50iig。通常油乳液(任選地水包油乳液)將包含2-10%可代謝油。任選地它將包含2-10%角鯊烯，2_10%a生育酚和0.3-3%(任選地0.4-2%)乳化劑(任選地tween80[聚氧乙烯山梨醇單油酸酯])。當角鯊烯和a生育酚都存在時，任選地角鯊烯a生育酚的比例等于或小于l，這提供了更穩定的乳液。Span85(去水山梨糖醇三油酸酯)也可在本發明所用乳液中以0.5_1%的水平存在。在部分情況下，本發明的免疫原性組合物和疫苗可有利地進一步包含穩定劑，例如其它乳化劑/表面活性劑，包括辛酸(merckindex10thEdition,entryno.1739)，例如三辛酸甘油酯。當包含角鯊烯和皂甙(任選地QS21)時，在配方中還可有利地包含固醇(任選地膽固醇)，這允許減少乳液中油的總體水平。這帶來了生產成本的下降，疫苗總體舒適性的提高，以及所得免疫應答的定性和定量改善，例如提高了IFN-Y生產。相應地，本發明的佐劑系統通常包含的可代謝的油皂甙(w/V)比例范圍為200:l至300:i，此外本發明還可以"低油"方式使用，其任選的范圍為i:l至200:1，任選地20:i至ioo:i，或者約48:i，該疫苗保留了所有成分的有益佐劑性能，同時反應原性大大下降。相應地，部分實施方式中的角鯊烯QS2i(w/w)比例范圍為i:l至250:1，或20:l至200:i，或20:i至ioo:1，或約48:i。任選地以此處所述的皂甙固醇比例包含固醇(例如，膽固醇)。本發明的乳液系統任選地具有在亞微米范圍內的小油滴大小。任選地該油滴直徑將在120-750nm或120-600nm范圍內。—種特別有效的佐劑配方(最終與A1P04在本發明的免疫原性組合物中合并)包含了皂甙(例如，QS21)、LPS衍生物(例如3D-MPL)和油乳液(例如含于水包油乳液的角鯊烯和a生育酚)，其描述于WO95/17210或W099/12565(特別是實施例2，表1中的佐劑配方11)。TLR2激動劑的范例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑喹啉，例如咪喹莫特和瑞喹莫德是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(人TLR8的和小鼠的TLR7)，而取鏈RNA和聚IC(聚肌苷酸-聚胞苷酸，一種商業合成的病毒RNA模擬物)是示范性的TLR3激動劑。3D-MPL是TLR4激動劑的范例，而CPG是TLR9動劑的范例。免疫原性組合物可包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫剌激劑。EP0576478Bl、EP0689454B1和EP0633784Bl描述了基于鋁的疫苗制劑，在其顆粒上吸附了抗原和免疫剌激劑3-脫-0-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)。在這些情況下，抗原首先被吸附在鋁鹽上，然后將免疫剌激劑3D-MPL吸附到相同的鋁鹽顆粒上。該方法包括用超聲在水浴中懸浮3D-MPL，直至顆粒大小介于80和500nm。該抗原通常在室溫攪拌下在鋁鹽上吸附一小時。然后將3D-MPL懸浮液添加至吸附抗原，并將該配方在室溫下孵育1小時，并在fC下保存待用。在另一方法中，該免疫剌激劑和該抗原分別吸附在單獨的金屬顆粒上，如EP1126876所述。這種改進的方法包括將免疫剌激劑吸附在金屬鹽顆粒上，然后將抗原吸附在另一金屬鹽顆粒上，然后混合分散的金屬鹽顆粒以形成疫苗。在本發明中所用的佐劑可以是包含吸附在金屬鹽顆粒上的免疫剌激劑的佐劑組合物，其特征在于該金屬鹽顆粒基本不含其它抗原。此外，本發明提供的疫苗的特征在于該免疫剌激劑被吸附在基本不含其它抗原的金屬鹽顆粒上，且該金屬鹽顆粒吸附至基本不含其它免疫剌激劑的抗原。相應地，本發明提供了包含免疫剌激劑的佐劑配方，其被吸附在金屬鹽顆粒上，特征在于該組合物基本不含其它抗原。此外，本發明的佐劑配方可以是中間體，如果采用該種佐劑時，疫苗的生產中需要該種中間體。相應地提供了一種生產疫苗的方法，其包括將一種或多種免疫剌激劑吸附在金屬顆粒上的佐劑組合物與抗原相混合。任選地，該抗原已被預先吸附在金屬鹽上。所述的金屬鹽與吸附了免疫剌激劑的金屬鹽相同或類似。任選地，該金屬鹽為鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。本發明進一步提供了疫苗組合物，其包含了第一金屬鹽顆粒上的免疫剌激劑，以及吸附在金屬鹽上的抗原，其特征在于該第一和第二金屬鹽顆粒是單獨的顆粒。此處所述的LPS或LOS衍生物或突變體或脂質A衍生物被設計為別天然脂多糖具有更低的毒性(例如，3D-MPL)，并對于此處所述的部分的任意用途而言是可以互換的等同物。在一個實施方式中，在本發明的組合物中所用的佐劑包含脂質體載體(通過已知技術由磷脂(例如二油酰基磷脂酰膽堿[DOPC])和可選地固醇[例如膽固醇]制備)。該種脂質體載體可攜帶脂質A衍生物[例如3D-MPL，-參見上文]和/或皂甙(例如QS21參見上文)。在一個實施方式中，該佐劑包含(每O.5mL劑量)0.l-10mg、0.2_7、0.3_5、0.4-2或0.5-lmg(e.g.0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或lmg)磷月旨(例如DOPC)、0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25or0.125mg)固醇(例如膽固醇)、5-60、10-50、or20_30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50iig)皂甙(例如QS21)。該佐劑特別適用于老年疫苗制劑。在一個實施方式中，含有該佐劑的該疫苗組合物包含來自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的相應效價。在一個實施方式中，本發明的組合物中所用的佐劑包含由可代謝的油(例如角鯊烯)、乳化劑(例如Tween80)和任選地母育酚(例如a生育酚)制成的水包油乳液。在一個實施方式中，該佐劑包含(每O.5mL劑量)0.5-15、l-13、2-ll、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-llmg)可代謝的油(如角鯊烯)、0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、l-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化劑(如Tween80)以及任選地0.5-20、1-15、2-12、4-10、295-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(如a生育酚)。該佐劑可任選地進一步包含5-60、10-50或20-30yg(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。這些佐劑特別適于嬰兒或老年疫苗制劑。在一個實施方式中，含有該佐劑的該疫苗組合物包含來自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導的相應效價。該佐劑可任選地包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)、5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50iig)脂質A衍生物(例如3D-MPL)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。該佐劑特別適用于老年疫苗制劑。在一個實施方式中，含有該佐劑的該疫苗組合物包含來自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不明顯低于由—Prevnar—疫苗誘導的相應效價。在一個實施方式中，用于本發明組合物的該佐劑包含磷酸鋁和脂質A衍生物(如3D-MPL)。該佐劑可包含(每O.5mL劑量)100-750、200-500、400-500或300-400iigAl(磷酸鋁)以及5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑特別適用于老年或嬰兒疫苗制劑。在一個實施方式中，含有該佐劑的該疫苗組合物包含來自至少如下血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(還可包含一種或多種來自血清型3、6A、19A和22F的糖綴合物)，其中在人類接種者中針對一種或多種(或者所有)疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導的GMC抗體效價不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導的相應效價。包含該疫苗制備物的本發明的免疫原性組合物可通過經全身或粘膜途徑施用所述疫苗的方式保護或治療易受傳染的哺乳動物。這些施用可包括通過肌肉內(M)、腹膜內(IP)、皮內(ID)或皮下(SC)途徑注射；或通過粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。通過鼻內(IN)施用疫苗治療肺炎或中耳炎是可能的(因為肺炎雙球菌的鼻咽運輸能被更有效的預防，從而在其最早的階段減少感染)。盡管本發明的疫苗可作為單個劑量施用，其成分也可同時或不同時共同施用(例如肺炎球菌糖綴合物可在該疫苗的任意細菌蛋白成分的施用同時或1-2周后單獨施用，以最佳最佳協調彼此的免疫應答)。對于同時施用，任選地Thl佐劑可存在于任意或所有的不同施用中。處理單途徑施用，可采用2種不同的施用途徑。例如，糖或糖綴合物可IM(或ID)施用，而細菌蛋白可IN(或ID)施用。此外，本發明的疫苗可IM施用初次劑量，IN施用促升劑量。在疫苗中的蛋白抗原含量通常在1-100yg范圍內，任選地在5-50yg范圍內，例如在5-25iig范圍內。在初次接種后，對象可以充分的間隔接受一次或多次促升接種。疫苗制備總體描述于疫苗設計中("Thesub皿itandadju麗t卿roach，，(edsPowellM.F.&NewmanM.J.)(1995)PlenumPressNewYork)。Fullerton的美國專利US4，235，877描述了在脂質體中的膠囊化。本發明的疫苗或免疫原組合物可被貯存在溶液中或被凍干。在一個實施方式中，該溶液在作為無定形凍干保護劑的糖(例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或者乳糖)的存在下被凍干。在一個實施方式中，該溶液在作為無定形凍干保護劑的糖以及提供改善的餅結構的填充劑(例如甘氨酸或甘露糖醇)的存在下被凍干。結晶填充劑的存在允許在高鹽濃度存在下縮短冷凍干燥周期。用于本發明的免疫原性組合物或疫苗的冷凍干燥的該種混合物的范例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麥芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露糖醇/海藻糖/甘露糖醇、葡萄糖/甘露糖醇、甘露糖/甘露糖醇和麥芽糖/甘露糖醇。典型的兩種組分的摩爾比例任選地為i:i、i:2、i:3、i:4、i:5或i:6。本發明的免疫原性組合物任選地包含上述凍干試劑。上述穩定劑和穩定劑的混合物可以進一步包含能夠提高制劑的玻璃轉化溫度(Tg')的聚合物如聚(乙烯-吡咯烷酮)(PVP)、羥乙基淀粉或葡聚糖，或者作為結晶填充劑的聚合物如分子量介于1500和6000的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖。本發明的免疫原性組合物任選地凍干并在使用前臨時復原。凍干可導致更穩定的組合物(疫苗)，并可能導致在3D-MPL存在下和鋁基佐劑缺失下更高的抗體效價。在本發明的一個方面提供了疫苗試劑盒，其包含了含有本發明的免疫原性組合物(任選地呈凍干形式)的小瓶，并進一步包含含有此處所述的佐劑的小瓶。在本發明的該方面預想，該佐劑將被用于復原該凍干的免疫原性組合物。盡管本發明的疫苗可通過任意途徑施用，所述疫苗施用至皮膚(ID)形成了本發明的一個實施方式。人類的皮膚包含了外部"角質"表皮，被稱為角質層，其覆蓋了表皮。在表皮下是一個成為真皮的層，其進而覆蓋了皮下組織。研究人員已經顯示將疫苗注射進入皮膚，特別是真皮時，可剌激免疫應答，這還伴隨了多種額外的優點。以此處所述的疫苗進行皮內疫苗接種形成了本發明的任選特征。皮內注射的常規技術"mantoux步驟"包括清潔皮膚，然后伸展一只手，用窄軌針頭(26-31號)的斜面向上，將針頭以介于10-15°的角度插入。當針頭的斜面插入時，針頭的圓筒部分下降，進一步插入同時提供略微的壓力使其在皮膚下抬升。然后極為緩慢地注射液體，從而在皮膚表面形成皰或腫塊，然后緩慢退出針頭。最近，已描述了特別設計用于將液體藥劑施用至皮膚或透過皮膚的裝置，例如，在W099/34850和EP1092444中描述的裝置，以及在例如W001/13977;US5，480，381，US5，599，302，US5，334，144，US5，993，412，US5，649，912，US5，569，189，US5，704，911，US5，383，851，US5，893，397，US5，466，220，US5，339，163，US5，312，335，US5，503，627，US5，064，413，US5，520，639，US4，596，556，US4，790，824，US4，941，880，US4，940，460，WO97/37705和WO97/13537中描述的快速注射裝置。替代性地皮內施用疫苗制劑的方法包括常規的注射器和針頭，或者設計用于沖擊傳遞固體疫苗的裝置(W099/27961)，或者透皮貼劑(W097/48440;W098/28037);或者應用于皮膚表面(經真皮或經表皮傳遞W098/20734;W098/28037)。當本發明的疫苗被施用至皮膚時，或者更具體而言被施用至真皮時，該疫苗具有較少的液體體積，特別是介于約0.05ml和0.2ml的體積。31本發明的皮膚或皮內疫苗中抗原的含量類似于肌肉疫苗中的常規劑量(見上文)。然而，皮膚或皮內疫苗的一個特征在于該制劑可能是"低劑量的"。相應的，該"低劑量"疫苗中的蛋白抗原任選地以低至每劑量O.l-lOyg或O.l-5yg存在；且該糖(任選地糖綴合物)抗原可以每劑量0.01-1yg或0.01-0.5g存在。此處所用的術語"皮內傳遞"指將疫苗傳遞至皮膚的真皮區域。然而，該疫苗并不必須僅處于真皮中。真皮是皮膚內從人皮膚表面約1.0和2.Omm的層，但它隨著個體和身體的不同部位有著一定程度的變化。總體而言，預計在皮膚表面以下1.5mm可達到真皮。真皮位于表面的角質層和表皮與下方的皮下層之間。根據傳遞的模式，該疫苗最終可唯一或主要存在于真皮中，或者最終分布在表皮和真皮內。本發明進一步提供了用于預防或緩解由流感嗜血桿菌引起的中耳炎的改良疫苗，該改良疫苗通過添加流感嗜血桿菌蛋白例如綴合形式的蛋白D得到。此外，本發明進一步提供了用于預防或緩解嬰兒肺炎球菌感染(例如，中耳炎)的改良疫苗，其通過向本發明的肺炎鏈球菌綴合物組合物添加一種或兩種作為游離或綴合蛋白的肺炎球菌蛋白得到。所述肺炎球菌游離蛋白可與用作載體蛋白的任意肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或多種粘膜炎莫拉菌蛋白抗原可以游離或綴合形式包含在組合疫苗中。因此，本發明是一種誘發針對嬰兒中耳炎的(保護性)免疫應答的改良方法。在另一實施方式中，本發明是通過施用安全和有效量的本發明的疫苗[兒科疫苗]誘發嬰兒(在本發明的上下文中定義為0-2歲大)的(保護性)免疫應答的改良方法。本發明進一步的實施方式包括準備本發明的抗原性肺炎鏈球菌綴合物組合物以用于藥物，以及本發明的肺炎鏈球菌綴合物在生產用于預防(或治療)肺炎球菌疾病的藥物中的應用。在另一實施方式中，本發明是一種通過施用安全和有效量的本發明的疫苗、任選地結合一種或兩種作為游離或綴合蛋白肺炎鏈球菌蛋白(其中游離肺炎鏈球菌蛋白可與此處用作載體蛋白的任意肺炎鏈球菌蛋白相同或不同)，誘發老年人群(在本發明的上下文中定義為50歲或更大，通常超過55歲，更通常超過60歲)的(保護性)免疫應答的改良方法。本發明的進一步的方面是一種針對肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌引起的疾病免疫人類宿主的方法，其包括向該宿主施用免疫保護劑量的本發明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒。本發明的進一步的方面是用于治療或預防由肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌感染引起的疾病的本發明的免疫原性組合物。本發明進一步的方面是本發明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒在生產用于治療或預防由肺炎鏈球菌和任選地流感嗜血桿菌感染引起的疾病的藥物中的用途。此處的術語"包含"、"包括""含有"在每種情況下可任選地分別被術語"由......組成"所取代。涉及本發明的"疫苗組合物"的實施方式同樣適用于涉及本發明"免疫原性組合物"的實施方式，反之亦然。在本發明說明書中所引用的所有參考文獻或專利申請均引入作為參考。為使本發明被更好地理解，列舉了以下實施例。這些實施例僅用于闡述，不應解釋32為以任何方式限制本發明的范圍。實施例實施例1:蛋白D的表達流感嗜血桿菌蛋白D蛋白D表達的遺傳構建起始材料蛋白D編碼DNA蛋白D在所有血清型和不可分型菌株的流感嗜血桿菌之間高度保守。含有編碼完整蛋白D基因的DNA序列的載體pHlC348已從瑞典Malm6的Malm6綜合醫院，L皿d大學醫學微生物部的A.Forsgren博士處獲得。蛋白D的DNA序列已由Janson等人(1991)Infect.Immun.59:119-125公開。表達載體pMGl表達載體pMGl是一種pBR322衍生物(Gross等人，1985)，其中導入了來自噬菌體入的用于外源插入基因轉錄和翻譯的控制元件(Shatzman等人，1983)。此外，氨芐青霉素抗性基因與卡那霉素抗性基因相交換。大腸桿菌菌株AR58大腸桿菌菌株AR58可通過以預先在SA500衍生物上生長的PI噬菌體儲液轉導N99后生成(galE::TN10，lambdaKil—cI857AHI)。N99和SA500是來自國立衛生研究院的MartinRosenberg博士實驗室的大腸桿菌K12菌株。表達載體pMG1為了生產蛋白D，編碼該蛋白的DNA被克隆進入表達載體pMG1。該質粒采用了來自lambda噬菌體DNA的信號來推動插入外源基因的轉錄和翻譯。該載體包含啟動子PL、操縱子OL和兩個使用位點(NutL和NutR)以接受N蛋白被提供時的轉錄極性效應。包含該PL啟動子的載體被導入大腸桿菌溶源性宿主，以穩定質粒DNA。溶源性宿主菌株包含整合進入基因組的復制缺陷型lambda噬菌體DNA(Shatzman等人，1983)。染色體的lambda噬菌體DNA引導與載體的0L阻遏物結合的cl阻遏蛋白的合成，并防止RNA聚合酶結合至PL啟動子從而轉錄插入基因。表達菌株AR58的cl基因包含溫度敏感性突變體，從而使PL引導的轉錄可被溫度變化調節，即，培養溫度的上升可使阻遏物失活，并啟動外援蛋白的合成。這種表達系統允許外源蛋白(特別是對細胞可能有毒性的那些蛋白)的受控合成(Shimataka&Rosenberg,1981)。大腸桿菌菌株AR58用于生產蛋白D載體的AR58溶源性大腸桿菌菌株是標準NIH大腸桿菌K12菌株N99的衍生物(F—su—galK2，lacZ—thr—)。它包含了缺陷型溶源性lambda噬菌體(galE::TN10，lambdaKil—cI857AHI)。Kil—表型可阻止宿主大分子合成的切斷。cI857突變賦予了cl阻遏蛋白溫度敏感性損傷。AH1缺失去除了lambda噬菌體右操縱子和宿主bio、uvr3和chlA基因座。AR58菌株可通過以預先在SA500衍生物上生長的PI噬菌體儲液轉導N99后生成(galE::TN10，lambdaKil—cI857AH1)。缺陷型溶源體導入N99中可采用四環素通過鄰近galE基因的編碼四環素抗性的TN10轉座子的存在進行選擇。載體pMGMDPPrD的構建33包含編碼流感病毒非結構SI蛋白的基因的pMG1載體(pMGNSI)被用于構建pMGMDPPrD。蛋白D基因通過PCR從pHIC348載體擴增(Janson等人1991Infect.Immun.59:119-125)，其中采用了在5'和3'端分別包含了NcoI和XbaI限制性位點的PCR引物。該Ncol/Xbal片段隨后被導入Ncol和Xbal之間的pMGNSl，從而創建了含有后接PD蛋白的NS1蛋白的N末端81氨基酸的融合蛋白。該載體被標記為pMGNSlPrD。基于上述構建體，生成了用于蛋白D表達的最終構建體。從pMGNSlPrD去除BamHI/BamHI片段。該DNA水解去除NS1編碼區(除了前三個N末端殘基)。再次連接載體時，生成了具有WO07/71711第44頁實施例1所示序列的編碼融合蛋白的基因。蛋白D不包含通常連接了脂質鏈的前導肽或N末端半胱氨酸。因此該蛋白既不分泌進入周質，也不脂化，而是以可溶形式保留在細胞質中。最終的構建體pMG-MDPPrD通過37。C下熱休克導入AR58宿主株。含質粒的細菌可在卡那霉素存在下進行選擇。蛋白D編碼DNA插入物的存在可通過采用選定的內切核酸酶消化分離的質粒DNA進行證實。該重組大腸桿菌菌株被稱為ECD4。蛋白D的表達受到lambda啟動子/(\操縱子的控制。宿主株AR58在基因組中包含了溫度敏感型cl基因，其通過與(\結合在低溫下阻斷lambdaP^的表達。一旦溫度升高，cl從(\釋放，蛋白D被表達。小規模制備在發酵末期，該細胞被濃縮并冷凍。從收獲細胞的提取和蛋白D的純化按照如下進行。將冷凍的細胞培養物團解凍，并重懸浮于細胞破壞溶液(檸檬酸緩沖液pH6.0)中，至最終OD,=60。將懸浮液在P=1000bar下兩次通過高壓勻槳機。離心澄清細胞培養勻槳液，通過過濾去除細胞碎片。在第一純化步驟中，過濾的細胞溶解物被應用至陽離子交換層析柱(SPS印haroseFastFlow)。PD通過離子相互作用結合至凝膠基質，并通過增加洗脫緩沖液的離子強度的步驟來洗脫。在第二純化步驟中，雜質被保留在陰離子交換基質(QS印haroseFastFlow)上。PD不與凝膠結合，并可在流出液中收集。在兩個柱層析步驟中，通過OD監測收集的組分。用超濾濃縮通過該陰離子交換柱層析的含有純化蛋白D的流出液。將含有蛋白D的超濾保留物最終通過0.2m膜。大規模制備從收獲細胞的提取和蛋白D的純化按照如下進行。冷卻收集的肉湯，直接在約800的壓力下兩次通過高壓勻漿機。在第一純化步驟中，細胞培養勻漿液被稀釋并被應用至陽離子交換層析柱(SPS印haroseBigbeads)。PD通過離子相互作用結合至凝膠基質，通過增加洗脫緩沖液的離子強度的步驟來洗脫并過濾。在第二純化步驟中，雜質被保留在陰離子交換基質(QS印haroseFastFlow)上。PD不與凝膠結合，并可在流出液中收集。在兩個柱層析步驟中，通過OD監測收集的組分。用超濾濃縮通過該陰離子交換柱層析的含有純化蛋白D的流出液并進行滲濾。34將含有蛋白D的超濾留物最終通過0.2m膜。實施例lb:PhtD的表達PhtD蛋白是肺炎球菌組氨酸三聯體(Pht)蛋白家族的成員，其特征在于組氨酸三聯體(HXXHXH基序)的存在。PhtD是一個838aa-的分子，并攜帶5個組氨酸三聯體(參見MedlmmuneWOOO/37105的氨基酸序列SEQIDNO:4禾PDNA序列SEQIDNO:5)。PhtD還在中部(氨基酸位置348-380)含有富脯氨酸區。PhtD具有帶LXXC基序的20aa-N-末端信號序列。遺傳構建體成熟MedlmmunePhtD蛋白的基因序列(從aa21至aa838)通過攜帶pA啟動子的內部pTCMP14載體重組轉移至大腸桿菌。該大腸桿菌宿主菌株為AR58，其攜帶了cI857熱敏感性阻遏物，允許啟動子的熱誘導。實施聚合酶鏈式反應以從Medlmmune質粒(攜帶來自肺炎鏈球菌菌株Norway4(血清型4)的phtD基因-WO00/37105中所述的SEQIDNO:5)擴增phtD基因。僅特異性針對phtD基因的引物被用于擴增兩個片段中的phtD基因。引物攜帶Ndel和JKpnl或者Kpnl和Xbal限制性位點。這些引物不與除了phtD特異性基因序列外的載體的任何核苷酸雜交。人工ATG起始密碼子可采用攜帶NdeI限制性位點的第一引物插入。然后將所生成的PCR產物插入pGEM-T克隆載體(Promega)，并確認該DNA序列。然后采用標準技術對TCMP14表達載體中的片段亞克隆，然后將載體轉化進入AR58大腸桿菌。PhtD純化PhtD純化按如下方式實現口在卡那霉素存在下生長大腸桿菌細胞在3(TC下生長30小時，然后在39.5"C下誘導18小時口在EDTA5mM和作為蛋白酶抑制劑的PMSF2mM存在下從0D±115全培養物破裂大腸桿菌細胞Rannie，2代，1000bars。口在室溫下(20°C)在膨脹床模式StreamlineQXL色譜上進行抗原捕獲和細胞碎片去除，用NaCl150mM+Empigen0.25%pH6.5洗柱，并用含于pH7.4的25mM磷酸鉀緩沖液的NaCl400mM+Empigen0.25%洗脫。口在Sartobran150柱體(0.45+0.2iim)上過濾口在4。C下5mM咪唑存在下于pH7.4下將抗原結合在ZrT螯合S印haroseFFIMAC色譜上；用咪唑5mM和Empigen1%洗柱，并用50mM咪唑洗脫，兩者均在pH8.0的25mM磷酸鉀緩沖液中。口在4。C下于pH8.0(25mM磷酸鉀)的FractogelEMDDEAE上以正電荷模式進行弱陰離子交換色譜；用140mMNaCl洗柱，并用200mMNaCl洗脫，同時污染物(蛋白和DNA)保持吸附在交換劑上。口在50kDa膜上用pH7.15的2mMNa/K磷酸鹽濃縮和超濾。口在Millipak-200.2iim過濾筒上對純化物進行無菌過濾。實施例lc:肺炎球菌溶血素的表達肺炎球菌的肺炎球菌溶血素可參照W02004/081515和W02006/032499所述進行制備和解毒。35實施例2:綴合物制備本領域公知如何制備純化的肺炎球菌多糖。針對這些實施例的目的，這些多糖主要參照EP072513所述或通過密切相關的方法制備。在綴合之前，該多糖可通過如下所述的微射流進行大小處理。活化和偶聯條件對每種多糖均為特定。這些條件在表1中給出。將大小處理的多糖(除PS5、6B和23F)溶解于NaCl2M、NaCl0.2M或水中以進行注射(WFI)。對所有血清型評估最佳多糖濃度。如下文具體描述，除血清型18C外的所有血清型直接綴合至載體蛋白。制備了兩種替代型的血清型22F綴合物；一種直接綴合，一種通過ADH接頭綴合。從含于乙腈或乙腈/水50%/50%溶液的100mg/ml儲備液中，將CDAP(CDAP/PS比例0.5-1.5mg/mgPS)添加至多糖溶液。1.5分鐘后，添加0.2M-0.3MNaOH以獲得特定的活化pH。多糖的活化可在該pH下于25t:下在3分鐘內進行。將純化蛋白(蛋白D、PhtD、肺炎球菌溶血素或DT)(其數量取決于初始PS/載體蛋白比例)添加至活化多糖，經pH調節在特定pH下進行偶聯反應達2小時(取決于血清型)。為了淬滅未反應的氰酸酯基團，向混合物中添加2M甘氨酸溶液。將pH調節至淬滅pH(pH9.0)。將所述溶液在25t:下攪拌30分鐘，然后在2-『C下連續緩慢攪拌過夜。18C的制備將18C通過接頭_己二酸雙肼(ADH)連接至載體蛋白在綴合前對多糖血清型18C進行微射流。以EDAC衍生破傷風類毒素對于破傷風類毒素的衍生，在0.2MNaCl中稀釋純化TT至25mg/ml，并添加ADH間隔基以達到最終濃度O.2M。當間隔基的溶解完全時，將pH調節至6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)以達到最終濃度0.02M，將混合物在pH調節下攪拌1小時。通過在25t:下將pH升至9.0至少30分鐘終止縮合反應。然后滲濾(10kDaCO膜)衍生化TT，從而去除殘留ADH和EDAC試劑。TTffl整體最終無菌過濾直至偶聯步驟，并在_701:下貯存。將TTAH化學偶聯至PS"C詳細綴合參數可參見表l。將2克微射流PS在水中稀釋至指定濃度，并通過添加NaCl粉末調節至2MNaCl。添加CDAP溶液(100mg/ml，在50/50v/v乙腈/WFI中新鮮制備)至達到合適的CDAP/PS比例。通過添加0.3MNaOH將pH升高至活化pH9.0，并在該pH下穩定至添加TTAH。3分鐘后，添加衍生TT旭(20mg/ml，含于0.2MNaCl)至TTAH/PS比例為2;將pH調節至偶聯pH9.0。將溶液在pH調節下保持一小時。向混合物PS/TTAH/CDAP添加2M甘氨酸溶液以淬滅。將pH調節至淬滅pH(pH9.0)。將溶液在25t:下攪拌30分鐘，然后在2-『C下連續緩慢攪拌過夜。PS22F，-PhtD綴合物在該糖的第二種綴合方法中(第一種為表1所示的直接PS22-PhtD綴合法)，通過接頭_己二酸雙肼(ADH)將22F連接至載體蛋白。在綴合前對多糖血清型22F進行微射流。PS22F衍生在溫控水浴中在25t:連續攪拌下進行活化和偶聯。稀釋微射流PS22F以獲得在O.2MNaCl中的6mg/ml的最終PS濃度，并用0.INHC1將該溶液調節至P朋.05±0.2。添加CDAP溶液(100mg/ml，在50/50乙腈/WFI中新鮮制備)至達到合適的CDAP/PS比例(1.5/lww)。通過添加O.5MNa0H將pH升高至活化pH9.00±0.05，并在該pH下穩定至添加ADH。3分鐘后，添加ADH以達到合適的ADH/PS比例(8.9/lw/w);將pH調節至偶聯pH9.0。將溶液在pH調節下保持一小時。濃縮并滲濾該PSAH衍生物。偶聯將含于O.2MNaCl的10mg/mlPhtD添加至PS22F旭衍生物，以使PhtD/PS22FAH比例為4/l(w/w)。用HCl將pH調節至5.0±0.05。在10分鐘內人工添加(250iU/min)EDAC溶液(20mg/ml，含于0.1MTris-HCl，pH7.5)以達到lmgEDAC/mgPS22FAH。在25。C攪拌和pH調節下將所得溶液孵育150分鐘(盡管也使用60分鐘)。通過添加1MTris-HClpH7.5(最終體積的1/10)中和該溶液，并在25t:下保持30分鐘。在S印hacrylS400HR上洗脫前，使用5iimMinisart過濾器澄清綴合物。所得綴合物的最終PhtD/PS比例為4.1(w/w)，游離PS含量低于1%，抗原性(a-PS/a-PS)36.3%，抗-PhtD抗原性7.4%。蛋白和多糖比例的測定采用Lowry和Resorcinol法進行，抗原性采用夾心ELISA進行測定。綴合物純化采用以0.15MNaCl平衡的S印hacrylS400HR凝膠過濾柱(18C采用S500HR)對綴合物進行凝膠過濾純化以去除小分子(包括DMAP)和未結合的PS和蛋白。基于反應成分的不同分子大小，PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎球菌溶血素或PS-DT綴合物被首先洗脫，然后是游離PS，然后為游離PD或游離DT，最后為DMAP和其它鹽(NaCl，甘氨酸)。含有綴合物的組分可通過，28。—檢測。根據它們的Kd匯集組分，無菌過濾(0.22iim)并在+2-『C下貯存。測定綴合物制劑中的PS/蛋白比例。PS肺炎鏈球菌_蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特定活化/偶聯/淬滅條件"yfluid"在表頭中出現時表示該糖在綴合前通過微射流調節大小。微射流后的糖的大小在表2中給出。表1PS肺炎鏈球菌_蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply綴合物的特定活化/偶聯/淬滅碰37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注pHa、c、q分別對應于活化、偶聯和淬滅pH鑒別每種綴合物均經過鑒別并滿足了表2中所述的規格。多糖含量(Pg/ml)通過Resorcinol測試檢測，蛋白含量(Pg/ml)通過Lowry測試檢測。最終的PS/PD比例(w/w)通過濃度的比例確定。游離多糖含量(％):在fC下保存或在37t:下貯存7天的綴合物的游離多糖含量可在與a-載體蛋白抗體和飽和硫酸銨孵育后離心所得的上清液中測定。在上清液中游離多糖的定量采用a-PS/a-PSELISA。不含綴合物還作為a_載體蛋白/a-PSELISA的對照。抗原性在相同綴合物上的抗原性可在夾心型ELISA中分析，其中抗體的捕獲和檢測分別為a-PS和a-蛋白。游離蛋白含量(％):未綴合的載體蛋白可在純化步驟中從綴合物中分離。游離殘留蛋白的含量可在分子排阻色譜(TSK5000-PWXL)后通過UV檢測(214nm)進行測定。洗脫條件允許分離游離載體蛋白和綴合物。然后相對校正曲線測定在大量綴合物中的游離蛋白含量(0-50yg/ml載體蛋白)。以％表示的游離載體蛋白參照如下獲得％游離載體=(游離載體g/ml)/(通過Lowry測定的相應載體蛋白總濃度(Pg/ml)*100%)。穩定性在HPLC-SEC凝膠過濾(TSK5000-PWXL)上對4。C下保存和在37。C下貯存7天的綴合物測定分子量分布(Kav)和穩定性。10/11/13/14-價鑒別在表2中給出(參見下方的注釋)。蛋白綴合物可被吸附在磷酸鋁上，并匯集形成最終的疫苗。表2-綴合物的特性40<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*天然PS微射流后的PS大小***未進行大小處理的多糖ND-未測定IO價疫苗可通過將血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F混合綴合物(例如，每人劑量分別采用1、3、1、1、1、1、1、3、3、1g糖)后制備得到。11價疫苗可通過進一步添加表5中的血清型3綴合物(例如每人劑量添加1Pg糖)制備得到。13價疫苗可通過進一步添加上述血清型19A和22F綴合物(22F既可直接連接至PhtD，也可通過ADH接頭連接)[例如每人劑量添加3g的每種糖]制備得到。14價疫苗可通過進一步添加上述血清型6A綴合物[例如每人劑量添加1Pg糖]制備得到。實施例3:在本發明免疫原性組合物中包含流感嗜血桿菌蛋白D可提供對急性中耳炎(AOM)增強的保護的證據研究設計。該研究采用了llPn-PD疫苗，其包含了各自與來自流感嗜血桿菌的蛋白D綴合的血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(參見實施例4表5)。研究對象被隨機分成兩組以在約3、4、5和12-15個月齡時接受四個劑量的11Pn-PD疫苗或賀福立適(Havirx)。所有對象在3、4和5個月齡時同時接受GSKBiologicals的Infanrix-hexa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是在施用前混合的Pediarix和Hib的組合。在"根據方案"分析的效力隨訪起始于第三疫苗劑量施用后2周，并持續至24-27個月齡。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的鼻咽運輸可在選定的對象亞組中評估。如果兒童出現惡心、耳部疼痛、鼓膜自發穿孔或自發性耳液溢，建議家長向研究人員咨詢。如果該研究人員懷疑是AOM事件，則該兒童應立即讓耳鼻喉(ENT)專家確認診斷。AOM的臨床診斷可基于鼓膜的外觀(g卩，發紅、腫脹、光反射損失)或者中耳液體流出的存在(可通過簡單的或氣動式耳鏡檢查或通過顯微鏡觀察證實)。此外，至少應存在如下跡象或癥狀中的兩種耳部疼痛、耳液溢、聽力損失、發燒、昏睡、過敏、厭食、嘔吐或腹瀉。如果ENT專家確認臨床診斷，則通過鼓膜穿剌術采集中耳液樣本進行細菌學測試。對于重復患病的對象，如果在前一事件開始后持續了30天以上，則認為出現了新的AOM事件。此外，如果分離的細菌/血清型不同于之前的分離物，不管兩個連續事件之間的間隔，AOM事件被認為新的細菌事件。試驗結果總計4968名嬰兒入組，2489名進入llPn-PD組，2479名進入對照組。在兩個組之間沒有人口統計特征或風險因素的較大差異。臨床事件和A0M案例定義在依據方案的隨訪期，在11Pn-PD組總計記錄了333次臨床AOM事件，在對照組記錄了499次。表3顯示了11Pn-PD疫苗和之前在芬蘭測試的兩種7價疫苗(Eskola等人NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等人ClinInfectDis200337:1155-64)對任意AOM事件或不同肺炎球菌血清型、流感嗜血桿菌、NTHi和卡他莫拉菌引起的AOM的保護性效力。不管針對何種病原學，11Pn-PD實現了總體AOM疾病負擔的33.6%的統計學顯著的和臨床相關的減少(表3)。在11Pn-PD疫苗中包含的11種肺炎球菌血清型中任意一種對A0M事件的總體效力為57.6%(表3)。在當前研究中另一重要的發現是llPn-PD疫苗對流感嗜血桿菌引起的AOM提供了35.6%的保護(特別地，對NTHi引起的A0M提供了35.3X的保護)。鑒于在肺炎球菌綴合物疫苗時代流感嗜血桿菌作為AOM主要起因的持續增加的重要性，這一發現具有重要的臨床意義。與針對AOM提供的保護一致，11Pn-PD疫苗還減少了生命的第二年中的加強劑量后流感嗜血桿菌的鼻咽運輸。這些發現不同于之前在芬蘭的觀察結果，其中作為病因替換的證據，對于兩種7價肺炎球菌綴合物疫苗均觀察到了流感嗜血桿菌引起的AOM事件的增加(Eskola等人和Kilpi等人)。在對Hi引起的A0M事件的保護和針對載體蛋白D的抗體水平之間無法建立明確的關聯，因為在11Pn-PD疫苗中初次免疫后的抗-PDIgG抗體濃度(其保持無HiA0M事件)，與在效力隨訪期過程中發生至少一次HiAOM事件時在llPn-PD疫苗中測得的初始劑量后抗-PDIgG抗體水平基本相同。然而，盡管在疫苗的生物學影響和初次免疫后IgG抗-PD免疫原性之間無法建立關聯，可以合理地假設在流感嗜血桿菌菌株之間高度保守的PD載體蛋白很大程度上有助于誘導針對Hi的保護。對AOM疾病的作用伴隨著對鼻咽運輸的作用，對此，疫苗血清型肺炎雙球菌和流感嗜血桿菌的作用在類似的等級上(圖1)。PD-綴合物疫苗對流感嗜血桿菌的鼻咽運輸的減少支持了PD-綴合物疫苗針對流感嗜血桿菌的直接保護作用的假設，即使這種保護效力無法與ELISA測得的抗-PDIgG免疫應答相關聯。在以下實驗中采用了毛絲鼠中耳炎模型和以本實施例的11價制劑或實施例2的10價疫苗免疫的嬰兒獲得的血清匯集物(還可參見表1和2以及下方的注釋)。兩種匯集物均相對免疫前血清匯集物使得患中耳炎動物百分比的明顯減少。在10和11價免疫匯集物之間不存在顯著差異。這證明了兩種疫苗對于在該模型中誘導針對不可分型流感嗜血桿菌引起的中耳炎的保護具有類似的潛力。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例4:血清型19F載體蛋白的選擇采用的ELISA測定22F抑制ELISA法主要基于Conc印cion和Frasch在2001年提出的測定，并在Henckaerts等人，2006，ClinicalandVaccineImmunology13:356-360中報道。簡單而言，將純化的肺炎球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合，并吸附在N皿cMaxisorpTM(Roskilde，DK)高結合微量滴定板上4°C過夜。用含于PBS的10%胎牛血清(FBS)在室溫攪拌下封閉該板1小時。用含10%FBS、10iig/mL細胞壁多糖(SSI)禾P2yg/mL血清型22F的肺炎球菌多糖(ATCC)的PBS稀釋血清樣本，并用相同緩沖液在該微量滴定板上進一步稀釋。采用89-SF中血清型-特異性IgG濃度針對標準血清89-SF校準的內部參照以相同方式處理并包含在每塊板上。洗滌后，采用在10%FBS(含于PBS)中稀釋的過氧卜=dss—AZ.備J2IAaJd-荊啦Tf別n=cw-￡ll:斜*.-9.敏喻》紫扭^*咖裙拿棒"e^^s^貪容務塌^裙Atv"Ni^々、<=dz化物酶綴合的抗人IgG單克隆抗體(StratechScientificLtd.，Soham，UK)并在室溫小攪拌1小時孵育，以檢測結合抗體。采用即時可用的單組份四甲基聯苯胺過氧化物酶免疫測定底物試劑盒(BioRad，Hercules,CA，US)在室溫下暗處顯色。用H2S040.18M終止反應，在450nm下讀取光密度。通過參考內部參照血清曲線指定限度內的光密度點計算樣本中的血清型特異性IgG濃度(yg/mL)，所述曲線可通過用SoftMaxProTM(MolecularDevices，Sunnyvale,CA)軟件計算的4_參數邏輯對數方程建模。對于所有的血清型(考慮檢測限和定量極限)，ELISA的截斷為0.05iig/mLIgG。調理吞噬測定在2003年6月的WHO咨詢會議上建議使用Romero-Steiner等人ClinDiagnLabImmunol200310(6):卯1019_1024提出的OPA測定。該方案用于在如下試驗中測試血清型的OPA活性。綴合物制備在研究llPn-PD&Di-OOl以及llPn-PD&Di_007中包括了三種11價疫苗制劑(表4)，其中3g的19F多糖被綴合至白喉類毒素(19F-DT)，而非將1yg多糖綴合至蛋白D(19F-PD)。研究11Pn-PD、llPn-PD&Di-001禾PllPn-PD&Di_007的綴合參數分別披露于表5、6禾口7。這些19F-DT制劑進行初次免疫后一個月時針對血清型19F的抗肺炎球菌抗體應答和OPA活性分別顯示于表8和9中。表10顯示了在23價純多糖加強免疫之前和之后的22F-ELISA抗體濃度和達到0.2iig/mL閾值的對象比例。以這些19F-DT制劑誘導的抗體顯示明顯提高了調理吞噬活性，這可通過初次免疫后一個月時更高的血清陽性比例(調理吞噬效價^1:8)和OPAGMT得到證明(表9)。23價純多糖加強免疫后一個月時，19F抗體的調理吞噬活性依舊明顯高于用19F-DT制劑初次免疫的兒童(表ll)。表12顯示了在之前以19F-DT或19F-PD綴合物接種的幼兒在11Pn-PD加強劑量后與第四次連續Prevnar(S)劑量對比的免疫原性數據。考慮在美國Prevnar⑧的引入后報道的爆發案例，血清型19F綴合至DT載體蛋白時提高的調理吞噬活性可能對該候選疫苗有利。表13提供了19F-DT綴合物相對于交叉反應性血清型19A的ELISA和OPA數據。據發現19F-DT誘導了少量但明顯的針對19A的OPA活性。表4在臨床研究中所用的肺炎球菌綴合物疫苗制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表6用于llPn-PD&Di-OOl研究的PS肺炎鏈球菌-蛋白D/DT綴合物的特異件活仆,/鵬/艇脅<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎鏈球菌-蛋白D/DT綴合物的特異件活仆,/鵬/艇脅<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>〔0382〕〔0383〕謝8浙1ug19FIPEK3ug19FIDT勢Prevnar(2ug19F-CHM)哲突沙輸(,降)后一個月時的19F抗體濃度^0.20g/mL的對象的百分比和19F抗體幾何平均抗體濃度(95%CI的GMC;iig/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表9在1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫(全組)后一個月時的19F0PA效價^1:8的對象的百分比和19F0PAGMT<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表11對兒童以1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫后以23價純多糖加強免疫前或一個月后(全組)19F0PA效價^1:8的對象的百分比和19F0PAGMT<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表12對兒童以liig19F-PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)初次免疫后以llPn-PD或Prevnar加強免疫一個月后(全組)針對19F肺炎雙球菌的抗體濃度20iig/mL、OPA>1:8的對象的百分比和GMC/GMT<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。表13以1iig19F_PD、3iig19F-DT或Prevnar(2iig19F-CRM)(全組)初次免疫后一個月時針對19A肺炎雙球菌的抗體濃度》0.20iig/mL、OPA>1:8的對象的百分比禾口GMC/GMT<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>F不同制劑的組成在表4中提供。實施例5:在臨床前模型中的佐劑實驗對老年恒河猴中肺炎球菌11價多糖綴合物的免疫原性的影響為了優化老年群體中引發的對綴合肺炎球菌疫苗的應答，GSK配制了具有新型佐劑佐劑C的11價多糖(PS)綴合疫苗_見下文。5只老年恒河猴(14-28歲)組成的組在第0天和第28天以500的吸附在315iigA1P04上的11價PS綴合物或與佐劑C混合的11價PS綴合物進行肌肉內免疫。在兩種疫苗制劑中，該11價PS綴合物分別由以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用的疫苗為該疫苗的人用劑量的1/5劑量(除6B[10i！g]外每人用劑量每種糖5i！g)，該疫苗根據表6的條件(實施例4)綴合，除了19F參照如下CDAP工藝條件制備9mg/ml大小處理的糖、5mg/ml的PD、初始PD/PS比例為1.2/1、CDAP濃度為0.75mg/mgPS、pHa=pHc=pHq9.0/9.0/9.0且偶聯時間為60min。抗-PSELISAIgG水平和調理吞噬效價可在第42天采集的血清中測定。抗-PS3記憶B細胞頻率可從第42天采集的外周血細胞通過Elispot測定。根據下文所示的結果，佐劑C相比具有A1P04的綴合物明顯提高了老年猴中11價PS綴合物的免疫原性。該新型佐劑增強了對PS的IgG應答(圖1)和調理吞噬抗體效價(表14)。另有支持證據顯示通過使用佐劑C增加了PS3-特異性記憶B細胞的頻率(圖2)。表14在老年恒河猴中的綴合物免疫原性(II期后的調理_吞噬效價)PS1PS3PS4PS5PS銀PS7FP幼VPS14PS18CPS19FPS23F11.價AIP04免疫前n期后14天<8B181<864549<864164096鄰42<837<8169<864<8<6411價AdJ-C免疫前59<85837<8<8<8<8<8n期后14天7761351的1676620816384"116171322048<64B細胞Elispot該測定的原理依賴于記憶B細胞與CpG體外培養5天后發育成漿細胞的事實。體外生成的抗原特異性漿細胞可被容易地檢測，因此通過B細胞elispot測定進行計算。特異性漿細胞的數量反映了培養中發生的記憶B細胞的頻率。簡單而言，在涂覆了抗原的培養板上孵育體外生成的漿細胞。通過常規免疫-酶催化步驟檢測并作為記憶B細胞計算的抗原特異性漿細胞形成了抗體/抗原斑點。在本研究中，多糖曾被用于涂覆培養板，從而計算相應的記憶B細胞。結果表示為一百萬個記憶B細胞中PS特異性記憶B細胞的頻率。58該研究顯示佐劑C能夠減少PS3加強性的已知問題(參見5thlnternationalSymposiumonPneumococciandPneumococcalDiseases,April2—62006，AliceSprings,CentralAustralia)Specificitiesofimmuneresponsesagainstaserotype3pneumococcalconjugate.SchuermanL，PrymulaR，PoolmanJ.Abstractbookp245，P010.06)。實施例6解毒肺炎球菌溶血素(dPly)作為蛋白載體增強幼年Balb/c小鼠中的PS19F免疫原性的效力40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50的4價純PS或4價dPly-綴合PS(均與佐劑C混合)IM免疫。兩種疫苗制劑均由0.liig(糖的量)的各種如下PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天采集的血清中檢測抗-PSELISAIgG水平。與純PS免疫的小鼠相比，4價dPly綴合物免疫的小鼠中的抗-PS19F應答明顯增加(在圖3中作為范例顯示)。對于抗-PS8、12F和22FIgG應答，觀察到了相同的提高(數據未顯示)。實施例7肺炎球菌組氨酸三聯體蛋白D(PhtD)作為蛋白載體增強幼年Balb/c小鼠中的PS22F免疫原性的效力40只雌性Balb/c小鼠(4周大)的組在第0、14和28天用50iU的4價純PS或4價PhtD-綴合PS(均與佐劑C混合)IM免疫。兩種疫苗制劑均由0.1iig(糖的量)的各種如下PS組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天采集的血清中檢測抗-PSELISAIgG水平。與純PS免疫的小鼠相比，4價PhtD綴合物免疫的小鼠中的抗-PS22F應答明顯增加(在圖4中作為范例顯示)。對于抗-PS8、12F和19FIgG應答，觀察到了相同的提高(數據未顯示)。實施例8含19A-dPly和22F_PhtD的13價PS綴合物在老年C57B1小鼠中的免疫原性30只老年C57B1小鼠(>69周齡)的組在第0、14和28天用50yl的11價PS綴合物或13價PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對11價疫苗的注釋)。該13價疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中，該肺炎球菌溶血素載體通過GMBS處理解毒，在第3和第5組中，其通過甲醛解毒(該方法描述于W004/81515)。在第2和第3組中，PhtD被用于綴合PS22F，在第4和第5組中，采用了PhtD_E融合體(構建體VP147來自于W003/054007)。在第6組中，19A被綴合至白喉類毒素，22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平可通過如下步驟在第42天采集的單獨血清中確定。在匯集的血清中測量對其它PS生成的ELISAIgG應答。小鼠血清學歩驟:抗-PS19AELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中評估用含于PBS緩沖液的純化19A型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時。將血清加入微孔，并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板，添加抗_小鼠IgG-過氧化物酶綴合物(1/2500稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后，向每個微孔添加底物(含于10ml0.1MpH4.5檸檬酸鹽的4mgOPDA禾P5illH202)，反應進行15分鐘。添加INHCl終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過與參考曲線比較確定血清樣本中存在的抗-PS19AIgG水平，并以iig/ml表示。可由針對所添加血清的已知量的ELISA結果對每塊板生成參考曲線。抗-PS22FELISAIgG水平可用如下所述的步驟在第42天采集的血清中評估用含于PBS緩沖液的純化22F型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時。將血清加入微孔，并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板，添加抗_小鼠IgG抗體過氧化物酶綴合物(1/2500稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后，向每個微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5illH202)，反應進行15分鐘。添加INHCl終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平，并以yg/ml表示。除了將小鼠血清匯集以外，可參照相同的步驟實現針對所有其它血清型的免疫應答。在13價綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F_PhtD在老年C57B1小鼠中顯示了免疫原性(表15)。與用ll價疫苗制劑免疫的小鼠相比，用13價制劑免疫的小鼠中針對其他PS誘導的免疫應答未受到負面影響。表15在老年C57B1小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)60<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>NR-未測得實驗結果小鼠OPA步驟將血清樣本在56t:下加熱45分鐘，以滅活任意殘留的內源性補體。將每等分二十五微升的每種1:2稀釋的血清樣本在96孔圓底微量滴定板的每個微孔中以25OPA緩沖液(HBSS-14.4%滅活FBS)兩倍系列稀釋。然后，將25的活化HL-60細胞(IX107細胞/ml)、新鮮解凍的肺炎球菌工作種子和新鮮解凍的幼兔補體混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀釋的血清中，以得到50iU的終體積。將測定板在37t:下定軌振蕩(210rpm)孵育2小時，以促進吞噬過程。通過將微量滴定板在冰上放置至少1分鐘終止反應。將板上每個微孔的20i！1等分轉移至96孔平底微量滴定板的相應微孔中，并向每個微孔添加50ii1Todd-HewittBroth-O.9%瓊脂。在37"和5%C02下孵育過夜后，在瓊脂中出現肺炎球菌集落，采用自動化圖像分析系統(KS400，Zeiss,Oberkochen，Germany)進行計數。八個無血清樣本的微孔被用作細菌對照，以確定每個微孔的肺炎球菌數量。測定對照微孔的CFU平均數，并用于計算每個血清樣本的殺傷活性。血清樣本的OPA效價可通過能夠殺傷50%的肺炎球菌的血清的倒數(reciprocal)稀釋進行確定。調理吞噬效價可采用4參數曲線擬合分析進行計算。調理吞噬測定的結果顯示于圖13和14中。實施例9含19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性30只幼年Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50iU的11價PS綴合物或13價PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對11價疫苗的注釋)。該13價疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中，該肺炎球菌溶血素載體通過GMBS處理解毒，在第3和第5組中，其通過甲醛解毒(該方法描述于WO04/81515)。在第2和第3組中，PhtD被用于綴合PS22F，在第4和第5組中，采用了PhtD_E融合體(構建體VP147來自于WO03/054007)。在第6組中，19A被綴合至白喉類毒素，22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平可在第42天采集的單獨血清中確定。在匯集的血清中測量對其它PS生成的ELISAIgG應答。在13價綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中顯示了免疫原性(表16)。與用ll價疫苗制劑免疫的小鼠相比，用13價制劑免疫的小鼠中針對其他PS誘導的免疫應答未受到負面影響。ELISA按照實施例8所述進行。表16在幼年Balb/c小鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>NR-未測得實驗結果小鼠OPA歩驟:將血清樣本在56t:下加熱45分鐘，以滅活任意殘留的內源性補體。將每等分二十五微升的每種1:2稀釋的血清樣本在96孔圓底微量滴定板的每個微孔中以25OPA緩沖液(HBSS-14.4%滅活FBS)兩倍系列稀釋。然后，將25的活化HL-60細胞(IX107細胞/ml)、新鮮解凍的肺炎球菌工作種子和新鮮解凍的幼兔補體混合物以例如4/2/1比例(v/v/v)添加至稀釋的血清中，以得到50iU的終體積。將測定板在37t:下定軌振蕩(210rpm)孵育2小時，以促進吞噬過程。通過將微量滴定板在冰上放置至少1分鐘終止反應。將板上每個微孔的20i！1等分轉移至96孔平底微量滴定板的相應微孔中，并向每個微孔添加50ii1Todd-HewittBroth-O.9%瓊脂。在37"和5%C02下孵育過夜后，在瓊脂中出現肺炎球菌集落，采用自動化圖像分析系統(KS400，Zeiss,Oberkochen，Germany)進行計數。八個無血清樣本的微孔被用作細菌對照，以確定每個微孔的肺炎球菌數量。測定對照微孔的CFU平均數，并用于計算每個血清樣本的殺傷活性。血清樣本的OPA效價可通過能夠殺傷50%的肺炎球菌的血清的倒數稀釋進行確定。調理吞噬效價可采用4參數曲線擬合分析進行計算。結果顯示于圖15和16。在alum制劑中的結是:含19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在幼年Balb/c小鼠中的免疫原性40只幼年Balb/c小鼠(4周齡)的組在第0、14和28天用50的11價PS綴合物或13價PS綴合物(均吸附在A1P04上)IM免疫。同時施用InfanrixHexa。該11價疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對11價疫苗的注釋)。該13價疫苗制劑額外包含0.1iig的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中，該肺炎球菌溶血素載體通過GMBS處理解毒，在第3和第5組中，其通過甲醛解毒。在第2和第3組中，PhtD被用于綴合PS22F，在第4和第5組中，采用了PhtD_E融合體(構建體VP147來自于W003/054007)。在第6組中，19A被綴合至白喉類毒素，22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平以及調理吞噬效價可在第42天采集的單獨血清中確定。在匯集的血清中測量對其它PS生成的ELISAIgG應答。在13價綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年Balb/c小鼠中顯示了免疫原性和調理吞噬效價(表17和圖19-20)。與用11價疫苗制劑免疫的小鼠相比，用13價制劑免疫的小鼠中針對其他PS誘導的免疫應答未受到負面影響。調理吞噬測定被用于評估該血清，結果顯示于圖19和20。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>或13價PS綴合物(均吸附在A1P04上)IM免疫。同時施用InfanrixHexa。該11價疫苗制劑由如下每種綴合物的0.1iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4_PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對11價疫苗的注釋)。該13價疫苗制劑額外包含0.1g的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中，該肺炎球菌溶血素載體通過GMBS處理解毒，在第3和第5組中，其通過甲醛解毒(該方法描述于W004/81515)。在第2和第3組中，PhtD被用于綴合PS22F，在第4和第5組中，采用了PhtD_E融合體(構建體VP147來自于W003/054007)。在第6組中，19A被綴合至白喉類毒素，22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平以及調理吞噬效價可在第42天采集的單獨血清中確定。在匯集的血清中測量對其它PS生成的ELISAIgG應答。在13價綴合物疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼年0F1小鼠中顯示了免疫原性和調理吞噬效價(表18和圖21-22)。與用ll價疫苗制劑免疫的小鼠相比，用13價制劑免疫的小鼠中針對其他PS誘導的免疫應答未受到負面影響。該血清同樣通過調理吞噬測定評估，結果顯示于圖21和22。實施例10含19A-dPly和22F_PhtD的13價PS綴合物在豚鼠中的免疫原性[O476]20只幼年豚鼠(Hartley株；5周齡)的組在第0、14和28天用125的11價PS69<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>綴合物或13價PS綴合物(均與佐劑C混合)IM免疫(見下文)。該11價疫苗制劑由如下每種綴合物的0.25iig糖組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V_PD、PS14_PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1和表2下方對11價疫苗的注釋)。該13價疫苗制劑額外包含0.1g的PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1和表2下方對13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在第2和第4組中，該肺炎球菌溶血素載體通過GMBS處理解毒，在第3和第5組中，其通過甲醛解毒。在第2和第3組中，PhtD被用于綴合PS22F，在第4和第5組中，采用了PhtD—E融合體(構建體VP147來自于W003/054007)。在第6組中，19A被綴合至白喉類毒素，22F被綴合至蛋白D。抗-PS19A和22FELISAIgG水平可通過如下方案在第42天采集的單獨血清中確定。在匯集的血清中測量對其它PS生成的ELISAIgG應答。隨血齢雄:抗-PS19AELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中評估用含于PBS緩沖液的純化19A型肺炎球菌PS(IOyg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時。將血清加入微孔，并在PBS-BSA0.05XTween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板，添加抗-豚鼠IgG過氧化物酶綴合物(1/1000稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后，向每個微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5y1H202)，反應進行15分鐘。添加INHC1終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS19AIgG水平，并以yg/ml表示。抗-PS22FELISAIgG水平可用如下所述步驟在第42天采集的血清中確定用含于PBS緩沖液的純化22F型肺炎球菌PS(10yg/ml)在37。C下涂覆微量滴定板2小時。用NaCl0.9%mM-Tween200.05%洗滌滴定板四次。將血清與含于PBS0.05%Tween20的50yg/mlCPS(V/V)在37。C下孵育1小時。將血清加入微孔，并在PBS-BSA0.05%Tween0.05%中系列稀釋(兩倍稀釋步驟)。將滴定板在室溫下攪拌孵育30分鐘。參照上文洗滌滴定板，添加抗_豚鼠IgG過氧化物酶綴合物(1/1000稀釋)并將滴定板在室溫下孵育30分鐘。洗滌后，向每個微孔添加底物(含于10ml檸檬酸鹽0.1MpH4.5的4mgOPDA和5iUH202)，反應進行15分鐘。添加INHC1終止反應。使用分光光度計讀取490-620nm下的吸收值。形成的顏色與血清中存在的抗體的量成直接比例。通過與各板上添加血清的參考曲線比較確定未知血清中存在的抗-PS22FIgG水平，并以yg/ml表示。除了將豚鼠血清匯集以外，可根據相同的步驟實現針對所有其它血清型的免疫應答。表19在豚鼠中的PS免疫原性(III期后IgG水平)70<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>調理吞噬測定同樣被用于測試該血清，結果顯示于圖17和18。實施例11制備和測試的制劑a)制備以下制劑(采用了表1的13價疫苗和表5的血清型3_參見表2下方關于14價疫苗的注釋[采用了直接綴合的22F或通過ADH接頭綴合])。所述糖按如下所示與磷酸鋁和3D-MPL配制。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>b)向相同的糖制劑添加如下佐劑中的每一種-在下文的表中顯示了每500ii1劑量的乳液成分的濃度。佐劑A1佐劑A2佐劑A3成分250ii10,乳液125ii1o/w乳液50ii1o/w乳液a生育酚11.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg5.35mg2.14mgTween804.85mg2.43mg0.97mg佐劑A4佐劑A5佐劑A6佐劑A7成分250ii10,250ii1o/w乳125ii10,乳50ii1o/w乳液液液乳液a生育酚11.88mg11.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg10.7mg5.35mg2.14mgTween804.85mg4.85mg2.43mg0.97mg3D-MPL50iig25iig25iig10iigc)該糖還可與兩種基于脂質體的佐劑配制佐劑B1組成性質數量(每0.5mL劑量)脂質體-D0PClmg-膽固醇O.25mg3DMPL50ugQS2150iigKH2P0413.124mg緩沖液Na2HP0410.290mg緩沖液NaCl2.922mg(lOOmM)WFI添加額外(q.s.ad)0.5ml溶劑p服.11.總P04濃度二50mM佐劑B2組成性質數量(每0.5mL劑量)脂質體-DOPC0.5mg-膽固醇O.125mg3DMPL25iigQS2125ugKH2P0413.124mg緩沖液Na2HP0410.290mg緩沖液NaCl2.922mg(lOOmM)WFI添加額外0.5ml溶劑pH6.1d)該糖還可與佐劑C配制(參見上文使用了該佐劑的其它組合物)性質數量(每0.5mL劑量)水包油乳液50ul-角鯊烯2.136mg-a-生育酚2.372mg-Tween800.97mg-膽固醇O.lmg3DMPL50ygQS2150iigKH2P0410.470mg緩沖液Na2HP0410.219mg緩沖液NaCl4.003mg74(137mM)KC10.lOlmg(2.7mM)WFI添加額外0.5ml溶劑p朋.8實施例12綴合化學對22F-PhtD綴合物在Balb/c小鼠中免疫原性的影響30只雌性Balb/c小鼠的組在第0、14和28天用包含PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價PS制劑(劑量:對于PS4、18C、19A、19F和22F為0.3iig糖/綴合物，對于其它PS為0.liig糖/綴合物)肌肉內(IM)途徑免疫。PS18C被綴合至破傷風類毒素，19F被綴合至白喉類毒素，19A被綴合至甲醛_解毒Ply，22F被綴合至PhtD，其它PS被綴合至PD。對通過直接CDAP化學制備的22F-PhtD或22F_AH_PhtD(ADH衍生PS)組成的兩種制劑進行比較。以直接綴合或通過ADH間隔基綴合22F制備的13價疫苗的特征參見實施例2，表1以及表2下方的注釋。該疫苗制劑添加了佐劑C。抗-PS22FELISAIgG水平和調理吞噬效價在42天采集的血清中測定。對于IgG水平(圖5)和調理吞噬效價(圖6)，22F-AH-PhtD均顯示了比22F_PhtD高得多的免疫原性。實施例13新佐劑對肺炎鏈球菌莢膜PS綴合物的免疫原性的影響40只幼年C57B1小鼠的組在第0、14和28天用包含PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價PS制劑(劑量:對于PS4、18C、19A、19F和22F為0.3iig/綴合物，對于其它PS為0.1iig/綴合物)IM途徑免疫。PS18C被綴合至破傷風類毒素，19F被綴合至白喉類毒素，19A被綴合至甲醛_解毒Ply，22F被綴合至PhtD，其它PS被綴合至PD。以22F直接綴合制備的13價疫苗的特征參見實施例2，表1以及表2下方的注釋。添加了A1P(V佐劑Al、佐劑A4或佐劑A5的四種制劑進行對比。在42天采集并每組匯集的血清中測定抗_PS、Ply、PhtD和PDELISAIgG水平。對每種抗原計算以下比例以所測試新佐劑誘導的IgG水平/以A1P0J秀導的IgG水平。與經典的A1P04制劑相比，所有測試的新型佐劑使得對血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和22F綴合物的免疫應答均提高了至少2倍(圖7)。在本實驗中，血清型23F未獲得可靠應答。實施例14PhtD/解毒Ply組合在肺炎球菌猴肺炎模型中的保護效力將按照具有最低預先存在的抗-19F抗體水平選擇的6只恒河猴(3至8歲)的組在第0和28天用包含PS綴合物(即，1yg[糖的]PS1、3、5、6B、7F、9V、14和23F以及3iigPS4、18C和19F)或PhtD(10iig)+甲醛-解毒Ply(10iig)或PhtD/E融合蛋白(10iig)和甲醛-解毒Ply(10iig)或單獨的佐劑肌肉內免疫。PS18C被綴合至破傷風類毒素，19F被綴合至白喉類毒素，其它PS被綴合至PD。11價疫苗的特征參見實施例2，表1以及表2下方的注釋。所有制劑添加了佐劑C。在第42天于右肺中接種19F型肺炎球菌(5.108cfu)。在攻擊后第1、3和7天采集的支氣管肺泡灌洗液中對集落進行計數。所述結果表示為攻擊后7天每組死亡、肺部移生或清除的動物數量。如圖8所示，與單獨佐劑組相比，ll價綴合物和PhtD+dPly組合獲得了接近統計顯著性(盡管所用動物數量較少)的良好保護(P<0.12，Fisher精確檢驗)。實施例15綴合化學對針對22F-PhtD綴合物誘導的4型攻擊的抗-PhtD抗體應答和保護效力的影響20只雌性0F1小鼠的組在第0禾P14天用3iig的22F-PhtD(通過直接CDAP化學制備)或22F-AH-PhtD(ADH-衍生PS)或單獨的佐劑肌肉內途徑免疫。兩種單價22F綴合物均通過實施例2的方法制備(也參見表1和表2)。每種制劑均添加佐劑C。在第28天采集的血清中檢測抗-PhtDELISAIgG水平。在第29天用5.106cfu的4型肺炎球菌鼻內攻擊小鼠(即，未被所測試疫苗制劑中存在的PS所潛在涵蓋的肺炎球菌血清型)。監測死亡率至攻擊后10天。圖9所示的結果證明了與22F-PhtD相比，22F_AH_PhtD誘導了明顯更高的抗-PhtDIgG應答。如在圖10中所示反映，與22F-PhtD相比，對4型攻擊有更好的保護。實施例16在生成保護性免疫應答中結合多糖和蛋白的益處在小鼠致命肺炎鏈球菌攻擊模型中評估了針對PhtD和莢膜多糖的免疫應答之間的潛在協同作用。小鼠以PhtD肌肉內免疫三次(第0、14和28天)。在細菌攻擊前一小時，將抗多糖抗體被動轉移至小鼠(IP，200iU)。在攻擊后8或11天通過肺炎鏈球菌誘導致死率。這里對兩種肺炎鏈球菌菌株(血清型3和血清型1)存在保護的協同作用。肺炎鏈球菌3/43攻擊模型在此實驗中，用吸附在AlP04上的PhtD免疫0Fl小鼠，并在用肺炎鏈球菌血清型3(Spn3/43)攻擊前1小時被動轉移1.25yg抗-PS3豚鼠抗體。結果顯示于圖11。在僅接受PBS的小鼠中觀察到了70%的致死率。在接受抗-PS3抗體或以PhtD免疫的小鼠的組中觀察到了中等的保護。在結合了分別針對PhtD和PS3的主動和被動免疫的小鼠中得到了幾乎導致完全保護的協同作用。肺炎鏈球菌血清型1/57攻擊模型在此實驗中，用添加了TH1佐劑的PhtD免疫0F1小鼠，并在用肺炎鏈球菌血清型l(Spn1/57)攻擊前一小時被動轉移抗-PSl豚鼠抗體。結果顯示于圖12。在僅接受了TH1佐劑(主動免疫)和PBS(被動免疫)的對照組的小鼠中觀察到了較高的致死率。在接受抗-PSl抗體(55%存活)或以PhtD免疫(25%存活)的小鼠的組中觀察到了中等的保護。在結合了分別針對PhtD和PSl的主動和被動免疫的小鼠中得到了幾乎導致完全保護的協同作用。這些數據支持在針對肺炎鏈球菌感染的保護機制中針對肺炎鏈球菌蛋白(即PhtD)和莢膜多糖的免疫應答的協同作用。實施例17肺炎球菌PS-TT和PS-DT綴合物對11價疫苗制劑中剩余的肺炎球菌PS-PD綴合物免疫應答的影響含有11PS-PD綴合物的制劑與含有7PS-PD、2PS-TT(PS6B和23F)和2PS-DT(PS18C和19F)綴合物的制劑在小鼠和豚鼠免疫原性模型中比較。小鼠用疫苗人用劑量的1/10(0.1iigPS)肌肉內免疫三次。在第42天采集血液樣本，通過ELISA測定針對每種多糖的免疫應答。豚鼠用疫苗人用劑量的1/4(0.25iigPS)肌肉內免疫三次。同時施用InfanrixHexa以模擬人的情形。在第42天采集血液樣本，通過ELISA測定針對每種多糖的免疫應答。E:實驗N。PN115(plms20040304)小鼠ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>含有與TT(PS6B和23F)和DT(PS18C和19F)綴合的兩種多糖的制劑與11-VPD制劑相比，在小鼠和豚鼠中均觀察到針對與PD綴合的大部分多糖的增加的免疫應答。這些差異分別在小鼠和豚鼠中針對PS1、4、5、9V和14以及PS1、7F和14具有統計顯著性。權利要求包含至少7種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性組合物，所述肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物包括來自血清型19A和19F的莢膜糖綴合物，其中19A與第一細菌類毒素綴合，19F與第二細菌類毒素綴合，而2-9種肺炎鏈球菌莢膜糖與蛋白D綴合。2.如權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述第一細菌類毒素是不同于所述第二細菌類毒素的蛋白。3.如權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中所述第一細菌類毒素選自破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細菌溶細胞素以及肺炎球菌溶血素。4.如權利要求l-3任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述第二細菌類毒素選自破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細菌溶細胞素和肺炎球菌溶血素。5.如權利要求l-4任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述第一細菌類毒素為肺炎球菌溶血素。6.如權利要求l-5任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述第二細菌類毒素為白喉7.如權利要求1-6任意一項所述的免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C和23F莢膜糖綴合物。8.如權利要求1-7所述的免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌血清型1、5和7F莢膜糖綴合物。9.如權利要求1-8所述的免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌血清型22F莢膜糖綴合物。10.如權利要求1-9所述的免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌莢膜糖3綴合物。11.如權利要求1-10所述的免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌莢膜糖6A綴合物。12.如權利要求1-11任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖中的第3、4或5型與蛋白D綴合。13.如權利要求7-12任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型4莢膜糖與蛋白D綴合。14.如權利要求8-13任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型5莢膜糖與蛋白D綴合。15.如權利要求8-14任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型7F莢膜糖與蛋白D綴合。16.如權利要求7-15任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型9V莢膜糖與蛋白D綴合。17.如權利要求7-16任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型14莢膜糖與蛋白D綴合。18.如權利要求9-17任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型22F莢膜糖與蛋白D綴合。19.如權利要求7-18任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述血清型23F莢膜糖與蛋白D綴合。20.如權利要求l-19任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖中的少數與蛋白D綴合。21.如權利要求1-20任意一項所述的免疫原性組合物，其中3種不同的載體蛋白分別與至少3種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。22.如權利要求1-21任意一項所述的免疫原性組合物，其中4種不同的載體蛋白分別與至少4種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。23.如權利要求l-22任意一項所述的免疫原性組合物，其中5種不同的載體蛋白分別與至少5種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。24.如權利要求1-22任意一項所述的免疫原性組合物，其中6種不同的載體蛋白分別與至少6種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。25.如權利要求21-24任意一項所述的免疫原性組合物，其包含了選自如下的3、4、5或6種載體蛋白破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D和PhtD或其融合蛋白。26.如權利要求l-25所述的免疫原性組合物，其包含與破傷風類毒素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖18C。27.如權利要求l-26所述的免疫原性組合物，其包含與肺炎球菌溶血素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖19A。28.如權利要求l-27所述的免疫原性組合物，其包含與PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖22F。29.如權利要求l-28所述的免疫原性組合物，其包含與肺炎球菌溶血素或流感嗜血桿菌蛋白，可選的蛋白D或PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖6A。30.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中19A莢膜糖直接與所述載體蛋白綴合。31.如權利要求l-29任意一項所述的免疫原性組合物，其中19A莢膜糖通過接頭與所述載體蛋白綴合。32.如權利要求31所述的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。33.如權利要求31或32所述的免疫原性組合物，其中所述接頭通過碳二亞胺化學，可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。34.如權利要求30-33任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述19A糖與所述載體蛋白綴合或用CDAP化學與接頭綴合。35.如權利要求l-30任意一項所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白與19A糖的比例介于5:i禾pi:5、4:i禾pi:l或3.5:l禾P2.5:1(w/w)之間。36.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖直接與所述載體蛋白綴合。37.如權利要求l-35任意一項所述的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖通過接頭與所述載體蛋白綴合。38.如權利要求37所述的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。39.如權利要求37或38所述的免疫原性組合物，其中所述接頭通過碳二亞胺化學，可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。40.如權利要求36-39任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述19F糖與所述載體蛋白綴合或通過CDAP化學與所述接頭綴合。41.如權利要求l-40任意一項所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白與19F糖的比例介于5:i禾卩i:5、4:i禾卩i:i或2:i禾卩i:1(w/w)之間。42.如權利要求1-41任意一項所述的免疫原性組合物，其包含與所述載體蛋白直接綴合的22F莢膜糖。43.如權利要求1-41任意一項所述的免疫原性組合物，其包含與所述載體蛋白通過接頭綴合的22F莢膜糖。44.如權利要求43所述的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。45.如權利要求43或44所述的免疫原性組合物，其中所述接頭通過碳二亞胺化學，可選地采用EDAC與所述載體蛋白連接。46.如權利要求42-45任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述22F糖與所述載體蛋白綴合或使用CDAP化學與所述接頭綴合。47.如權利要求1-46任意一項所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白與22F糖的比例介于5:i禾pi:5、4:i禾pi:i或2:i禾pi:i(w/w)之間。48.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中19A糖的平均大小在100kDa以上。49.如權利要求48所述的免疫原性組合物，其中19A糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或140-160kDa之間。50.如權利要求48或49所述的免疫原性組合物，其中所述19A糖為天然多糖或以不超過x5的因子進行大小處理。51.如權利要求48、49或50所述的免疫原性組合物，其中所述19A糖已通過微射流進行大小處理。52.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述19A糖綴合物的劑量為介于1-10iig、2-8iig或3-7iig的糖之間。53.如權利要求52所述的免疫原性組合物，其中所述19A糖綴合物的劑量為5iig的糖。54.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含22F糖綴合物，其中所述22F糖的平均大小在100kDa以上。55.如權利要求54所述的免疫原性組合物，其中22F糖的平均大小介于110-700kDa、110-300、120-200、130-180或150-170kDa之間。56.如權利要求54或55所述的免疫原性組合物，其中22F糖為天然多糖或以不超過x5的因子進行大小處理。57.如權利要求54、55或56所述的免疫原性組合物，其中22F糖已通過微射流進行大小處理。58.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含22F糖綴合物，其中所述22F糖綴合物的劑量為介于1-10iig、2-8iig或3-7yg的糖之間。59.如權利要求58所述的免疫原性組合物，其中22F糖綴合物的劑量為5yg的糖。60.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述糖的平均大小在50kDa以上。61.如權利要求60所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于300和400kDa之間的血清型1。62.如權利要求60和61所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于75和125kDa之間的血清型4。63.如權利要求60、61和62所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于350和450kDa之間的血清型5。64.如權利要求60-63任意一項所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于1000和1400kDa之間的血清型6B。65.如權利要求60-64任意300kDa之間的血清型7F。66.如權利要求60-65任意300kDa之間的血清型9V。67.如權利要求60-66任意250kDa之間的血清型14。68.如權利要求60-67任意1000kDa之間的血清型23F。69.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含作為天然糖的血清型5、6B和23F(以及可選的6A)。70.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖綴合物的劑量為每種綴合物介于1-10yg、1-5iig或1-3iig的糖之間。71.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含每種綴合物的劑量為3yg糖的血清型4、18C和19F(以及可選的19A和22F)。72.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含每種綴合物的劑量為liig糖的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F(以及可選的6A和/或3)。73.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其進一步包含血清型不同于綴合的血清型的未綴合肺炎鏈球菌糖，使得綴合和未綴合糖血清型的數量少于或等于23。74.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其進一步包含一種或多種未綴合或綴合的肺炎鏈球菌蛋白。75.如權利要求74所述的免疫原性組合物，其包含一種或多種未綴合的肺炎鏈球菌蛋白。76.如權利要求74或75所述的免疫原性組合物，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌蛋白選自聚組氨酸三聯體家族(PhtX)、膽堿結合蛋白家族(CbpX)、截短CbpX、LytX家族、截短LytX、截短CbpX-截短LytX嵌合蛋白、解毒肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33。77.如權利要求74、75或76所述的免疫原性組合物，其包含肺炎球菌溶血素。78.如權利要求74-77任意一項所述的免疫原性組合物，其包含PhtX蛋白。79.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含作為游離或載體蛋白的肺炎球菌溶血素。80.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其包含作為游離或載體蛋白的PhtX蛋白。項所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于200和項所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于250和項所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于200和項所述的免疫原性組合物，其包含平均糖大小介于900和81.如權利要求80所述的免疫原性組合物，其中所述PhtX蛋白為PhtD，或者，PhtBD或PhtDE融合蛋白。82.如前述任意一項權利要求所述的免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。83.如權利要求82所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含脂質體載體。84.如權利要求83所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.l-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-lmg(如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或lmg)磷月旨(例如DOPC)。85.如權利要求83或84所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。86.如權利要求83-85任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。87.如權利要求83-86任意一項所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。88.如權利要求82所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含水包油乳液。89.如權利要求88所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.5-15、l-13、2-ll、4-8或5-6mg(如2-3、5-6或10-llmg)可代謝的油(例如角鯊烯)。90.如權利要求88或89所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每O.5mL劑量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、l-4或2-3mg(如0.9-1.1、2_3或4-5mg)乳化齊U(例如Tween80)。91.如權利要求88-90所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)O.5-20、l-15、2-12、4-10、5-7mg(如11-13、5-6或2-3mg)母育酚(例如a生育酚)。92.如權利要求88-91所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。93.如權利要求88-92所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。94.如權利要求88-93所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50iig)皂武(例如QS21)。95.如權利要求82所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含金屬鹽和脂質A衍生物。96.如權利要求95所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)100-750、200-500或300-400iig磷酸鋁形式的Al。97.如權利要求95或96所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)5-60、10-50或20-30iig(如5-15、40_50、10、20、30、40或50yg)脂質A衍生物(例如3D-MPL)。98.如權利要求1-97任意一項所述的免疫原性組合物，其至少或恰好包含與PhtD或其融合蛋白綴合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種肺炎鏈球菌莢膜糖。99.如權利要求l-97任意一項所述的免疫原性組合物，其至少或恰好包含與肺炎球菌溶血素綴合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13種肺炎鏈球菌莢膜糖。100.疫苗試劑盒，其包含如權利要求l-97任意一項所述的免疫原性組合物，并進一步包含用于同時或依次施用的如權利要求83-99任意一項所定義的佐劑。101.疫苗，其包含如權利要求l-99任意一項所述的免疫原性組合物及藥學上可接受的賦形劑。102.制備如權利要求101所述的疫苗的方法，其包括將如權利要求1-99任意一項所述的免疫原性組合物與藥學上可接受的賦形劑相混合的步驟。103.對人類宿主進行免疫以對抗肺炎鏈球菌感染引起的疾病的方法，其包括向所述宿主施用免疫保護劑量的如權利要求1-99任意一項所述的組合物或如權利要求101所述的疫苗。104.如權利要求103所述的方法，其中所述人類宿主為老年人，且所述疾病是肺炎或侵襲入性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或兩者。105.如權利要求103或104所述的方法，其中所述人類宿主為老年人，且所述疾病是慢性阻塞性肺病(C0PD)的惡化。106.如權利要求103所述的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，且所述疾病為中耳炎。107.如權利要求103或106所述的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，且所述疾病為腦膜炎和/或菌血癥。108.如權利要求103、106或107所述的方法，其中所述人類宿主為嬰兒，且所述疾病為肺炎和/或結膜炎。109.如權利要求1-99所述的免疫原性組合物或如權利要求101所述的疫苗，其用于預防治療由肺炎鏈球菌感染引起的疾病。110.如權利要求1-99所述的免疫原性組合物或疫苗或如權利要求101所述的疫苗在生產用于治療或預防由肺炎鏈球菌感染引起的疾病的藥物中的用途。111.如權利要求iio所述的用途，其中所述疾病是老年人的肺炎或侵襲性肺炎球菌性疾病(IPD)之一或兩者。112.如權利要求110或111所述的用途，其中所述疾病是老年人慢性阻塞性肺病(C0PD)的惡化。113.如權利要求110所述的用途，其中所述疾病是人類嬰兒的中耳炎。114.如權利要求110或113所述的用途，其中所述疾病是人類嬰兒的腦膜炎和/或菌血癥。115.如權利要求110U13或114所述的用途，其中所述疾病是人類嬰兒的肺炎和/或結膜炎。116.在嬰兒體內引發對抗中耳炎的保護性免疫應答的方法，其包括作為單獨或組合成分相繼或同時施用(i)如權利要求l-99任意一項所述的免疫原性組合物或疫苗和(ii)來自流感嗜血桿菌的蛋白D，其中所述蛋白D可以是游離的和/或綴合的。117.通過施用任意前述權利要求的免疫原性組合物或疫苗在嬰兒體內引發對抗肺炎鏈球桿菌的保護性免疫應答的方法。118.引發老年患者對抗肺炎鏈球桿菌的保護性免疫應答的方法，其通過相繼或同時聯合施用如下成分(i)如前述任意權利要求所述的免疫原性組合物或疫苗，(ii)選自PhtX家族和肺炎球菌溶血素的一種或多種肺炎鏈球菌表面蛋白。119.如權利要求1-99所述的免疫原性組合物或權利要求101所述的疫苗，其包含由至少所有如下血清型衍生的糖綴合物4、6b、9v、14、18c、19f、23f、1、5、7f，其中在人類疫苗接種者中針對一種或多種疫苗成分4、6b、9v、14、18c、19f和23f誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。120.如權利要求119所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型4誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。121.如權利要求119或120所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型6b誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導的gmc抗體效價。122.如權利要求119-121所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型9v誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnar⑧疫苗誘導的gmc抗體效價。123.如權利要求119-122所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型14誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。124.如權利要求119-123所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型18c誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。125.如權利要求119-124所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型19f誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。126.如權利要求119-125所述的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型23f誘導的gmc抗體效價不明顯低于由Prevnai^疫苗誘導的gmc抗體效價。127.如權利要求119-126所述的免疫原性組合物，其包含血清型3糖綴合物。128.如權利要求119-127所述的免疫原性組合物，其包含血清型6a糖綴合物。129.如權利要求119-128所述的免疫原性組合物，其包含血清型19a糖綴合物。130.如權利要求119-129所述的免疫原性組合物，其包含血清型22f糖綴合物。131.如權利要求119-130所述的免疫原性組合物，其包含結晶填充劑，任選甘露糖醇。132.如權利要求131所述的免疫原性組合物，其包含糖，任選蔗糖。133.免疫原性組合物，其包含至少四種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，其含有來自不同肺炎鏈球菌血清型的糖，其中至少一種糖綴合PhtD或其融合蛋白，且所述免疫原性組合物能夠引發針對PhtD的有效免疫應答。全文摘要本發明披露了包含來自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物(capsularsaccharideconjugates)的免疫原性組合物，其中19A與第一細菌類毒素綴合，19F與第二細菌類毒素綴合。本發明還描述了疫苗、制備疫苗的方法以及該疫苗的用途。文檔編號A61P31/04GK101784282SQ200880104210公開日2010年7月21日申請日期2008年6月24日優先權日2007年6月26日發明者J·普爾曼,P·V·赫爾曼,R·L·比曼斯申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司