Cripto結合分子的制作方法

專利名稱：Cripto結合分子的制作方法
CRIPTO結合分子相關申請本申請要求2007年6月1日提交的名為“Cripto Binding Molecules (Cripto結 合分子)，，的USSN 60/932，879的優先權。本申請與2006年1月5日提交的名為“Cripto Binding Molecules (Cripto結合分子)”的國際專利申請PCT/US2006/000502相關。本申請 還與2005年1月 5 日提交的名為“Purification andPreferential Synthesis of Binding Molecules (純化和優先合成結合分子)”的USSN 60/641691相關。本申請還與2003年6 月 27 日提交的名為“Purificationand Preferential Synthesis of Polyp印tides (純化 和優先合成多肽)”的USSN60/483877和2003年10月3日提交的名為“Purification and PreferentialSynthesis of Antigen Binding Polyp印tides (純化和優先合成抗原結合多 肽)”的USSN 60/508，810相關。本申請還與2004年6月28日提交的名為“Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules (純化和優先合成結合分子)”的 USSN 10/880，320相關。本申請還與2004年9月20日提交的名為“Cripto-Specific Antibodies (Cripto特異性抗體)”的USSN 10/945，853、2003年10月23日提交的名為 "Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof (Cripto 封閉抗體及其應用)”的 USSN 10/693，538、2002年3月 22 日提交的名為“Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto (針對Cripto的配體結合域的抗體)”的美國專利申請60/367，002 ；2001 年 6 月 26 日提交的名為"Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof (Cripto 封閉 抗體及其應用)”的申請60/301，091 ；2001年5月17日提交的名為“Antibodies Directed to theLigand Binding Domain of Cripto (針對Cripto的配體結合域的抗體)”的申請 60/293,020 ；以及 2001 年 4 月 26 日提交的名為 “Antibodies Directed to theLigand Binding Domain of cripto (針對Cripto的配體結合域的抗體)”的申請60/286, 782相 關。這些專利申請每一個的內容均通過該引用整體并入本文。
背景技術：
抗體及其各種工程化形式是目前用于治療患有多種病癥的患者的有效治療 劑。這些抗體中的一些識別位于腫瘤細胞表面上的抗原。Cripto是一種許多腫瘤細 胞過表達的188個氨基酸的細胞表面蛋白。在人胚胎癌文庫的cDNA篩選中分離到了 Cripto (Ciccodicola 等人，1989，EMBO J. 8 1987-91)。Cripto 最初被劃分為 EGF 家族的成 員(Ciccodicola等人，同上)；但是，后來的分析表明Cripto不與任何已知EGF受體結合， 它的EGF樣的結構域實際上與EGF家族是趨異的(Bianco等人，1999，J. Biol. Chem. 274 8624-29)。Cripto蛋白的過表達與許多組織(包括但不限于腦、乳腺、睪丸、結腸、肺、卵巢、 膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃)的腫瘤相關。Panico等人，1996，Int. J. Cancer 65:51-56; Byrne 等人，1998，J. Pathology 185 108-11 ；De Angelis 等人，1999，Int. J. Oncology 14: 437-40。對結合Cripto的鼠抗體已有描述。然而，盡管鼠抗體確實可用作人類治療劑，但 因為它們并非來源于人類，所以它們可能是免疫原性的。施用這樣的抗體可能導致中和抗體反應(人類抗鼠抗體(HAMA)反應)，這在需要反復施用抗體的情況下(例如治療慢性或 復發性疾病狀況)尤其有問題。同時，因為它們含有的是小鼠恒定區，可能不會顯示人效應 子功能。試圖減弱免疫原性危險時，通常會制備“人源化”抗體。在一個實驗方案中，將來 源于小鼠的抗體的CDR轉移到人框架區上，產生“CDR移植”抗體。通常，框架區中可能影響 抗原結合的氨基酸殘基會被回復突變(backmuate)成相應的小鼠殘基。但是，雖然人源化抗體因其可能在人體中具有低免疫原性而是想要的，但它們的 產生是無法預計的。例如，抗體的序列修飾可能導致極大甚至完全喪失其抗原結合親和性， 或者失去結合特異性。此外，不論序列修飾，“人源化抗體"可能還是會在人體中表現出 免疫原性。這類抗體將提供靶向Cripto陽性腫瘤細胞以遞送抗腫瘤劑諸如毒素、放射性標 記及類似物的途徑。開發這種偶聯的抗體分子和施用它們的給藥方案將大有益處。發明概述本發明至少部分基于發現偶聯于美登木素生物堿(maytansoid)的人源化抗 Cripto抗體B3F6. 1 (B3F6. 1-DM4)當以單次劑量或每兩周的給藥方案施用時，在動物模型 中有效地抑制體內腫瘤細胞生長。這些模型中每兩周給藥表示，B3F6. 1-DM4在人類的有效 劑量包括每3周施用一次的給藥方案。本發明進一步基于發現單次劑量的B3F6. 1-DM4在 體內動物模型中有效抑制已建立的腫瘤生長。本發明將進一步基于發現施用B3F6. 1-DM4 聯同另外的藥劑如抗代謝物，如5’ -氟尿嘧啶，在體內動物模型中造成協同抑制體內腫瘤 細胞生長。因此，一方面，本發明提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，該方法包括向受治 療者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子，其中所述結合分子每三周施用一次，從而抑 制受治療者腫瘤生長。在一個實施方案，該結合分子是抗Cripto抗體。在一個實施方案，該結合分子是 人源化抗Cripto抗體。在一個實施方案，該抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿如DM4。 在一個實施方案，該美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑如SPDB偶聯于所述抗體。在一個 實施方案，平均3. 5個DM4分子連接于抗Cripto抗體。在一個實施方案，所述受治療者患有選自下組的器官的癌癥腦、乳腺、睪丸、結 腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。在優選實施方案，所述受治療者患有結腸癌。在一個實施方案，所述結合分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto 抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量選自下組約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg 禾口約 40mg/kgo另一方面，本發明提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療 者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子和化療劑如抗代謝物，從而抑制受治療者腫瘤 生長。在一個實施方案，該結合分子與化療劑如抗代謝物協同作用。在一個實施方案，該化療劑是抗代謝物。在一個實施方案，該抗代謝物是嘧啶類似 物。在一個實施方案，該嘧啶類似物是5’ -氟尿嘧啶。在一個實施方案，該結合分子是抗Cripto抗體。在一個實施方案，該結合分子是 人源化抗Cripto抗體。在一個實施方案，該抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿如DM4。在一個實施方案，該美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑如SPDB偶聯于抗體。在一個實施 方案，平均3. 5個DM4分子連接于抗Cripto抗體。在一個實施方案，所述結合分子與所述化療劑如抗代謝物以單次劑量施用。在一 個實施方案，所述結合分子與所述化療劑如抗代謝物每兩周施用一次。在一個實施方案，所 述結合分子與所述化療劑如抗代謝物每三周施用一次。在一個實施方案，所述結合分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto 抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量選自下組約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/kg 和約40mg/kg。在優選實施方案，所述結合分子的有效劑量是15mg/kg。 在一個實施方案，所述結合分子與所述化療劑如抗代謝物腹膜內、口服、鼻內、皮 下、肌內、表面局部(topical)或靜脈內地施用。在一個實施方案，所述受治療者患有選自下組的器官的癌癥腦、乳腺、睪丸、結 腸、直腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。在優選實施方案，所述受治療者患有結腸癌。另一方面，本發明提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，所述方法包括以下步 驟(i)選擇具有已建立的腫瘤的患者；并(ii)向受治療者施用有效劑量的結合Cripto的 結合分子；從而抑制受治療者腫瘤生長。在一個實施方案，該結合分子是抗Cripto抗體。 在一個實施方案，該結合分子是人源化抗Cripto抗體。在一個實施方案，該抗Cripto抗體 偶聯于美登木素生物堿如DM4。在一個實施方案，該美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑如 SPDB偶聯于抗體。在一個實施方案，平均3. 5個DM4分子連接于抗Cripto抗體。在一個實施方案，所述結合分子以單次劑量施用。在一個實施方案，所述結合分子 每兩周施用一次。在一個實施方案，所述結合分子每三周施用一次。在一個實施方案，所述結合分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto 抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量選自下組約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約25mg/ kg和約40mg/kg。在一個實施方案，所述結合分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化 抗Cripto抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量是至少約15mg/kg。在一個實施方案，所述結合 分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量是 至少約25mg/kg。在一個實施方案，所述結合分子(如，偶聯于美登木素生物堿的人源化抗 Cripto抗體如，B3F6. 1-DM4)的有效劑量是至少約40mg/kg)。在一個實施方案，所述結合分子腹膜內、口服、鼻內、皮下、肌內、表面局部或靜脈 內地施用。在一個實施方案，所述受治療者患有選自下組的器官的癌癥腦、乳腺、睪丸、結 腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。在優選實施方案，所述受治療者患有結腸癌。另一方面，本發明提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療 者施用單次有效劑量的結合Cripto的結合分子，從而抑制受治療者腫瘤生長。在一個實施方案，該結合分子是抗Cripto抗體。在一個實施方案，該結合分子是 人源化抗Cripto抗體。在一個實施方案，該抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。在 優選實施方案，該美登木素生物堿是DM4。在優選實施方案，平均3. 5個DM4分子連接于 一分子的抗體。在一個實施方案，該美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑偶聯于抗體。 在一個實施方案，該異雙官能交聯劑是4-(2_吡啶二硫代)丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(4- (2-pyridyldithio)butanoic acid N-hydroxysuccinimide ester，SPDB)。在一個實施方案，有效單次劑量選自下組約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約 25mg/kg 禾口約 40mg/kgo在一個實施方案，所述受治療者患有選自下組的器官的癌癥腦、乳腺、睪丸、結 腸、直腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。另一方面，本發明提供一種液態含水藥物制劑，其包含(a)治療有效量的結合 Cripto的結合分子，(b) IOmM琥珀酸鈉，pH是5.0，(c) 120mM L-甘氨酸，(d)120mM甘油，和 (e)0. 01% Polysorbate 80。在一個實施方案，該結合分子是人源化抗Cripto抗體。在一個實施方案，該人源 化抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。在一個實施方案，該美登木素生物堿是DM4。在 優選實施方案，平均3. 5個DM4分子連接于一分子的抗體。在一個實施方案，該美登木素生 物堿經由異雙官能交聯劑偶聯于抗體。在一個實施方案，該異雙官能交聯劑是4-(2_吡啶 二硫代)丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。在優選實施方案，結合分子(如，偶聯于DM4 的人源化抗Cripto抗體)的濃度是5mg/ml。附圖簡述

圖1顯示在帶有已建立的CT-3異種移植腫瘤的無胸腺裸小鼠中，以各種方案IV 施用的單次劑量(25和40mg/kg/inj)或兩次劑量(25和40mg/kg/inj) B3F6. 1-DM4對腫瘤
重量變化的效應。圖2顯示在帶有已建立的CT-3異種移植腫瘤的無胸腺裸小鼠中，各以IV施用的 單次劑量(15mg/kg/inj)B3F6. 1-DM4、單次劑量(30mg/kg/inj) 5-氟尿嘧啶、和單次劑量 (15mg/kg/inj)B3F6. 1-DM4聯同單次劑量(30mg/kg/inj) 5-氟尿嘧啶的組合對腫瘤重量變 化的效應。圖3顯示在帶有大的CT-3異種移植腫瘤，如具有550_775mg的平均腫瘤重量的腫 瘤的無胸腺裸小鼠中，IV施用的單次劑量(15和25mg/kg/inj)B3F6. 1-DM4對腫瘤重量變 化的效應。圖4顯示在帶有已建立的人類睪丸異種移植腫瘤的無胸腺裸小鼠中，IV施用的 單次劑量(5,10 和 15mg/kg/inj)B3F6. I-SMCC-DMl 或單次劑量(5,10 和 15mg/kg/inj) B3F6. 1-SPDB-DM4對腫瘤重量變化的效應。發明詳述本發明至少部分基于發現偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto抗體 B3F6. 1 (B3F6. 1-DM4)當以單次劑量或每兩周的給藥方案施用時，在動物模型中有效地 抑制體內腫瘤細胞生長。鼠模型中每兩周給藥等效于在靈長類每三周一次的劑量，表示 B3F6. 1-DM4在人類的有效劑量包括每3周施用一次的給藥方案。本發明進一步基于發現單 次劑量的B3F6. 1-DM4在體內鼠模型中有效抑制已建立的腫瘤生長。本發明將進一步基于 發現施用B3F6. 1-DM4聯同另外的藥劑如化療劑諸如抗代謝物，如5’ -氟尿嘧啶，在體內鼠 模型中造成協同抑制體內腫瘤細胞生長。因此，本發明提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，該方法包括向患者施用有 效劑量的結合Cripto的結合分子，例如偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto抗體 (如，B3F6. 1-DM4)，其中所述結合分子每三周施用一次。本發明進一步提供一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子，如 偶聯于美登木素生物堿的人源化抗Cripto抗體(如，B3F6. 1-DM4)和另外的化療劑，如抗 代謝物，如嘧啶類似物，如5’ -氟尿嘧啶，從而抑制受治療者腫瘤生長。本發明還提供一 種抑制受治療者腫瘤生長的方法，所述方法包括以下步驟選擇具有已建立的腫瘤的患者； 并向受治療者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子；從而抑制受治療者腫瘤生長。在進一步描述本發明之前，為了方便起見，一些術語描述如下I.定義本發明的結合分子是包含至少一個結合結構域的多肽分子，所述結合結構域包含 特異結合人類Cripto分子的結合位點。人類Cripto的示例性序列如SEQ ID NO 6 (CR-I) 和SEQ ID NO :7(CR-3)所示。CR-I對應編碼在未分化的人畸胎癌細胞中表達的人類Cripto 蛋白質的結構基因，CR-3對應編碼區中含有7個堿基取代的mRNA完整拷貝，這些堿基取代 代表了沉默和置換取代。CR-I定位到染色體3，CR-3定位到Xq21_q22。Dono等人· 1991. Am T HumGenet. 1991 49 :555。優選地，本發明的結合分子包含至少一個來源于鼠B3F6抗體的⑶R (如1、2、3、4、5 或優選地6個⑶R)。鼠B3F6抗體結合到Cripto內跨越氨基酸殘基46-62的結構域中的表 位。制備鼠B3F6抗體(又稱為B3F6. 17)的雜交瘤以PTA-3319的保藏號保存在ATCC。所 述抗體通過用在CHO細胞中表達的Cripto融合蛋白免疫小鼠而獲得。用于免疫的融合蛋白 包含融合至人類IgG1Fc區的Cripto的氨基酸殘基1到169 [SEQ ID NO 6的氨基酸1-169] (構建體稱為CR(del C)-Fc)。制備B3F6抗體的方法在例如WO 02/058170中有更詳細的 描述。尤其是，示例性人源化B3F6抗體可見于WO 06/74397。產生一種人源化版本的B3F6 抗體的CHO細胞以PTA-7284的保藏號保存在ATCC。如本文使用，“已建立的腫瘤”是實體瘤，其大小足以使得營養即氧氣不再能從受 治療者的脈管系統通過滲透滲入腫瘤中心，因此腫瘤需要其自身的脈管供應以接受營養。在一個實施方案，本方法用于治療血管瘤。血管瘤包括具有已建立的脈管系統的 標志的腫瘤。這種腫瘤由其大小和/或存在血管或血管發生的標志物而被鑒定。在本發明一個實施方案，聯合治療用于治療已建立的腫瘤，如大小足以使得營養 不再能從受治療者的脈管系統通過滲透滲入腫瘤中心，因此腫瘤需要其自身的脈管供應以 接受營養的腫瘤，即脈管瘤。在一個實施方案，聯合治療用于治療直徑為至少約ImmXlmm的 腫瘤。在本發明另一實施方案，聯合治療用于治療至少約2mmX2mm的腫瘤。在本發明另一 實施方案，聯合治療用于治療至少約5mmX5mm的腫瘤。在本發明其它實施方案，腫瘤具有至 少約Icm3的體積。在一個實施方案，本發明的聯合治療用于治療足夠大以致于可以觸診或 本領域熟知的成像技術如MRI、超聲或CAT掃描發現的腫瘤。如本文使用，術語“來源于”指定蛋白質是指多肽的來源。在一實施方案中，來源于 特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或與其相關的序列。在一實施方案中，來源 于特定起始多肽的氨基酸序列是不連續的。例如，在一實施方案中，1、2、3、4、5或6個CDR 來源于起始抗體。在一實施方案中，來源于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序 列的氨基酸序列與所述起始序列或者其部分的氨基酸序列基本相同，其中所述部分由至少 3-5個氨基酸、5-10個氨基酸、至少10-20個氨基酸、至少20-30個氨基酸，或至少30-50個 氨基酸組成；或者本領域技術人員可以識別出其來源是所述起始序列。在一實施方案中，來源于起始抗體的一或多個CDR序列被改變，從而產生變體CDR序列，其中所述變體CDR序列 保持了 Cripto結合活性。本領域技術人員還會理解，可以對本發明的結合分子進行修飾，使其與衍生其的 B3F6分子的氨基酸序列不同。例如，可以進行核苷酸或氨基酸取代，這些取代導致在“非關 鍵”氨基酸殘基上發生保守取代或改變(例如在CDR和/或框架殘基)。本發明的結合分 子保持了結合Cripto的能力。編碼多肽非天然變體的分離核酸分子可以通過在免疫球蛋白的核苷酸序列中引 入一或多個核苷酸取代、添加或缺失而產生，使得所編碼的蛋白中被引入一或多個氨基酸 取代、添加或缺失。可以通過標準技術來引入突變，諸如定點誘變和PCR-介導的誘變。優 選的，在一或多個非關鍵氨基酸殘基上進行保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是指 其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基所代替的取代。本領域對具有類似側鏈的氨 基酸殘基家族已有界定，包括堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如， 天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇 氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族 側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非關鍵氨基酸 殘基可以用來自相同側鏈家族中的另一個氨基酸殘基來代替。在另一實施方案中，一串氨 基酸可以用結構上類似、在側鏈家族成員的順序和/或組成上不同的氨基酸串來代替。可選地，在另一實施方案中，可以沿全部或部分免疫球蛋白編碼序列隨機引入突 變。在一實施方案中，所述結合分子包含一個結合位點。在另一實施方案中，所述結合 分子包含至少兩個結合位點。在一實施方案中，結合分子包含兩個結合位點。在一實施方 案中，結合分子包含三個結合位點。在另一實施方案中，結合分子包含四個結合位點。在一實施方案中，本發明的結合分子是單體。在另一實施方案中，本發明的結合分 子是多聚體。例如，在一實施方案中，本發明的結合分子是二聚體。在一實施方案中，本發 明的二聚體是同二聚體，包含兩個相同的單體亞基。在另一實施方案中，本發明的二聚體是 異二聚體，包含兩個不同的單體亞基。所述二聚體的亞基可以包含一或多個多肽鏈。例如， 在一實施方案中，所述二聚體包含至少兩個多肽鏈。在一實施方案中，所述二聚體包含兩個 多肽鏈。在另一實施方案中，所述二聚體包含四個多肽鏈(例如，在抗體分子的情況中)。本發明優選的結合分子包含來源于人類氨基酸序列的框架和/或恒定區氨基酸 序列。例如，在一實施方案中，本發明結合分子是嵌合抗體。在另一實施方案中，本發明結 合分子是人源化抗體。但是，結合多肽可以包含來源于其它哺乳動物物種的框架和/或恒 定區序列。例如，靈長類框架區(例如非人類靈長類)、重鏈部分和/或鉸鏈部分都可以包 括在所述結合分子中。在一實施方案中，結合多肽的框架區可以存在一或多個鼠氨基酸，例 如人類或非人類靈長類框架氨基酸序列可以包含一或多個氨基酸回復突變，在這些回復突 變中存在相應的鼠氨基酸殘基。本發明優選的結合分子比起始的B3F6鼠抗體免疫原性低。如本文使用，術語“重鏈部分”包括來源于免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。含有重 鏈部分的多肽包含以下至少之一 CH1結構域、鉸鏈(例如上游、中游和/或下游鉸鏈區) 結構域、CH2結構域、CH3結構域、或者它們的變體或片段。在一實施方案中，本發明多肽包括含有CHl結構域、至少部分鉸鏈區，和CH2結構域的多肽鏈。在另一實施方案中，本發明 多肽包括含有CHl結構域和CH3結構域的多肽鏈。在另一實施方案中，本發明多肽包括含 有CHl結構域、至少部分鉸鏈區，和CH3結構域的多肽鏈。在另一實施方案中，本發明多肽 包括含有CH3結構域的多肽鏈。在一實施方案中，本發明的多肽缺少至少部分CH2結構域 (例如，全部或部分CH2結構域)。在另一實施方案中，本發明的多肽包含完整的Ig重鏈。 如上所述，本領域技術人員會理解，可以對這些結構域(例如，重鏈部分)進行修飾從而使 其氨基酸序列與天然存在的免疫球蛋白分子不同。在一實施方案中，本發明結合分子的至少兩個多肽鏈包含至少一個來源于抗體或 免疫球蛋白分子的重鏈部分。在一實施方案中，本發明多肽的至少兩個重鏈部分位于不同 多肽鏈上，并例如借助至少一個二硫鍵相互作用(A型)或借助非共價健相互作用(B型) 而形成二聚體多肽，該二聚體的每個單體包含至少一個重鏈部分。在一實施方案中，二聚體的一個多肽鏈的重鏈部分與該二聚體第二個多肽鏈的重 鏈部分相同。在一實施方案中，本發明二聚體的單體(或半體)彼此相同。在另一實施方 案中，它們是不同的。例如，每個單體可能包含不同的靶結合位點。在一實施方案中，本發明的結合分子是通過共價相互作用(例如二硫鍵)連在一 起的，并是二聚的。在一實施方案中，本發明的二聚體是通過一或多個二硫鍵連在一起的。 在另一實施方案中，本發明的二聚體是通過一或多個，優選兩個二硫鍵連在一起的。在另一 實施方案中，本發明的二聚體是通過一或多個，優選三個二硫鍵連在一起的。在另一實施方 案中，本發明的二聚體是通過一或多個，優選四個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中， 本發明的二聚體是通過一或多個，優選五個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中，本發明 的二聚體是通過一或多個，優選六個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中，本發明的二聚 體是通過一或多個，優選七個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中，本發明的二聚體是通 過一或多個，優選八個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中，本發明的二聚體是通過一或 多個，優選九個二硫鍵連在一起的。在另一實施方案中，本發明的二聚體是通過一或多個， 優選十個二硫鍵連在一起的。在進一步的實施方案中，本發明的二聚體不是通過二硫鍵連 在一起的，而是例如借助非共價相互作用連在一起的。多肽的重鏈部分可以來源于不同免疫球蛋白分子。例如多肽的重鏈部分可以包含 來源于IgGl分子的CHl結構域和來源于IgG3分子的鉸鏈區。在另一個實例中，重鏈部分 可以包含部分來源于IgGl分子、部分來源于IgG3分子的鉸鏈區。在另一個實例中，重鏈部 分可以包含嵌合鉸鏈，其部分來源于IgGl分子，部分來源于IgG4分子。如本文使用，術語“輕鏈部分”包括來源于免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。優選的， 所述輕鏈部分包含VL或CL結構域的至少一個。在一實施方案中，本發明的多肽包含不是來源于Ig分子的氨基酸序列或者一或 多個部分。示例性的修飾在下文有更詳細的描述。例如，在一實施方案中，本發明的多肽可 以包含柔性的接頭序列。在另一實施方案中，多肽可以被修飾從而添加一或多個功能部分 (例如，PEG、藥物、前藥，和/或可檢測標記)。“嵌合”蛋白包含連接至自然界中不與其天然連接的第二氨基酸序列的第一氨基 酸序列。所述氨基酸序列可能在正常情況下存在于在融合多肽中在一起的分開的蛋白中， 或者它們通常存在于相同蛋白中，但在融合多肽中處于新的排列方式。嵌合蛋白可以例如通過化學合成，或者通過產生并翻譯其中肽區按所需位置關系編碼的多核苷酸而產生。示 例性的嵌合多肽包括本發明的融合蛋白和嵌合鉸鏈連接肽。在一實施方案中，本發明的結合多肽是融合蛋白。在一實施方案中，本發明的融合 蛋白是包含結合結構域(該結構域含有至少一個結合位點)和二聚化結構域(該結構域含 有至少一個重鏈部分)的嵌合分子。所述重鏈部分可以來自任何免疫球蛋白，諸如IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4亞型，IgA、IgE、IgD或IgM。在一實施方案中，融合蛋白還包含合成的連 接肽。在本發明的另一實施方案中，結合分子是“抗體_融合蛋白嵌合體”。這些分子包 含結合了抗體的至少一個結合結構域和至少一個融合蛋白的分子。優選地，兩個多肽之間 的界面是免疫球蛋白分子的CH3結構域。術語“異源”在用于多核苷酸或多肽時，意味著該多核苷酸或多肽來源于基因型不 同于與之進行比較的其他實體的實體。例如，異源多核苷酸或抗原可以來源于不同物種、不 同細胞型，或不同個體的相同細胞型。術語“配體結合結構域”或“配體結合部分”于本文用來指任何天然受體(例如， 細胞表面受體)或該受體的任何區域或衍生物，這些區域或衍生物保持了相應天然受體的 至少性質上的配體結合能力，優選保持了相應天然受體的生物活性。術語“受體結合結構域”或“受體結合部分”于本文用來指天然配體或該配體的區 域或衍生物，這些區域或衍生物保持了相應天然配體的至少性質上的受體結合能力，優選 保持了相應天然配體的生物活性。在一實施方案中，本發明的結合分子是“抗體”或“免疫球蛋白，，分子，例如天然存 在的抗體或免疫球蛋白分子(或其抗原結合片段)，或者遺傳工程化抗體分子，它們結合抗 原的方式與抗體分子類似。如本文使用，術語“免疫球蛋白”包括這樣的多肽，無論是否具 備任何相關的特異免疫反應性，它都有兩條重鏈和兩條輕鏈的組合。“抗體”是指那些對目 標抗原(例如，腫瘤相關抗原)有明顯的已知特異免疫反應活性的組裝體。抗體和免疫球 蛋白包含輕鏈和重鏈，它們之間有或沒有鏈間共價鍵。脊椎動物系統的基本免疫球蛋白結 構已有了較好的理解。如下文將詳細討論的，通用術語“免疫球蛋白”包括可以從生物化學加以區分的5 類不同抗體。所有5類抗體均在本發明的范圍內，以下討論一般是針對免疫球蛋白分子中 的IgG類。就IgG而言，免疫球蛋白包含兩個相同的分子量約23，000道爾頓的多肽輕鏈， 和兩個相同的分子量為53，000-70，000的重鏈。這四條鏈通過二硫鍵連接成“Y”形構型， 其中輕鏈位于重鏈外側，從“Y”的開口處開始，一直延續通過可變區。輕鏈和重鏈均被劃分成結構和功能同源的一些區域。術語“恒定”和“可變”是就 功能而言的。就此而言，應理解，輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變區決定抗原的識別和特 異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定區賦予重要的生物特性，諸如分 泌、通過胎盤、Fc受體結合、補體結合等。傳統上，恒定區結構域的編號隨著它們遠離抗體 的抗原結合位點或氨基端而增加。N末端是可變區，C末端是恒定區；CH3和CL結構域實際 上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端。如本文使用，術語“可變區CDR氨基酸殘基”包括利用基于序列或結構的方法 鑒定的CDR或互補決定區中的氨基酸。如本文使用，術語“CDR”或“互補決定區”是指重鏈和輕鏈多肽的可變區中存在的非連續性抗原結合部位。這些特定區域已由Kabat 等人，J. Biol. Chem. 252,6609-6616 (1977)和 Kabat 等人，Sequences of protein of immunological interest (免疫學上重要蛋白的序列).(1991)，Chothia 等人，J. Mol. Biol. 196 901-917 (1987)以及 MacCallum 等人，J. Mol. Biol. 262 :732_745 (1996)描述過， 其中定義包括了在相互之間進行比較時，氨基酸殘基的重疊或子集。本文列出了涵蓋以上 引用的每個文獻所定義的CDR的氨基酸殘基進行比較。優選地，術語“CDR”是Kabat在序 列比較的基礎上所定義的CDR。
Kabat1CDR定義 Chothia2MacCallum3Vh CDRl31-3526-3230-35Vh CDR250-6553-5547-58VhCDR395-10296-10193-101VlCDRI24-3426-3230-36VlCDR250-5650-5246-55VlCDR389-9791-9689-961殘基編號按照Kabat等人的系統命名法，同上2殘基編號按照Chothia等人的命名法，同上3殘基編號按照MacCallum等人的命名法，同上如本文使用，術語“可變區框架(FR)氨基酸殘基”是指Ig鏈的框架區中的那些氨 基酸。用于本文的術語“框架區”或“FR區”包括是可變區的部分，但不是CDR(例如，按照 Kabat對CDR的定義)的部分的氨基酸殘基。因此，可變區框架長度為約100-120氨基酸， 但只包括CDR之外的那些氨基酸。作為重鏈可變區和Kabat等人定義的CDR的具體例子， 框架區1對應涵蓋氨基酸1-30的可變區結構域；框架區2對應涵蓋氨基酸36-49的可變區 結構域；框架區3對應涵蓋氨基酸66-94的可變區結構域；框架區4對應從氨基酸103到可 變區末端的可變區結構域。輕鏈框架區類似地被每個輕鏈可變區CDR分隔開。類似的，采 用Chothia等人或者McCallum等人對⑶R的定義，框架區邊界被上面描述的各自⑶R末端 分隔開。在優選實施方案中，CDR是按照Kabat的定義。在天然存在的抗體中，每個單體抗體中存在的六個CDR是短的非連續氨基酸序 列，當抗體在水性環境中呈現其三維構型時，這些序列處于特異性的位置從而構成抗原結 合位點。重鏈和輕鏈可變區其它部分顯示較小的氨基酸序列的分子間差異，被命名為框架 區。框架區主要采取β-折疊構型，⑶R形成連接β-折疊結構的一些環，在一些情況中構 成折疊結構的一部分。因此，這些框架區形成了一個支架，通過鏈間、非共價相互作用 使六個CDR處于正確的方位。被定位的CDR所形成的抗原結合位點界定出與免疫反應性抗 原上的表位互補的表面。這一互補表面會促進抗體與免疫反應性抗原表位的非共價結合。 本領域普通技術人員可以容易地鑒定出⑶R的位置。如前文所述，各個免疫球蛋白類的恒定區亞基結構和三維構型是人們熟知的。如本文使用，術語“VH結構域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結構域，術語“CH1結構 域”包括免疫球蛋白重鏈的第一個(最氨基端的)恒定區結構域。CHl結構域與VH結構域 相鄰，并且處于免疫球蛋白重鏈分子中鉸鏈區的氨基端。如本文使用，術語“CH2結構域”包括重鏈分子的一部分，按照常規的編號方案， 該部分例如從抗體的約殘基244延伸到殘基360 (殘基244到360，Kabat編號系統；殘 基 231-340, EU 編號系統，Kabat EA 等人· Sequences ofProteins of Immunological Interest (免疫學上重要蛋白的序列)· Bethesda，USD印artment of Health and Human servicesjIH. 1991)。CH2結構域的獨特之處在于它不與另一結構域緊密配對。而是兩個 N-連接的分支碳水化合物鏈置于完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。還充分報 道，CH3結構域從CH2結構域延伸到IgG分子的C末端，包含約108個殘基。如本文使用，術語“鉸鏈區”包括重鏈分子中連接CHl結構域和CH2結構域的 部分。該鉸鏈區包含約25個殘基并且是柔性的，因此允許兩個N末端抗原結合結構域 獨立移動。鉸鏈區可以細分成三個不同的結構域上游、中游和下游鉸鏈區(Roux等 人· J. Immunol. 1998161 4083)。輕鏈分為κ或λ (Κ、λ)。每個重鏈種類可以結合κ或λ輕鏈。一般來說，當 免疫球蛋白由雜交瘤、B細胞或遺傳工程化宿主細胞產生時，輕鏈和重鏈彼此共價結合，兩 個重鏈的“尾”部分通過共價二硫鍵或非共價鍵彼此結合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構型 的分叉末端的N端延伸到每個鏈的底部的C末端。本領域技術人員知道重鏈分類為Y、μ、 α , δ ^ ε (γ , μ , α , δ , ε )，其中還有一些亞類(例如，Y 1_ Y 4)。重鏈的特性決定了 抗體的“種類”分別為IgG, IgM, IgA, IgG或IgE0免疫球蛋白亞類(同種型)，例如IgG1, IgG2JgG3JgG4JgA1等已被很好表征，并且已知它們賦予功能特化。參照本文的公開內容， 技術人員可以容易地看出這些種類和同種型的每一種的修飾版本，因此這些修飾版本也屬 于本發明的范圍。如上文所述，可變區使得抗體選擇性地識別并特異性結合抗原的表位。這就是說， 抗體的\結構域和Vh結構域結合起來形成定義三維的抗原結合位點的可變區。這一四級 抗體結構形成了位于Y構型每個臂末端的抗原結合位點。更具體地說，抗原結合位點是由 位于每個Vh和\鏈上的三個互補決定區(OTR)界定的。術語“片段”是指抗體或抗體鏈的一部分或組成部分，其包含的氨基酸殘基比完整 或整個抗體或抗體鏈少。術語“抗原結合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，該片段 結合抗原或與完整抗體(即它所來源的完整抗體)競爭結合抗原(即，特異性結合)。如本 文使用，術語抗體分子的“抗原結合片段”包括抗體的抗原結合片段，例如，抗體輕鏈(VL)、 抗體重鏈(VH)、單鏈抗體(ScFV)、F(ab，)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段和單結構域抗 體片段(DAb)。片段可以例如通過完整或完全的抗體或抗體鏈的化學或酶處理或者通過重 組手段來獲得。如本文使用，術語“結合位點”包含負責選擇性地與目標靶分子(例如，抗原、配 體、受體、底物或抑制劑)結合的多肽區域。結合結構域包含至少一個結合位點。示例性的 結合結構域包括抗體可變區、配體的受體結合結構域、受體的配體結合結合結構域或者酶 促結構域。如本文使用，術語“價”是指多肽中可能的靶結合位點數目。每個靶結合位點特異結合一個靶分子或者靶分子上的特定位點。當多肽包含一個以上靶結合位點時，每個靶結 合位點可以特異結合相同或不同的分子(例如，可以結合不同的配體或不同的抗原，或者 同一抗原上的不同表位)。這里討論的結合分子有至少一個特異性針對人類Cripto分子的 結合位點。術語“特異性”是指與指定目標特異結合(例如與之免疫反應)的能力。多肽可 以是單特異性的，含有一或多個特異結合靶的結合位點；或者多肽可以是多特異性的，含有 兩個或更多個特異結合相同或不同靶的結合位點。在一實施方案中，本發明的結合分子對一個以上的靶有特異性。例如，在一個實施 方案中，本發明的多特異性結合分子結合Cripto和腫瘤細胞上表達的第二個分子。本領域 已知包含與腫瘤細胞上表達的抗原結合的抗原結合位點的示例性抗體，這類抗體的一或多 個⑶R可以包括在本發明的結合分子中。這類抗體的例子包括2B8、Lym 1、Lym 2、LL2、 Her2、Bl、MBl、BH3、B4、B72. 3、5E8 和 5E10。在一實施方案中，本發明的結合分子包含連接肽。本發明的連接肽是合成的。如 本文使用，術語“合成的”涉及到多肽時包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如， 是天然存在多肽的修飾形式(例如，包含諸如添加、取代或缺失的突變)或者包含與其在自 然界中不是天然連接的第二氨基酸序列(是或不是天然存在的)以線性氨基酸序列連接的 第一氨基酸序列(是或不是天然存在的)的非天然存在的多肽。本發明的連接肽連接本發明結合分子的兩個結構域(例如，結合結構域和二聚化 結構域)。例如，連接肽將重鏈部分連到含有結合位點的結合結構域上。在一實施方案中， 連接肽以多肽鏈的線性氨基酸序列連接兩個重鏈恒定區，諸如CHl和CH2結構域；CHl和 CH3結構域；鉸鏈區和CHl結構域；鉸鏈區和CH3結構域；VH和鉸鏈區，或者CH3結構域和 非免疫球蛋白多肽)。優選的，這類連接肽給結合分子提供了柔性，并促進借助二硫鍵的二 聚化。在一實施方案中，本發明的連接肽用來代替一或多個重鏈結構域(例如，結構域缺失 的構建體中至少恒定區結構域的一部分(例如，至少CH2結構域的一部分)和/或至少鉸 鏈區的一部分(例如，至少下游鉸鏈區結構域的一部分))。例如，在一實施方案中，VH結構 域與CH3結構域通過連接肽融合在一起(連接肽的C末端連到CH3結構域的N末端，連接 肽的N末端連到VH結構域的C末端)。在另一實施方案中，VL結構域與CH3結構域通過連 接肽融合在一起(連接肽的C末端連到CH3結構域的N末端，連接肽的N末端連到VL結構 域的C末端)。在另一實施方案中，CHl結構域與CH3結構域通過連接肽融合在一起(連接 肽的C末端連到CH3結構域的N末端，連接肽的N末端連到CHl結構域的C末端)。在一實施方案中，合成連接肽包含恒定區結構域的一部分。例如，在一實施方案 中，代替CH2結構域的連接肽可能包含CH2結構域的一部分。在一實施方案中，連接肽包含gly-ser接頭，或由該接頭組成。如本文使用，術語 "gly-ser接頭”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性gly/ser接頭包含氨基酸序 列GGGSSGGGSG(SEQ ID NO :8)。在一實施方案中，本發明的連接肽包含至少部分上游鉸鏈區 (例如，來源于IgGU IgG3或IgG4分子)、至少部分中游鉸鏈區(例如，來源于IgGU IgG3 或IgG4分子)以及一系列gly/ser氨基酸殘基(例如，gly/ser接頭，諸如GGGSSGGGSG (SEQ IDNO :8))。在一實施方案中，與天然存在的IgGl或IgG3鉸鏈區相比，所述連接肽包含一 或多個氨基酸取代。在另一實施方案中，連接肽包含諸如WO 02/060955中描述的氨基酸序列。連接肽在下文有更詳細的描述。如本文使用，術語“二硫鍵”包括兩個硫原子之間形成的共價健。氨基酸半胱氨酸 包含一個巰基，可以與第二巰基形成二硫鍵或橋。在多數天然存在的IgG分子中，CHl和CL 區通過二硫鍵連接，兩個重鏈通過在對應于使用Kabat編號系統的239和242位點(EU編 號系統的位點226或229)的位置的兩個二硫鍵連接。在一實施方案中，本發明的結合分子包含抗體結合位點。例如，在一實施方案中， 本發明的結合分子是全長抗體分子。在另一實施方案中，本發明的結合分子是抗體分子的 片段。在另一實施方案中，本發明的結合分子是修飾或合成的抗體分子。本發明的結合分子可以利用本領域已知的技術來制備。在一實施方案中，本發明 多肽是“重組產生”的抗體分子，即是利用重組DNA技術產生的。制備抗體分子的示例性技 術在下文有更詳細的討論。在一實施方案中，本發明的多肽是修飾的抗體。如本文使用，術語“修飾的抗體”包 括合成形式的抗體，即抗體被改變成非天然存在的形式，例如包含至少兩個重鏈部分，但不 是兩個完整的重鏈的抗體(諸如，結構域缺失抗體或微抗體)；被改變成結合兩個或更多個 不同抗原或單個抗原上的不同表位的多特異性抗體形式(例如，雙特異性、三特異性等)； 重鏈分子與scFv分子相連的抗體等。ScFv分子是本領域已知的，在美國專利5，892，019中 有描述。此外，術語“修飾的抗體”包括多價形式的抗體(例如，結合三個或更多個拷貝的 相同抗原的三價、四價等抗體)。在另一實施方案中，本發明的結合分子是融合蛋白，其包含 至少一個缺少CH2結構域的重鏈部分，并包含一種多肽的結合結構域，其中所述多肽含有 受體配體對之一成員的結合部分。在一實施方案中，術語“修飾的抗體”根據本發明包括免疫球蛋白、抗體或它們的 免疫反應片段或重組體，其中一或多個恒定區結構域的至少一部分被缺失或以其它方式改 變，從而提供所期望的生化特性，諸如與具有大體相同的免疫原性的完整的未改變抗體相 比，非共價地二聚化的能力、定位到腫瘤位點的能力增強，或者血清半衰期降低。在一個實 施方案中，本發明的多肽是結構域缺失的抗體，其包含與免疫球蛋白重鏈類似的多肽鏈，但 是缺少一或多個重鏈結構域的至少一部分。更優選地，經修飾的抗體的恒定區的一個整個 結構域被缺失，甚至更優選的是，全部或部分CH2結構域被缺失。在優選實施方案中，本發明的多肽不會在人體中引起有害的免疫應答。在一實施方案中，本發明的結合分子包含恒定區，例如重鏈恒定區，與野生型恒 定區相比，該恒定區被修飾。即，本文公開的發明多肽可能包含對三個重鏈恒定區結構域 (CH1、CH2或CH3)中的一或多個和/或對輕鏈恒定區結構域(CL)的改變或修飾。示例性 修飾包括在一或多個結構域中一或多個氨基酸的添加、缺失或取代。如本文使用，術語“惡性腫瘤(malignancy)”是指非良性的腫瘤或癌癥。如本文使 用，術語“癌癥”包括以不受調節或失去控制的細胞生長為特點的惡性腫瘤。癌癥的例子包 括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。術語“癌癥”包括原發性惡性腫瘤(例如，其細胞沒有轉移 到受治療者體內原始腫瘤部位之外的位點的惡性腫瘤)和繼發性惡性腫瘤(例如，通過轉 移，即腫瘤細胞遷移到原始腫瘤部位之外的第二位點形成的)。如本文使用，術語“工程化”包括通過合成手段(例如，通過重組技術、體外肽合 成、肽的酶促或化學偶聯，或者這些技術的一些組合)對核酸或多肽分子進行操作。優選地，本發明的結合分子被工程化用于例如表達本發明連接肽。如本文使用，術語“連接”、“融合的”或者“融合”可以交換使用。這些術語是指通 過包括化學偶聯或重組手段的任何手段將兩個以上的元件或組分聯系到一起。“符合讀框 的融合”是指將兩個或以上的可讀框(ORF)連在一起形成一個連續的更長的0RF，連接方 式保持原始ORF的正確閱讀框。因此，得到的重組融合蛋白是含有兩個或多個區段的單個 蛋白，其中的區段對應由原始ORF編碼的多肽(這些區段在自然界中通常不天然地如此連 接)。雖然全部融合區段的閱讀框被制成了連續的，這些區段可以被例如符合讀框的接頭序 列物理上或空間上分隔開。在多肽上下文中，“線性序列”或“序列”是指多肽中氨基酸的順序處于從氨基到羧 基端的方向，其中序列中相鄰的殘基在該多肽的一級結構中是連續的。如本文使用，短語“因施用結合分子而受益的受治療者”包括這樣一些受治療者 (諸如哺乳動物受治療者)，它們受益于施用結合分子，這些結合分子是用來例如檢測該結 合分子能識別的抗原(如用于診斷方案)，和/或受益于用該結合分子進行處理從而減少或 去除這些分子能夠識別的靶。例如，在一實施方案中，受治療者可能受益于減少或去除循環 系統或血清中的可溶性或顆粒性分子(例如毒素或病原體)，或者受益于減少或去除表達 靶的細胞群(例如腫瘤細胞)。如本文更詳細的描述，所述結合分子可以以非偶聯的形式使 用，或者偶聯到例如藥物、前藥或表位上來使用。II.人源化在一實施方案中，本發明結合分子包含或來源于至少一個人源化的B3F6抗體可 變區，例如輕鏈或重鏈可變區。術語“人源化抗體”是指這樣的抗體，其包含至少一條含有基本來自人類抗體鏈 (稱為“受者抗體”)的可變區框架殘基的鏈，和至少一條基本來自非人類抗體(稱為“供者 抗體”)的互補決定區(“CDR，，)的鏈，本例中為抗Cripto抗體，如B3F6。優選地，如果存 在恒定區，則恒定區也是基本或完全來自人類免疫球蛋白。鼠B3F6抗體描述于WO 2006074397。鼠B3F6抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區的 序列分別提供在SEQ ID NO 39和SEQ ID NO :40。鼠B3F6的CDR如下表1所示表1 :B3F6CDR 序列(Kabat 定義)
CDR LlRSSQSIVHSNGNTYLESEQ ID NO 9CDR L2KVSNRFSSEQ ID NO 10CDR L3FQGSHVPLTSEQ ID NO 11CDR HlSYffIHSEQ ID NO 12CDR H2ENDPSNGRTNYNEKFKNSEQ ID NO 13CDR H3GPNYFYSMDYSEQ ID NO 14
鼠B3F6抗體的可變輕鏈是小鼠亞組K 2的成員，在113aa重疊中有92. 9%同一 性(小鼠亞組κ 2的共有序列顯示在SEq ID NO 41)。可變重鏈是小鼠亞組2B的成員，在 128aa重疊中有80. 5%同一性(小鼠亞組2B的共有序列顯示在SEQ ID NO :42)。可變輕 鏈對應于人類亞組κ 2，在114aa重疊中有76. 3%同一性(人類亞組κ 2的共有序列顯示 在SEQ ID Ν0:43)。可變重鏈對應于人類亞組1，在129aa重疊中有65. 1 %同一性(人類 亞組1的共有序列顯示在SEQ IDNO 44)。在一實施方案中，本發明的抗原結合分子包含B3F6抗體分子的至少一個重鏈或 輕鏈CDR。在另一實施方案中，本發明的抗原結合分子包含至少兩個來自B3F6抗體分子的 CDR0在另一實施方案中，本發明的抗原結合分子包含至少三個來自B3F6抗體分子的CDR。 在另一實施方案中，本發明的抗原結合分子包含至少四個來自B3F6抗體分子的CDR。在另 一實施方案中，本發明的抗原結合分子包含至少五個來自B3F6抗體分子的CDR。在另一實 施方案中，本發明的抗原結合分子包含至少六個來自B3F6抗體分子的CDR。在一實施方案 中，所述至少一個⑶R(或結合分子中存在的一個以上B3F6⑶R中的至少一個OTR)被修飾， 因此其序列與天然存在的B3F6分子的CDR不同，但保留了結合B3F6的能力。人源化抗體可以利用重組DNA技術來制備，參見例如Queen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，(1989)，86 10029-10033 Jones 等人，Nature，(1986)，321 :522_25 ； Riechmann 等人，Nature, (1988)，332 :323_27 ；Verhoeyen 等人，Science, (1988)，239 1534-36 ；Orlandi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989)，86 :3833_37 ；美國專利第 5，225，539 ；5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，761 ；5，693，762 ；6，180，370 號。例如，當已經選擇了用于人源化的優選的非人類供者抗體時，合適的人類受者抗 體可以得自，例如被表達的人類抗體基因序列數據庫，來自種系Ig序列或者幾種人類抗體 共有序列。如果人類可變結構域框架處于和CDR所來源的非人類可變框架相同或類似的 構型，則將該非人類CDR替代到人類可變區結構域框架中非常可能的結果是會保持它們的 正確空間方向。實現這一點是通過從人類受者抗體中獲取人可變結構域，所述受者抗體 的框架序列與CDR所來源的非人類可變框架結構域有很高的序列同一性。重鏈和輕鏈可 變框架區可以來源于相同或不同人類抗體序列。優選的，人類受者抗體保留了供者抗體 的規范殘基和界面殘基。此外，優選人類受者抗體在CDR環的長度上具有相當的類似性。 參見 Kettleborough 等人，ProteinEngineering 4:773(1991) ；Kolbinger 等人，Protein Engineering 6 971(1993)和 Carter 等人，WO 92/22653。鑒定了供者抗體和合適的人類受者抗體的⑶R后，下一步是確定這些成分中的哪 些殘基(如果有)應當被取代以便優化所得人源化抗體的特性。通常，要用抗原結合所需 要的非人類供者免疫球蛋白輕鏈或重鏈中氨基酸的一些或全部(例如，一或多個CDR)來取 代人類受者抗體輕鏈或重鏈中的相應氨基酸。人類受者抗體保留了不為抗原結合所需要的 一些或全部氨基酸。一般來說，將人類氨基酸殘基替代為鼠的應當盡量少，因為引入鼠殘基 會增加抗體引發人的人抗小鼠抗體(HAMA)反應的危險。可以采用本領域認可的方法來測 定免疫反應以便監測特定患者或進行臨床試驗時的HAMA反應。被施用人源化抗體的患者 可以在施用該治療的開始和整個過程中進行免疫原性評價。例如，利用本領域技術人員已 知的方法(包括表面等離子共振技術(BIAC0RE)和/或固相ELISA分析)檢測患者血清樣 品中針對人源化治療劑的抗體來測量HAMA反應。
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如果需要，可以將人類框架區的一或多個殘基改變成鼠抗體中相應位點的殘基，從而保留人源化抗體對抗原的結合親和性。這種改變有時被稱為“回復突變”。根據對CDR 構象和/或結合抗原的可能影響，挑選一些人類可變區框架氨基酸殘基來進行回復突變。 用人類可變框架區代替鼠CDR區會造成構象限制，這除非通過對一些氨基酸殘基進行取代 來糾正，否則會導致結合親和性的喪失。在一實施方案中，挑選用于回復突變的氨基酸殘基可以利用本領域認可的技術， 部分地通過計算機建模來決定。通常，從免疫球蛋白鏈或其結構域的已知結構出發產生出 分子模型。比較待建模鏈與已知三維結構(例如，X-射線結構)的鏈或結構域的氨基酸序 列相似性，選擇表現出最高序列相似性的鏈或結構域為出發點來構建分子模型。對已知的 起始結構進行修飾，以允許待建模的免疫球蛋白鏈或結構域中的實際氨基酸與起始結構中 的氨基酸的不同。然后將修飾過的結構組裝成復合免疫球蛋白。最后，通過能量最小化并 通過確認所有原子相互之間保持適當的距離以及鍵長和角度處于化學上可接受的范圍來 完善模型。在另一實施方案中，可以利用基于已有知識的方法或數據庫分析來進行人源化。 例如，這類人源化策略可以基于根據Rosok等(Rosok MJ，等人，1996. J.Biol. Chem. 271 22611-22618)描述的方法目測和分析V區序列。鑒定出規范決定簇、表面殘基和可能 的接觸殘基。可能的接觸殘基被記錄并根據以下進行大概分類=Chothia等人(Chothia C 和 Lesk AM. 1987. J. Mol. Biol. 196 901-917)定義的 CDR 環的結構定義、Kabat 等人 (Kabat EA, Wu TT, Reid-Miller M, Parry HM,禾口 Gottesman KS. 1987. Sequences of Protein of Immunological Interest ( ^iiS i^iMSS S), U. S. department of Healthand Human Services, NIH, Bethesda, MD)定義的序列高變性，以及 MacCallum 等人 (MacCallum RM, Martin ACR 和 Thorton JM. 1996. J. Mol. Biol. 262 :732_745)定義的可能 的抗原接觸殘基。將遵循Kabat編號和定義的鼠CDR環全部移植到受者人類框架上。鑒 定出Padlan (Padlan EA. 1991. Mol Immunol. 28 :489_498)所定義的堆積殘基，并嘗試按照 Singer 等人(Singer II 等人· 1993. J. Immunol. 150 =2844-2857)描述的策略來保留這些 堆積殘基。框架序列中的每個殘基被指定為Harris和Bajorath (Harris L和Bajorath J. 1995. ProteinScience 4:306-310)描述的抗體人源化的低度、中度或高度“危險位點”。—般來說，低危險位點保持為人類的殘基。關于許多各不相同的中度和高度危 險氨基酸位點，可以參考公開的或私有的人源化抗體序列資料。在參考以前的人源化抗 體序列時，記錄下含有人類或鼠(回復突變)氨基酸殘基是否會產生功能性的結合活性。 在考慮進行取代的情況中，可以參考氨基酸取代圖譜(D. Bordo和P. Argos. 1991. J. Mol. Biol. 217 721-729)以便確認這些殘基是功能上可以互換的。也可以部分地通過研究特定位置上的氨基酸的特性，或者根據經驗觀察特定氨基 酸的取代或誘變的影響來挑選進行取代的氨基酸殘基。例如，當非人類可變區框架殘基和 選定的人類可變區框架殘基有一個氨基酸不同，供者抗體中的氨基酸是規范殘基、界面堆 積殘基，或者靠近結合位點的不常見或罕見殘基時，通常應當將人類框架氨基酸取代為來 自非人類供者抗體的等效的框架氨基酸。在一實施方案中，本發明的結合分子還包含至少一個人類氨基酸殘基回復突變為 相應的小鼠氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基是界面堆積殘基。“界面堆積殘基”包括按照例如 Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 :4592_66 (1985)定義的位于 VL 和 VH 之 間的界面的殘基。在一實施方案中，本發明的結合分子還包含至少一個人類氨基酸殘基回復突變 為相應的小鼠氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基是規范殘基。“規范殘基”是已知對CDR構 象重要的規范類型或結構類型中的保守的框架殘基(Tramontane)等人，J. Mol. Biol. 215 175(1990)，其全文以參考的方式引入本文)。規范殘基包括輕鏈中的2、25、27B、28、29、30、 33、48、51、52、64、71、90、94 和 95，以及重鏈中的殘基 24、26、27、29、34、54、55、71 和 94。其 它殘基(例如，CDR結構決定殘基)可以根據Martin和Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263 800的方法來鑒定。在一實施方案中，本發明的結合分子還包含至少一個人類氨基酸殘基回復突變為 相應的小鼠氨基酸殘基，其中該氨基酸殘基處于能夠和CDR相互作用的位置。特別是，在許 多抗體中，輕鏈中位點2、48、64和71的氨基酸以及重鏈中位點26-30、71和94的氨基酸 (按照Kabat的編號)是已知能與⑶R相互作用的。輕鏈位點35和重鏈位點93和103的 氨基酸也有可能與⑶R相互作用在例如美國專利5，585，089中提出了挑選進行取代的框架殘基的示例性技術。那 項專利中描述了幾類可以被改變的人類框架氨基酸。在一實施方案中，第2類氨基酸被回 復突變為相應的鼠殘基。具體來說，第2類氨基酸是人類受者免疫球蛋白框架中的不常見 氨基酸(即，“罕見”，該術語在文中表示在代表性數據庫中，人類重鏈(輕鏈)V區序列中低 于約20%，通常低于約10%會在該位點出現這個氨基酸)，如果該位點的供者氨基酸對于 人類序列來說是典型的(即，“常見”，該術語在文中表示所述氨基酸出現在代表性數據庫中 約25%以上，通常是約50%以上的序列中)，則可以選擇非人類供者氨基酸(例如，鼠氨基 酸)，而不是人類受者氨基酸。這個標準幫助確保人類框架中的非典型氨基酸不會破壞抗體 的結構。并且，通過用供者抗體中碰巧對人類抗體而言是典型的氨基酸來代替不常見氨基 酸，可以使人源化抗體的免疫原性下降。所有人類輕鏈和重鏈可變區序列均被分別劃分成相互之間同源性特別高、在一些 關鍵位點有相同氨基酸的序列“亞群”(Kabat等人，同上)。在確定人類受者序列中的氨基 酸對于人類序列來說是“罕見”還是“常見”的時候，經常優選只將相同亞群中的人類序列 考慮為受者序列。在一實施方案中，第3類氨基酸被回復突變為相應的鼠殘基。屬于第3類的殘基 在人源化免疫球蛋白鏈的一級序列中與3個CDR中的一或多個相鄰，可以選擇供者氨基酸 而非受體氨基酸。這些氨基酸特別可能與CDR中的氨基酸相互作用，并且如果選自受者，則 它們會使供者CDR變形并降低親和性。而且，相鄰氨基酸可能與抗原直接相互作用(Amit 等人，Science, 233，747-753 (1986))，挑選供者中的這些氨基酸可能有益于保持原始抗體 中提供親和性的所有的抗原接觸。在一實施方案中，第4類氨基酸被回復突變成相應的鼠殘基。第4類氨基酸是這樣 一些氨基酸，通常在原始供者抗體的三維模型中，顯示CDR之外的一些氨基酸與CDR很近， 有很大的可能性通過氫鍵、范德華力、疏水相互作用等與CDR中的氨基酸相互作用。在這些 氨基酸位點，可選擇供者免疫球蛋白氨基酸，而非受者免疫球蛋白氨基酸。遵循這個標準的 氨基酸一般具有與CDR中的一些原子距離在約3埃單位以內的側鏈原子，并且必須含有能與這些⑶R原子通過諸如上面列舉的已知化學力發生相互作用的原子。在可形成氫鍵的原子的例子中，3埃是在它們的原子核之間測量，但是對于不形成 鍵的原子，3埃是在它們的范德華表面之間測量的。因此，在后一種情況中，被認為能發生 相 互作用的原子的原子核必須處于約6埃以內(3+范德華半徑之和)。許多情況中，原子核相 距4或5至6 A。確定氨基酸能否與⑶R相互作用時，優選不將重鏈⑶R 2的最后8個氨基 酸認為是CDR的一部分，因為從結構來看，這8個氨基酸表現得更象是框架的一部分。框架中能與⑶R氨基酸發生相互作用的氨基酸屬于第4類，可以通過另一種方式 進行區別。每個框架氨基酸的溶劑可及性表面積以兩種方法計算(1)完整抗體，和(2)由 去除了 CDR的抗體組成的假設分子。這些數字之間約10平方埃或以上的顯著差異表明框架 氨基酸與溶劑的接觸至少部分被CDR阻斷，因此該氨基酸與CDR有相互作用。氨基酸的溶 劑可及性表面積可以在抗體的三維模型的基礎上，利用本領域已知的算法來計算(例如， Connolly,J. App1. Cryst. 16，548(1983)，Lee和 Richards，J. Mol. Biol. 55，379(1971))。框 架氨基酸還可能偶爾通過影響另一個框架氨基酸的構象，使之與CDR發生接觸，從而間接 地與⑶R相互作用。已知在許多抗體中，框架中多個位點的氨基酸能夠與⑶R相互作用(Chothia和 Lesk, J. Mol. Biol. 196，901 (1987)、Chothia 等人，Nature 342,877(1989)以及 Tramontano 等人，J. Mol. Biol. 215，175 (1990)，這些文章全部以參考的方式引入本文)，特別是，輕鏈的 位點2、48、64和71以及重鏈的26-30、71和94(按照Kabat的編號系統，同上)，因此這些 氨基酸一般屬于第4類。在一實施方案中，本發明的人源化免疫球蛋白除此之外還包括屬 于第4類的供者氨基酸(當它們不同時)。輕鏈位點35以及重鏈位點93和103的氨基酸 也可能與CDR有相互作用。因此，在一實施方案中，人源化免疫球蛋白中可能包括一或多個 供者氨基酸，而非受者氨基酸(當它們不同時)。另一方面，一些可能屬于第4類的位點，諸 如輕鏈的前5個氨基酸，有時可能從受者免疫球蛋白中挑選而并不損失人源化免疫球蛋白 的親和性。除了以上這些描述人源化免疫球蛋白中的氨基酸何時可取自供者的類別，人源化 免疫球蛋白中的一些氨基酸如果落入第5類，則它們既不能從供者也不能從受者中獲取。 如果供者免疫球蛋白中給定位點的氨基酸對于人類序列來說是上文中定義的“罕見的”，受 者免疫球蛋白中該位點的氨基酸對于人類序列也是“罕見的”，則人源化免疫球蛋白中該位 點的氨基酸可以選擇為人類序列中的某“典型”氨基酸。優選的選擇是最常出現在與受者 序列屬于同一亞群的已知人類序列該位點的氨基酸。在一實施方案中，本發明的結合分子包含三個B3F6輕鏈⑶R (⑶RLl、⑶RL2 和CDRL3)和人類輕鏈框架區。在一實施方案中，最適合的表達的人類輕鏈框架是人類 gi-21669417(BAC01733) (SEQ ID NO :45)。在一實施方案中，本發明的結合分子還包含在至 少一個選自2和100的位點的人氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的至少一個回復突變。 在一實施方案中，本發明的結合分子還包含在至少一個選自2和100的位點的人氨基酸殘 基到相應小鼠氨基酸殘基的一個回復突變。在另一實施方案中，結合分子包含位于人源化 B3F6輕鏈的位點2和100的回復突變。在另一實施方案中，本發明的結合分子包含位于人 源化B3F6輕鏈的位點2的回復突變和至少另外一個回復突變。在另一實施方案中，本發明 的結合分子包含位于人源化B3F6輕鏈的位點100的回復突變和至少另外一個回復突變。
在一實施方案中，本發明的結合分子包含三個B3F6重鏈⑶R (⑶RHl、⑶RH2 和CDRH3)和人類重鏈框架區。在一實施方案中，最適合的表達的人類重鏈框架是 gi-14289106(AAK57792) (SEQ ID NO :46)。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自1、 48、67、71、73、81、82b、93和112組成的組的至少一個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應 小鼠氨基酸殘基的至少一個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自1、48、 67、71、73、81、82b、93和112組成的組的一個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基 酸殘基的一個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自1、48、67、71、73、81、 82b,93和112組成的組的兩個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的兩個 回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自l、48、67、71、73、81、82b、93和112 組成的組的三個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的三個回復突變。在 一實施方案中，本發明的結合分子在選自l、48、67、71、73、81、82b、93和112組成的組的四 個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的四個回復突變。在一實施方案中， 本發明的結合分子在選自l、48、67、71、73、81、82b、93和112組成的組的五個位點上，包含 人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的五個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合 分子在選自l、48、67、71、73、81、82b、93和112組成的組的六個位點上，包含人類氨基酸殘 基到相應小鼠氨基酸殘基的六個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自1、 48、67、71、73、81、82b、93和112組成的組的七個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠 氨基酸殘基的七個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自1、48、67、71、73、 81、82b、93和112組成的組的八個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的 八個回復突變。在一實施方案中，本發明的結合分子在選自l、48、67、71、73、81、82b、93和 112組成的組的九個位點上，包含人類氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的九個回復突變。在一實施方案中，本發明涉及B3F6抗體的人源化可變區，以及包含該人源化可變 區的多肽。在一實施方案中，本發明的結合分子包含如SEQ ID NO :52中氨基酸1_112所示的 ⑶R移植的輕鏈可變區序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含如SEQ ID N0:55中 氨基酸1-121所示的CDR移植的輕鏈可變區序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :47所示的輕鏈版本1可變區 序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :48所示的重鏈版本1可變區序 列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQID NO :49所示的重鏈版本2可變區序列。在另一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :50所示的輕鏈版本2可變 區序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :51所示的重鏈版本3可變區 序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO 52所示的⑶R移植的輕鏈。 在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :53所示的版本1輕鏈。在一實施方案 中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :54所示的版本2輕鏈。在一實施方案中，本發明的結 合分子包含SEQ ID NO 55所示的⑶R移植的重鏈。 在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :56所示的版本1重鏈。在一實施方案 中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :57所示的版本2重鏈。在一實施方案中，本發明的 結合分子包含SEQ ID NO 58所示的版本3重鏈。
在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :59所示的⑶R移植的結構域 缺失重鏈。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID N0:60所示的版本1結構域缺 失重鏈。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :61所示的版本2結構域缺失 重鏈。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :62所示的版本3結構域缺失重 鏈在一實施方案中，本發明的結合分子包含如SEQ ID NO :63所示的⑶R移植的輕 鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO 64 所示的版本1輕鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含 SEQ ID NO :65所示的版本2輕鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :66所示的⑶R移植的重鏈序 列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID N0:67所示 的版本1重鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結合分子包含SEQ ID NO :68所示的版本2重鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，本發明的結 合分子包含SEQID NO 69所示的版本3重鏈序列，其包括任選的信號序列。在一實施方案中，將包含鼠B3F6⑶R和人類框架區的輕鏈與包含鼠B3F6⑶R和 人類框架區的重鏈結合在一起。在一實施方案中，將包含鼠B3F6⑶R和人類框架區的輕 鏈與含有人類框架氨基酸殘基到相應小鼠氨基酸殘基的至少一個回復突變的人源化B3F6 重鏈版本組合在一起。在另一實施方案中，將含有至少一個人類框架氨基酸殘基到相應小 鼠氨基酸殘基的回復突變的人源化B3F6輕鏈版本，與含有至少一個人類框架氨基酸殘基 到相應小鼠氨基酸殘基的回復突變的人源化B3F6重鏈版本組合在一起。在另一實施方案 中，將包含小鼠B3F6 CDR和人類框架區以及至少一個從人類框架氨基酸殘基到相應小鼠氨 基酸殘基的回復突變的輕鏈與人源化B3F6重鏈版本組合在一起。示例性的組合方式在WO 2006 074397的實施例中有更詳細的描述。例如，在一實施方案中，WO 2006 074397實施 例中的人源化Ll輕鏈與WO 2006 074397實施例中的Hl重鏈組合在一起形成人源化B3F6 抗體的第1個版本。在另一實施方案中，WO 2006 074397實施例中的人源化Ll輕鏈與WO 2006 074397實施例中的H2重鏈組合在一起形成人源化B3F6抗體的第2版本。這一版本 的人源化B3F6由保藏在ATCC，保藏號是PTA-7284的CHO細胞系產生。在另一實施方案中， WO 2006 074397實施例中的人源化Ll輕鏈與WO 2006 074397實施例中的H3重鏈組合在 一起形成人源化B3F6抗體的第3版本。在另一實施方案中，WO 2006 074397實施例中的 人源化L2輕鏈與WO 2006 074397實施例中的Hl重鏈組合在一起形成人源化B3F6抗體的 第4個版本。在另一實施方案中，WO 2006 074397實施例中的人源化L2輕鏈與WO 2006 074397實施例中的H2重鏈組合在一起形成人源化B3F6抗體的第5個版本。在另一實施方 案中，WO 2006 074397實施例中的人源化L2輕鏈與WO 2006 074397實施例中的H3重鏈 組合在一起形成人源化B3F6抗體的第6個版本。對本領域普通技術人員來說，顯然這些組 合方式都在本發明的范圍內。在一實施方案中，本發明的結合分子是由根據布達佩斯條約，保藏在美國典型 培養物保藏中心(ATCC) 10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110，保藏號為 PTA-7284的細胞系產生的人源化抗體。II.結合分子的形式
Α.抗體或其部分
在一實施方案中，本發明的結合分子是抗體分子。例如，在一實施方案中，本發明 的結合分子是結合Cripto的人源化抗體或其部分。在另一實施方案中，本發明的結合分子 是多價的，包含人源化抗體的結合Cripto的抗原結合片段，以及抗體的第二個抗原結合片 段。在一實施方案中，可制備其它抗Cripto抗體。此外，可制備用于并入多價抗 Cripto抗體的結合位點。例如，優選通過在哺乳動物中多次皮下或腹膜內注射相關抗原 (例如，純化的腫瘤相關抗原或含有該抗原的細胞或細胞提取物)和佐劑來培育抗體。這類 免疫接種通常會引發包括由活化的脾細胞或淋巴細胞產生抗原反應性抗體在內的免疫應 答。雖然可以從動物血清中收集所得抗體來提供多克隆制品，但通常希望從脾、淋巴結或外 周血中分離單個淋巴細胞以便提供單克隆抗體(MAb)的均一制品。優選地，所述淋巴細胞 得自脾。在這個眾所周知的方法(Kohler等人，Nature，256 =495(1975))中，將來自被注射 了抗原的哺乳動物的相對短壽或者會死亡的淋巴細胞與永生的腫瘤細胞系(例如，骨髓瘤 細胞系)融合，從而制備出雜交細胞或“雜交瘤”，其既可以無限增殖又能產生遺傳編碼的B 細胞抗體。經過挑選、稀釋并再培養含有形成單個抗體的特定基因的每個單獨株，將所得雜 交體分離成單遺傳株。它們產生的抗體均一地抗目的抗原，就其純的遺傳家系而言，被稱為 “單克隆的”。將這樣制備的雜交瘤細胞接種并生長在合適的培養基中，優選培養基含有一或多 種能夠抑制未融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。本領域技術人員知道，用于形 成、挑選和培養雜交瘤的試劑、細胞系和培養基可以從多種來源購買，標準方案已建立完 善。通常，要檢測雜交瘤細胞生長培養基中針對目的抗原的單克隆抗體的產生。優選的， 通過免疫沉淀或者體外測定(諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附法(ELISA))來 確定雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。鑒定到產生所需特異性、親和性和/ 或活性的抗體的雜交瘤細胞后，克隆可以經有限稀釋程序進行亞克隆并用標準方法培養 (Goding， Monoclonal Antibodies principles and Practice (單克隆抗體的原理禾口實 踐)，第59-103頁(Academic Press，1986))。還要理解，可通過常規純化方法，諸如蛋白A、 羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體從培養基、腹水 或血清中分離出來。在另一實施方案中，可以利用常規步驟(例如，利用能夠特異結合編碼鼠抗體重 鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離出編碼所需單克隆抗體的DNA并測序。分離 并亞克隆的雜交瘤細胞是這類DNA的優選來源。分離后，DNA可以引入表達載體，然后將后 者轉染到本來不會產生免疫球蛋白的原核或真核宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猴COS細 胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞。更具體地說，可以按照Newman等人1995年1 月25日提交的美國專利第5，658，570號(全文以參考的方式引入本文)中描述的，用分離 的DNA(可以是如本文描述的合成DNA)來克隆恒定和可變區序列以便制備抗體。實質上， 這需要從所選細胞中提取RNA、轉化成cDNA以及用Ig特異引物PCR擴增。適用于該目的的 引物在美國專利第5，658，570號中也有描述。如下文更詳細描述的，表達所需抗體的轉化 細胞可以較大量地培養以便提供免疫球蛋白的臨床和商業供應。
本領域技術人員還會理解，編碼抗體或抗體片段(例如，抗原結合位點)的DNA還 可以來源于抗體噬菌體文庫，例如利用Pd噬菌體或Fd噬菌粒技術。示例性的方法在例如 EP 368 684 Bl ；美國專利第 5，969，108 號、Hoogenboom, H. R.和 Chames. 2000. Immunol. Today 21 371 ；Nagy 等人.2002. Nat. Med. 8 801 ；Huie 等人.2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 2682 ；Lui等人.2002. J. Mol. Biol. 315 1063中描述，這些文獻均以參考的方式 引入本文。有些出版物(例如，Marks等人· Bio/Technology 10:779-783(1992))描述了 通過鏈改組來產生高親和性人類抗體、以及用組合感染和體內重組作為構建大噬菌體文庫 的策略。在另一實施方案中，可以利用核糖體展示代替噬菌體作為展示平臺(參見例如， Hanes 等人· 2000. Nat. Biotechnol. 18 1287 ；Wilson 等人· 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :3750 ；或 Irving 等人.2001 J. Immunol. Methods 248 :31)。在另一實施方案中，可 以篩選細胞表面文庫來獲得抗體(Boder等人.2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 10701 ； Daugherty等 人.2000J. Immunol. Methods243 211)。這些方案提供了用于分離以及隨后克 隆單克隆抗體的傳統雜交瘤技術的替代方法。在本發明的另一實施方案中，本發明結合分子的結合位點可以由人類抗體或基 本上人類抗體提供。人類抗體或基本上人類抗體可以在不能產生內源免疫球蛋白的轉基 因動物(例如小鼠)中制備(參見例如，美國專利第6，075，181、5，939，598、5，591，669和 5，589，369號，均以參考方式引入本文)。例如，有人描述，嵌合和種系突變小鼠中抗體的重 鏈連接區的純合缺失導致內源抗體產生被完全抑制。將人類免疫球蛋白基因陣列轉移到這 樣的種系突變小鼠中，使得它在抗原攻擊時產生人類抗體。另一種優選的利用SCID小鼠產 生人類抗體的手段在美國專利第5，811，524號中有描述，該專利以參考方式引入本文。應 理解，與這些人類抗體相關的遺傳物質也能如文中所述進行分離和操縱。還有一種高效率產生重組抗體的手段在Newman，Biotechnology, 10 1455-1460(1992)中公開。具體來說，這一技術使得產生了含有猴可變區和人類恒定區序列 的靈長類源化抗體。該文獻以引用的方式全文引入本文。此外，這一技術在共同轉讓的美 國專利第5，655，570,5, 693，780和5，756，096號中也有描述，這些專利均以參考的方式引 入本文。在另一實施方案中，可以通過顯微操作挑選淋巴細胞，并分離可變區基因。例如， 可以從免疫的哺乳動物中分離外周血單核細胞，體外培養約7天。在培養物中篩選符合篩 選標準的特異IgG。可分離陽性孔中的細胞。單個產生Ig的B細胞可以經FACS或者通過 在補體介導的溶血斑測定中鑒定它們而被分離。產生Ig的B細胞可以顯微操作到試管中， 利用例如RT-PCR擴增VH和VL基因。可將VH和VL基因克隆到抗體表達載體中，并轉染到 細胞(例如，真核或原核細胞)內進行表達。此外，用于產生本發明結合分子的遺傳序列可以得自許多不同來源。例如，象上面 大量討論過的，許多人類抗體基因是公眾可以獲取的保存形式。許多抗體和抗體編碼基因 的序列已被公開了，可以利用本領域認可的技術由這些序列化學合成合適的抗體基因。與 本發明這一方面相符的寡核苷酸合成技術是技術人員熟知的，可以利用任何多種可購買獲 得的自動合成儀來實現。另外，本文中給出的編碼不同種類重鏈和輕鏈的DNA序列可以通 過商業的DNA合成供應商獲得。然后可以將利用任何以上方法得到的遺傳物質進行改變或 合成，從而得到本發明的多肽。
可選地，可以用技術人員熟知的技術挑選和培養抗體產生細胞系。這類技術在 許多實驗室手冊和主要出版物中都有描述。就此而言，適用于本發明的技術在Current Protocols in Immunology (免疫學最新實驗方案)，Coligan 等人編輯，Green Publishing Associates and ffiley-Interscience, John Wiley andSons, New York(1991)中描述，該 書以參考文獻的方式全文引入本文，包括補充內容。
應當進一步意識到本發明的范圍進一步覆蓋了抗原結合性DNA序列的等位基因、 變體和突變。眾所周知，RNA可以從起始雜交瘤細胞或其它轉化細胞中通過標準技術分離，所述 技術諸如異硫氰酸胍提取和沉淀，隨后進行離心或層析。如果需要，可以通過標準技術(諸 如在寡dT纖維素上進行層析)從總RNA中分離mRNA。合適的技術是本領域所熟悉的。在一實施方案中，編碼抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以同時或分別用逆轉錄酶和DNA 聚合酶，根據公知方法制備。可以在已公開的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的基礎上，用共 有恒定區引物或更特異的引物引發PCR。如上面討論過的，PCR也可以用于分離編碼抗體輕 鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況中，可以用共有引物或更大的同源探針，諸如小鼠恒定區 探針來篩選文庫。可以采用領域已知的技術從細胞中分離DNA (通常是質粒DNA)，并按照在例如前 面涉及重組DNA技術的參考文獻中詳細描述的標準公知技術進行限制酶切圖譜和測序。當 然，根據本發明，在分離或隨后的分析過程中的任何點，DNA可以是合成的。用于本發明結 合分子的示例性抗體或其片段包括識別文中給出的靶的抗體。在一些實施方案中，可用領域公知技術制備抗體的抗原結合片段。B.修飾的抗體在一實施方案中，本發明的結合分子包含被修飾的抗體，或由經修飾的抗體組成， 即來源于抗體的分子，但不是野生型抗體，例如微抗體(微抗體可以用領域中已描述過的 方法來制備(參見，例如美國專利第5，837，821號或WO 94/09817A1)等)。1.結構域缺失的抗體在一實施方案中，本發明結合分子包含其中一或多個結構域被部分或完全缺失的 合成恒定區(“結構域缺失抗體”)。在特別優選的實施方案中，適用修飾抗體包含結構域 缺失的構建體或變體，其中整個CH2結構域被去除(ACH2構建體)。對于其它優選實施方 案，可以用短的連接肽來取代被缺失的結構域以為可變區提供柔性和移動自由。本領域技 術人員理解，由于CH2結構域對抗體代謝速率的調節作用，這樣的構建體是特別優選的。在另一實施方案中，本發明的經修飾的抗體是CH2結構域缺失抗體。結構域缺失 構建體可以利用編碼IgG1人類恒定結構域的載體(例如，來自IDECPharmaceuticals，San Diego)來獲得(參見，例如WO 02/060955A2和W002/096948A2)。這個示例性的載體被工 程化以缺失CH2結構域并提供一種表達結構域缺失的IgG1恒定區的合成載體。然后編碼 C2B8抗體、5E8抗體、B3F6抗體的鼠可變區，或人源化CC49抗體的可變區的基因被插入到 該合成載體并克隆。當在轉化細胞中表達時，這些載體分別提供了 C2B8. ACH2、5E8. ACH2、 B3F6. ACH2或huCC49. ACH2。這些構建體表現出許多特性，使得它們成為了特別有吸引力 的單體亞基候選物。使用鉸鏈區連接肽Gl/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO 5)構建的一種CH2結構域缺失的嵌合B3F6 (chB3F6 Δ CH2)抗體描述于W02006074397。“chB3F6”是 嵌合的抗CRIPTO單克隆抗體，由分別融合于人類重鏈和輕鏈恒定結構域的鼠重鏈和輕鏈 可變結構域組成。由分別融合于人類重鏈和輕鏈恒定結構域的鼠重鏈和輕鏈可變結構域組 成、含有Gl/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]鉸鏈連接肽的重鏈CH2結構域缺失的嵌合 抗CRIPTO單克隆抗體(chB3F6)的DNA序列顯示在SEQ ID NO :1。輕鏈CH2結構域缺失的 chB3F6 的 DNA 序列顯示在 SEQ ID NO :2。含有 Gl/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]鉸鏈 連接肽的重鏈CH2結構域缺失的chB3F6的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO :3。輕鏈CH2結 構域缺失的chB3F6的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO :4。用于制備結構域缺失的抗體(包 含鉸鏈連接肽(HCP))的恒定區序列顯示在SEQ ID NO :70，用于制備全長抗體的全長IgGl 恒定區序列顯示在SEQ ID N0:71。已制備了人源化結構域缺失的B3F6抗體，更詳細地描 述于WO 2006074397的實施例應指出的是這些示例性的構建體被工程化了，使得CH3結構域直接融合到本發明 相應多肽的鉸鏈區。在其它構建體中，可能希望在鉸鏈區和合成CH2和/或CH3結構域之 間提供一個間隔肽。例如，可以表達這樣的適用構建體，其中CH2結構域被缺失，剩下的CH3 結構域(合成或非合成的)借助5-20個氨基酸的間隔連接至鉸鏈區。例如，可以加上這樣 的間隔肽來保證恒定結構域的調節元件保持自由，具有可及性，或者鉸鏈區保持靈活。例 如，可以使用這樣一種結構域缺失的B3F6構建體，該構建體有取代了 CH2結構域的短氨基 酸間隔GGSSGGGGSG(SEQ. ID No. 8)和下游鉸鏈區(B3F6. Δ CH2 [gly/ser])。其它示例性的 連接肽如表2所示。這些連接肽可以用于本發明的任何多肽。優選地，所述連接肽用于缺 少CH2重鏈結構域的多肽。優選地，適合本發明的任何接頭是相對非免疫原性的，不會抑制 本發明多肽的非共價鍵結合。在一實施方案中，只要允許在單體亞基之間形成共價或非共價連接，則本發明多 肽包含帶有數個甚至單個氨基酸缺失或取代的免疫球蛋白重鏈。例如，在CH2結構域的選 定區域的單氨基酸突變可足以明顯減少Fc結合，從而提高對腫瘤的定位。類似的，可能希 望僅缺失一或多個恒定區結構域中控制待調節的效應子功能(例如，補體結合)的那部分。 恒定區的這種部分缺失可改善抗體的選定特性(血清半衰期)，而與目標恒定區結構域相 關的其它所需功能保持完整。而且，如上文提到的，公開的抗體的恒定區可以是合成的，通 過一或多個氨基酸的突變或取代，增強了所得構建體的特性。從這一點來說，有可能將保守 結合位點(例如，Fc結合)所賦予的活性破壞掉，而基本上維持被修飾抗體的構型和免疫 原性特點。但是，其它優選實施方案可能包含在恒定區中添加一或多個氨基酸以便增強所 需特性(諸如效應子功能)或者提供更強的細胞毒素或碳水化合物附著。在這些實施方案 中，可能希望插入或重復來源于選定恒定區結構域的特異序列。本領域已知恒定區介導多種效應子功能。例如，補體的Cl組分與抗體結合會活化 補體體系。補體的活化在調理作用和細胞病原體的裂解中非常重要。補體的活化還刺激炎 癥反應，并可參與自身免疫超敏感性。此外，隨著抗體Fc區域的Fc受體位點結合到細胞上 的Fc受體(FcR)，抗體借助Fc區域結合到細胞上。有許多針對不同種類的抗體的Fc受體， 包括IgG (Y受體)、IgE (ε受體)、IgA (α受體)和IgM (μ受體)。抗體結合細胞表面上 的Fc受體引發大量重要和多樣的生物反應，包括胞吞和破壞被抗體包被的顆粒、清除免疫 復合體、殺傷細胞對包被抗體的靶細胞的溶解(稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，或ADCC)、釋放炎性介質、通過胎盤以及控制免疫球蛋白的產生。在一實施方案中，效應子功能可以通過下述被消除或降低利用被認為不能清除 靶細胞的IgG4抗體的恒定區；或者生成Fc變體，其中Fc區域里對于效應子功能很關鍵的 殘基利用本領域已知技術(例如，美國專利第5，585，097號)被突變。例如，恒定區結構域 的缺失或滅活(通過點突變或其它手段)可減少Fc受體結合循環的經修飾的抗體，從而提 高對腫瘤的定位。其它情況中，可能與本發明一致的恒定區修飾會減緩補體結合，因此降低 偶聯的細胞毒素的血清半衰期和非特異締合。然而，可以用恒定區的其它修飾來改變二硫 鍵或寡糖部分，從而使其定位因為抗原特異性或抗體柔性增加而增強。更一般來說，本領域 技術人員會認識到如本文的描述進行修飾的抗體可產生許多微妙的效果，這些效果可以或 可以不很容易地得到領會。但是，這些修飾所產生的生理特性、生物利用度及其它生化效果 (諸如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期)不需要經過過多實驗，可以容易地利用已知免疫 技術測量和定量。在一實施方案中，可以用本領域已知技術由整個前體或母體抗體制得修飾形式的 抗體。示例性技術在下文有更詳細描述。包含重鏈部分的多肽可以包含或不包含不是來源于免疫球蛋白分子的其它氨基 酸序列或部分。以下更詳細地描述了這類修飾。例如，在一實施方案中，本發明多肽可能包 含柔性接頭序列。在另一實施方案中，多肽可以被修飾以添加功能部分，諸如藥物或PEG。2.雙特異性結合分子在一實施方案中，本發明的結合分子是雙特異性的。例如，在一實施方案中，所述 結合分子結合Cripto和另一個分子。在一實施方案中，本發明的雙特異性結合分子可包 含另外的結合位點，該結合位點結合一或多個腫瘤分子或與腫瘤細胞生長相關的分子。在 一實施方案中，對于贅生性病癥，所公開的多肽的抗原結合位點(即，可變區或免疫反應片 段或其重組體)結合到位于惡性腫瘤部位的選定腫瘤相關分子。考慮到已報道的與贅生腫 瘤細胞生長相關的分子的數量和相關抗體的數量，本領域技術人員應意識到，要求保護的 結合分子的結合位點可以因此來源于大量完整抗體的任何之一。更一般來說，用于本發明 的結合位點可以得自或來源于與選定情況相關的靶分子或標記物反應的任何抗體(包括 文獻中已有報道的)。此外，用于產生本文公開的多肽的母體或前體抗體，或者其片段可以 是鼠的、人類的、嵌合的、人源化的、非人類靈長類的或靈長類源化的。在其它優選實施方案 中，本發明的多肽可以包含具有本文描述的被改變恒定區的單鏈抗體構建體(諸如美國專 利第5，892，019號中公開的那些，該專利以參考的方式引入本文)。因此，這些類型的抗體 的任何一種都可以用來獲得能引入本發明雙特異性分子的結合位點。如本文使用，“腫瘤相關分子”指通常與腫瘤細胞相關的任何抗原或靶分子，即其 表達程度與正常細胞相同或更高。更廣泛的說，腫瘤相關分子包括任何這樣的分子，這些分 子即使在非惡性腫瘤細胞上也有表達，它們使得免疫反應性抗體能定位到贅生性細胞上。 這些分子可相對具有腫瘤特異性，其表達限于惡性腫瘤細胞表面。可選地，在惡性和非惡性 腫瘤細胞上都能發現這類分子。例如，CD20是一種在惡性和非惡性B細胞表面上都有發現 的泛B抗原，它已被證實是治療非霍奇金淋巴瘤的免疫治療抗體的極其有效的靶。在這方面，泛T細胞抗原，諸如⑶2、⑶3、⑶5、⑶6和⑶7也包含本發明意義中的腫 瘤相關分子。其它示例性腫瘤相關分子包括但不限于LewisY、MAGE-1、MAGE-3、MUC-I、HPV
2816、HPV E6&E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF 受體和 HER2 受 體。許多情況中，這些抗原每一個的免疫反應性抗體在文獻中已有報道。本領域技術人員 會理解，與本發明一致的，這些抗體每一個都可以作為本發明多肽的前體。以前報道過的能與腫瘤相關分子反應的抗體可以按照本文的描述進行改變， 從而給本發明多肽提供一或多個結合位點。可以用來給所述多肽提供結合位點的示 例性抗體(或者結合位點可以來源的抗體)包括但不限于，2B8和C2B8(Zevalin 和 Rituxan ； IDEC Pharmaceuticals Corp. , San Diego) > Lym IfPLym 2 (Techniclone) > LL2 (Immunomedics Corp. , New Jersey)、HER2 ( Herceptin , Genentech Inc. , South San
Francisco)、Bl ( Bexxar , Coulter Pharm. , San Francisco)、Campath (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge)、MB1、BH3、B4、B72. 3 (Cytogen Corp. )、CC49 (National Cancer Institute)和SElO (University of Iowa)。在優選實施方案中，本發明多肽會與以 上列舉的抗體結合相同的腫瘤相關抗原。在特別優選的實施方案中，所述多肽來源于2B8、 C2B8、CC49和C5E10，或者和它們結合的抗原相同，更優選的是，所述多肽包含結構域缺失 的抗體(即，ACH2抗體)。在第一優選實施方案中，本發明的雙特異性分子與Rituxan 結合相同的腫瘤相 關抗原。Rituxan (又稱為利妥昔單抗、IDEC-C2B8和C2B8)是FDA批準的第一個用于治 療人類B細胞淋巴瘤的單克隆抗體(參見美國專利第5，843，439 ；5, 776，456和5，736，137 號，這些專利均以參考的方式引入本文)。Y2B8(90Y標記的2B8 ；Zevalin ;替伊莫單抗) 是C2B8的鼠親本。Rituxan 是一種嵌合的抗CD20的單克隆抗體，該抗體具有生長抑制性， 并且有報道說它能在體外使一些淋巴瘤細胞系對化療劑的細胞凋亡敏感。所述抗體能夠有 效地結合人類補體，具有強FcR結合，并且能借助補體依賴性(CDC)和抗體依賴性(ADCC) 機制體外有效地殺傷人類淋巴細胞(Reff等人，Blood 83 :435_445 (1994))。本領域技術人 員明白，按照本公開文本能夠結合Cripto和CD20+的雙特異性結合分子，可以偶聯或非偶 聯形式使用以有效地治療出現CD20+惡性腫瘤的患者。更一般地說，我們要重申本文公開 的多肽可以以“裸露”或未偶聯狀態或者偶聯細胞毒性劑來有效地治療多種病患的任何之
ο在本發明其它優選實施方案中，本發明雙特異性多肽可以包含來自CC49抗體(或 來源于CC49抗體)的結合位點。正如前面提到的，CC49能夠結合人腫瘤相關抗原TAG-72， 該抗原與一些來自人類的腫瘤細胞，特別是LS174T腫瘤細胞系的表面結合。LS 174T[美國 典型培養物保藏中心(文中稱為ATCONo. CL 188]是LS180(ATCC No. CL187)結腸腺癌細 胞系的變體。我們還知道，已開發了對TAG-72有結合特異性的許多鼠單克隆抗體。這些單克隆 抗體中的一個稱為B72. 3，是由雜交瘤B72. 3(ATCC No. HB-8108)產生的鼠IgGl。B72. 3是 用人類乳腺癌提取物作為免疫原開發出的第一代單克隆抗體(參見Colcher等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，78 3199-3203 (1981)；以及美國專利第 4，522，918 和 4，612，282 號，這些出版物均以參考的方式引入本文)。其它針對TAG-72的單克隆抗體被命名為 “CC” (表示結腸癌)。正如Schlom等人(美國專利第5，512，443號，以參考的方式引入 本文)描述的，CC單克隆抗體是用TAG-72從B72.3中純化制備的第二代鼠單克隆抗體家
29族。由于對TAG-72的結合親和性相對較好，以下CC抗體已被保存在ATCC，經申請后有限 制的訪問CC49(ATCC No. HB 9459) ；CC 83 (ATCC No. HB 9453) ；CC46 (ATCCNo. HB 9458)； CC92(ATTCC No. HB 9454) ；CC30(ATCC No. HB 9457) ；CC11(ATCC No. 9455)；禾口 CC15(ATCC No. HB 9460)。U. S. P. N. 5，512，443進一步教導了，可以利用本領域已知的重組DNA技術將 公開的抗體改變成它們的嵌合形式，例如通過用人類恒定區結構域(Fe)取代小鼠恒定區。 除了公開了鼠和嵌合抗TAG-72抗體，Schlom等人還制備了 PCT/US99/25552中公開的人源 化CC49抗體、和美國專利第5，892，019號中公開的單鏈構建體的變體，這兩份專利均以參 考的方式引入本文。本領域技術人員明白，以上提到的抗體、構建體或重組體，以及它們的 變體的每一個可以是合成的，并用于制備本發明雙特異性分子。除了上面討論過的抗TAG-72抗體，多個研究組還報道過結構域缺失的 CC49和B72. 3抗體的構建和部分表征情況(例如，Calvo等人· CancerBiotherapy, 8(1) 95-109(1993) , Slavin-Chiorini 等人.Int. J. Cancer 53:97-103(1993)和 Slavin-Chiorini 等人.Cancer. Res. 55 :5957_5967 (1995)。這些構建體也可以包括在本發 明的雙特異性分子中。在一實施方案中，本發明的雙特異性分子與⑶23結合(美國專利第6，011，138 號)。在一個優選實施方案中，本發明的雙特異性結合分子包含與5E8抗體結合相同表位 的結合位點。在另一實施方案中，本發明的結合分子包含至少一個來自抗CD23抗體(例如 5E8抗體)的CDR。在另一實施方案中，本發明的雙特異性分子包含來源于C5E10抗體的一個結合位 點(或者是與C5E10抗體結合相同腫瘤相關性抗原的結合位點)。正如同時待審的專利申請 09/104, 717中提出的，CSElO是識別似乎特異于前列腺腫瘤細胞系(例如，DU 145、PC3或 NDl)的約115kDa的糖蛋白決定子的抗體。因此，結合本發明來看，可以產生特異結合C5E10 抗體所識別的相同腫瘤相關抗原的雙特異性多肽(例如，CH2結構域缺失的抗體)，并以偶 聯或未偶聯形式用于治療贅生性病癥。在特別優選的實施方案中，所述結合分子來源于或 者包含C5E10抗體的抗原結合結構域的全部或部分，C5E10抗體如ATCC保藏號為PTA-865 的雜交瘤細胞系所分泌的。然后可以將得到的結合分子象下文描述的那樣偶聯于放射性核 素，并按照本文的方法施用于患有前列腺癌的患者。在另一實施方案中，可以在本發明結合分子中包含配體，例如用來賦予對特定受 體的結合能力，或者在結合分子中加上受體，用于例如從循環中去除配體。所述雙特異性結 合分子可以包含的示例性配體及其受體包括a.細胞因子或細胞因子受體細胞因子對淋巴細胞的增殖、分化和功能活化具有多效性作用。各種細胞因子或 其受體結合部分均可以用于本發明融合蛋白中。示例性細胞因子包括白介素(如IL-1、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13 和 IL-18)，集落刺激 因子(CSF)(例如，粒細胞CSF (G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF (GM-CSF)，和單核細胞巨噬細 胞CSF(M-CSF))，腫瘤壞死因子(TNF) α和β，及干擾素如干擾素-α、β或γ (美國專利 第 4，925，793 和 4，929，554 號)。細胞因子受體典型地由配體特異的α鏈和共同的β鏈組成。示例性細胞因子 受體包括GM-CSF、IL-3(美國專利第5，639，605號)、IL_4(美國專利第5，599，905號)、
30IL-5 (美國專利第5，453,號)、IFN γ (EP0240975)的受體，和TNF受體家族(如， TNFa (如，TNFR-I (EP 417，563)、TNFR-2 (EP 417，014)淋巴毒素 β 受體)。b.粘附蛋白或其受體粘附分子是允許細胞彼此相互作用的膜結合蛋白。各種粘附蛋白，包括白細胞歸 巢受體和細胞粘附分子，或其受體結合部分，均可以摻入本發明結合分子中。白細胞歸巢受 體在炎癥期間表達在白細胞表面上，包括介導與細胞外基質成分結合的β-1整聯蛋白(如 VLA-1、2、3、4、5和6)、和與血管內皮上的細胞粘附分子(CAM)結合的β 2-整聯蛋白(例如， LFA-I、LPAM-I、CR3 和 CR4)。示例性 CAM 包括 ICAM-1、ICAM-2、VCAM-I 和 MAdCAM-I。其它 CAM包括選擇蛋白家族的那些，包括E-選擇蛋白、L-選擇蛋白和P-選擇蛋白。c.趨化因子或其受體趨化因子-刺激白細胞向感染位點遷移的趨化蛋白-也可以摻入本發明結合分子 中。示例性趨化因子包括巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-a和MIP-1-β)、嗜中性粒細胞趨化因 子和RANTES (受活化調節的、正常由T細胞表達和分泌的)。d.生長因子或生長因子受體生長因子或其受體(或其受體結合部分或配體結合部分)或與它們結合的分 子可以摻入本發明結合分子中。示例性生長因子包括血管生成素、血管內皮生長因子 (VEGF)和其同種型(美國專利第5，194，596號)；表皮生長因子(EGF)；成纖維細胞生 長因子(FGF)，包括aFGF和bFGF;心房鈉尿因子(ANF)；肝生長因子(HGF;美國專利第 5，227，155和6，099，541號)、神經營養因子例如骨衍生的神經營養因子(BDNF)、神經營養 蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神經生長因子例如NGF-β、血小板衍生 生長因子(PDGF)(美國專利第 4，889，919,4, 545，075,5, 910，574 和 5，877，016 號)；轉化 生長因子(TGF)例如TGF-a和TGF-β (W0 90/14359)，骨誘導因子包括骨形成蛋白(BMP)； 胰島素樣生長因子-I和-II (IGF-I和IGF-II ；美國專利第6，403，764和6，506，874號)； 促紅細胞生成素(EPO)；干細胞因子(SCF)，血小板生成素(c-Mpl配體)，和Wnt多肽(美 國專利第6，159，462號)。可以使用的示例性生長因子受體包括EGF受體(EGFR) ；VEGF受體(如，Fltl或 Flkl/KDR)、PDGF受體(W0 90/14425) ；HGF受體(美國專利第 5，648，273 和 5，686，292 號)， IGF受體(如IGFRl和IGFR2)，和神經營養受體包括結合NGF、BNDF和NT-3的低親和受體 (LNGFR)，也稱作p75N 或p75，以及作為受體酪氨酸激酶trk家族成員的高親和受體(如 trkA、trkB (EP455, 460)、trkC(EP 522,530))。在另一實施方案中，靴向 IGFRl 和 VEGF 兩 者。在另一實施方案中，靶向VLA4和VEGF。還可靶向其它細胞表面受體和/或其配體(如，TNF家族受體或其配體(如本文 更詳細描述的)。e.激素用作本發明結合分子中靶向劑的示例性生長激素或與其結合的分子包括腎素、人 生長激素(HGH ；美國專利第5，834，598號)、N-甲硫氨酰基人生長激素；牛生長激素；生長 激素釋放因子；甲狀旁腺激素(PTH)；甲狀腺刺激激素(TSH)；甲狀腺素；胰島素原和胰島 素(美國專利第5，157，021和6，576，605號)；濾泡刺激激素(FSH)、降鈣素、黃體生成素 (LH)、瘦蛋白、胰高血糖素；鈴蟾肽(bombesin)；促生長素；Mullerian抑制物；松弛素和松
31弛素原；促性腺激素相關肽；催乳素；胎盤催乳激素；OB蛋白^mullerian抑制物。f.凝血因子在本發明結合分子中用作靶向劑的示例性血液凝結因子包括凝血因子(例如因 子 V、VII、VIII、IX、X、XI、XII 和 XIII、von Willebrand 因子)；組織因子(美國專利第 5，346，991,5, 349，991,5, 726，147和6，596，84號)；凝血酶和凝血酶原；纖維蛋白和纖維 蛋白原；纖溶酶和纖溶酶原；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人類尿或組織型纖溶酶原激 活物(t-PA)。C.融合蛋白本發明還涉及包含一或多個免疫球蛋白結構域的結合分子。在一實施方案中，本 發明的融合蛋白包含結合結構域(其包含至少一個結合位點)和二聚化結構域(其包含至 少一個重鏈部分)。例如，在一實施方案中，本發明的結合分子可包含至少一個人源化B3F6 結合位點和二聚化結構域。在一實施方案中，所述融合蛋白是雙特異性的(有一個對第一 靶的結合位點，和對第二靶的第二結合位點)。在一實施方案中，所述融合蛋白是多價的 (有針對相同靶分子的兩個結合位點)。在一實施方案中，所述融合蛋白包含B3F6結合位點、至少一個重鏈結構域和合成 連接肽。文獻中報道的示例性融合蛋白包括以下物質的融合T細胞受體(Gascoigne 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :2936_2940 (1987)) ；CD4 (Capon 等人，Nature 337 525-531 (1989) ；Traunecker 等人，Nature 339 :68_70(1989) ；Zettmeissl 等人，DNA Cell Biol. USA 9 :347_353 (1990)；和 Byrn 等人，Nature 344 :667_670(1990)) ；L-選 擇蛋白(歸巢受體)(Watson 等人，J. Cell. Biol. 110 2221-2229 (1990)；和 Watson 等 人，Nature 349 164-167 (1991)) ；CD44 (Aruffo 等人，Cell 61 1303-1313 (1990)) ；CD28 和 B7 (Linsley 等人，J. Exp. Med. 173 :721_730 (1991)) ；CTLA-4 (Lisley 等人，J.Exp· Med. 174 :561-569(1991)) ；CD22(Stamenkovic 等人，Cell 66 1133-1144 (1991)) ；TNF 受體(Ashkenazi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 10535-10539 (1991) ；Lesslauer 等人，Eur. J. Immunol. 27 :2883-2886 (1991)；和 Peppel 等人，J. Exp. Med. 174 1483-1489(1991))；以及 IgE 受體 a(Ridgway 和 Gorman, J. Cell. Biol.第 115 卷，摘要 No. 1448(1991))。在一實施方案中，當制備本發明融合蛋白時，編碼結合結構域(例如，人源化B3F6 結合結構域)的核酸C-末端與編碼免疫球蛋白恒定結構域序列N-末端的核酸融合。N-末 端融合也是可能的。在一實施方案中，融合蛋白包含CH2和CH3結構域。還可以在恒定區 Fc部分的C末端，或者重鏈CHl緊鄰N末端的位置或者輕鏈中的相應區域進行融合。在一實施方案中，配體或受體結構域的序列與免疫球蛋白分子Fc區的N末端融 合。還可能將整個重鏈恒定區與配體或受體結構域的序列融合。在一實施方案中，用于融 合的是剛好從鉸鏈區中化學上界定了 IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位點(即殘基216，假設重 鏈恒定區的第一個殘基在位點114)或者其它免疫球蛋白中類似位點的上游開始的一段序 列。進行融合的確切位點并不重要；特定位點是熟知的并可以被選擇以優化所述分子的生 物活性、分泌或結合特點。制備融合蛋白的方法是本領域已知的。對于雙特異性融合蛋白，所述融合蛋白被組裝成多聚體，特別是異二聚體或異四
32聚體。通常，這些組裝好的免疫球蛋白具有已知單元結構。IgG、IgD和IgE均以基本的四 鏈結構單元的形式存在。在更高分子量免疫球蛋白中是四鏈單元的重復；IgM—般是由二 硫鍵連接在一起的四鏈基本單元的五聚體。IgA球蛋白，以及有時IgG球蛋白，可能還會以 多聚體形式存在于血清中。在多聚體的情況中，四個單元中的每一個可能是相同或不同的。例如W00069913A1和W00040615A2中教導了融合蛋白。融合蛋白可以利用本領域 熟知的方法來制備(參見，例如美國專利第5，116，964和5，225，538號)。通常，配體或受 體結構域通過C-末端融合到重鏈(或重鏈部分)恒定區的N-末端，代替可變區。優選在 融合前將配體結合受體中任何跨膜區或者脂質或磷脂錨識別序列滅活或缺失。將編碼配體 或受體結構域的DNA用限制性內切酶在編碼所需ORF片段的DNA的5’和3’端或者附近進 行切割。然后將得到的DNA片段容易地插入編碼重鏈恒定區的DNA。可以根據經驗挑選進 行融合的確切位點以便優化可溶性融合蛋白的分泌或結合特性。然后編碼融合蛋白的DNA 被轉染到宿主細胞內進行表達。III.合成的連接肽在一實施方案中，本發明二聚體的至少一條多肽鏈包含合成連接肽。在一實施方 案中，本發明二聚體的至少兩條鏈包含連接肽。在優選實施方案中，本發明二聚體的兩條鏈 包含連接肽。在一實施方案中，可以用連接肽將兩個重鏈部分符合讀框地連接到單個多肽鏈 中。例如，在一實施方案中，本發明的連接肽可以用于將CH3結構域(或合成CH3結構域) 與鉸鏈區(或合成鉸鏈區)融合。在另一實施方案中，本發明的連接肽可用于將CH3結構 域(或合成CH3結構域)融合到CHl結構域(或合成CHl結構域)上。還有一實施方案中， 連接肽可以作為鉸鏈區(或合成鉸鏈區)和CH2結構域(或合成CH2結構域)之間的間隔 肽。在另一實施方案中，CH3結構域可以被融合到胞外蛋白結構域上(例如，VL結構域 (或合成結構域)、VH結構域(或合成結構域)、CHl結構域(或合成結構域)、鉸鏈區(或 合成鉸鏈)，或者融合到受體的配體結合部分或配體的受體結合部分上)。例如，在一實施 方案中，VH或VL結構域借助連接肽(連接肽的C-末端連著CH3結構域的N-末端，連接肽 的N-末端連著VH或VL結構域的C-末端)被融合到CH3結構域上。在另一實施方案中， CHl結構域借助連接肽(連接肽的C-末端連著CH3結構域的N-末端，連接肽的N-末端連 著CHl結構域的C-末端)融合到CH3結構域上。在另一實施方案中，本發明的連接肽可以 用于將CH3結構域(或合成CH3結構域)融合到鉸鏈區(或合成鉸鏈區)或其部分上。還 有一實施方案中，連接肽可以作為鉸鏈區(或合成鉸鏈區)和CH2結構域(或合成CH2結 構域)之間的間隔肽。在一實施方案中，連接肽可以包含gly/ser間隔子或由它組成。例如，可以使用 含有短氨基酸間隔序列GGSSGGGGSG(SEQ ID No. 8)的結構域缺失構建體(CH2 [gly/ser])， 間隔序列取代了 CH2結構域和下游鉸鏈區。在另一實施方案中，連接肽包含氨基酸序列 IGKTISKKAK(SEQ ID NO: 15)。在另一實施方案中，連接肽可以包含免疫球蛋白鉸鏈區的至少一部分。鉸鏈結構 域可以細分成三個不同的區上游、中游和下游鉸鏈區(Roux等人.J. Immunol. 1998161 4083)。包含對IgGl和IgG3鉸鏈的這些區域的多肽序列顯示在表3。例如，可以構建將來源于不同抗體同種型的鉸鏈元件聯合起來嵌合鉸鏈結構域。在一實施方案中，連接肽可包 含IgGl鏈區的至少一部分。在另一實施方案中，連接肽可以包含IgG3鉸鏈區的至少一部 分。在另一實施方案中，連接肽可以包含IgGl鉸鏈區的至少一部分和IgG3鉸鏈區的至少 一部分。在一實施方案中，連接肽可以包含IgGl上游和中游鉸鏈以及單個IgG3中游鉸鏈
重復基序。表3 =IgGU IgG3 和 IgG4 鉸鏈區
IgG上游鉸鏈中游鉸鏈下游鉸鏈IgGlepkscdkthtcppcpapellggp(seq id no: 17)(seq id no: 18)(seq id no: 19)IgG3elktplgdtthtcprcp (Epkscdtpppcprcp)3apellggp(seq id n0:20)(seq id n0:21)(seq id no: 19)igg4eskygppcpscpapeflggp(seq id no:22)(seq id no:23)(seq id no:24)示例性連接肽教導于例如TO 06/74397。在一實施方案中，本發明的連接肽包含非天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區結構域， 例如所述鉸鏈區結構域天然情況下不會見于包含該鉸鏈區結構域的多肽，和/或該鉸鏈區 結構域被改變而使它的氨基酸序列與天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區結構域不同。在一實施 方案中，可以對鉸鏈區結構域進行突變以便制得本發明的連接肽。在一實施方案中，本發明 連接肽包含的鉸鏈結構域不含有天然存在數量的半胱氨酸，即該連接肽包含的半胱氨酸數 目比天然存在的鉸鏈分子要少或多。在一個優選實施方案中，在多肽中引入所述連接肽得 到組合物，其中50 %、60 %、70 %、80 %或90 %以上的二聚體分子以兩個重鏈部分借助至少 一個鏈間二硫鍵連在一起的形式存在。在本發明的一實施方案中，連接肽包含鉸鏈區結構域，該結構域在與Kabat編號 系統中氨基酸位點243(位點230，EU編號系統)對應的氨基酸位點含有脯氨酸殘基。在一 實施方案中，連接肽在與Kabat編號系統中氨基酸位點244 (位點246，EU編號系統)對應 的氨基酸位點含有丙氨酸殘基。在另一實施方案中，本發明連接肽在與位點245 (Kabat編 號系統；位點247，EU編號系統))對應的氨基酸位點包含脯氨酸殘基。在一實施方案中， 連接肽在與Kabat編號系統的位點239 (位點226，EU編號系統)對應的氨基酸位點包含半 胱氨酸殘基。在一實施方案中，連接肽在與Kabat編號系統的位點239 (位點226，EU編號 系統)對應的氨基酸位點包含絲氨酸殘基。在一實施方案中，連接肽在與Kabat編號系統 的位點242(位點229，EU編號系統)對應的氨基酸位點包含半胱氨酸殘基。在一實施方案 中，連接肽在與Kabat編號系統的位點242 (位點229，EU編號系統)對應的氨基酸位點包 含絲氨酸殘基。在一實施方案中，可以挑選連接肽以便優先合成多肽的特定同種型，例如其中兩 個重鏈部分借助二硫鍵連接或者不借助二硫鍵連接。例如，如WO 2006074397實施例中的描述，Gl/G3/Pro243+[gly/ser]接頭(SEQ ID NO 26) ,Gl/G3/Pro243Ala244Pro245+[gly/ ser]接頭(SEQ ID NO 5)、Pro243+[gly/ser]接頭(SEQ ID NO 33)禾口 Pro243Ala244Pro245+ [gly/ser]接頭(SEQID NO :32)，連接肽導致僅產生 A 型 CH2 結構域 缺失抗體，沒有可檢測的B型。相反，CH2結構域缺失的Cys242Ser :Pro243(SEQ ID NO 31)，和 CH2 結構域缺失的 Cys242Ser :Pro243Ala244Pro245 (SEQ ID NO :32)，均優先產生 B 同種型。因此這些合成鉸鏈區連接肽可以用于幫助合成A型或B型同種型。根據CH3結構 域所有四種人類同種型之間的高同源性，這對抗體的任何同種型(例如，IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4)都是正確的。(包括相同和保守氨基酸殘基，IgGl CH3結構域與IgG2 CH3結構域 95. 13%同源，與IgG3 CH3 97. 20%同源，與IgG4 CH3 96. 26%同源)。除非另有說明，提及 本發明連接肽和各種結合分子時的括號內的內容代表等同的術語。在一實施方案中，本發明連接肽包含的鉸鏈區結構域跟隨著柔性gly/ser接頭。 示例性的連接肽示于表2和SEQ ID NO :5、25-34。人們會理解，產生這些示例性連接肽的變 體形式可以通過向編碼該連接肽的核苷酸序列中引入一或多個核苷酸取代、添加或缺失， 從而在連接肽中引入一或多個氨基酸取代、添加或缺失。例如，可以通過標準技術來引入突 變，諸如定點誘變和PCR介導的誘變。優選地，在一或多個非關鍵氨基酸殘基進行保守性氨 基酸取代，使得連接肽優先促進合成A型或B型的能力沒有改變。因此，優選將免疫球蛋白 多肽中的非關鍵氨基酸殘基用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。在另一實施方 案中，可以將一串氨基酸用結構類似、而側鏈家族成員的順序和/或組成不同的氨基酸串 取代。表2 鉸鏈區連接肽序列
35
本發明的連接肽可以是不同長度的。在一實施方案中，本發明連接肽長約15到約 50個氨基酸。在另一實施方案中，本發明連接肽長約20到約45個氨基酸。在另一實施方 案中，本發明連接肽長約25到約40個氨基酸。在另一實施方案中，本發明連接肽長約30
權利要求
一種抑制受治療者的腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子，其中所述結合分子每三周施用一次，從而抑制受治療者的腫瘤生長。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合分子是抗Cripto抗體。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述結合分子是人源化抗Cripto抗體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述人源化抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述美登木素生物堿是DM4。
6.根據權利要求5所述的方法，其中平均一個所述抗體分子連接有3.5個DM4分子。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑偶聯于 所述抗體。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述異雙官能交聯劑是4-(2-吡啶二硫代)丁酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述受治療者患有選自由以下組成的組的器官的 癌癥腦、乳腺、睪丸、結腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述受治療者患有結腸癌。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量選自由以下組成的組 約 5mg/kg、約 10mg/kg、約 15mg/kg、約 25mg/kg 和約 40mg/kg。
12.—種抑制受治療者的腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療者施用有效劑量的結 合Cripto的結合分子和另外的化療劑，從而抑制受治療者的腫瘤生長。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子與所述化療劑協同作用。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述化療劑是抗代謝物。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述抗代謝物是嘧啶類似物。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述嘧啶類似物是5’-氟尿嘧啶。
17.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子是抗Cripto抗體。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述結合分子是人源化抗Cripto抗體。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述人源化抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述美登木素生物堿是DM4。
21.根據權利要求19所述的方法，其中平均一個所述抗體分子連接有3.5個DM4分子。
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑偶聯 于所述抗體。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述異雙官能交聯劑是4-(2-吡啶二硫代)丁 酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。
24.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子與所述化療劑以單次劑量施用。
25.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子與所述化療劑每兩周施用一次。
26.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子與所述化療劑每三周施用一次。
27.根據權利要求9所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量選自由以下組成的組 約 5mg/kg、約 10mg/kg、約 15mg/kg、約 25mg/kg 和約 40mg/kg。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量是15mg/kg。
29.根據權利要求12所述的方法，其中所述結合分子與所述化療劑腹膜內、口服、鼻 內、皮下、肌內、表面局部或靜脈內地施用。
30.根據權利要求12所述的方法，其中所述受治療者患有選自由以下組成的組的器官 的癌癥腦、乳腺、睪丸、結腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。
31.根據權利要求12所述的方法，其中所述受治療者患有結腸癌。
32.—種抑制受治療者的腫瘤生長的方法，所述方法包括以下步驟(i)選擇具有已建立的腫瘤的患者；并( )向該受治療者施用有效劑量的結合Cripto的結合分子；從而抑制該受治療者的腫瘤生長。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子是抗Cripto抗體。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述結合分子是人源化抗Cripto抗體。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述美登木素生物堿是DM4。
37.根據權利要求36所述的方法，其中平均一個所述抗體分子連接有3.5個DM4分子。
38.根據權利要求35所述的方法，其中所述美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑偶聯 于所述抗體。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述異雙官能交聯劑是4-(2-吡啶二硫代)丁 酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。
40.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子以單次劑量施用。
41.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子每兩周施用一次。
42.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子每三周施用一次。
43.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量選自由以下組成的 組約 5mg/kg、約 10mg/kg、約 15mg/kg、約 25mg/kg 和約 40mg/kg。
44.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量是約15mg/kg。
45.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子的有效劑量是約25mg/kg。
46.根據權利要求32所述的方法，其中所述結合分子腹膜內、口服、鼻內、皮下、肌內、 表面局部或靜脈內地施用。
47.根據權利要求32所述的方法，其中所述受治療者患有選自由以下組成的組的器官 的癌癥腦、乳腺、睪丸、結腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。
48.根據權利要求32所述的方法，其中所述受治療者患有結腸癌。
49.一種抑制受治療者的腫瘤生長的方法，該方法包括向受治療者施用單個有效劑量 的結合Cripto的結合分子，從而抑制受治療者的腫瘤生長。
50.根據權利要求49所述的方法，其中所述結合分子是抗Cripto抗體。
51.根據權利要求50所述的方法，其中所述結合分子是人源化抗Cripto抗體。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述抗Cripto抗體偶聯于美登木素生物堿。
53.根據權利要求52所述的方法，其中所述美登木素生物堿是DM4。
54.根據權利要求53所述的方法，其中平均一個所述抗體分子連接有3.5個DM4分子。
55.根據權利要求52所述的方法，其中所述美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑偶聯 于所述抗體。
56.根據權利要求55所述的方法，其中所述異雙官能交聯劑是4-(2-吡啶二硫代)丁 酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。
57.根據權利要求49所述的方法，其中所述有效單次劑量選自由以下組成的組約 5mg/kg、約 10mg/kg、約 15mg/kg、約 25mg/kg 禾口約 40mg/kg。
58.根據權利要求49所述的方法，其中所述受治療者患有選自由以下組成的組的器官 的癌癥腦、乳腺、睪丸、結腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、宮頸、胰腺和胃。
59.一種液態含水藥物制劑，其包含(a)治療有效量的結合Cripto的結合分子，(b)IOmM琥珀酸鈉，pH是5.0，(c)120mM L-甘氨酸，(d)120mM甘油，和(e)0.01% Polysorbate 80。
60.根據權利要求59所述的藥物制劑，其中所述結合分子是人源化抗Cripto抗體。
61.根據權利要求60所述的藥物制劑，其中所述人源化抗Cripto抗體偶聯于美登木素 生物堿。
62.根據權利要求61所述的藥物制劑，其中所述美登木素生物堿是DM4。
63.根據權利要求62所述的藥物制劑，其中平均一個所述抗體分子連接有3.5個DM4 分子。
64.根據權利要求61所述的藥物制劑，其中所述美登木素生物堿經由異雙官能交聯劑 偶聯于所述抗體。
65.根據權利要求64所述的藥物制劑，其中所述異雙官能交聯劑是4-(2_吡啶二硫 代)丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDB)。
66.根據權利要求63所述的藥物制劑，其中所述結合分子的濃度是5mg/ml。
全文摘要
本發明涉及抗CRIPTO抗體的人源化形式及其部分，以及其單獨或聯合其它藥劑治療病癥諸如癌癥的應用。
文檔編號A61K39/395GK101970001SQ200880101481
公開日2011年2月9日 申請日期2008年6月2日 優先權日2007年6月1日
發明者米歇爾·薩尼科拉納德爾 申請人:比奧根艾迪克Ma公司